CN107286071A - 一种从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，包括将胆囊破裂后提出胆汁，经过滤去杂得胆汁，所得胆汁通过碱化处理后进行离心处理，收集过滤液，过滤液直接喷干后得干粉，干粉加混合溶剂，在亚临界条件下萃得到含脂浸膏和脱脂粉末；含脂浸膏加入丙酮回流萃取，收集滤液和滤渣，滤液经蒸发浓缩后用于提取胆固醇，滤渣回收用于提取卵磷脂；脱脂粉末加水和二氯甲烷后形成萃取液，经萃取得上层悬浮液和下层红色液，下层红色液用于提取胆红素，上层悬浮液用于提取胆酸。采用本发明所述的方法，在提取胆红素和胆酸同时，还能联产提取胆固醇和卵磷脂，实现胆汁综合利用，有利于节约资源和降低能耗，可推动行业持续性发展。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法。
背景技术
胆汁是在胆道中流动的一种特殊的体液，由哺乳动物肝脏分泌产生。在肝脏中形成后经胆囊管进入胆囊，并在那里储存起来；进食后从胆囊中释放出来，消化食物中的脂肪和类脂。胆汁中极大部分是水(约占97％)，在水中溶有许多种物质，其中包括能帮助脂肪消化和吸收的胆汁酸(约占2.5％)，以及与消化无关的肝的***物胆红素(约占0.4％)。此外，胆汁中含有磷脂、胆固醇、钠、钾、钙、磷酸盐、碳酸盐以及极少量蛋白质等成分。
胆酸别名三羟基胆烷酸、三羟基胆甾烷酸、环孢素等，属于固醇类，具有乳化脂肪，促进消化，利胆、镇咳、祛痰、平喘等功效；胆红素是胆汁色素的一种，别名胆深素、胆红质等，虽然有一定毒性，但是具有镇静、镇惊、解热、降压、抑制癌瘤、灭活脑炎病毒、抗氧化、促进红血球再生等功效；胆固醇别名胆甾醇，可用于乳化剂，是合成牛黄、维生素B、化妆品、激素的重要原料；卵磷脂简称PC，与蛋白、维生素并列为第三“营养物质”，是血管的“清道夫”，肝脏的“保护神”，糖尿病的“康复品”，并有减缓记忆力衰退、清除毒素、化解胆结石的功效。
其中胆酸、胆固醇和胆红素均是合成人工牛黄的重要原料。因为天然牛黄极少，远远满足不了市场需求，随着体外模拟牛黄结石技术的推广，对于胆酸、胆固醇和胆红素的需求必然是“水涨船高”。 因为多以动物的胆汁为原料提取，云贵是全国重要的牛羊养殖区域，牛羊的胆汁资源比较丰富，然而以上产品在云贵尚属空白，所以研发从牛羊胆汁中综合提取胆固醇、卵磷脂、胆酸和胆红素的优化工艺，对于发展云贵特色的生物产业有着积极的意义。
目前现行综合提取胆红素和胆酸主要有两种途径，一是加入氢氧化钙提取胆红素钙盐沉淀，滤液再酸化提取胆酸沉淀，然后分别纯化；二是弱酸性条件下以氯仿或者二氯甲烷萃取胆红素，萃取余液再强酸条件沉淀胆酸，然后分别纯化。采用现行的工艺方法普遍存在如下问题：一是胆汁中脂肪酸、卵磷脂、胆固醇含量较多，对于提取胆红素和胆酸的收率和纯度影响较大，更没有考虑卵磷脂、胆固醇的回收；二是胆红素的纯化主要采用强酸性条件以二氯甲烷萃取，不仅杂质去除不完全，而且很容易促使胆红素异构化；三是胆酸的纯化主要采用反复结晶和活性炭处理，过程繁琐，流失较多，并缺少去除去氧胆酸杂质的有效措施。由此可见现有的工艺方法提取胆红素和胆酸的收率和纯度均不是很理想。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，应用此种方法通过对胆汁碱化处理后，并以亚临界萃取技术分离并回收胆固醇和卵磷脂，不仅回收了胆固醇和卵磷脂，而且使胆红素和胆酸的收率和纯度得以提高，其产品可以用于制备人工牛黄等药物，为制药行业提供必要的原料，解决市场供需缺口大的矛盾。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将新鲜或冷冻的待处理胆囊破裂后，提出胆汁，经过滤去杂后得胆汁，再所得胆汁中加入胆汁量的1%亚硫酸钠和0.2%EDTA钠盐进行碱化处理，并加热至70℃，然后再加10%的氢氧化钠溶液调节pH值至10.5，之后再加热至85℃,并保温10min，最后将所得碱化液进行离心处理，收集过滤液，所述过滤液直接喷干后得干粉，其中在喷干过程中控制进风温度为170℃，出风温度为85℃；
(2)将步骤(1)中所得的干粉加入混合溶剂，在亚临界条件下萃取1～3次得到含脂浸膏和脱脂粉末；
