CN107255722A - 基于金属同位素标记流式结合icp‑ms的单细胞蛋白检测方法 - Google Patents
基于金属同位素标记流式结合icp‑ms的单细胞蛋白检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于金属同位素标记流式结合ICP‑MS的单细胞蛋白检测方法,属于流式单细胞蛋白检测技术领域。本发明采用金属元素标签标记抗体或染料,从根本上解决了荧光串色的问题,利用质谱原理对单细胞进行多参数定量检测,实现了几十个参数的同时测量,应用于单细胞蛋白组学分析。将质谱技术与流式细胞技术两种实验平台的融合,既继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点,又具有质谱检测的高分辨能力。本发明中可使用的金属标签元素种类丰富,在细胞中的含量极低,同时金属原素通过多聚螯合物实现与抗体的共价耦联,这种多聚螯合物与细胞组分的非特异性结合能力极低,所以信号的背景极低。
Description
技术领域
本发明属于流式单细胞蛋白检测技术领域,具体地说,涉及一种蛋白标记技术,更具体地说,涉及一种基于金属同位素标记流式结合ICP-MS的单细胞蛋白检测方法,本发明涉及在单细胞尺度上同时对至少37种以上的蛋白表达进行同时检测的技术。
背景技术
流式细胞术是一种采用激光束激发单行流动的细胞,对它的散射光和携带的荧光进行探测,从而完成对快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术,具有检测速度快、测量参数多、采集数据量大、分析全面、分选纯度高、方法灵活等特点,被广泛应用于临床医学、细胞学、生物学、微生物学、制药学、生殖学等领域。作为最普遍使用的单细胞技术之一,流式技术一直在生物学各研究领域都有着广泛的应用。一直以来,流式技术是分析复杂细胞群体的重要手段,它可以实现对细胞进行多参数分析,从而区分不同种类的细胞;其所能检测参数的多少,也决定了我们对于所研究群体异质性的了解程度。
流式细胞仪主要由4部分组成:液流***、光学***、电子***、分析***。它只能检测悬浮的单细胞或微粒的信号,一般是将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本,在一定气体压力下将待测样品压入流动室(核心部件,由石英玻璃制成),形成一个圆形的流束(即鞘流),细胞在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜,将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22μm×66μm),使通过激光检测区的细胞受照强度一致,最大限度的减少杂散光的干扰。细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光,这些荧光信号的强度代表所测细胞膜表面抗原的强度或其细胞内核内物质的浓度,经光电倍增管接收后可转换为电信号,再通过模数转换器,将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号,从而使计算机采集分析。检测数据的显示视测量参数的不同有多种形式可供选择。对于双参数或多参数数据,既可以单独显示每个参数的直方图,也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。
