CN107287300A - 一种鉴别9种黄檀属木材的dna组合条形码及其鉴别方法和应用 - Google Patents
一种鉴别9种黄檀属木材的dna组合条形码及其鉴别方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种鉴别9种黄檀属木材的DNA组合条形码，所述DNA组合条形码是条形码序列trnL、trnH‑psbA、trnV‑trnM或ITS2中的任意2种以上或全部组合形成的DNA组合条形码。本发明还公开了一种鉴别9种黄檀属木材的方法。本发明提供的DNA组合条形码及其方法可以实现9种黄檀属木材的准确鉴别，解决了传统木材识别方法无法鉴别黄檀属木材到“种”水平的难题，为海关、质量检验检疫等木材贸易执法部门和木材经营贸易人员提供一种高效可靠的鉴别方法，为濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)的执行提供技术支持，具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于木材材种鉴定的分子生物学检测领域，具体涉及一种鉴别9种黄檀属木材的DNA组合条形码及其鉴别方法和应用。
背景技术
黄檀属(Dalbergia L.f.)隶属豆科(Leguminosae)，约300余种，主要分布于热带及亚热带地区。黄檀属木材材质坚硬、纹理细腻，色泽柔美，深受消费者喜爱。旺盛的市场需求和高额利益的驱使，使非法采伐及非法贸易等行为愈演愈烈，最终导致了黄檀属木材资源的严重短缺并加剧了全球天然林资源的破坏。黄檀属木材资源的现状引起了国际社会的高度持续关注。目前已有86种黄檀属木材被列入国际自然保护联盟(IUCN)红色名录。2016年在南非召开的濒危野生动植物种国际贸易保护公约(CITES)第17次缔约国大会，一致通过将黄檀属所有树种列入附录II。
黄檀属木材树种丰富，分布范围较广。不同树种、不同产地的黄檀属木材，其市场价值也往往大相径庭。因此，对黄檀属木材进行科学、快速、准确的识别具有很高的应用价值。传统的木材解剖学识别技术只能鉴别黄檀属木材到“属”或者“类”，无法实现“种”水平的鉴别，而新兴的DNA条形码技术为黄檀属木材“种”水平识别提供了可能。
DNA条形码是一段标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。近年来，DNA条形码已经发展成为物种鉴定的重要工具。但单一DNA条形码对于进化关系复杂且亲缘关系较近物种的识别能力较为有限。而DNA组合条形码通过对多条单一DNA条形码进行组合，具有更丰富的序列信息位点，进而提高物种识别能力，是一种有效的物种鉴别方法。
总体来说，黄檀属木材物种丰富，基于木材解剖学的传统识别技术难以实现木材“种”水平的识别，而新兴的DNA条形码技术，特别是DNA组合条形码逐步发展成为木材识别的有效工具。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对传统木材识别技术无法准确鉴别9种黄檀属木材到种，而提供一种基于细胞核核糖体DNA内转录间隔区如ITS2序列和叶绿体基因间隔区如trnH-psbA序列的DNA组合条形码以及一种准确鉴别9种黄檀属木材的方法。
所以，本发明的第一目的是提供一种鉴别9种黄檀属木材的DNA组合条形码。
本发明的第二目的是提供一种鉴别9种黄檀属木材的方法。
本发明的第三目的是提供所述DNA组合条形码和所述鉴别9种黄檀属木材的方法在黄檀属木材鉴别中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明首先提供了一种鉴别9种黄檀属木材的DNA组合条形码，所述DNA组合条形码是条形码序列trnL、trnH-psbA、trnV-trnM或ITS2中的任意2种以上或全部组合形成的DNA组合条形码。
具体地，所述DNA组合条形码包括：ITS2+trnL、ITS2+trnH-psbA、ITS2+trnV-trnM、trnH-psbA+trnL、trnH-psbA+trnV-trnM、trnV-trnM+trnL、ITS2+trnH-psbA+trnL、ITS2+trnH-psbA+trnV-trnM、ITS2+trnL+trnV-trnM、trnH-psbA+trnL+trnV-trnM和ITS2+trnH-psbA+trnL+trnV-trnM。
优选的，所述9种黄檀属木材分别为降香黄檀Dalbergia odorifera T.C.Chen、黄檀D.hupeana Hance、海南黄檀D.hainanensis Merr.&Chun、交趾黄檀D.cochinchinensisPierre、阔叶黄檀D.latifolia Roxb.、东非黑黄檀D.melanoxylon Guill.&Perr.、奥氏黄檀D.oliveri Prain、微凹黄檀D.retusa Hemsl.和伯利兹黄檀D.stevensonii Standl.。
考虑到费用成本和实验周期等因素，相比于三个及以上的条形码组合，ITS2+trnH-psbA、trnH-psbA+trnL、trnL+trnV-trnM、ITS2+trnL等两个条形码组合是更好的选择；另外，对木材DNA识别而言，DNA扩增成功率是筛选DNA条形码的一个非常重要的条件。表4显示，ITS2+trnH-psbA组合在以上4个组合中具有最高的扩增成功率(ITS2和trnH-psbA序列片段扩增成功率均大于90％)，更适用于DNA发生严重降解的木材样品的鉴别。