(3)将步骤(2)中所得的含脂浸膏加入丙酮进行回流萃取，收集滤液和滤渣，所述滤液经蒸发浓缩后用于提取胆固醇，所述滤渣回收用于提取卵磷脂；
(4)将步骤(2)中所得的脱脂粉末加入水和二氯甲烷，在常温条件下搅拌均匀后形成萃取液，经静置分层后，分别收集上层悬浮液和下层红色液，并对收集的上层悬浮液再加入二氯甲烷进行萃取2～4次，萃取至上层悬浮液接近无色为止，收集的萃取液合并下层红色液用于提取胆红素，剩余的上层悬浮液用于提取胆酸。
进一步地，所述的从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，其中所述步骤(2)中的混合溶剂由丙烷、丁烷和***按重量比1:1.5:1.5组成，加入混合溶剂后，在亚临界条件下萃取2～3次得到含脂浸膏和脱脂粉末。
进一步地，所述的从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，其中所述步骤(2)中的亚临界条件，指在常温条件下，萃取压力为5Mpa，萃取时间为3h。
进一步地，所述的从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，其中所述步骤(3)中提取胆固醇具体包括以下步骤：
(1)将所收集的含脂浸膏中加入3倍量的丙酮进行回流萃取，萃取温度为45～50℃，萃取时间为6～8h，分别收集滤液和滤渣；
(2)将步骤(1)中所得的滤液加热至60℃进行蒸发浓缩回收丙酮，并得呈黄色状的浓缩液；
(3)将步骤(2)中所得的浓缩液加入混合溶剂和甲醇钠混合后进行回流醇解，经醇解后过滤去杂，收集滤液；
(4)将步骤(3)中所得的滤液加10%的硫酸调节pH值在5～6之间，然后加入滤液量0.3%的活性炭进行吸附，在温度为50℃条件下回流吸附，回流吸附时间≥0.5h，然后过滤去杂，收集滤液；对收集的滤液再次调节pH值在1～2之间，在温度为50℃条件下回流酸化，回流酸化时间≥4h，经过滤去杂后收集滤液；
(5)将步骤(4)中所得的滤液进行真空蒸发回收混合溶剂，收集的浓缩液加3倍量的水稀释并降至常温，经过滤后取沉淀物，并用水反复洗涤至中性，最后将沉淀物过滤沥干；
(6)将步骤(5)中所得的沉淀物再加10倍量乙醇进行回流溶解，回流溶解温度≥50℃，回流溶解时间为1h，然后将溶解液降温至≤5℃条件下进行结晶，过滤取结晶体，最后将结晶体洗涤后，在温度为70～80℃条件下进行真空干燥，即得精品胆固醇，并避光密封保存。
进一步地，所述的从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，其中所述步骤(3)中所加入的混合溶剂由乙醇与正己烷按其重量比1:1.5组成，其加入量为浓缩液5倍量的混合溶剂和6%的甲醇钠，经充分混合后进行回流醇解，其中醇解温度为50℃，醇解时间≤1h，经醇解后过滤去杂，收集滤液。
进一步地，所述的从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，其中所述步骤(3)中提取卵磷脂具体包括以下步骤：
(1)将在所收集的滤渣中加入3倍量的85%乙醇进行回流溶解，回流溶解温度≥50℃，回流溶解时间为1h，然后将溶解液过滤，收集滤液；
(2)将步骤(1)中所得的滤液以10%盐酸调节pH值至5，然后加入滤液量0.3%的活性炭进行吸附，在温度为50℃条件下回流吸附，回流吸附时间≥0.5h，然后过滤去杂，收集滤液降至常温后，再以10%氢氧化钠调节pH值至7，再经过氧化铝层析柱吸附至终点，收集滤液；
(3)将步骤(2)中所得的滤液以浓度95%的乙醇在常温条件下进行洗脱，洗脱后收取204nm处有吸收值的活性洗脱液；
(4)将步骤(3)中所得活性洗脱液调节pH值至7，在温度为45℃条件下进行真空蒸发浓缩，回收乙醇，经浓缩后得浓缩液，在所得浓缩液中加少量丙酮和水进行洗涤后再进行离心脱水处理后，得沉淀物；
(5)将步骤(4)中所得沉淀物在温度为40～50℃条件下进行真空干燥，即得精品卵磷脂，并避光密封保存。
进一步地，所述的从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，其中所述步骤(4)中提取胆红素具体包括以下步骤：