现代流式细胞术综合了流体力学技术、激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、荧光化学技术及单克隆抗体技术,是多学科多领域技术进步的结晶。随着现代科技的高速发展,为了满足生命科学对细胞分析更高层次的要求,流式细胞技术仍然在快速发展,并已经在检测技术、分选技术及高通量分析等方面取得了许多突破。流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、荧光灵敏度、分析参数多少及分析、分选速度及纯度等。目前随着新的荧光色素分子的不断发现,荧光标记技术的进步和流式细胞仪的多激光激发等技术的进展,多色荧光分析得到迅速发展,三色或四色流式细胞仪已常规应用于临床检验中。应用多色流式细胞仪可同时检测多个标记分子,减少试剂的重复使用、所需样本量以及分析时间,从而降低检测成本。多色荧光分析是流式细胞技术发展的一个重要方向。然而,如附图1所示,荧光染料的开发目前已达瓶颈。同时,基于荧光标记的流式细胞术由于荧光光谱的重叠带来的误差,一些高端的流式细胞仪也只能够同时测量10个荧光信号,在用于研究单细胞水平上的功能和特征时,受到限制。
ICP-MS是一种灵敏度非常高的元素分析仪器,可以测量溶液中含量在ppb或ppb以下的微量元素。广泛应用于半导体、地质、环境以及生物制药等行业中。ICP-MS全称是电感藕合等离子体质谱,它是一种将ICP技术和质谱结合在一起的分析仪器。ICP利用在电感线圈上施加的强大功率的高频射频信号在线圈内部形成高温等离子体,并通过气体的推动,保证了等离子体的平衡和持续电离,在ICP-MS中,ICP起到离子源的作用,高温的等离子体使大多数样品中的元素都电离出一个电子而形成了一价正离子。
ICP-MS所用电离源是感应耦合等离子体(ICP),它与原子发射光谱仪所用的ICP是一样的,其主体是一个由三层石英套管组成的炬管,炬管上端绕有负载线圈,三层管从里到外分别通载气,辅助气和冷却气,负载线圈由高频电源耦合供电,产生垂直于线圈平面的磁场。如果通过高频装置使氩气电离,则氩离子和电子在电磁场作用下又会与其它氩原子碰撞产生更多的离子和电子,形成涡流。强大的电流产生高温,瞬间使氩气形成温度可达10000k的等离子焰炬。样品由载气带入等离子体焰炬会发生蒸发、分解、激发和电离,辅助气用来维持等离子体,需要量大约为1L/min。冷却气以切线方向引入外管,产生螺旋形气流,使负载线圈处外管的内壁得到冷却,冷却气流量为10-15L/min。最常用的进样方式是利用同心型或直角型气动雾化器产生气溶胶,在载气载带下喷入焰炬,样品进样量大约为1mL/min,是靠蠕动泵送入雾化器的。在负载线圈上面约10mm处,焰炬温度大约为8000K,在这么高的温度下,电离能低于7eV的元素完全电离,电离能低于10.5eV的元素电离度大于20%。由于大部分重要的元素电离能低于10.5eV,因此具有很高的灵敏度,少数电离能较高的元素,如C、O、Cl、Br等也能检测,只是灵敏度较低。质谱是一个质量筛选和分析器,通过选择不同质核比(m/z)的离子通过来检测到某个离子的强度,进而分析计算出某种元素的强度。但ICP-MS价格昂贵,干扰大,且在生物医药领域的应用受限,更无法实现单细胞水平检测。中国专利申请号为201480009995.6,申请公布日为2015年12月23日的专利申请文件公开了一种用于使用激光烧蚀电感耦合等离子体质谱法(LA-ICP-MS)分析样品的方法和设备,将激光束的脉冲导向样品以便产生对于每个脉冲的样品的羽流;区别性地捕获对于每个脉冲的每个羽流;将区别性地捕获的羽流转移至ICP;以及在ICP中电离区别性地捕获和转移的羽流并产生用于质谱流式细胞术分析的离子。但是该专利中公开的方法检测通道有限,且不能实现在蛋白和基因两个组学层面的共同检测。
一方面,传统流式细胞仪的检测通道数量已经很难有质的提升。目前美国BD最高端的分析型流式细胞仪具有20个检测通道,而实验室常用的通道数量一般少于12个。由于荧光的发射信号具有较长的带宽,流式信号的检测窗口已经非常拥挤,很难容纳新的检测通道。另一方面,发射光谱的重叠会导致通道间的信号之间会相互干扰,当检测较多通道多于8个时,实验设计和补偿计算已经变得相当复杂,使得多参数检测成为了一项复杂、费时的技术性工作,从而限制了它的应用。再者,荧光染料的荧光信号易猝灭、易漂白,且非特异性背景高。而ICP-MS价格昂贵,干扰大,样品制备困难,分析速度慢常规离子源效率低,且在生物医药领域的应用受限,更无法实现单细胞水平检测。
