CN107287297A - 基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤dna的方法 - Google Patents
基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤dna的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法,包括以下步骤:(1)CQDs表面生物功能化处理:在表面氨基化的CQDs溶液中加入戊二醛,静置10~40min后,加入氧化损伤DNA,4℃下保存备用;(2)AuNPs制备和表面生物功能化处理:利用柠檬酸钠还原高氯金酸的方法制备AuNPs,8‑OHdG抗体通过抗体上的氨基端连接到制备得到的AuNPs表面,AuNPs和8‑OHdG抗体的物质的量比为1:10~1:50;(3)氧化损伤DNA的测定:将8‑OHdG抗体修饰的AuNPs溶液加入到氧化损伤DNA修饰的CQDs溶液中,孵育0.5~2小时后进行荧光强度测定。本发明快速、简便、灵敏。
Description
技术领域
本发明涉及一种氧化损伤DNA的检测技术方法,尤其涉及一种基于碳量子 点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法。
背景技术
环境***具有类似生物体内激素性质,能干扰人体内分泌***的正常生理 功能。常见的环境***有双酚A、邻苯二甲酸酯类塑化剂以及与***结构相 似的类固醇衍生物合成***等。这些环境污染物具有高亲脂性或脂溶性,易通 过食物链进入人体,富集于动物和人体中。环境***在人体内代谢,产生活性 氧自由基如羟自由基、超氧阴离子等,攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳 原子,生成氧化性加合物8-羟基脱氧鸟苷,导致DNA氧化损伤,进而诱发基因 突变和细胞癌变。
目前,常用的DNA氧化损伤检测主要有高效液相色谱结合电化学检测,气 质联用分析法,这些方法操作成本相对较高,且假阳性高。伴随着免疫学技术的 快速发展,8-羟基脱氧鸟苷多克隆抗体的发展和单克隆抗体的使用为酶联免疫吸 附测定(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)的发展提供了条件。ELISA 虽然特异性强、灵敏度高,但存在交叉反应,可能导致检测值比真实值偏高。
近年来,生物传感器趋向于微型化、集成化、智能化方向发展,在早期快速 疾病诊断治疗方面展示出了广阔的应用前景。荧光共振能量转移(fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)生物传感器是荧光生物传感器的一种类型,在一 个荧光基团(供体)的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向另一个荧光 基团(受体)转移的过程,可广泛应用于生物化学领域分子检测、快速抗原检测、 癌症标记物检测等。FRET传感器***中需要两个不同的荧光基团,传统的有机 荧光基团价格昂贵,且荧光不稳定,容易发生不可逆的光漂白,不适合可靠长期 检测。这就要求我们发展新型的低成本稳定的FRET荧光传感体系用于环境雌激 素代谢引起DNA损伤和修复分析研究。
发明内容
为了克服已有检测损伤DNA的方法的速度较慢、工序复杂、灵敏度较差等 不足,本发明提供了一种快速、简便、灵敏的基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光 共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的 方法,所述方法包括以下步骤:
(1)CQDs表面生物功能化处理:在表面氨基化的CQDs溶液中加入戊二醛, 所述CQDs溶液和戊二醛的体积比为:(100~300):(1~6);静置10~40min后, 加入氧化损伤DNA,4℃下保存备用;
(2)AuNPs制备和表面生物功能化处理:利用柠檬酸钠还原高氯金酸的方 法制备AuNPs,8-OHdG抗体通过抗体上的氨基端连接到制备得到的AuNPs表面, AuNPs和8-OHdG抗体的物质的量比为1:10~1:50;
(3)氧化损伤DNA的测定:将8-OHdG抗体修饰的AuNPs溶液加入到氧 化损伤DNA修饰的CQDs溶液中,孵育0.5~2小时后进行荧光强度测定。
进一步,所述步骤(1)中,CQDs的浓度为25μg/mL,戊二醛的质量分数为 50%,氧化损伤后带有8-OHdG的DNA的浓度范围为0pM~30μM。
再进一步,所述步骤(2)中,8-OHdG抗体浓度为1mg/mL,AuNPs浓度为 5~10nM。
更进一步,所述步骤(3)中,每100μL~300μL CQDs溶液,戊二醛的体积 为1μL~6μL,所述8-OHdG抗体修饰的AuNPs溶液的体积为10~50μL。
本发明利用碳量子点(Carbon quantum dots,CQDs)和金纳米颗粒(Goldnanoparticles,AuNPs)构成荧光共振能量转移体系的供体和受体对,以波长为300 nm紫外光激发CQDs,发射440nm荧光为检测信号。通过对不同浓度的带有 8-OHdG的DNA进行检测,实现氧化损伤DNA检测的目的。
本发明利用CQDs较好的荧光稳定性和荧光强度,且表面容易生物功能化修 饰,AuNPs易于合成,具有较宽的吸收光谱等特点,作为构成荧光共振能量转移 体系的供体和受体对。当检测到氧化损伤的DNA时,CQDs和AuNPs的距离在 10nm以内。在波长为300nm的紫外光激发下,CQDs的荧光通过荧光共振能量 转移到AuNPs上,被CQDs淬灭。以上荧光强度变化可通过荧光分光光度计进行 分析,达到检测分析氧化损伤DNA的目的。
本发明的有益效果主要表现在:将表面生物功能化的CQDs和AuNPs构成荧 光共振能量转移***,用于氧化受损DNA的检测分析。实验表明该方法构建的 荧光传感器可用于快速、简便、灵敏的氧化损伤DNA的分析检测。
附图说明
图1为本发明检测方法的检测原理图;
图2为本发明CQDs的透射电子显微镜(TEM)图;
图3为本发明CQDs的荧光曲线图;
图4为本发明AuNPs的透射电子显微镜(TEM)图;