(1)将所收集的脱脂粉末中加入2倍量的水和二氯甲烷，在常温条件下搅拌萃取0.5h后，形成均匀后形成萃取液，再加入1%的亚硫酸钠溶解，用10%的盐酸调节pH值至4，并避光静置萃取分层，分取上层悬浮液和下层红色液；并对收集的上层悬浮液再加入1倍量的二氯甲烷进行萃取2～4次，萃取至上层悬浮液接近无色为止，收集萃取液并合并下层红色液，得红色混合液；
(2)将步骤(1)中所收集的红色混合液加入0.2%活性炭，在常温条件下避光搅拌0.5h，过滤去杂后，收集滤液；
(3)将步骤(2)中所收集的滤液在温度为40℃条件下进行真空蒸发浓缩，回收二氯甲烷，经浓缩后得浓缩液，在所得浓缩液中加水稀释至沉淀析出，避光并静置至沉淀物完全沉淀析出后，过滤收取沉淀物；
(4)将步骤(3)中所收集的沉淀物加入少量乙醇反复洗涤3～4次，然后再加少量甲醇反复洗涤3～4次，过滤后收取滤液并沥干；
(5)将步骤(4)中所得的沉淀物在温度≤40℃条件下进行真空干燥，即得精品胆红素，并避光密封保存。
进一步地，所述的从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，其中所述步骤(4)中提取胆酸具体包括以下步骤：
(1)将收集的上层悬浮液加入其重量10%的氢氧化钠和0.2%的甲醇钠进行破碱解液，经搅拌溶解后，加热升温至90～95℃，碱解时间为≥6h，其中在温度为40℃时开始回收液体中的二氯甲烷；二氯甲烷回收后，将碱解液降至常温，用10%的盐酸调节pH值至6，静置放置≥2h后，当沉淀物完全析出后，进行离心处理，收取清液；收取的清液中再用10%的盐酸调节pH值在2～3之间，静置放置≥2h后，当沉淀物完全析出后，进行离心处理，收取沉淀物；
(2)将步骤(1)中所收集的沉淀物加入4倍量的75%乙醇，并调节pH值至3，并加入3%的活性炭，在温度为50℃条件下回流吸附，回流吸附时间≥1h，离心过滤；收集滤液再经过聚苯乙烯凝胶层析柱吸附，再以90%乙醇洗脱，洗脱后收取460nm处有吸收值的活性乙醇洗脱液；
(3)将步骤(2)中所收取活性乙醇洗脱液在温度≥80℃条件下进行蒸发回收乙醇，其浓缩液降温至≤5℃后，静放20～30h后，过滤收取沉淀物；
(4)将步骤(3)中所收取沉淀物加入少量90%乙醇反复洗涤2～3次，过滤后收取滤液并沥干；
(5)将步骤(4)中所得的沉淀物在温度为70～80℃条件下进行真空干燥，即得精品胆酸，并密封包装。
采用本发明所述的一种从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，与现有技术相比，其有益效果在于：通过对胆汁碱化处理后，并以亚临界萃取技术分离并回收胆固醇和卵磷脂；胆红素提取过程中采取多种措施防止异构化，并增加了EDTA保护和活性炭脱色脱杂处理，胆酸提取过程中增加了甲醇钠为催化剂，采取了去除去氧胆酸的措施，通过一次性结晶方式以减少流失。其最大的特点是在提取胆红素和胆酸同时，还能联产提取胆固醇和卵磷脂，实现胆汁的综合利用，胆红素和胆酸的收率和纯度比较高。具有资源利用率高，附加值高，具有提取率高、吸附选择性好、产品纯度高、工艺简单、污染小、环保容易达标等优点，经济效益显著，所以技术竞争优势十分明显，有利于节约资源和降低能耗，可推动行业持续性发展。
具体实施方式
为了更充分的解释本发明的实施，以下结合具体实施例来进一步说明本发明。所举实例只用于解释本发明，而不是限定本发明的范围。
采用本发明所述从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇和卵磷脂，其设计依据包括以下内容：
一、胆汁成分
胆汁为肝脏分泌形成肝胆汁，消化时经过胆管排入十二指肠，一般不易收集，而且有效成分相对较低；多余的肝胆汁经过胆管排入胆囊储存，并经过胆囊的浓缩形成囊胆汁，有效成分是肝胆汁的10倍左右，故以囊胆汁作为原料为宜。牛、羊囊胆汁分别为80、30ml左右，pH=6.8，有效成分含量依种属、年龄、产地、季节而有差异，一般水分80%、胆酸类13%、胆红素0.1%、胆固醇1.5%、卵磷脂0.35%、黏蛋白2.5%、脂肪酸1.5%、无机盐1%。其中胆酸类由胆固醇经肝脏代谢而产生，是胆酸、去氧胆酸、去氢胆酸的总称，几乎全部与甘氨酸或者牛磺酸形成结合型，而且以牛磺酸结合型居多，并多以钠盐的形式存在，胆酸以牛、羊、狗胆汁丰富，去氧胆酸以猪、家禽胆汁丰富；其中胆红素是由血红素代谢而生成，在胆汁中多与葡萄糖醛酸结合形成可溶性胆红素酯，以乳牛、狗胆汁含量丰富，猪、非乳牛次之，羊、家禽胆汁多含胆绿素；其中黏蛋白主要是分子量为67KD、55KD、28KD、64KD、13KD的蛋白；其中胆固醇多与脂肪结合为酯，卵磷脂多以游离型存在；其中无机盐主要是锌、铁、钾、钠盐。
