CN107287189A - 一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺 - Google Patents

一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺 Download PDF

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肖湘文
刘淑园
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Abstract

本发明公开了一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺，其组分包括磁珠裂解结合液、磁珠液、磁珠洗涤液1、磁珠洗涤液2、磁珠洗脱液。其中，磁珠裂解结合液、磁珠液、磁珠洗涤液1、磁珠洗涤液2、磁珠洗脱液均添加有不同的指示剂，从而使得各组分具有不同的颜色。将各提取试剂组分分装到96孔深孔板中，用热封仪将热封膜封在96孔板深孔板上，防止提取试剂漏液。在进行核酸提取过程中，两种提取组分相接触时会变色。本发明让核酸提取变得更有乐趣，带给核酸提取操作者一种愉悦感，不但提高了提取效率，还降低了分装与提取过程中出差错的概率。

Description

一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺
技术领域
本发明涉及试剂配制领域，特别涉及一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺。
背景技术
目前，生命体遗传特征的基本单元是核酸，在病毒、基因研究领域都离不开对核酸的检测，而针对对核酸检测，目前普遍有PCR、测序、分子杂交等技术。这些技术的运用的关键前提是提取出核酸。
针对核酸提取，目前市面上有各种各样的提取方法：有磁珠法、柱提法、煮沸法和仪器自动提取法等。在这么多提取方法中，所用到的提取试剂几乎都是无色透明的，即使有颜色也是某一提取成分，因此在分装过程中容易出现差错，且在提取过程中，颜色保持不变，这让核酸提取过程单调、乏味，易出错，且不能根据试剂所处的颜色状态辨别出核酸提取的所处步骤。在不断重复核酸提取的过程中，慢慢让人感到疲惫，容易在核酸提取过程中，混淆提取步骤，降低了提取效率。
所以，一种带颜色的，且在提取过程中可变色的预分装提取试剂非常重要。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺，磁珠法核酸提取试剂的组分包括磁珠裂解结合液、磁珠液、磁珠洗涤液1、磁珠洗涤液2、磁珠洗脱液，其中，所述磁珠裂解结合液包括Tris-缓冲液、(NH4)2SO4、NP-40、盐酸胍、TritonX-100、异丙醇、指示剂1；所述磁珠液包括Tris-缓冲液、EDTA-2Na、磁珠、指示剂2；所述磁珠洗涤液1包括Tris-缓冲液、盐酸胍、无水乙醇、指示剂3；所述磁珠洗涤液2包括Tris-缓冲液、NaCl、无水乙醇、指示剂4；所述磁珠洗脱液包括Tris-缓冲液、EDTA-2Na、Carrier RNA、指示剂5。
进一步的，所述磁珠裂解结合液包括10-30mmol/L的Tris-缓冲液、90-110mmol/L的(NH4)2SO4、1-3%的NP-40、1.5-3.5mol/L的盐酸胍、1-3%的TritonX-100、25-30%的异丙醇、0.01-0.08mmol/L的指示剂1；所述磁珠液包括10-25mmol/L的Tris-缓冲液、5-15mmol/L的EDTA-2Na、0.3-0.8mg/ml的磁珠、0.01-0.08mmol/L的指示剂2；所述磁珠洗涤液1包括70-100mmol/L的Tris-缓冲液、90-110mmol/L的盐酸胍、30-50%的无水乙醇、0.01-0.08mmol/L的指示剂3；所述磁珠洗涤液2包括5-10mmol/L的Tris-缓冲液、0.5-1%的NaCl、60-80%的无水乙醇、0.01-0.08mmol/L的指示剂4；所述磁珠洗脱液包括10-25mmol/L的Tris-缓冲液、3-10mmol/L的EDTA-2Na、0.1-0.4μg/μl的Carrier RNA、0.01-0.08mmol/L的指示剂5。