随着我们对于造血发生、免疫细胞分化成熟、癌细胞转化、干细胞自我更新和分化、诱导多功能干细胞等关键生物学领域的研究逐渐深入,我们需要更清晰的了解细胞群体内部的各种变化,对流式的通道数量和信号质量有了更高的要求。传统的荧光流式细胞仪已经不能完全满足科研的需要,急切需要一种更加高效、易用、可以进行更多参数检测的流式细胞仪用于以后的科学研究。
发明内容
1.要解决的问题
针对现有流式细胞仪检测通道少、信号之间会相互干扰、检测多参数时复杂、费时的问题,以及ICP-MS价格昂贵,干扰大、无法实现单细胞水平检测等问题,本发明提供一种基于金属同位素标记流式结合ICP-MS的单细胞蛋白检测方法,采用金属元素标签标记抗体染料,利用质谱原理对单细胞进行多参数定量检测,应用于单细胞蛋白组学分析。将质谱技术与流式细胞技术两种实验平台的融合,既继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点,又具有质谱检测的高分辨能力。
2.技术方案
为了解决上述问题,本发明所采用的技术方案如下:
基于金属同位素标记流式结合ICP-MS的单细胞蛋白检测方法,包括以下步骤:
(1)样品标记:采用金属元素标记的特异抗体或染料标记或识别细胞表面和内部的信号分子,作为靶标表达水平的报告因子;
(2)雾化处理:将标记后的样品溶液进行雾化处理,去除其中的水分;
(3)plasma离子化:单细胞雾化悬滴进入plasma后被气化、原子化、离子化,形成离子云;
(4)去除未离子化物质及光子:利用偏转电场及加速电场的结合去除离子云流中存在的未离子化的物质及光子;
(5)ICP-MS检测:用ICP-MS观察单个细胞的原子质量谱,将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部的信号分子数据,并通过专业分析软件对获得的数据进行分析,从而实现对细胞表型和信号网络的精细观察。
更进一步地,所述步骤(1)中金属元素与特异抗体或染料之间通过多聚螯合物实现共价耦联。
更进一步地,用于标记的金属元素,其原子质量介于88-210Da之间。
更进一步地,用于标记的金属元素为镧系金属元素。
更进一步地,所述步骤(2)中用蠕动泵将样品溶液均匀的送入雾化器,雾化温度为200-250℃左右。
更进一步地,所述步骤(2)中样品溶液在雾化器中雾化时,雾化器中的液体流道为氩气环境,氩气流速0.15-0.35L/min。
更进一步地,所述步骤(3)中plasma内温度范围为5000-10000K。
更进一步地,所述步骤(5)中的ICP-MS检测全程在真空状态下进行。
3.有益效果
相比于现有技术,本发明的有益效果为:
(1)本发明针对荧光染料存在荧光信号易猝灭、易漂白,且非特异性背景高等缺陷进行了改进,采用金属元素标签标记抗体染料,利用质谱原理对单细胞进行多参数定量检测,应用于单细胞蛋白组学分析;将质谱技术与流式细胞技术两种实验平台的融合,既继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点,又具有质谱检测的高分辨能力;
(2)本发明提供的样品标记方法具有创新性,应用稀土金属元素代替传统荧光标记,通常是金属元素标记的特异抗体或者染料(通过螯合集团聚合物链共轭连接上纯化过的稳定重金属同位素)标记或识别细胞表面和内部的信号分子,作为靶标表达水平的报告因子,从根本上解决了荧光串色的问题,并实现了几十个参数的同时测量。这样不仅使实验流程得到简化,也节约了标本和试剂;
(3)本发明采用金属元素标记代替荧光标记可避免由于荧光波段重叠带来的串色补偿的困扰,具有非常宽的原子量检测范围(88~210Da),相邻通道间的干扰<0.3%,通道数量增加同时避免了补偿计算,而传统流式细胞技术主要基于对荧光发射光谱的检测,故而存在检测通道数量限制以及光谱重叠串色而需进行复杂补偿的过程;