二、理化性质
胆固醇相分子量386.84，几乎不溶解于水、酸和弱碱溶液（0.2mg/100ml），而微溶于冷乙醇（20℃，1.29g/100ml），可溶于热乙醇（80℃，28g/100ml），易溶于石油醚、丙酮、乙酸乙酯、己烷、苯、氯仿、油脂和胆酸盐溶液中；在空气中能缓慢氧化而颜色发黄，熔点和溶解度随之变化。
卵磷脂广义上是磷脂的的混合物，分子量为500～900，含磷酸基和胆碱，PL=6.7，为两性电解质物质，可与蛋白、多糖、酸碱盐结合，发生乳化；不溶于水、丙酮等强极性溶剂，易溶于乙醇、***、苯、氯仿、石油醚等弱极性溶剂；也溶于动植物油脂及脂肪酸中；有水条件下接触空气、光照、高温，易氧化酸败色加深；碱性乙醇或者水中加热易皂化，酸性水溶液中加热易水解；可被磷脂酶催化分解为“溶血磷脂”；可被硫酸、氯磺酸磺化而碳化；
胆酸的相对分子量为408.6，既有羟基、羧基和磺酸基等亲水集团，又有甲基、甾体核等疏水集团；一般难溶于水，微溶于***、氯仿、油脂，可溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯，易溶于醋酸；胆酸盐易溶于中性和碱性水，酸化后游离并沉淀析出。
胆红素多与葡萄糖醛酸结合为酯，分子量937，为弱酸性，带负电荷，溶于水；游离型分子量584.7，不溶于水和***，溶于油脂、氯仿、二氯甲烷、苯和稀碱溶液，微溶于乙醇、乙酸乙酯和丙酮，但是加热可提高溶解度；碱性条件下遇3价铁离子易氧化为胆绿素，含水胆红素易被氧化剂破坏，加适量亚硫酸钠、Vc等还原剂和EDTA可提高稳定性；但游离型钠盐溶于水，不溶于氯仿和二氯甲烷，钙、镁、钡盐不溶于水。
三、实施例
本发明以牛、羊的胆囊为原料，提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，包括有以下步骤：
采用本发明所述方法，首先需要对原料进行预处理，由于胆汁中含有相当数量的磷脂和胆固醇与油脂混溶，如果不预先去除，必将影响胆酸和胆红素的提取收率和纯度，为此选择既能溶解卵磷脂和胆固醇，又不能溶解胆酸和胆红素的丙烷+丁烷+***为混合溶剂，并以亚临界常温萃取方式为宜。其混合溶剂能够循环使用，低毒，相比二氧化碳超临界萃取设备投资少，成本低。
具体处理方法包括以下步骤：
(1)将新鲜或冷冻的待处理的牛、羊胆囊破裂后，提出胆汁，经过滤去杂后得胆汁，再所得胆汁中加入胆汁量的1%亚硫酸钠和0.2%EDTA钠盐进行碱化处理，并加热至70℃，然后再加10%的氢氧化钠溶液调节pH值至10.5，之后再加热至85℃,并保温10min，最后将所得碱化液进行离心处理，收集过滤液，所述过滤液直接喷干后得干粉，其中在喷干过程中控制进风温度为170℃，出风温度为85℃；
(2)将步骤(1)中所得的干粉加入混合溶剂，在亚临界条件下萃取2～3次得到含脂浸膏和脱脂粉末；其中所述混合溶剂由丙烷、丁烷和***按重量比1:1.5:1.5组成，所述亚临界条件，指在常温条件下，萃取压力为5Mpa，萃取时间为3h。
(3)将步骤(2)中所得的含脂浸膏加入丙酮进行回流萃取，收集滤液和滤渣，所述滤液经蒸发浓缩后用于提取胆固醇，所述滤渣回收用于提取卵磷脂；
(4)将步骤(2)中所得的脱脂粉末加入水和二氯甲烷，在常温条件下搅拌均匀后形成萃取液，经静置分层后，分别收集上层悬浮液和下层红色液，并对收集的上层悬浮液再加入二氯甲烷进行萃取2～4次，萃取至上层悬浮液接近无色为止，收集的萃取液合并下层红色液用于提取胆红素，剩余的上层悬浮液用于提取胆酸。