进一步的，所述Tris-缓冲液可选自Tris-H2SO4、Tris-乙酸、Tris-HCL中的任意一种或多种，Tris-缓冲液的pH为2.0～9.0。
进一步的，所述指示剂1-5可选自甲基橙、溴百里酚蓝、酚酞、石蕊、甲基红等指示剂中的任意一种或多种。
进一步的，所述磁珠裂解结合液、磁珠液、磁珠洗涤液1、磁珠洗涤液2、磁珠洗脱液各具一种颜色，其颜色由各组分的pH决定，且所述5种组分 所具颜色互不相同。
进一步的，配制磁珠裂解结合液步骤为：配制磁珠裂解结合液步骤为：先加入一定体积的灭菌纯化水，再依次加入一定浓度的Tris-缓冲液、(NH4)2SO4、NP-40、盐酸胍、TritonX-100、异丙醇、指示剂1，搅拌至充分溶解后，加入酸溶液调至一定pH，然后用灭菌纯化水定容；配制磁珠液步骤为：先加入一定体积的灭菌纯化水，再依次加入一定浓度的Tris-缓冲液、EDTA-2Na、磁珠、指示剂2，搅拌至充分溶解后，加入酸溶液调至一定pH，然后用灭菌纯化水定容；配制磁珠洗涤液1步骤为：先加入一定体积的灭菌纯化水，再依次加入一定浓度的Tris-缓冲液、盐酸胍 、无水乙醇、指示剂3，搅拌至充分溶解后，加入酸溶液调至一定pH，然后用灭菌纯化水定容；配制磁珠洗涤液2步骤为：先加入一定体积的灭菌纯化水，再依次加入一定浓度的Tris-缓冲液、NaCl、无水乙醇、指示剂4，搅拌至充分溶解后，加入酸溶液调至一定pH，然后用灭菌纯化水定容；配制磁珠洗脱液步骤为：先加入一定体积的灭菌纯化水，再依次加入一定浓度的Tris-缓冲液、EDTA-2Na、Carrier RNA、指示剂5，搅拌至充分溶解后，加入酸溶液调至一定pH，然后用灭菌纯化水定容。
进一步的，所述酸溶液可选自硫酸、硝酸、盐酸、磷酸、乙酸等酸性溶液中的一种或多种，所加入酸溶液的pH及浓度不限。
进一步的，分装提取试剂步骤为：按250-400μl/孔的量将磁珠裂解结合液分装到96孔深孔板的第1列和第7列，按400-700μl/孔的量将磁珠液分装到96孔深孔板的第2列和第8列，按400-700μl/孔的量将磁珠洗涤液1分装到96孔深孔板的第3列和第9列，按400-700μl/孔的量将磁珠洗涤液2分装到96孔深孔板的第4、5、10、11列，按60μl/孔的量将磁珠洗脱液分装到96孔深孔板的第6列和第12列。
进一步的，封膜，利用热封仪将热封膜封在96孔深孔板上表面，防止提取试剂漏液。
进一步的，在利用上述分装好的提取试剂进行核酸提取的过程中，当两种提取试剂成分相接触时会产生特定的颜色变化，核酸提取反应完毕后，5种组分所在的反应管中的最终液体具有特定颜色，且颜色互不相同。
优选的，所述酸溶液可为盐酸，pH可为2.0，浓度可为10mmol/L，亦可选用其他酸溶液，只需保证最终能配制出各组分的标准pH即可。
优选的，所述磁珠裂解结合液为黄色，其pH为4.6，Tris-HCL浓度为20mmol/L，Tris-HCL的pH为3.5，(NH4)2SO4浓度为100mmol/L，NP-40含量为1%，盐酸胍浓度为2.5mol/L，TritonX-100含量为2%，异丙醇含量为28%，甲基橙含量为0.05%。
优选的，所述磁珠液为红色，其pH为3.0，Tris-HCL浓度为15mmol/L，Tris-HCL的pH为2.9，EDTA-2Na浓度为8mmol/L，磁珠浓度为0.5mg/ml，甲基橙含量为0.05%。
优选的，所述磁珠洗涤液1为绿色，其pH为7.0，Tris-HCL浓度为85mmol/L，Tris-HCL的pH为9.0，盐酸胍浓度为100mmol/L，无水乙醇的含量为42%，溴百里酚蓝含量为0.01%。
优选的，所述磁珠洗涤液2为蓝色，其pH为7.8，Tris-HCL浓度为8mmol/L，Tris-HCL的pH为2.0，NaCl含量为0.7%，无水乙醇的含量为70%，溴百里酚蓝含量为0.01%。
优选的，所述磁珠洗脱液为浅红色，其pH为8.5，Tris-HCL浓度为15mmol/L，Tris-HCL的pH为2.9，EDTA-2Na浓度为5mmol/L，Carrier RNA浓度为2μg/μl ，酚酞含量为0.01%。