(4)本发明中可使用的金属标签元素种类丰富,在细胞中的含量极低,同时金属原素通过多聚螯合物实现与抗体的共价耦联,这种多聚螯合物与细胞组分的非特异性结合能力极低,所以信号的背景极低;本发明通道数量的激增带来信息量的成倍增长,而各种分析方法如SPADE、PCA、viSNE以及Gemstone通过对数据进行降维处理,可充分提取有用的生物学信息;
(5)本发明应用蠕动泵把溶液样品比较均匀的送入雾化器,并同时排除雾化室中的废液,通过控制蠕动泵的转速,可以得到理想的进样速度。
附图说明
图1为荧光染料技术的发展示意图;
图2为本发明样品标记方法的示意图;
图3为镧系金属常用的polymer结构示意图;
图4为质谱检测法与传统的荧光检测法相比的优势示意图;
图5为传统流式细胞仪与本发明的原理图;
图6为本发明中雾化的示意图;
图7为本发明中去除未离子化物质及光子的示意图;
图8为本发明中雾化与流式细胞的对比图;
图9为本发明中四极管的原理示意图;
图10为本发明中可用于标记的金属元素示意图,图中带有“√”标记的元素标签可用于DNA标记;带有“O”标记的元素标签可用于与抗体结合标记抗体;灰色标记为传统生物学ICP-MS可用的检测元素;
图11为本发明中基于飞行时间的检测原理示意图;
图12为本发明中实施例1的实验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
附图5为传统流式细胞仪(upper panel)与本实施(lower panel)的原理图对比。传统流式细胞仪通过荧光染料标记抗体,继而抗体与抗原结合,在鞘液包绕下,通过流动室,形成单细胞悬液,经激光器,并将前向散射角、侧向散射角、荧光激发信号灯信息经由PMT传递给计算机分析。本实施应用金属元素标签代替荧光染料标签,经过nebulizer形成单细胞悬液,由plasma torch将单细胞悬液离子化,并有TOF进行检测。由于本发明技术的使用,使得单细胞蛋白水平检测结果数据量及数据维度激增,因而分析数据时,可以应用多种降维算法、聚类分析算法。
对于液体样本的分析,在进入plasma离子化之前需要尽可能地除去其中的水分。因此Nebulizer的作用即为将样本雾化,随后通过加热至200-250℃左右的雾化室,进入plasma。Nebulizer中心有一内置毛细管,为样本液体流道。毛细管管流道为氩气环境。氩气流速0.15-0.35L/min。当样本流出nebulizer尖端时,氩气流的剪切力使得样本流形成微小水珠,即雾化,如图6所示。本发明用流式细胞原理分离单个细胞,即细胞进入单细胞悬浮培养雾化,经由氩等离子体,共价键断裂,产生自由原子,并完成充电过程。ICP Torch炬管主要有三层结构,外层的叫做外管,其次是内管,中间的是中心管。外管中通的是大流量的氩气,叫做冷却气,冷却气提供给等离子体气体源源不断的Ar原子,在等离子体中不断的电离放热,产生的Ar离子在射频线圈中振荡碰撞,从而维持了很高的温度,伴随着大量离子留出等离子体,又有很多Ar原子流入,从而达到了一种平衡。冷却气的流量大概为18L/min。在内管中流动的气体叫做辅助气,也是氩气,它的作用是给等离子体火焰向前的推力,实现不断的电离,也很好的了中心管,以免过高的温度使其熔化。辅助气的流量为~1L/min。中心管中流出的是从雾室排出的样品溶液的气溶胶。
单细胞雾化水珠流出雾化室后即进入ICP。ICP torch的原理是当在感应线圈上施加高频电场时,由于某种原因(如电火花等)在等离子体工作气体中部分电离产生的带电粒子在高频交变电磁场的作用下做高速运动,碰撞气体原子,使之迅速、大量电离,形成雪崩式放电,电离的气体在垂直于磁场方向的截面上形成闭合环形的涡流,在感应线圈内形成相当于变压器的次级线圈并同相当于初级线圈的感应线圈耦合,这种高频感应电流产生的高温又将气体加热、电离,并在管口形成一个火炬状的稳定的等离子体焰矩。其特点如下:
(1)工作温度高、同时工作气体为惰性气体(氩气),因此原子化条件良好,有利于难熔化合物的分解及元素的激发,对大多数元素有很高的灵敏度;
(2)由于趋肤效应的存在,稳定性高,自吸现象小,测定的线性范围宽;
(3)由于电子密度高,所以碱金属的电离引起的干扰较小;
(4)ICP属无极放电,不存在电极污染现象;
(5)ICP的载气流速较低,有利于试样在中央通道中充分激发,而且耗样量也较少;
(6)采用惰性气体(氩气)作为工作气体,因而光谱背景干扰少
单细胞悬滴进入plasma时,plasma内温度范围为5000-10000K。因此进入plasma的单细胞悬滴被瞬间气化、原子化、离子化,由此单细胞转化为一团离子云。
离子化后的离子云流内包含大量未离子化的物质及光子等,若不滤除,易黏附于仪器结构,引起检测信号漂移。其中光子若抵达检测器将被误以为是待检测离子,引起检测结果准确度下降。因此,在进入TOF检测前,需去除其中的未离子化物质及光子。利用偏转电场及加速电场的结合即可实现。具体原理见图7所示。采样锥作用是把来自等离子体中心通道的载气流,即离子流大部分吸入锥孔,进入第一级真空室。采样锥通常由Ni、Al、Cu、Pt等金属制成。
检测技术全程要求真空状态。因为结合的质谱技术要求离子具有较长的平均自由程,以便离子在通过检测器时与另外的离子、分子、原子碰撞的几率最低,真空度直接影响了离子传输效率、质谱波形及检测器寿命。
本发明应用四极管质量分析器的原理筛选原子质量,如图9所示。四极管的作用是基于在四根电极之间的空间产生一个随时间变化的特殊的电磁场,只有给定荷质比(m/z)的离子才能获得稳定的路径而通过极棒,从另一端出射,其它离子将被过分偏转,与极棒碰撞,并在极棒上被中和而丢失。通过四极管去除常见生物元素后,限定检测的原子量的检测范围(88-210Da),分辨率极高。筛选检测原子质量较大的原子,滤除原子量小的元素,保留较宽的原子量检测范围的同时,由于该类元素在细胞内的含量极低,所以信号的背景极低。金属元素同位素的选择不局限于镧系金属。可以是原子质量介于88-210Da之间的且螯合物安全无毒可合成的任意元素。金属标签元素种类丰富,通道数量激增,信息量亦成倍增长。金属标签可以是通过金属螯合物与抗体结合,如图10所示,图中带有“√”标记的元素标签可用于DNA标记;带有“O”标记的元素标签可用于与抗体结合标记抗体;灰色标记为传统生物学ICP-MS可用的检测元素。
基于飞行时间(Time of Flight)原理进行检测(示意图如图11所示)。用感应耦合等离子质谱(ICP-MS)观察单个细胞的原子质量谱,原子的质量与细胞表面和内部的信号分子数据呈现一一对应的关系,即检测到1个原子质量信号就代表有一个细胞表面和内部的信号分子,最后将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部的信号分子数据,并通过专业分析软件对获得的数据进行分析,从而实现对细胞表型和信号网络的精细观察。
信号分子检测通道数量的增加,可实现从单个样本获取更大的信息量,为单细胞蛋白质组学的研究提供了新的手段。然而数据量及数据维度的激增使得原有传统流式的数据分析图无法很好地呈现数据结果。应用多种降维算法、聚类分析算法、分群算法等进行数据分析与可视化。目前已有大量相关算法文献报道。如SPADE、DREVI、ACCENSE、XShift、viSNE以及Phenograp。
实施例2
基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法的步骤包括以下内容:
(一)人外周血样本的处理与冻存(提取单个核细胞-细胞活性染色-细胞刺激-细胞固定)
