CN107267410B - 一种抗菌方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物领域，具体的说一种使用复合微生物菌剂的抗菌方法。所选用的微生物菌剂的有效成分为球形赖氨酸芽孢杆菌1‑5重量份，苏云金芽孢杆菌1‑5重量份。本发明提供了一种使用时抗菌菌剂不直接与对象物接触而杀灭对象物上特定细菌的方法。

Description

一种抗菌方法
技术领域
本发明属于微生物领域，具体的说是一种复合微生物菌剂的抗菌方法。
背景技术
随着人民生活水平的不断发展，居民日常生产生活产生的废水废物逐渐增多，因此，养殖场、垃圾堆、被污染的水体，总会有不断扩散的恶臭气体，恶臭气体直接影响周围民众的生活质量，甚至危害人民的健康。此外，随着居民对室内生活品质的追求，
卫生间内的用具越来越多例如浴缸、坐便、小便池、洗手池、置物架、洗衣机等，容易产生日常清理死角，想要彻底清理极其不便费时费力，久而久之产生污垢，卫生间内的异味影响人们的日常生活，并滋生害虫，对生活质量产生严重影响。
传统的防霉及消除异味方法，往往用香精掩盖异味或用物理抽气的方式；或臭氧氧化分解异味；或用化学方法。这些方法尽管也能使异味得到一定程度的缓和，但它最终并不能从根本上真正的解决问题，此外香精和化学除臭或抗菌方法还存在二次污染的可能，如果使用不当甚至对人体有害，比如浓盐酸与84消毒液共同使用导致人身伤亡事故屡见不鲜。
厨房作为处理食物的空间，做菜时油烟附着在厨房各处，且厨房用水量大比较潮湿，也容易引发霉菌滋生、久而久之引起厨房墙面变色并滋生害虫。
近年来，利用微生物技术来治理环境污染已引起人们的广泛注意，其高效、经济和无二次污染的优点，使其比物理方法和化学方法更具推广价值。利用微生物除臭、果蔬清洗、水产养殖和防霉领域等也越来越让人们认可接受。
目前，对于卫生间除臭现有技术多采用化学清洁剂和频繁清洁来达到保持卫生间无异味的目的。中国专利104946544A公开了一种用于城市生活垃圾、公共卫生间、禽畜养殖场的除臭的微生物菌剂，包括产朊假丝酵母、植物乳杆菌、乳酸链球菌、啤酒酵母、嗜热链球菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌。
该发明的除臭复合菌剂中含有的有益微生物之间通过协同作用，其能够把垃圾场、公共卫生间、禽畜养殖场中腐败生物的腐败降解向发酵分解转变，对已经产生的恶臭气体硫化氢和氨气吸收降解，消除垃圾和垃圾渗滤液的恶臭，同时有益菌植物杆菌能够产生乳酸抑制腐败细菌的生长，从根本解决恶臭气体的产生，形成一个能够消除臭味和无病害传播垃圾堆放环境。
但该菌剂中含有啤酒酵母，在无氧环境中产生酒精和二氧化碳，二氧化碳在水中可能会中和植物乳杆菌、乳酸链球菌和嗜热链球菌生产的乳酸，即无法将使用环境酸化。其环境适应力差，除臭效果较弱。
目前，市面上基本所有的厨卫清洁剂都需要与需要清洁的物体接触，从而达到除菌效果。常用的厨卫清洁方法包括使用浸泡过抗菌剂溶液的抹布擦拭，或将抗菌剂直接涂抹到目标物上，或将抗菌剂溶液以喷雾的方式喷洒到目标物上。但是，这样使抗菌剂与目标物直接接触的方式，要求目标物可移动或目标物需要清洁的部位四周留有足够的空间，很大程度上限制了目标物，与可能清洁的部位。而且常用的化学清洁剂，使用时对人体有较大的刺激性，对人体造成二次伤害。
发明内容
本发明发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结合现有技术，发现一些常见的抗菌菌株在使用时不与抗菌目标接触的情况下，仍具有杀菌效果，展现了优异的抗菌活性，从而完成了本发明。
本发明属于微生物领域，具体的说是一种复合微生物菌剂的抗菌方法。