优选的，按350μl/孔将磁珠裂解结合液分装到96孔深孔板的第1列和第7列，按600μl/孔将磁珠液分装到96孔深孔板的第2列和第8列，按600μl/孔将磁珠洗涤液1分装到96孔深孔板的第3列和第9列，按600μl/孔将磁珠洗涤液2分装到96孔深孔板的第4列和第5列、第10列、第11列，按60μl/孔将磁珠洗脱液分装到96孔深孔板的第6列和第12列。
优选的，在利用上述分装好的提取试剂进行核酸提取的过程中，当两种提取试剂成分相接触时会产生特定的颜色变化：磁珠裂解结合液由黄色变为橙色；磁珠洗涤液1颜色由绿色变为黄色；磁珠洗涤液2颜色由蓝色变为绿色；磁珠洗脱液颜色由浅红色变为无色。
本发明的有益效果：
本发明的带有颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺，其让提取试剂的每一成分都含有颜色，且在提取过程中，两种提取试剂接触时会变色，提取过程完毕后，每种提取试剂所在的反应管中的最终液体具有特定颜色，且颜色互不相同，颜色的变化可以使操作者更明显的区分出核酸提取的所处步骤，有利于在核酸提取过程中的工作交接，并使操作者通过最后的颜色观察确定反应是否完全、是否正确进行。利用试剂颜色之间的变换，能够提高分装过程的准确率，也使得操作更为得准确，并且不会出现提取过程步骤的混淆，不但提高了提取效率，还降低了出差错的概率。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容及所实现的目的，下面结合具体的实施例进行描述。
实施例1：磁珠法核酸提取试剂的制备
1、磁珠法核酸提取试剂各组分的配制：
配制磁珠裂解结合液（1L）：先加入约800ml灭菌纯化水，再按pH为3.5、浓度为20mmol/L的Tris-HCL、100mmol/L的(NH4)2SO4、1%的NP-40、2.5mol/L的盐酸胍、2%的TritonX-100、28%的异丙醇、0.05%的甲基橙的量分别加入Tris、(NH4)2SO4、NP-40、盐酸胍 、TritonX-100、异丙醇、甲基橙，搅拌至充分溶解后，加入10mmol/L的盐酸将pH调至4.6，然后用灭菌纯化水定容至1L。
配制磁珠液（1L）：先加入约800ml灭菌纯化水，再按pH为2.9、浓度为15mmol/L的Tris-HCL、8mmol/L的EDTA-2Na、0.5mg/ml的磁珠、0.05%的甲基橙的量分别加入Tris、EDTA-2Na、甲基橙，搅拌至充分溶解后，加入10mmol/L的盐酸将pH调至3.0，然后用灭菌纯化水定容至1L。
配制磁珠洗涤液1（1L）：先加入约800ml灭菌纯化水，再按pH为9.0、浓度为85mmol/L的Tris-HCL、100mmol/L的盐酸胍、42%的无水乙醇、0.01%的溴百里酚蓝的量分别加入Tris、盐酸胍 、无水乙醇、溴百里酚蓝，搅拌至充分溶解后，加入10mmol/L的盐酸将pH调至7.0，然后用灭菌纯化水定容至1L。
配制磁珠洗涤液2（1L）：先加入约800ml灭菌纯化水，再按pH为2.0、浓度为8mmol/L的Tris-HCL、0.7%的NaCl、70%的无水乙醇、0.01%的溴百里酚蓝的量分别加入Tris、NaCl 、无水乙醇、溴百里酚蓝，搅拌至充分溶解后，加入10mmol/L的盐酸将pH调至7.8，然后用灭菌纯化水定容至1L。
配制磁珠洗脱液（1L）：先加入约800ml灭菌纯化水，再按pH为2.9、浓度为15mmol/L的Tris-HCL、5mmol/L的EDTA-2Na、2μg/μl的Carrier RNA、0.01%的酚酞的量分别加入Tris、EDTA-2Na、Carrier RNA、酚酞，搅拌至充分溶解后，加入10mmol/L的盐酸将pH调至8.5，然后用灭菌纯化水定容至1L。
2、分装：
按350μl/孔将磁珠裂解结合液分装到96孔深孔板的第1列和第7列，按600μl/孔将磁珠液分装到96孔深孔板的第2列和第8列，按600μl/孔将磁珠洗涤液1分装到96孔深孔板的第3列和第9列，按600μl/孔将磁珠洗涤液2分装到96孔深孔板的第4列和第5列、第10列、第11列，按60μl/孔将磁珠洗脱液分装到96孔深孔板的第6列和第12列。
3、封膜：
利用热封仪将热封膜封在96孔深孔板上表面，防止提取试剂漏液。