1.试剂准备。a.试剂平衡至常温:Ficoll淋巴细胞分离液;Ca2+/Mg2+Free PBS;2×Fixation Solution(3.2%PFA in PBS);人红细胞裂解液(可选);Cell Staining Buffer(0.5%BSA+0.02%NaN3in PBS)。b.需要预热的试剂:FBS Free DMEM/1640(37℃)。c.将以下试剂冰上放置:含有10%DMSO的Cell Staining Buffer;Cell Staining Buffer;Cisplatin 5mM;
2.全血样本的采集和运输。血液标本采集是分析前质量控制的重要环节。推荐用肝素或者柠檬酸盐作为抗凝剂,本实施例中采用肝素作为抗凝剂,按照医院里的标准用量来使用;EDTA易与金属标签元素螯合影响抗体标记,故而EDTA抗凝全血中提取出的PBMC样本可能需要额外的洗涤步骤。一般情况下,在4小时内将全血样本需要送达实验室,常温运输;(22摄氏度最佳,不要低于15度或者高于35度);
3.PBMC细胞分离。用生理盐水/PBS/Hanks液(三者的混合液,一般按照1:1:1的体积比混合后使用)将全血样本1:1稀释后,用一次性吸管缓缓将其加入含1倍体积Ficoll淋巴细胞分离液的离心管内,注意将离心管倾斜,不要晃动,以免扰动液面影响分层。常温400g,刹车速度设为5,离心20min;吸出中层白色的PBMC细胞转移至新的15mL离心管中。再以预热的无血清DMEM/1640,室温下300g,5min离心清洗细胞一遍后,用1mL预热的无血清的DMEM/1640重悬细胞沉淀。若红细胞太多,可用红细胞裂解液处理,但对细胞活性影响较大,故若需对胞内蛋白磷酸化检测时谨慎使用。
4.细胞活性(顺铂)染色。短时间(5~10min)的处理过程中,顺铂无法进入活细胞内部,因此胞内顺铂信号很弱。而死细胞内大量蛋白与顺铂共价结合,会呈现较强的信号,可以此来区分细胞活性。细胞密度调至1×107/mL以下,与1uL终浓度为5uM的顺铂混匀,37度,孵育5min;加入2~5倍体积(本实施例中采用的是3倍体积)的常温的Cell StainingBuffer,混匀中止标记反应,常温300g,离心5min,去上清后用常温的Cell StainingBuffer(固定用)重悬或预热的培养基(刺激用)进行重悬。活性染色步骤中用到的所有CellStaining Buffer中都含有0.5%BSA+0.02%NaN3。
5.细胞刺激。将细胞转移至培养箱中培养20min(一般根据需要来选择培养的时间,15~30min均可),使细胞恢复“静息”状态。并根据适当的刺激物及刺激方法对细胞进行分组刺激,本实施例中采用γ-干扰素作为刺激物,加入细胞溶液中混合均匀,然后用于细胞固定实验,一般建议在细胞刺激之后2小时内使用。
6.细胞固定。重悬混匀细胞悬液;加入等倍体积的2×固定液(含3.2%PFA的PBS)后立即用移液器吹打或涡旋振荡混匀,以减少细胞形成二聚体。室温孵育10min。加入4mL冰冷的Cell Staining Buffer以减慢PFA固定反应。4℃,600g,离心5min。去上清。加入1mL冻存液(含10%DMSO的Cell Staning Buffer)重悬细胞,放置在冰上静置用于后续染色或置于冰上静置数分钟后放入-80度冰箱冻存。样本应注意避免反复冻融。在前处理过程中,通过在显微镜下,细胞计数的办法,分析每1000个细胞里有多少二聚体、三聚体等。
(二)金属标签标记的抗体与细胞结合(细胞表面抗体染色-细胞内磷酸化蛋白染色-单细胞标记)
1.表面抗体染色。对于用PFA固定、冻存的细胞,在冰上或者冷水浴中融化后,Vortex重悬细胞,取1mL(106个)细胞溶液加入2mL Cell Staning Buffer,600g 5min离心去上清,加入50uL Blocking Mix(每份人PBMC(外周血单个核细胞)样本:5uL Fc ReceptorBlocking Solution+50uL CSB,取其中的50uL)重悬,常温放置10min。每管加入50uLcocktail(单个样品的各抗体用量均为1.1uL,总体积55uL,见下表)混匀,常温30分钟。加入2mL Cell Staining Buffer,常温500g离心5min,去上清并重复一次。