一种抗菌方法，其特征在于，在密闭空间内使用抗菌菌剂与目标物非接触的条件下，抗菌菌剂抑制特定细菌生长的抗菌方法；
所述抗菌菌剂的有效成分组成为即球形赖氨酸芽孢杆菌1-5重量份、苏云金芽孢杆菌1-5重量份；
所述特定细菌为芽枝状枝孢，球孢枝孢，链格孢，弯孢霉，立枯丝核菌中一种或两种以上；
所述密闭空间容积为10L以内。
更进一步，所述抗菌菌剂的组成为还包括酵母菌150-250重量份、光合菌400-600重量份；菌剂的优选组成为球形赖氨酸芽孢杆菌2重量份、苏云金芽孢杆菌2重量份、酵母菌200重量份、光合菌500重量份。
更进一步，所述酵母菌为安琪酵母；所述光合菌为鳝宝光合菌。
更进一步，所述抗菌菌剂中，还含有由60℃～150℃的高温处理过的家禽粪；菌剂中全部微生物菌与所述培养基质量比为1～10：100
更进一步，所述的家禽粪选自牛粪、猪粪、鸡粪中的至少一种。
上述任一权利要求所述的抗菌方法用于防霉及植物预防疾病的用途。
所述抗菌菌剂的制备方法如下：
(1)按照选定的菌株，配制适宜于所述球形赖氨酸芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、酵母菌、光合菌培养的培养基；(2)取选定量的所述球形赖氨酸芽孢杆菌、苏云金芽杆菌、酵母菌、光合菌加入所述培养基中，于36-38℃进行培养，即得所述复合微生物除臭、防霉菌剂。
所述培养基的具体配制步骤包括：取选定的家禽粪粉剂于30℃～50℃条件下加水至湿度为20％～50％培养获得。
所述步骤(2)中，还包括将选定菌株在适宜活化液中进行活化的步骤。
所述活化步骤的活化液与所述培养基相同。
本发明具有如下优点：
1.本发明利用微生物除臭、防霉的技术，通过筛选多种有益微生物，利用它们互不拮抗、互相协同的作用下扩繁培养的，应用在污染水体、管道以及纺织品领域的除臭、防霉方法，可以在使用时菌剂与目标物不接触的情况下进行除臭防霉，适用于狭小空间。
利用能够转化或者降解恶臭物质的特殊微生物菌群的分解、吸收和代谢作用对水体、下水管道等散发的硫化氢、二氧化硫、氨、氮、磷、二硫化碳、甲烷等恶臭气体及有害物质、病原菌等进行净化，分解，转化为无害无臭的物质，降低恶臭气体及有害物质、病原菌等对水体对空气的污染、降低处理难度和费用。达到彻底改善水质、净化环境、保护人体健康的目的。
2.本发明的复合微生物除臭防止霉菌附着菌剂的制备过程中以家禽粪便作为培养基，且全部制备过程均在固态条件下进行，省去液体经干燥制备粉体的操作步骤。降低成本，制备过程更高效。
3.本发明中利用光合细菌可以在完全无机的环境中生长和代谢，它们可将无机污染物如H2S、NH3等物质转变为含硫蛋白质并成为新生细胞的组成部分，或者进一步转化为低毒性的NO3 +和分子硫。同时，光合细菌还可利用光合作用降低空气中CO2的含量，从而改善空气的质量。光合细菌在水体中，能迅速有效地将氨及硫化氢等恶臭物质氧化成无臭无毒且无挥发性的硝酸盐、含硫蛋白和微生物细胞质。因此，由含氮含硫的物质释放出的臭气更能被有效的控制。以及利用球形芽孢杆菌的适应环境性及强力除臭、抑制病原菌能力等等。大量有益微生物及其产生的分解酶，能使水体或下水管道中(包括；原发性污染源)产生的氨氮、硫化氢、硫醇、甲烷、磷等有机物分解，使有害微生物得到抑制，进行持续性有益菌类繁殖，降解污染物、除臭以及净化被污染的水质，减少污垢。多种微生物共同作用更有利于吸收、分解水体、下水管道中具恶臭味的有害气体。
4.本发明的复合微生物除臭防霉方法中使用的菌剂为粉剂、可以单独使用也可与液体、膏体、吸水凝胶等载体混合后使用，使用种类多样，简单。所述菌剂中的微生物又可产生抗菌抑毒的效果。不产生二次污染，无次生灾害，修复原有的生态环境，提高自净能力。
附图说明
图1为实施例1培养皿放置示意图。
图2为实施例2中1.3L容器培养皿放置示意图。