实施例2：利用预分装板中的提取试剂进行核酸提取的步骤（人工操作）
①此操作在96深孔预分装板中进行，运用磁力架从第2列（第8列）吸取磁珠；
②把样品、蛋白酶k、磁力架吸附的磁珠放进第1列（第7列）进行混匀反应，此时，第1列（第7列）中的液体颜色变化为黄色→橙色；
③运用磁力架从第1列（第7列）吸取磁珠，被吸取的磁珠同时带有第1列（第7列）反应完毕的液体，通过磁力架把磁珠及第1列（第7列）反应完毕的液体放进第3列（第9列）进行混匀反应，此时，第3列（第9列）中的液体颜色变化为绿色→黄色；
④运用磁力架从第3列（第9列）吸取磁珠，被吸取的磁珠同时带有第3列（第9列）反应完毕的液体，通过磁力架把磁珠及第3列（第9列）反应完毕的液体放进第4列（第10列）进行混匀反应，此时，第4列（第10列）中的液体颜色变化为蓝色→绿色；
⑤运用磁力架从第4列（第10列）吸取磁珠，被吸取的磁珠同时带有第4列（第10列）反应完毕的液体，通过磁力架把磁珠及第4列（第10列）反应完毕的液体放进第5列（第11列）进行混匀反应，此时，第5列（第11列）中的液体颜色变化为蓝色→绿色；
⑥运用磁力架从第5列（第11列）吸取磁珠，被吸取的磁珠同时带有第5列（第11列）反应完毕的液体，通过磁力架把磁珠及第5列（第11列）反应完毕的液体放进第6列（第12列）进行混匀反应，随后运用磁力架从第6列（第12列）吸取磁珠放至第2列（第8列）中，此时，第6列（第12列）中的液体颜色变化为浅红色→无色；
⑦当核酸提取反应过程完毕，96深孔预分装板中每列颜色显示如下：
第1列（第7列）：橙色
第2列（第8列）：红色
第3列（第9列）：黄色
第4列（第10列）：绿色
第5列（第11列）：绿色
第6列（第12列）：无色
因此，本发明中特定的颜色变化有利于操作者根据试剂所处的颜色状态辨别出核酸提取的所处步骤及辨别操作过程是否有误，使得整个提取过程提取效率得以提高、降低了出差错的概率，并使分装过程准确率提高。
当然，本发明创造并不局限于上述实施方式，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做出等同变形或替换，这些等同的变形或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺，磁珠法核酸提取试剂的组分包括磁珠裂解结合液、磁珠液、磁珠洗涤液1、磁珠洗涤液2、磁珠洗脱液，其特征在于：所述磁珠裂解结合液包括Tris-缓冲液、(NH4)2SO4、NP-40、盐酸胍、TritonX-100、异丙醇、指示剂1；所述磁珠液包括Tris-缓冲液、EDTA-2Na、磁珠、指示剂2；所述磁珠洗涤液1包括Tris-缓冲液、盐酸胍、无水乙醇、指示剂3；所述磁珠洗涤液2包括Tris-缓冲液、NaCl、无水乙醇、指示剂4；所述磁珠洗脱液包括Tris-缓冲液、EDTA-2Na、Carrier RNA、指示剂5。
2.根据权利要求1所述一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺，其特征在于：
所述磁珠裂解结合液包括10-30mmol/L的Tris-缓冲液、90-110mmol/L的(NH4)2SO4、1-3%的NP-40、1.5-3.5mol/L的盐酸胍、1-3%的TritonX-100、25-30%的异丙醇、0.01-0.08mmol/L的指示剂1；
所述磁珠液包括10-25mmol/L的Tris-缓冲液、5-15mmol/L的EDTA-2Na、0.3-0.8mg/ml的磁珠、0.01-0.08mmol/L的指示剂2；
所述磁珠洗涤液1包括70-100mmol/L的Tris-缓冲液、90-110mmol/L的盐酸胍、30-50%的无水乙醇、0.01-0.08mmol/L的指示剂3；
所述磁珠洗涤液2包括5-10mmol/L的Tris-缓冲液、0.5-1%的NaCl、60-80%的无水乙醇、0.01-0.08mmol/L的指示剂4；
所述磁珠洗脱液包括10-25mmol/L的Tris-缓冲液、3-10mmol/L的EDTA-2Na、0.1-0.4μg/μl的Carrier RNA、0.01-0.08mmol/L的指示剂5。