根据DNA条形码优选原则对所述11个条形码组合进行筛选，确定最优的DNA组合条形码为ITS2+trnH-psbA。所述ITS2+trnH-psbA组合条形码分别由9种黄檀属木材的细胞核核糖体DNA内转录间隔区ITS2序列与叶绿体基因间隔区trnH-psbA序列组合形成。
优选的，所述ITS2+trnH-psbA序列如SEQ ID No.9-17所示。
进一步地，本发明首先提供了一种鉴别9种黄檀属木材的方法，该方法利用DNA组合条形码，并通过分子生物学手段来鉴别9种黄檀属木材；所述DNA组合条形码是条形码序列trnL、trnH-psbA、trnV-trnM或ITS2中的任意2种以上或全部组合形成的DNA组合条形码。
具体地，所述方法包括以下步骤：
(1)将木材样品研磨处理成木粉；
(2)提取步骤(1)所得的木粉样品的DNA；
(3)以步骤(2)提取得到的DNA为模板，PCR扩增所述ITS2和trnH-psbA条形码序列；
(4)将步骤(3)得到的PCR扩增产物进行测序，得到ITS2和trnH-psbA序列，并对其进行组合；
(5)以步骤(4)所得的ITS2+trnH-psbA条形码组合构建***发育进化树鉴别9种黄檀属木材。
优选的，所述步骤(1)中木粉样品研磨至200目及以上。
优选的，所述步骤(2)中DNA需进行纯化，DNA终浓度为1-200ng/μL。
优选的，扩增ITS2序列的正反引物如SEQ ID No.1-2所示，扩增trnH-psbA序列的正反引物如SEQ ID No.3-4。
优选的，所述步骤(3)中PCR扩增反应体系为0.5-3U DNA聚合酶、1.0-2.0mMMgCl2、200μM单一dNTP、0.1-5.0μM单一引物、pH7.0-8.0的0.1-1.5mg/mL牛血清白蛋白和10-1000ng模板DNA；
优选的，所述步骤(3)中PCR反应条件为94-96℃预变性0.5-10min；94-96℃变性0.05-2min，40-65℃退火0.5-2min，72℃延伸0.3-2min，循环20-50次；72℃终延伸2-15min。
优选的，所述步骤(5)中构建***发育进化树采用的方法为邻接法。
进一步地，本发明还提供了所述DNA组合条形码，或所述鉴别9种黄檀属木材的方法在黄檀属木材鉴别中的应用。
本发明的有益效果如下：
1、本发明基于一种DNA组合条形码，可以实现9种黄檀属木材的准确鉴别，突破了传统木材识别技术的局限；
2、本发明筛选的鉴别引物特异性好，扩增及测序成功率高；
3、本发明优选的ITS2+trnH-psbA序列组合DNA条形码在黄檀属9种木材中存在明显的差异位点，具有很强的鉴别能力；
4、本发明优选的邻接法构建***发育进化树操作简单，对树种区分能力较强；
5、本发明取样量极少，且不受取材位置(边材、心边材过渡区及心材)、样品原始状态(木块、木粉)因素影响；
6、本发明实验条件依赖少，一般分子生物学实验室均可满足；
7、本发明为黄檀属木材的准确识别提供了一种新的途径和思路。
总之，本发明提供的DNA组合条形码及其方法可以实现9种黄檀属木材的准确鉴别，解决了传统木材识别方法无法鉴别黄檀属木材到“种”水平的难题，为海关、质量检验检疫等木材贸易执法部门和木材经营贸易人员提供一种高效可靠的鉴别方法，为濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)的执行提供技术支持，具有较高的应用价值。
附图说明
图1是本发明基于DNA组合条形码构建的***发育邻接树；
图中：(a)ITS2+trnH-psbA,(b)trnH-psbA+trnL,(c)trnL+trnV-trnM,(d)ITS2+trnL,(e)ITS2+trnL+trnV-trnM,(f)ITS2+trnH-psbA+trnL,(g)ITS2+trnH-psbA+trnV-trnM,(h)trnH-psbA+trnL+trnV-trnM及(i)ITS2+trnH-psbA+trnL+trnV-trnM。
图2是基于本发明构建的DNA组合条形码ITS+trnH-psbA鉴别未知样品的***发育邻接树。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的发明范围。该技术领域的技术工程师可根据上述发明的内容做出一些非本质性的改进和调整。
实施例1：黄檀属树种木材特异性引物设计
(1)从GenBank中下载黄檀属的叶绿体DNA序列trnL、trnH-psbA、trnV-trnM和细胞核DNA序列ITS2(表1)；
表1 GenBank中下载的黄檀属DNA条形码序列
(2)应用Clustal X 1.81软件比对序列，查找并确定黄檀属间4种DNA条形码序列的差异位点；
(3)应用Primer Premier 5软件对trnL、trnH-psbA、trnV-trnM和ITS2四个条形码设计引物。引物由上海生物工程有限公司合成，所述引物序列如表2所示。
表2 四种DNA条形码引物信息
实施例2：9种黄檀属木材标准样品的DNA组合条形码优选与确定
(1)标准样品采集
9种黄檀属标准样品(分别为降香黄檀、黄檀、海南黄檀、交趾黄檀、阔叶黄檀、东非黑黄檀、奥氏黄檀、微凹黄檀和伯利兹黄檀)合计50个，均取自中国林业科学研究院木材标本馆。