采用本发明所述方法在胆固醇提取过程中，含脂浸膏经过丙酮萃取后，因为胆固醇易溶，卵磷脂不溶，可达到分离，但是残留油脂也多溶解，而且部分胆固醇仍然与脂肪结合为酯，为此有必要再脱脂处理。脱脂可采取皂化或者醇解处理，以后者的脱脂率高，99%的胆固醇可转为游离型，混合溶剂可回收循环使用。其中甲醇钠起到碱化和催化作用；乙醇/正己烷=0.4/0.6的混合溶剂对于胆固醇的溶解度最高；油脂分解为水溶性的低级脂肪酸钠和甘油。醇解液通过活性炭处理，可去除弱极性杂质和脱色；再酸化处理可使胆固醇脱钠游离，并使残留的胆酸沉淀去除；通过蒸发溶剂和加水稀释，利用胆固醇的水不溶性，得到胆固醇沉淀，并可去除水溶性杂质；再水洗涤，可去除吸藏的残留杂质；再利用胆固醇在热、冷乙醇中溶解度的差异性，使胆固醇结晶，可去除醇溶性杂质。
提取胆固醇的方法具体包括以下步骤：
(1)将所收集的含脂浸膏中加入3倍量的丙酮进行回流萃取，萃取温度为45～50℃，萃取时间为6～8h，分别收集滤液和滤渣；
(2)将步骤(1)中所得的滤液加热至60℃进行蒸发浓缩回收丙酮，并得呈黄色状的浓缩液；
(3)将步骤(2)中所得的浓缩液加入5倍量的混合溶剂和6%的甲醇钠，经充分混合后进行回流醇解，其中醇解温度为50℃，醇解时间≤1h，经醇解后过滤去杂，收集滤液，其中所述混合溶剂由乙醇与正己烷按其重量比1:1.5组成；
(4)将步骤(3)中所得的滤液加10%的硫酸调节pH值在5～6之间，然后加入滤液量0.3%的活性炭进行吸附，在温度为50℃条件下回流吸附，回流吸附时间≥0.5h，然后过滤去杂，收集滤液；对收集的滤液再次调节pH值在1～2之间，在温度为50℃条件下回流酸化，回流酸化时间≥4h，经过滤去杂后收集滤液；
(5)将步骤(4)中所得的滤液进行真空蒸发回收混合溶剂，收集的浓缩液加3倍量的水稀释并降至常温，经过滤后取沉淀物，并用水反复洗涤至中性，最后将沉淀物过滤沥干；
(6)将步骤(5)中所得的沉淀物再加10倍量乙醇进行回流溶解，回流溶解温度≥50℃，回流溶解时间为1h，然后将溶解液降温至≤5℃条件下进行结晶，过滤取结晶体，最后将结晶体洗涤后，在温度为70～80℃条件下进行真空干燥，即得精品胆固醇，并避光密封保存。
采用本发明所述方法在卵磷脂提取过程中，当浸膏经过丙酮萃取的滤渣再经过乙醇萃取，因为卵磷脂易溶，而蛋白等亲水性杂质不溶，可达到分离的目的。乙醇萃取液经过活性炭吸附，可脱色和去除弱极性杂质；再经过氧化铝层析，可进一步纯化和脱盐。洗脱液蒸发回收乙醇，浓缩液再利用丙酮不溶解卵磷脂的性质，进一步去除脂溶性残留杂质，并使卵磷脂沉析出来，其中丙酮经过干燥容易挥发，不易残留。
在卵磷脂提取制备过程中，具体操作方法包括以下步骤：
(1)将在所收集的滤渣中加入3倍量的85%乙醇进行回流溶解，回流溶解温度≥50℃，回流溶解时间为1h，然后将溶解液过滤，收集滤液；
(2)将步骤(1)中所得的滤液以10%盐酸调节pH值至5，然后加入滤液量0.3%的活性炭进行吸附，在温度为50℃条件下回流吸附，回流吸附时间≥0.5h，然后过滤去杂，收集滤液降至常温后，再以10%氢氧化钠调节pH值至7，再经过氧化铝层析柱吸附至终点，收集滤液；
(3)将步骤(2)中所得的滤液以浓度95%的乙醇在常温条件下进行洗脱，洗脱后收取204nm处有吸收值的活性洗脱液；
(4)将步骤(3)中所得活性洗脱液调节pH值至7，在温度为45℃条件下进行真空蒸发浓缩，回收乙醇，经浓缩后得浓缩液，在所得浓缩液中加少量丙酮和水进行洗涤后再进行离心脱水处理后，得沉淀物；
(5)将步骤(4)中所得沉淀物在温度为40～50℃条件下进行真空干燥，即得精品卵磷脂，并避光密封保存。
采用本发明所述方法在胆红素提取过程中，由于脱脂粉末中胆红素已经转为为游离型钠盐，以在氯仿中的溶解度最高，二氯甲烷次之，但氯仿的毒性高，价格高，污染高，所以选择二氯甲烷为萃取溶剂为宜；经过酸化脱钠，胆红素易溶，胆酸难溶，可达到分离的目的，且按少量多次原则萃取，才能萃取完全。之所以没有采取钙盐沉淀法，是因为脂肪酸、胆固醇、卵磷脂的干扰已经基本去除，此时胆红素萃取的收率大于钙盐沉淀法。萃取液经过活性炭吸附杂质和色素，可使胆红素纯度大大提升；但是加入过量则收率降低，以0.2%为宜，收率≥90%。因为二氯甲烷的沸点低，所以可低温蒸发回收，浓缩液再加入少量水稀释，既降低温度，又有利降低胆红素的溶解性，使胆红素很容易沉析出来，沉淀以无水乙醇洗涤可去除残留的胆酸，再以甲醇洗涤可去除残留的胆绿素和胆固醇，因为胆红素≥40℃容易分解，而且对光敏感，所以干燥选择避光，≤40℃真空干燥。