图3为实施例3中10L容器培养皿放置示意图。
图4为实施例1实验效果示意图。
具体实施方式
本发明所采用的球形赖氨酸芽孢杆菌购自CGMCC:(编号：1.270)，苏云金芽孢杆菌购自CGMCC(编号：1.785)；采用的酵母为安琪酵母，光合菌为鳝宝光合菌。所选用的实验菌株购自CGMCC。
实施例中所使用的抗菌菌剂制备方法如下：
抗菌菌剂A：
1、在无菌生产车间按150kg罐为标准，打开温控***，使培养罐升至37℃。(温控***温度控制在37℃)。
2、使用高温灭菌锅于100℃灭菌后的100kg鸡粪加入培养罐内。打开发酵罐的搅拌***进行搅拌10分钟；得到培养基。
3、打开发酵罐的放料口放出1kg培养基与2kg水混合作为活化液，用于菌种活化，在1.2kg活化液中加入2000g安琪酵母菌粉剂。取1.2kg活化液中加入3000g鳝宝光合细菌粉剂。球形赖氨酸芽孢杆菌20g、苏云金芽孢杆菌20g分别与300g活化液混合均匀。此步骤用于活化菌种。
4、将活化好的酵母菌、光合细菌、球形赖氨酸芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌依次加入培养罐内发酵，加水至培养罐内湿度为25％。
5、开搅拌***搅拌15分钟，开温控***，温度控制在37℃培养7天完成生产。(注：7天内每天早、中、晚开搅拌***各搅拌15分钟)。
6、检测：PH在6-7之间、有益活菌数:每克5亿以上。
7、利用封装设备包装。
抗菌菌剂B
与抗菌菌剂A制备的不同之处在于酵母菌1500g，光合菌4000g，球形赖氨酸芽孢杆菌10g，苏云金芽孢杆菌10g。
在实施例抗菌实验中，选用的实验菌株购自CGMCC如下表所示
表1:实施例中所使用的实验菌株
Figure BDA0001289909510000041
Figure BDA0001289909510000051
所使用的培养基为：
1、营养琼脂培养基(NA)：肉类提取物5.0g/L、豆粕10.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂15.0g/L。pH值为7.0±0.1。
2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200.0g/L、葡萄糖20.0g/L、琼脂15.0g/L。
实施例1小空间内的抗菌活性实验
实验分为三组，分别是抗菌菌剂A、抗菌菌剂B与空白对照实验。每组实验中，不同的实验菌株与抗菌菌剂或空白对照进行单独试验。
在同一组中，每个单独的实验操作如下：在两个培养皿中分别放入和抗菌菌剂，两个培养皿内向重叠放置，如图1所示，在较小空间内，测定抗菌菌剂非接触抗菌效果。
(1)细菌培养
对于革兰氏阳性菌，使用细胞培养管40℃条件下振荡培养，取对数期后期细菌培养液200μL，加入1.8mL生理盐水。
对于其他实验菌株，其培养方式为将单一实验菌株涂抹接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，30℃培养一周后，将胞子悬浊于添加有0.01％SDS灭菌生理盐水0.5ml中。革兰氏阳性菌采用直接计数法测定细菌个数，其他的实验菌株使用血细胞计数器测定孢子数，将二者调节成约1000个/ml的悬浊液。
(2)实验菌株的准备
在实验菌株的培养基中涂抹接种悬浮液100μL。其中革兰氏阳性菌使用营养琼脂培养基(NA)；其他实验菌株使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。
(3)抗菌菌剂的准备
对于抗菌菌剂的培养(与空白对照实验)，培养皿内的营养琼脂培养基(NA)，分别覆盖菌剂A和菌剂B(与不覆盖抗菌菌剂)，接种菌剂的培养基与未接种的培养基(空白对照试验)在30℃环境下培养2天。