(2)样品制备
选取木材样品，利用70％酒精消毒后的解剖刀片将木材试样外表面切除，以避免外源污染；将木材试样切成若干木屑，并置于低温冷冻研磨仪中低温预冷3min，研磨3min，运行频率10cps；研磨结束后，过200目筛网，将细木粉分装到若干50mL的微量离心管中，每管木粉量500mg，并置于-80℃低温冰箱保存备用。
(3)DNA提取
在消毒处理的超净工作环境中，参考Jiao等文章(Jiao L,Yin Y,Cheng Y,JiangX.DNA barcoding for identification of the endangered species Aquilariasinensis:comparison of data from heated or aged woodsamples.Holzforschung.2014；68(4):487-494.)的DNA提取方法对9种黄檀属木材进行DNA提取。
(4)PCR扩增反应与测序
利用实施例1中的四种DNA条形码序列引物进行PCR扩增，
PCR扩增反应体系为30μL：其中Premix Ex Taq 15μL(包括l.25U Ex Taq DNA聚合酶，2mM MgCl2，200μM单一dNTP)，0.2μM单一引物和约20ng模板DNA。
PCR反应均在PCR扩增仪上进行。反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性15s，40℃(trnL)、61℃(trnH-psbA)、53℃(trnV-trnM)及52℃(ITS2)退火30s，72℃延伸20s，循环40次；72℃终延伸7min，即可获得高效扩增的DNA目的片段。将扩增产物送由生物公司纯化后进行双向直接测序(测序所有引物与PCR所有引物相同)。
(5)序列比对分析与序列组合。
应用ContigExpress软件对测序结果进行测序质量评估，去除两端低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接及校对。所述9种黄檀属木材的trnL、trnH-psbA、trnV-trnM及ITS2四种条形码序列GenBank登录号和序列特征信息分别如表3和表4所示。
应用Editseq软件分别对所述9种黄檀属木材物种的四种条形码进行组合，得到ITS2+trnL、ITS2+trnH-psbA、ITS2+trnV-trnM、trnH-psbA+trnL、trnH-psbA+trnV-trnM、trnV-trnM+trnL、ITS2+trnH-psbA+trnL、ITS2+trnH-psbA+trnV-trnM、ITS2+trnL+trnV-trnM、trnH-psbA+trnL+trnV-trnM和ITS2+trnH-psbA+trnL+trnV-trnM等11个DNA条形码组合。
表3 本研究测序得到的9种黄檀属木材的四种条形码序列GenBank登录号
表4 四种DNA条形码序列特征信息
(6)序列组合DNA条形码优选与确定
应用MEGA软件通过K2P距离模型对上述4种单一及11个DNA组合条形码的种内距离和种间距离进行计算分析，并采用邻接法构建***发育进化树。
结果显示，单一及DNA组合条形码的种内及种间距离如表5所示；***发育树结果如图1所示，单一条形码不能区分全部的9种黄檀属木材，而9对组合条形码ITS2+trnH-psbA、trnH-psbA+trnL、trnL+trnV-trnM、ITS2+trnL、ITS2+trnL+trnV-trnM、ITS2+trnH-psbA+trnL、ITS2+trnH-psbA+trnV-trnM、trnH-psbA+trnL+trnV-trnM和ITS2+trnH-psbA+trnL+trnV-trnM可以准确识别以上9种黄檀属木材。
考虑到费用成本和实验周期等因素，相比于三个及以上的条形码组合，ITS2+trnH-psbA、trnH-psbA+trnL、trnL+trnV-trnM、ITS2+trnL等两个条形码组合是更好的选择；另外，对木材DNA识别而言，DNA扩增成功率是筛选DNA条形码的一个非常重要的条件。表4显示，ITS2+trnH-psbA组合如SEQ ID No.7-19所示，在以上4个组合中具有最高的扩增成功率(ITS2和trnH-psbA序列片段扩增成功率均大于90％)，更适用于DNA发生严重降解的木材样品的鉴别。
根据以上原则对所述11个条形码组合进行筛选，确定最优的DNA组合条形码为ITS2+trnH-psbA。
表5 单一及DNA组合条形码的种内及种间距离
实施例3：未知木材样品DNA鉴别
(1)木材样品来源于木材市场，通过对其进行解剖构造鉴定，判定属红酸枝类木材，但无法识别到种。
(2)制备木粉并研磨至200目及以上。
(3)木材DNA提取。
在消毒处理的超净工作环境中，利用实施例2中提取DNA试剂盒对木材进行DNA提取。所述DNA还需进行纯化，DNA终浓度为1-200ng/μL。
(4)PCR扩增反应与测序。
以上述木材DNA为模板进行PCR扩增，扩增引物如SEQ ID NO：1-4所示。PCR扩增反应体系为30μL：其中Premix Ex Taq 15μL(包括l.25U Ex Taq DNA聚合酶，2mM MgCl2，200μM单一dNTP)，0.2μM单一引物和约20ng模板DNA。