图5为本发明基于CQDs和AuNPs的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA 的荧光强度随浓度变化曲线;
图6为本发明方法检测氧化损伤DNA荧光强度峰值随浓度变化关系;
图7为不同氧化损伤DNA浓度的荧光峰值变化示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。
参照图1~图6,一种基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧 化损伤DNA的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)CQDs表面生物功能化处理:在表面氨基化的CQDs溶液中加入戊二醛, 所述CQDs溶液和戊二醛的体积比为:(100~300):(1~6);静置10~40min后, 加入氧化损伤DNA,4℃下保存备用;
(2)AuNPs制备和表面生物功能化处理:利用柠檬酸钠还原高氯金酸的方 法制备AuNPs,8-OHdG抗体通过抗体上的氨基端连接到制备得到的AuNPs表面, AuNPs和8-OHdG抗体的物质的量比为1:10~1:50;
(3)氧化损伤DNA的测定:将8-OHdG抗体修饰的AuNPs溶液加入到氧 化损伤DNA修饰的CQDs溶液中,孵育0.5~2小时后进行荧光强度测定。
进一步,所述步骤(1)中,CQDs的浓度为25μg/mL,戊二醛的质量分数为 50%,氧化损伤后带有8-OHdG的DNA的浓度范围为0pM~30μM。
再进一步,所述步骤(2)中,8-OHdG抗体浓度为1mg/mL,AuNPs浓度为 5~10nM。
更进一步,所述步骤(3)中,每100μL~300μL CQDs溶液,戊二醛的体积 为1μL~6μL,所述8-OHdG抗体修饰的AuNPs溶液的体积为10~50μL。
本发明利用表面氨基化的CQDs通过戊二醛和单链DNA上的氨基连接,将 氧化损伤的单链DNA固定到CQDs的表面,AuNPs表面修饰8-OHdG抗体,可 用于连接CQDs上氧化损伤带有8-OHdG的DNA。当检测到氧化损伤的DNA时, CQDs和AuNPs的距离在10nm以内。在波长为300nm的紫外光激发下,CQDs 的荧光通过荧光共振能量转移到AuNPs上,被CQDs淬灭。上述现象可通过荧光 强度变化进行分析,进而检测氧化损伤DNA。与传统的检测方法相比,操作过程 简单,易于测量。并能实现DNA损伤的体外研究。
实例1:一种基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤 DNA的方法,过程如图1所示:
(1)CQDs表面生物功能化处理:在25μg/mL,100μL表面氨基化的CQDs 溶液中加入1μL戊二醛(质量分数50%)静置30min后,加入氧化损伤DNA, 浓度范围为1pM~30μM,4℃下保存备用;
(2)AuNPs制备及表面功能化处理:AuNPs通过柠檬酸钠还原高氯金酸制 得。去离子水在磁力搅拌加热器上加热至沸腾,15μL高氯金酸(14.3%)加入到 50μL沸水中,搅拌加热5min后,迅速加入5mL柠檬酸钠(1%)溶液,在搅拌 加热下进行反应。溶液颜色逐渐由浅黄变成紫色,再变成酒红色。当溶液颜色不 再改变时,继续保持溶液在搅拌状态下加热15min,关闭加热器,溶液搅拌冷却 至室温,制得的AuNPs在4℃下保存备用。制备得到的AuNPs浓度为6nM,AuNPs 和8-OHdG抗体的物质的量比为1:20混合均匀,静置12h,将8-OHdG抗体通过 抗体上的氨基端连接到AuNPs表面。
(3)氧化损伤DNA检测分析:将上述8-OHdG抗体修饰的AuNPs加入到 氧化损伤DNA修饰的CQDs溶液中,孵育30min后,8-OHdG抗体和氧化损伤 带8-OHdG的DNA进行特异性结合,使得CQDs和AuNPs的距离在10nm以内。 在波长为300nm的紫外光激发下,通过荧光分光光度计进行荧光强度测定,得到 基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法。
表面功能化处理的CQDs,用透射电子显微镜(TEM)对其进行表征,得到 结果如图2所示。CQDs在PBS溶液中具有较好的分散性,尺寸均匀,碳量子点 的平均直径为4nm。在波长为300nm的紫外光激发下,得到如图3所示的CQDs 荧光特性图。CQDs在400nm到460nm的范围内有较好的荧光特性,荧光峰值 在440nm左右。
制备得到的AuNPs及其表面利用8-OHdG抗体功能化,TEM对其形貌进行 表征后得到如图4所示的结果。经表面功能化后的AuNPs在PBS溶液中均匀分 散,尺寸均匀,平均直径为15nm。AuNPs的吸收特性如图5所示,AuNPs有较 宽的吸收谱,其中吸收峰在527nm。
将氧化损伤后带有8-OHdG的DNA固定到CQDs表面,加入经8-OHdG抗 体修饰的AuNPs,30min后进行测试,在300nm的紫外光激发下,测得不同浓 度氧化损伤的DNA后生物传感器的荧光强度,如图6所示。从图中可以看出, 随着氧化损伤DNA浓度的增加,荧光强度减弱,这是因为高浓度的氧化损伤DNA 能够结合更多的AuNPs,在激发光的激发下,发生荧光共振能量转移,测得的荧 光强度减弱。因此,进一步证明基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移 检测损伤DNA方法的成功制备。不同氧化损伤DNA浓度的荧光峰值变化如图7 所示。以荧光的峰值(y)为纵坐标,氧化损伤DNA浓度为横坐标,制作线性曲 线,线性关系公式为y=1.4006ln[x]+5.6797,线性度为0.9884。随着氧化损伤DNA 浓度的增加,荧光强度减弱。本发明中的基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振 能量转移检测氧化损伤DNA的方法能够实现氧化损伤DNA的检测分析,成本低、 简便且易于操作。
Claims (4)
1.一种基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:
(1)CQDs表面生物功能化处理:在表面氨基化的CQDs溶液中加入戊二醛,所述CQDs溶液和戊二醛的体积比为:(100~300):(1~6);静置10~40min后,加入氧化损伤DNA,4℃下保存备用;