在胆红素提取制备过程中，具体操作方法包括以下步骤：
(1)将所收集的脱脂粉末中加入2倍量的水和二氯甲烷，在常温条件下搅拌萃取0.5h后，形成均匀后形成萃取液，再加入1%的亚硫酸钠溶解，用10%的盐酸调节pH值至4，并避光静置萃取分层，分取上层悬浮液和下层红色液；并对收集的上层悬浮液再加入1倍量的二氯甲烷进行萃取2～4次，萃取至上层悬浮液接近无色为止，收集萃取液并合并下层红色液，得红色混合液；
(2)将步骤(1)中所收集的红色混合液加入0.2%活性炭，在常温条件下避光搅拌0.5h，过滤去杂后，收集滤液；
(3)将步骤(2)中所收集的滤液在温度为40℃条件下进行真空蒸发浓缩，回收二氯甲烷，经浓缩后得浓缩液，在所得浓缩液中加水稀释至沉淀析出，避光并静置至沉淀物完全沉淀析出后，过滤收取沉淀物；
(4)将步骤(3)中所收集的沉淀物加入少量乙醇反复洗涤3～4次，然后再加少量甲醇反复洗涤3～4次，过滤后收取滤液并沥干；
(5)将步骤(4)中所得的沉淀物在温度≤40℃条件下进行真空干燥，即得精品胆红素，并避光密封保存。
采用本发明所述方法在胆酸提取过程中，因为二氯甲烷的比重大于水，而且仅与水微溶，又因为胆酸在二氯甲烷中的溶解度低，所以萃取胆红素的上层悬浮液主要含胆酸。大部分胆酸仍然多与甘氨酸或者牛磺酸为结合型，所以应对其碱化使之水解成为游离型；考虑碱化需要加热，所以可与蒸发回收二氯甲烷同步进行，其中甲醇钠起到催化碱解作用。如果不进行碱化处理，可得到牛磺胆酸。碱解液调节pH在6～6.2之间，去氧胆酸沉淀可过滤去除；再酸化可使胆酸脱钠，因为脱钠的游离胆酸不溶解于水，所以可沉析分离，并可去除大部分盐等水溶性杂质。胆酸沉淀易溶解于升温的乙醇中，而黏蛋白不溶，并同步经过活性炭吸附，可脱色和去除弱极性杂质；再经过聚苯乙烯凝胶层析，可去除分子量大于胆酸的杂质并脱盐，其中凝胶层析又称分子筛过滤，关键是选择适宜分离胆酸分子量而且适宜有机相操作的凝胶，凝胶经过充分溶胀后才能使用，一般不需要再生。洗脱液蒸发回收乙醇后，因为胆酸难溶解于水，可沉淀析出。
在胆酸提取制备过程中，具体操作方法包括以下步骤：
(1)将收集的上层悬浮液加入其重量10%的氢氧化钠和0.2%的甲醇钠进行破碱解液，经搅拌溶解后，加热升温至90～95℃，碱解时间为≥6h，其中在温度为40℃时开始回收液体中的二氯甲烷；二氯甲烷回收后，将碱解液降至常温，用10%的盐酸调节pH值至6，静置放置≥2h后，当沉淀物完全析出后，进行离心处理，收取清液；收取的清液中再用10%的盐酸调节pH值在2～3之间，静置放置≥2h后，当沉淀物完全析出后，进行离心处理，收取沉淀物；
(2)将步骤(1)中所收集的沉淀物加入4倍量的75%乙醇，并调节pH值至3，并加入3%的活性炭，在温度为50℃条件下回流吸附，回流吸附时间≥1h，离心过滤；收集滤液再经过聚苯乙烯凝胶层析柱吸附，再以90%乙醇洗脱，洗脱后收取460nm处有吸收值的活性乙醇洗脱液；
(3)将步骤(2)中所收取活性乙醇洗脱液在温度≥80℃条件下进行蒸发回收乙醇，其浓缩液降温至≤5℃后，静放20～30h后，过滤收取沉淀物；
(4)将步骤(3)中所收取沉淀物加入少量90%乙醇反复洗涤2～3次，过滤后收取滤液并沥干；
(5)将步骤(4)中所得的沉淀物在温度为70～80℃条件下进行真空干燥，即得精品胆酸，并密封包装。
采用本发明所述的从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，与现行工艺方法相比较，具体如下表所示：
说明：因为质量的差异性，特别是有效成分的纯度不同，则同一种产品的市场价格区间很大。为保守起见，以上价格均以最低价格进行估算，其中：胆固醇580～1400元/kg；卵磷脂300～1200元/kg；胆红素3～5万元/kg；胆酸800～1500元/kg。