(4)培养
将各组步骤(2)制备好的实验菌株培养皿和步骤(3)中制备好的抗菌菌剂培养皿及空白对照组培养皿分别相互内扣重叠起来，并且使抗菌菌剂不与实验菌株的培养皿接触，如图1所示，载有抗菌菌剂或空白对照的培养皿置于下侧。上下两个培养皿在培养皿外侧通过医用透气胶带固定。。
在30℃环境下培养。培养时间分别为：革兰氏阳性菌组3天，其他实验菌株组7天。
(5)测定
如图4所示，与对照组相比，实验组实验菌株生长被明显抑制，则判定有对应菌剂有抑制效果。下表为小空间内所示抗菌活性试验结果。确认为抑制生长时为记为+，不被确认则标记为-。记录下表，对于抗菌菌剂A和B在小空间内非接触条件下，对实验菌株芽枝状枝孢、球孢枝孢、链格孢、弯孢霉、尖孢镰孢、立枯丝核菌有抗菌效果。
表2：在较小封闭空间内抗菌活性试验结果
Figure BDA0001289909510000061
实施例2 1.3L密闭空间抗菌活性实验
实验分为三组，分别是抗菌菌剂A、抗菌菌剂B与空白对照实验。每组实验中，不同的实验菌株与抗菌菌剂或空白对照进行单独试验。
在同一组中，每个单独的实验操作如下：在两个培养皿中分别放入和抗菌菌剂在两个培养皿中分别放入实验菌株和抗菌菌剂，两个培养皿并排放置在1.3L密闭塑料容器内，如图2所示，在较小空间内，测定抗菌菌剂非接触抗菌效果。
(1)细菌培养
对于革兰氏阳性菌，使用细胞培养管40℃条件下振荡培养，取对数期后期细菌培养液200μL，加入1.8mL生理盐水。
对于其他实验菌株，其培养方式为将单一实验菌株涂抹接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，30℃培养一周后，将胞子悬浊于添加有0.01％SDS灭菌生理盐水0.5ml中。革兰氏阳性菌采用直接计数法测定细菌个数，其他的实验菌株使用血细胞计数器测定孢子数，将二者调节成约1000个/ml的悬浊液。
(2)实验菌株的准备
在实验菌株的培养基中涂抹接种悬浮液100μL。其中革兰氏阳性菌使用营养琼脂培养基(NA)；其他实验菌株使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。
(3)抗菌菌剂的准备
对于抗菌菌剂的培养(与空白对照实验)，培养皿内的营养琼脂培养基(NA)，分别覆盖菌剂A和菌剂B(与不覆盖抗菌菌剂)，接种菌剂的培养基与未接种的培养基(空白对照试验)在30℃环境下培养2天。
(4)培养
将各组步骤(2)制备好的实验菌株培养皿和步骤(3)中制备好的抗菌菌剂培养皿及空白对照组培养皿分别相互内扣重叠起来，并且使抗菌菌剂不与实验菌株的培养皿接触，如图2所示，载有抗菌菌剂或空白对照的培养皿置于下侧。上下两个培养皿在培养皿外侧通过医用透气胶带固定。。
在30℃环境下培养。培养时间分别为：革兰氏阳性菌组3天，其他实验菌株组7天。
(5)测定
计算公式为：(对照组内的菌落数平均值-实验菌株的菌落数平均值)÷对照区的菌落数的平均值＝表示生长抑制率。
与对照组相比，实验组芽枝状枝孢、球孢枝孢、链格孢、立枯丝核菌生长抑制率为100％，被完全抑制，判定对应菌剂有抑制效果。下表为中等空间内所示抗菌活性试验结果。证实了抗菌菌剂A和B在1.3L封闭空间内在非接触条件下，对实验菌株芽枝状枝孢、球孢枝孢、链格孢、弯孢霉、立枯丝核菌有抗菌效果。
表3：1.3L封闭空间内抗菌活性试验结果
Figure BDA0001289909510000071
Figure BDA0001289909510000081
实施例3 10L密闭空间抗菌活性实验
实验分为三组，分别是抗菌菌剂A、抗菌菌剂B与空白对照实验。每组实验中，不同的实验菌株与抗菌菌剂或空白对照进行单独试验。