(2)AuNPs制备和表面生物功能化处理:利用柠檬酸钠还原高氯金酸的方法制备AuNPs,8-OHdG抗体通过抗体上的氨基端连接到制备得到的AuNPs表面,AuNPs和8-OHdG抗体的物质的量比为1:10~1:50;
(3)氧化损伤DNA的测定:将8-OHdG抗体修饰的AuNPs溶液加入到氧化损伤DNA修饰的CQDs溶液中,孵育0.5~2小时后进行荧光强度测定。
2.如权利要求1所述的基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法,其特征在于:所述步骤(1)中,CQDs的浓度为25μg/mL,戊二醛的质量分数为50%,氧化损伤后带有8-OHdG的DNA的浓度范围为0pM~30μM。
3.如权利要求1或2所述的基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法,其特征在于:所述步骤(2)中,8-OHdG抗体浓度为1mg/mL,AuNPs浓度为5~10nM。
4.如权利要求1或2所述的基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤DNA的方法,其特征在于:所述步骤(3)中,每100μL~300μL CQDs溶液,戊二醛的体积为1μL~6μL,所述8-OHdG抗体修饰的AuNPs溶液的体积为10~50μL。
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He et al. | Label free and homogeneous histone sensing based on chemiluminescence resonance energy transfer between lucigenin and gold nanoparticles | |
Chen et al. | Upconversion nanoparticles with bright red luminescence for highly sensitive quantifying alkaline phosphatase activity based on target-triggered fusing reaction | |
Huang et al. | Gold nanoparticle–enzyme conjugates based FRET for highly sensitive determination of hydrogen peroxide, glucose and uric acid using tyramide reaction | |
Wang et al. | Application of indium tin oxide device in gold-coated magnetic iron solid support enhanced electrochemiluminescent immunosensor for determination of carcinoma embryonic antigen | |
Hallaj et al. | A dual-mode colorimetric and fluorometric nanosensor for detection of uric acid based on N, P co-doped carbon dots and in-situ formation of Au/Ag core-shell nanoparticles | |
Lin et al. | A click-induced fluorescence-quenching sensor based on gold nanoparticles for detection of copper (Ⅱ) ion and ascorbic acid | |
Tan et al. | Simultaneous visualization and quantitation of multiple steroid hormones based on signal‐amplified biosensing with duplex molecular recognition | |
Hamd-Ghadareh et al. | Development of three-dimensional semi-solid hydrogel matrices for ratiometric fluorescence sensing of Amyloid β peptide and imaging in SH-SY5 cells: Improvement of point of care diagnosis of Alzheimer's disease biomarker | |
Zhang et al. | Multiplex immunoassays of plant viruses based on functionalized upconversion nanoparticles coupled with immunomagnetic separation | |
Cui et al. | A significant fluorescent aptamer sensor based on carbon dots and graphene oxide for highly selective detection of progesterone | |
Shi et al. | Ratiometric persistent luminescence aptasensors for carcinoembryonic antigen detection | |
Wang et al. | Direct fluorimetric determination of γ-globulin in human serum with organic nanoparticle biosensor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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