通过对比可知，采用本发明所述的工艺方法，其最大的特点是在提取胆红素和胆酸同时，还能联产提取胆固醇和卵磷脂，实现胆汁的综合利用，胆红素和胆酸的收率和纯度比较高。具有资源利用率高，附加值高，具有提取率高、吸附选择性好、产品纯度高、工艺简单、污染小、环保容易达标等优点，经济效益显著，所以技术竞争优势十分明显，有利于节约资源和降低能耗，可推动行业的持续性发展。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效替换或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将新鲜或冷冻的待处理胆囊破裂后，提出胆汁，经过滤去杂后得胆汁，再所得胆汁中加入胆汁量的1%亚硫酸钠和0.2%EDTA钠盐进行碱化处理，并加热至70℃，然后再加10%的氢氧化钠溶液调节pH值至10.5，之后再加热至85℃,并保温10min，最后将所得碱化液进行离心处理，收集过滤液，所述过滤液直接喷干后得干粉，其中在喷干过程中控制进风温度为170℃，出风温度为85℃；
(2)将步骤(1)中所得的干粉加入混合溶剂，在亚临界条件下萃取1～3次得到含脂浸膏和脱脂粉末；
(3)将步骤(2)中所得的含脂浸膏加入丙酮进行回流萃取，收集滤液和滤渣，所述滤液经蒸发浓缩后用于提取胆固醇，所述滤渣回收用于提取卵磷脂；
(4)将步骤(2)中所得的脱脂粉末加入水和二氯甲烷，在常温条件下搅拌均匀后形成萃取液，经静置分层后，分别收集上层悬浮液和下层红色液，并对收集的上层悬浮液再加入二氯甲烷进行萃取2～4次，萃取至上层悬浮液接近无色为止，收集的萃取液合并下层红色液用于提取胆红素，剩余的上层悬浮液用于提取胆酸。
2.根据权利要求1所述的从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的混合溶剂由丙烷、丁烷和***按重量比1:1.5:1.5组成，加入混合溶剂后，在亚临界条件下萃取2～3次得到含脂浸膏和脱脂粉末。
3.根据权利要求2所述的从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的亚临界条件，指在常温条件下，萃取压力为5Mpa，萃取时间为3h。
4.根据权利要求1所述的从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，其特征在于，所述步骤(3)中提取胆固醇具体包括以下步骤：
(1)将所收集的含脂浸膏中加入3倍量的丙酮进行回流萃取，萃取温度为45～50℃，萃取时间为6～8h，分别收集滤液和滤渣；
(2)将步骤(1)中所得的滤液加热至60℃进行蒸发浓缩回收丙酮，并得呈黄色状的浓缩液；
(3)将步骤(2)中所得的浓缩液加入混合溶剂和甲醇钠混合后进行回流醇解，经醇解后过滤去杂，收集滤液；
(4)将步骤(3)中所得的滤液加10%的硫酸调节pH值在5～6之间，然后加入滤液量0.3%的活性炭进行吸附，在温度为50℃条件下回流吸附，回流吸附时间≥0.5h，然后过滤去杂，收集滤液；对收集的滤液再次调节pH值在1～2之间，在温度为50℃条件下回流酸化，回流酸化时间≥4h，经过滤去杂后收集滤液；
(5)将步骤(4)中所得的滤液进行真空蒸发回收混合溶剂，收集的浓缩液加3倍量的水稀释并降至常温，经过滤后取沉淀物，并用水反复洗涤至中性，最后将沉淀物过滤沥干；
(6)将步骤(5)中所得的沉淀物再加10倍量乙醇进行回流溶解，回流溶解温度≥50℃，回流溶解时间为1h，然后将溶解液降温至≤5℃条件下进行结晶，过滤取结晶体，最后将结晶体洗涤后，在温度为70～80℃条件下进行真空干燥，即得精品胆固醇，并避光密封保存。
5.根据权利要求4所述的从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所加入的混合溶剂由乙醇与正己烷按其重量比1:1.5组成，其加入量为浓缩液5倍量的混合溶剂和6%的甲醇钠，经充分混合后进行回流醇解，其中醇解温度为50℃，醇解时间≤1h，经醇解后过滤去杂，收集滤液。
6.根据权利要求1所述的从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，其特征在于，所述步骤(3)中提取卵磷脂具体包括以下步骤：
(1)将在所收集的滤渣中加入3倍量的85%乙醇进行回流溶解，回流溶解温度≥50℃，回流溶解时间为1h，然后将溶解液过滤，收集滤液；
(2)将步骤(1)中所得的滤液以10%盐酸调节pH值至5，然后加入滤液量0.3%的活性炭进行吸附，在温度为50℃条件下回流吸附，回流吸附时间≥0.5h，然后过滤去杂，收集滤液降至常温后，再以10%氢氧化钠调节pH值至7，再经过氧化铝层析柱吸附至终点，收集滤液；