PCR反应均在PCR扩增仪上进行。反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性15s，40℃(trnL)、61℃(trnH-psbA)、53℃(trnV-trnM)及52℃(ITS2)退火30s，72℃延伸20s，循环40次；72℃终延伸。
(5)序列比对分析与树种鉴别。
对ITS2和trnH-psbA两个序列的测序结果进行组合，采用组合序列ITS2+trnH-psbA构建***发育进化树。分析结果如图2所示，该样品能够与交趾黄檀样品聚类，而与其他黄檀属树种区分开。聚类结果证明该样品为交趾黄檀。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国林科院木材工业研究所
<120> 一种鉴别9种黄檀属木材的DNA组合条形码及其鉴别方法和应用
<130> 011701704
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 22
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<211> 18
<212> DNA
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<211> 15
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<212> DNA
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ggctggctga aaatcgggtt cgtggtggat gcagcgccat gacagacggt ggttgagcgt 240
gttctcgagg ccagtcatga gggcggcctc caccagctcc gtacccagcg acccgcgagc 300
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gcttcggtcg aggctccatc tataaatgga taatattttt gtcttaaagg atacgagttt 420
ttgaaagtaa aggagcaata tcaacagagt ttctattgct cctttacttt ttttttttac 480
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<210> 10
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caa 663
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<210> 13
<211> 665
<212> DNA
<213> 东非黑黄檀ITS2+trnH-psbA组合序列
<400> 13
atgcgatact tggtgtgaat tgcagaatcc cgtgaaccat cgagtctttg aacgcaagtt 60
gcgcccgagg ccatccggct aagggcacgc ctgcctgggt gtcaccaatc gccgccccaa 120
cccccgcgcc tccgggcacg gagcggggcg aatgatggct tcccgtgagc accgcctcgc 180
ggctggctga aaatcgggtc cgtggcggaa gcagcgccac gacagatggt ggttgagcgt 240
gttctcgagg ccagtcgtgc gcgcggcctc cgccagctcc gtacccagtg acccgcgagc 300
gacgtcgatc gcccatgacg cgacctcagg ttcaggcggg gctacttccc tctagaccta 360
gcttcggtcg aggctccatc tctaaatgga taatattttt gtcttaaagg atacgagttt 420
ttgaaagtaa aggagcaata tcaacagagt ttctattgct cctttacttt tttttttttt 480
acattgcaaa gtcatatgtt aaaaaaaaca aatgaatgct tccattcttt tgctttttgt 540
atcccatcct atcttaagaa acgagtaaaa actaaagtta gagaagaaac agaaaaataa 600
taacaaaaga aaagagtata aataggttag tctaggagat ttttattaag ggcggatgta 660
gccaa 665
<210> 14
<211> 669
<212> DNA
<213> 奥氏黄檀ITS2+trnH-psbA组合序列
<400> 14
atgcgatact tggtgtgaat tgcagaatcc cgcgaaccat cgagtctttg aacgcaagtt 60
gcgcccgaag ccattaggcc aagggcacgc ctgcctgggt gtcgccaatc gttgccccaa 120
ccccctgtgc ccgtggccac ggggtggggc gaatgctggc ctcccgtgag caccgcctcg 180