表1 cocktail的组成成分
2.胞内磷酸化蛋白染色。经过前面的步骤之后,加入2mL PBS,500g离心5min,去上清。加入100uL PBS,轻轻Votex混匀细胞,冰上放置3分钟。加入1mL预冷的甲醇,立即用枪头吹匀,冰上放置15min以上,加入2mL PBS,800g离心5分钟,弃上清。加入2mL Cell StainingBuffer,800g离心5min,弃上清。每个样本用50uL cell staining Buffer重悬,加入50uL磷酸化抗体cocktail(配制方法同表面抗体),混匀,常温孵育30分钟。加入2mL CellStaining Buffer,800g离心5min,弃上清。
3.Cell Intercalation单细胞标记。加入2mL Cell Staining Buffer,常温500g离心5min,去上清。加入100ul PBS重悬细胞,边振荡边逐滴加入1mL cell intercalation溶液(在fix and perm buffer里加入终浓度为125nM的Ir(铱元素)或者500nM的Rh(铑元素),每个样品用量1mL)。分别用2mL Cell Staing Buffe及2mL水,800g离心5min,清洗细胞1次及3次后,加入1mL含有10%EQ beads的水重悬,将样本置于冰上。至此,样本前处理已完成,可用于后续检测
实施例3
基于金属同位素标记流式结合ICP-MS的单细胞蛋白检测方法,其步骤为:
(1)样品标记:按照前述的方法采用金属元素标记的特异抗体,作为靶标表达水平的报告因子;其中用于标记的金属元素,其原子质量介于88-210Da之间,常用于标记的金属元素为镧系金属元素,本实施例中分别采用Nd同位素质量为146标记蛋白CD8a,Nd同位素质量为145标记蛋白CD4。
(2)雾化处理:用蠕动泵将标记后的样品溶液均匀的送入雾化器进行雾化处理,去除其中的水分;雾化温度为200℃左右,雾化器中的液体流道为氩气环境,氩气流速0.15L/min。
(3)plasma离子化:单细胞雾化悬滴进入plasma后被气化、原子化、离子化,形成离子云;plasma内温度范围为5000K,离子化过程在密闭的高温腔体中进行,只要是能满足温度、密闭等要求的腔体,在腔体中将细胞烧掉,留下标记的同位素均可。
(4)去除未离子化物质及光子:利用偏转电场及加速电场的结合去除离子云流中存在的未离子化的物质及光子;
(5)ICP-MS检测:用ICP-MS观察单个细胞的原子质量谱(ICP-MS检测全程在真空状态下进行),将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部的信号分子数据,并通过专业分析软件对获得的数据进行分析,从而实现对细胞表型和信号网络的精细观察,实验的结果如图12所示。
实施例4
基于金属同位素标记流式结合ICP-MS的单细胞蛋白检测方法,其步骤为:
(1)样品标记:按照前述的方法采用金属元素标记的特异抗体,作为靶标表达水平的报告因子;其中用于标记的金属元素,其原子质量介于88-210Da之间,常用于标记的金属元素为镧系金属元素,本实施例中采用同位素166Er、169Tm、173Yb标记蛋白CD45。
(2)雾化处理:用蠕动泵将标记后的样品溶液均匀的送入雾化器进行雾化处理,去除其中的水分;雾化温度为250℃左右,雾化器中的液体流道为氩气环境,氩气流速0.35L/min。
(3)plasma离子化:单细胞雾化悬滴进入plasma后被气化、原子化、离子化,形成离子云;plasma内温度范围为8000K。
(4)去除未离子化物质及光子:利用偏转电场及加速电场的结合去除离子云流中存在的未离子化的物质及光子;
(5)ICP-MS检测:用ICP-MS观察单个细胞的原子质量谱(ICP-MS检测全程在真空状态下进行),将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部的信号分子数据,并通过专业分析软件对获得的数据进行分析,从而实现对细胞表型和信号网络的精细观察。