(3)将步骤(2)中所得的滤液以浓度95%的乙醇在常温条件下进行洗脱，洗脱后收取204nm处有吸收值的活性洗脱液；
(4)将步骤(3)中所得活性洗脱液调节pH值至7，在温度为45℃条件下进行真空蒸发浓缩，回收乙醇，经浓缩后得浓缩液，在所得浓缩液中加少量丙酮和水进行洗涤后再进行离心脱水处理后，得沉淀物；
(5)将步骤(4)中所得沉淀物在温度为40～50℃条件下进行真空干燥，即得精品卵磷脂，并避光密封保存。
7.根据权利要求1所述的从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，其特征在于，所述步骤(4)中提取胆红素具体包括以下步骤：
(1)将所收集的脱脂粉末中加入2倍量的水和二氯甲烷，在常温条件下搅拌萃取0.5h后，形成均匀后形成萃取液，再加入1%的亚硫酸钠溶解，用10%的盐酸调节pH值至4，并避光静置萃取分层，分取上层悬浮液和下层红色液；并对收集的上层悬浮液再加入1倍量的二氯甲烷进行萃取2～4次，萃取至上层悬浮液接近无色为止，收集萃取液并合并下层红色液，得红色混合液；
(2)将步骤(1)中所收集的红色混合液加入0.2%活性炭，在常温条件下避光搅拌0.5h，过滤去杂后，收集滤液；
(3)将步骤(2)中所收集的滤液在温度为40℃条件下进行真空蒸发浓缩，回收二氯甲烷，经浓缩后得浓缩液，在所得浓缩液中加水稀释至沉淀析出，避光并静置至沉淀物完全沉淀析出后，过滤收取沉淀物；
(4)将步骤(3)中所收集的沉淀物加入少量乙醇反复洗涤3～4次，然后再加少量甲醇反复洗涤3～4次，过滤后收取滤液并沥干；
(5)将步骤(4)中所得的沉淀物在温度≤40℃条件下进行真空干燥，即得精品胆红素，并避光密封保存。
8.根据权利要求1所述的从胆汁中提取胆红素和胆酸并联产胆固醇、卵磷脂的方法，其特征在于，所述步骤(4)中提取胆酸具体包括以下步骤：
(1)将收集的上层悬浮液加入其重量10%的氢氧化钠和0.2%的甲醇钠进行破碱解液，经搅拌溶解后，加热升温至90～95℃，碱解时间为≥6h，其中在温度为40℃时开始回收液体中的二氯甲烷；二氯甲烷回收后，将碱解液降至常温，用10%的盐酸调节pH值至6，静置放置≥2h后，当沉淀物完全析出后，进行离心处理，收取清液；收取的清液中再用10%的盐酸调节pH值在2～3之间，静置放置≥2h后，当沉淀物完全析出后，进行离心处理，收取沉淀物；
(2)将步骤(1)中所收集的沉淀物加入4倍量的75%乙醇，并调节pH值至3，并加入3%的活性炭，在温度为50℃条件下回流吸附，回流吸附时间≥1h，离心过滤；收集滤液再经过聚苯乙烯凝胶层析柱吸附，再以90%乙醇洗脱，洗脱后收取460nm处有吸收值的活性乙醇洗脱液；
(3)将步骤(2)中所收取活性乙醇洗脱液在温度≥80℃条件下进行蒸发回收乙醇，其浓缩液降温至≤5℃后，静放20～30h后，过滤收取沉淀物；
(4)将步骤(3)中所收取沉淀物加入少量90%乙醇反复洗涤2～3次，过滤后收取滤液并沥干；
(5)将步骤(4)中所得的沉淀物在温度为70～80℃条件下进行真空干燥，即得精品胆酸，并密封包装。
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Denomination of invention: A method for extracting bilirubin and bile acid from bile and co producing cholesterol and phospholipids Effective date of registration: 20231121 Granted publication date: 20191129 Pledgee: Industrial and Commercial Bank of China Limited Guanling Branch Pledgor: GUIZHOU HUIJING BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023520000067 |
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