cggttggctg aaaatcgggt tcgtggtgga ttcagcgcca tgacggatgg tggttgagta 240
tgttctcgag gccagtcatg cgcgcgacct ccaccagttc cgtgccctgt gacccacggg 300
cgacgtcgat cgcccatgat gcgacctcag gttcaggcgg ggctacttcc ctctagacct 360
agcttcggtc gaggctccat ctctaaatgg ataatatttt tgtcttaaag gatacgagtt 420
tttgaaagta aaggagcaat atcaacagag tttctattgc tcctttactt tttttttaca 480
ttgcaaattc atatgttaaa aaaaaaaaaa aacaaatgaa tgcttccatt cttttgcttt 540
ttgtatccca tcctatctta tcttaggaaa cgagtaaaaa ctaaagttag agaagaaaca 600
gaaaaataat aacaaaagag tataaatggt ttagtctagg agatttttat taagggcgga 660
tgtagccaa 669
<210> 15
<211> 665
<212> DNA
<213> 微凹黄檀ITS2+trnH-psbA组合序列
<400> 15
atgcgatact tggtgtgaat tgcagaatcc cgcgaaccat cgagtctttg aacgcaagtt 60
gcgcccgagg ccattaggcc aagggcacgc ctgcctgcgt gtcaccaatc cccgccccaa 120
cccctgtgcc tccggccacg gagcggggcg aatgctggcc tcccgtgagc accgcctcgc 180
ggctggctga aaatcgggat cgtggtggat gcagcgtcat gtcagacggt ggttgagcgt 240
gttctcgagg ccagtcatga gggcagcctc caccagctcc gtacccagcg acccgcgagc 300
gatgccgatc gcccacgacg cggcctcagg ttcaggcggg gctacttccc tttagaccta 360
gcttcggtcg aggctccatc tctaaatgga taatattttt gtcttaaagg atacgagttt 420
ttgaaagtaa aggagcaata gaaactctgt tgatattgct cctttacttt tttttttcca 480
ttgcaaagtc atatgttaaa aaaaaacaca aatgaatgct tccattcttt tgctttttgt 540
atcccatcct atcttaggaa acgagtaaaa actaaagtta gagaagaaac agaaaaataa 600
taacaaaaga aaagagtata aatggtttag tctaggagat ttttattaag ggcggatgta 660
gccaa 665
<210> 16
<211> 670
<212> DNA
<213> 阔叶黄檀ITS2+trnH-psbA组合序列
<400> 16
atgcgatact tggtgtgaat tgcagaatcc cgtgaaccat cgagtctttg aacgcaagtt 60
gcgcccgaag ccattaggcc aagggcacgc ctgcctgggt gtcaccaatc gttgccccaa 120
ccccctgtgc ccgtggccac ggggtggggc gaatgctggc ctcccgtgag caccgcctcg 180
cggttggctg aaaatcgggt tcgtggtgga ttcagcgcca tgacggacgg tggttgagta 240
tgttctcgag gccagtcatg cgcgcgacct ccaccagttc cgtgccctgt gacccgcggg 300
cgacgtcgat cgcccatgat gcgacctcag gttcaggcgg ggctacttcc ctctagacct 360
agcttcggtc gaggctccat ctctaaatgg ataatatttt tgtcttaaag gatacgagtt 420
tttgaaagta aaggagcaat atcaacagag tttctattgc tcctttactt ttttttttac 480
attgcaaagt catatgttaa aaaaaaagca aaaaaatgaa tgcttccatt cttttgcttt 540
ttgtatccca tcctatctta tcttaggaaa cgagtaaaaa ctaaagttag agaagaaaca 600
gaaaaaataa taacaaaaga gtataaatgg tttagtctag gagattttta ttaagggcgg 660
atgtagccaa 670
<210> 17
<211> 671