3.根据权利要求2所述一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺，其特征在于：所述Tris-缓冲液可选自Tris-H2SO4、Tris-乙酸、Tris-HCL中的任意一种或多种，Tris-缓冲液的pH为2.0～9.0。
4.根据权利要求2所述一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺，其特征在于：所述指示剂1-5可选自甲基橙、溴百里酚蓝、酚酞、石蕊、甲基红等指示剂中的任意一种或多种。
5.根据权利要求2所述一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺，其特征在于：所述磁珠裂解结合液、磁珠液、磁珠洗涤液1、磁珠洗涤液2、磁珠洗脱液各具一种颜色，其颜色由各组分的pH决定，且所述5种组分所具颜色互不相同。
6.根据权利要求1所述一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺，其特征在于：
配制磁珠裂解结合液步骤为：先加入一定体积的灭菌纯化水，再依次加入一定浓度的Tris-缓冲液、(NH4)2SO4、NP-40、盐酸胍、TritonX-100、异丙醇、指示剂1，搅拌至充分溶解后，加入酸溶液调至一定pH，然后用灭菌纯化水定容；
配制磁珠液步骤为：先加入一定体积的灭菌纯化水，再依次加入一定浓度的Tris-缓冲液、EDTA-2Na、磁珠、指示剂2，搅拌至充分溶解后，加入酸溶液调至一定pH，然后用灭菌纯化水定容；
配制磁珠洗涤液1步骤为：先加入一定体积的灭菌纯化水，再依次加入一定浓度的Tris-缓冲液、盐酸胍 、无水乙醇、指示剂3，搅拌至充分溶解后，加入酸溶液调至一定pH，然后用灭菌纯化水定容；
配制磁珠洗涤液2步骤为：先加入一定体积的灭菌纯化水，再依次加入一定浓度的Tris-缓冲液、NaCl、无水乙醇、指示剂4，搅拌至充分溶解后，加入酸溶液调至一定pH，然后用灭菌纯化水定容；
配制磁珠洗脱液步骤为：先加入一定体积的灭菌纯化水，再依次加入一定浓度的Tris-缓冲液、EDTA-2Na、Carrier RNA、指示剂5，搅拌至充分溶解后，加入酸溶液调至一定pH，然后用灭菌纯化水定容。
7.根据权利要求6所述一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺，其特征在于：所述酸溶液可选自硫酸、硝酸、盐酸、磷酸、乙酸等酸性溶液中的一种或多种，所加入酸溶液的pH及浓度不限。
8.根据权利要求1所述一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺，其特征在于：分装提取试剂步骤为：按250-400μl/孔的量将磁珠裂解结合液分装到96孔深孔板的第1列和第7列，按400-700μl/孔的量将磁珠液分装到96孔深孔板的第2列和第8列，按400-700μl/孔的量将磁珠洗涤液1分装到96孔深孔板的第3列和第9列，按400-700μl/孔的量将磁珠洗涤液2分装到96孔深孔板的第4、5、10、11列，按60μl/孔的量将磁珠洗脱液分装到96孔深孔板的第6列和第12列。
9.根据权利要求1所述一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺，其特征在于：封膜，利用热封仪将热封膜封在96孔深孔板上表面，防止提取试剂漏液。
10.根据权利要求1-9中任一权利要求所述一种带颜色的核酸提取试剂预分装板的配制工艺，其特征在于：在利用上述分装好的提取试剂进行核酸提取的过程中，当两种提取试剂成分相接触时会产生特定的颜色变化，核酸提取反应完毕后，5种组分所在的反应管中的最终液体具有特定颜色，且5种组分所在的反应管中的最终液体颜色互不相同。
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CN106754880A (zh) * 2016-12-26 2017-05-31 广州和实生物技术有限公司 尿液核酸快速提取试剂盒

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