实施例5
基于金属同位素标记流式结合ICP-MS的单细胞蛋白检测方法,其步骤为:
(1)样品标记:按照前述的方法采用金属元素标记的特异抗体,作为靶标表达水平的报告因子;其中用于标记的金属元素,其原子质量介于88-210Da之间,常用于标记的金属元素为镧系金属元素,本实施例中分别采用Nd同位素质量为146标记蛋白CD8a,Nd同位素质量为145标记蛋白CD4。
(2)雾化处理:用蠕动泵将标记后的样品溶液均匀的送入雾化器进行雾化处理,去除其中的水分;雾化温度为230℃左右,雾化器中的液体流道为氩气环境,氩气流速0.25L/min。
(3)plasma离子化:单细胞雾化悬滴进入plasma后被气化、原子化、离子化,形成离子云;plasma内温度范围为10000K。
(4)去除未离子化物质及光子:利用偏转电场及加速电场的结合去除离子云流中存在的未离子化的物质及光子;
(5)ICP-MS检测:用ICP-MS观察单个细胞的原子质量谱(ICP-MS检测全程在真空状态下进行),将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部的信号分子数据,并通过专业分析软件对获得的数据进行分析,从而实现对细胞表型和信号网络的精细观察,实验的结果基本同实施例1。
Claims (8)
1.基于金属同位素标记流式结合ICP-MS的单细胞蛋白检测方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)样品标记:采用金属元素标记的特异抗体或染料标记或识别细胞表面和内部的信号分子,作为靶标表达水平的报告因子;
(2)雾化处理:将标记后的样品溶液进行雾化处理,去除其中的水分;
(3)plasma离子化:单细胞雾化悬滴进入plasma后被气化、原子化、离子化,形成离子云;
(4)去除未离子化物质及光子:利用偏转电场及加速电场的结合去除离子云流中存在的未离子化的物质及光子;
(5)ICP-MS检测:用ICP-MS观察单个细胞的原子质量谱,将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部的信号分子数据,并通过专业分析软件对获得的数据进行分析,从而实现对细胞表型和信号网络的精细观察。
2.根据权利要求1所述的基于金属同位素标记流式结合ICP-MS的单细胞蛋白检测方法,其特征在于:所述步骤(1)中金属元素与特异抗体或染料之间通过多聚螯合物实现共价耦联。
3.根据权利要求1或2所述的基于金属同位素标记流式结合ICP-MS的单细胞蛋白检测方法,其特征在于:用于标记的金属元素,其原子质量介于88-210Da之间。
4.根据权利要求3所述的基于金属同位素标记流式结合ICP-MS的单细胞蛋白检测方法,其特征在于:用于标记的金属元素为镧系金属元素。
5.根据权利要求1所述的基于金属同位素标记流式结合ICP-MS的单细胞蛋白检测方法,其特征在于:所述步骤(2)中用蠕动泵将样品溶液均匀的送入雾化器,雾化温度为200-250℃左右。
6.根据权利要求1或5所述的基于金属同位素标记流式结合ICP-MS的单细胞蛋白检测方法,其特征在于:所述步骤(2)中样品溶液在雾化器中雾化时,雾化器中的液体流道为氩气环境,氩气流速0.15-0.35L/min。
7.根据权利要求1所述的基于金属同位素标记流式结合ICP-MS的单细胞蛋白检测方法,其特征在于:所述步骤(3)中plasma内温度范围为5000-10000K。
8.根据权利要求1所述的基于金属同位素标记流式结合ICP-MS的单细胞蛋白检测方法,其特征在于:所述步骤(5)中的ICP-MS检测全程在真空状态下进行。
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