<212> DNA
<213> 伯利兹黄檀ITS2+trnH-psbA组合序列
<400> 17
atgcgatact tggtgtgaat tgcaggatcc cgcgaaccgt cgagtctttg agcgcaagtt 60
gcccccggag ccattaggcc aagggcacgc ctgccagggt gtcgccaatc gttgccccaa 120
cccgctgtgc ccgtggccac ggggtggggc gaatgctggc ctcccgtgag caccgcctcg 180
cggttgcctg aaaatcgggt tcttggtgga ttcagcgcca tgagggatgg tggttgagta 240
tcttctcgag gccagtgatg cgcgcgacct ctaccagttc cgtgccccgt gacccgcggg 300
cgacgtcggt cgcccatgat gcgacctcag gttcaggcgg ggctacttcc ctctagacct 360
agcttcggtc gaggctccat ctctaaatgg ataatatttt tgtcttaaag gatacgagtt 420
tttgaaagta aaggagcaat atcaacagag tttctattgc tcctttactt tttttttttt 480
tacattgcaa agtcatatgt taaaaaaaaa aaaacaaatg aatgcttcca ttcttttgct 540
ttttgtatcc catcctatct taagaaacga gtaaaaacta aagttagaga agaaacagaa 600
aaataataac aaaagaaaag agtataaata ggttagtcta ggagattttt attaagggcg 660
gatgtagcca a 671
Claims (10)
1.一种鉴别9种黄檀属木材的DNA组合条形码，其特征在于，所述DNA组合条形码是条形码序列trnL、trnH-psbA、trnV-trnM或ITS2中的任意2种以上或全部组合形成的DNA组合条形码。
2.如权利要求1所述的DNA组合条形码，其特征在于，所述9种黄檀属木材分别为降香黄檀Dalbergia odorifera T.C.Chen、黄檀D.hupeana Hance、海南黄檀D.hainanensisMerr.&Chun、交趾黄檀D.cochinchinensis Pierre、阔叶黄檀D.latifolia Roxb.、东非黑黄檀D.melanoxylon Guill.&Perr.、奥氏黄檀D.oliveri Prain、微凹黄檀D.retusaHemsl.和伯利兹黄檀D.stevensonii Standl.。
3.如权利要求1或2所述的DNA组合条形码，其特征在于，所述DNA组合条形码是ITS2+trnH-psbA组合条形码。
4.如权利要求3所述的DNA组合条形码，其特征在于，所述ITS2+trnH-psbA序列如SEQID No.9-17所示。
5.一种鉴别9种黄檀属木材的方法，其特征在于，该方法利用DNA组合条形码，并通过分子生物学手段来鉴别9种黄檀属木材；所述DNA组合条形码是条形码序列trnL、trnH-psbA、trnV-trnM或ITS2中的任意2种以上或全部组合形成的DNA组合条形码。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将木材样品研磨处理成木粉；
(2)提取步骤(1)所得的木粉样品的DNA；
(3)以步骤(2)提取得到的DNA为模板，PCR扩增所述ITS2和trnH-psbA条形码序列；
(4)将步骤(3)得到的PCR扩增产物进行测序，得到ITS2和trnH-psbA序列，并对其进行组合；
(5)以步骤(4)所得的ITS2+trnH-psbA条形码组合构建***发育进化树鉴别9种黄檀属木材。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，扩增ITS2序列的正反引物如SEQ ID No.1-2所示，扩增trnH-psbA序列的正反引物如SEQ ID No.3-4。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR扩增反应体系为0.5-3UDNA聚合酶、1.0-2.0mM MgCl2、200μM单一dNTP、0.1-5.0μM单一引物、pH7.0-8.0的0.1-1.5mg/mL牛血清白蛋白和10-1000ng模板DNA；
所述步骤(3)中PCR反应条件为94-96℃预变性0.5-10min；94-96℃变性0.05-2min，40-65℃退火0.5-2min，72℃延伸0.3-2min，循环20-50次；72℃终延伸2-15min。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中构建***发育进化树采用的方法为邻接法。
10.权利要求1～4任意一项所述DNA组合条形码，或权利要求5～9任意一项所述鉴别9种黄檀属木材的方法在黄檀属木材鉴别中的应用。
Priority Applications (1)
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