在同一组中，每个单独的实验操作如下：在两个培养皿中分别放入和抗菌菌剂在两个培养皿中分别放入实验菌株和抗菌菌剂，两个培养皿并排放置在10L密闭塑料容器内，如图3所示，在较小空间内，测定抗菌菌剂非接触抗菌效果。
(1)细菌培养
对于革兰氏阳性菌，使用细胞培养管40℃条件下振荡培养，取对数期后期细菌培养液200μL，加入1.8mL生理盐水。
对于其他实验菌株，其培养方式为将单一实验菌株涂抹接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，30℃培养一周后，将胞子悬浊于添加有0.01％SDS灭菌生理盐水0.5ml中。革兰氏阳性菌采用直接计数法测定细菌个数，其他的实验菌株使用血细胞计数器测定孢子数，将二者调节成约1000个/ml的悬浊液。
(2)实验菌株的准备
在实验菌株的培养基中涂抹接种悬浮液100μL。其中革兰氏阳性菌使用营养琼脂培养基(NA)；其他实验菌株使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。
(3)抗菌菌剂的准备
对于抗菌菌剂的培养(与空白对照实验)，培养皿内的营养琼脂培养基(NA)，分别覆盖菌剂A和菌剂B(与不覆盖抗菌菌剂)，接种菌剂的培养基与未接种的培养基(空白对照试验)在30℃环境下培养2天。
(4)培养
将各组步骤(2)制备好的实验菌株培养皿和步骤(3)中制备好的抗菌菌剂培养皿及空白对照组培养皿分别相互内扣重叠起来，并且使抗菌菌剂不与实验菌株的培养皿接触，如图3所示，载有抗菌菌剂或空白对照的培养皿置于下侧。上下两个培养皿在培养皿外侧通过医用透气胶带固定。。
在30℃环境下培养。培养时间分别为：革兰氏阳性菌组3天，其他实验菌株组7天。
(5)测定
统计实验菌株的培养皿内菌落直径的平均值，对比对照组内的菌落直径的平均值，计算菌落生长抑制率(％)，菌落生长抑制率计算公式为：(1-处理区的菌落直径的平均值/对照区的菌落直径的平均值)*100％。
与对照组相比，实验组芽枝状枝孢、球孢枝孢、链格孢、立枯丝核菌生长被完全抑制，判定对应菌剂有抑制效果。下表为大空间内所示抗菌活性试验结果。证实了抗菌菌剂A和B在10L封闭空间内非接触条件下，对实验菌株芽枝状枝孢、球孢枝孢、链格孢、立枯丝核菌有抗菌效果。
表4：10L封闭空间内抗菌活性试验结果
Figure BDA0001289909510000091
实施例4灭菌处理后抗菌菌剂的抗菌效果
本实施例为验证实验菌株的生长抑制效果与抗菌菌剂的因果关系，灭菌处理操作为将杀菌菌剂放置于120℃高压灭菌器中灭菌。
实验取两份抗菌菌剂A其中一份灭菌处理；两份抗菌菌剂B其中一份灭菌处理。
选用的实验菌株为球孢枝孢；其他实验步骤与实施例1相同。实验结果如下表。可以证明，灭活的抗菌菌剂无法起到抗菌效果，且实验菌株的生长抑制是因为抗菌菌剂的作用。
表5：灭菌处理后抗菌菌剂的抗菌效果统计表
Figure BDA0001289909510000092

Claims (2)

1.一种抗菌方法，其特征在于，在密闭空间内使用抗菌菌剂与目标物非接触的条件下，抗菌菌剂抑制特定细菌生长的抗菌方法； 所述抗菌菌剂的有效成分组成为 CGMCC NO：1.270 球形赖氨酸 芽孢杆菌 1-5 重量份、CGMCC NO：1.785 苏云金芽孢杆菌 1-5 重量份、酵母菌 150-250 重量份、光合菌 400-600 重量份；所述特定细菌为芽枝状枝孢，球孢枝孢，链格孢，弯孢霉，立枯丝核菌中一种以上； 所述密闭空间容积为 10L 以内；所述光合菌为鳝宝光合菌。
2.根据权利要求 1 所述的抗菌方法，其特征在于：所述抗菌菌剂中，还含有由 60℃～150℃的高温处理过的家禽粪。
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