CN107223563A

CN107223563A - 一种培育无刺黑果枸杞的方法

Info

Publication number: CN107223563A
Application number: CN201710307900.4A
Authority: CN
Inventors: 王钦美; 张志宏; 张桐欣; 刘俞帆; 吴月亮; 朱明�; 周永斌
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2017-05-04
Filing date: 2017-05-04
Publication date: 2017-10-03
Anticipated expiration: 2037-05-04
Also published as: CN107223563B

Abstract

一种培育无刺黑果枸杞的方法，其特征是培育步骤中以有刺黑果枸杞的茎或成熟种子为原始供体材料，采用茎或叶为外植体培养获得无菌组培苗；将获得的组培苗接种于改良的1/4或1/2MS固体培养基，置于日光下进行壮苗培养；壮苗培养之后进行移栽驯化；刚移栽的组培苗要置于散射光下定期浇蒸馏水使栽培介质的含水量保持在100%田间持水量；对移栽驯化成活的健康盆栽组培苗进行控水处理并定期浇灌1/8改进的MS营养液或1/4改进的MS营养液：盆苗置于日光下，环境温度保持在18～28℃。本发明采用有茎刺黑果枸杞作为起始材料，成功培育出大量无刺黑果枸杞植株，且无刺植株生长发育良好，为培育无刺黑果枸杞新品种奠定基础。

Description

一种培育无刺黑果枸杞的方法

技术领域

本发明属于一种植物培育方法，具体涉及一种黑果枸杞无刺植株的培育。

背景技术

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)为茄科枸杞属多年生多棘刺灌木。植物棘刺分为茎刺(枝刺)、叶刺、皮刺、刺齿等。黑果枸杞棘刺为茎刺。它由腋芽***发育而成，为枝的***。茎刺也称为枝刺，它与茎的维管束相连，坚硬不易折断和剥离。野生黑果枸杞常以灌丛状生于盐碱荒地、盐化沙地、盐湖岸边、路旁等各种盐渍化土壤或荒漠环境，具有防风固沙和改善土质的作用。并且黑果枸杞果实保健价值和价格远超普通红果枸杞。黑果枸杞是用于治理和开发利用沙化土地及盐碱地的优良生态经济型树种。因此，荒漠和沙化土地营造黑果枸杞经济防护林具有重要的社会、经济和生态意义。但是黑果枸杞坚硬且牢固的茎刺不但增加造林和日常管理(尤其是采果)难度，而且降低了人工林的经济效益。茎刺表型是采果类经济树种的重要性状之一。参照无刺沙棘的生产表现，我们发现同等条件下的无刺类型无疑更宜作经济型林木栽培。综上，培育优良无刺黑果枸杞是一个很值得研究的课题。

我们前期研究已经建立了以黑果枸杞叶片和茎段为外植体的高效离体再生体系，并且相关研究已经申请国家发明专利(201610206401.1)。借鉴上述专利的方法，以有刺黑果枸杞为最初材料供体，通过离体快速繁殖获得无性系。进而通过盆栽控水处理联合浇灌营养液的方法获得了无棘刺的黑果枸杞无性系，本方法的无刺黑果枸杞得率高达100％。

本方法为培育黑果枸杞无刺品种、调控黑果枸杞株型和产量打下基础，为培育其它木本植物的无刺类型提供借鉴。此外，本研究可以丰富植物抗旱理论、植物表型可塑性理论、填补国内外茎刺相关研究的空缺，并为最终阐明黑果枸杞茎刺发育机理奠定基础。

发明内容

本发明的目的是为了搞清黑果枸杞的茎刺发育机理，提供了一种培育无刺黑果枸杞的方法，进而为培育黑果枸杞无刺品种奠定基础。

本发明采用的技术方案如下：

(1)无性系组培苗的获得

以有刺黑果枸杞的茎或成熟种子为原始供体材料，采用茎或叶为外植体培养获得无菌组培苗；

(2)壮苗培养

将上步获得的组培苗接种于改良的1/4或1/2MS固体培养基，置于自然日光下进行壮苗培养；上述改良1/4MS固体培养基，是除了KH₂PO₄和KNO₃的含量与MS培养基一样，其它大量元素、微量元素、铁盐及有机物质含量均为MS培养基1/4的一种培养基；而改良的1/2MS 固体培养基是除了KH₂PO₄和KNO₃的含量与MS培养基一样，其它大量元素、微量元素、铁盐及有机物质含量均为MS培养基1/2的一种培养基；改良的1/4和1/2MS固体培养基的蔗糖浓度为15～20g/L,琼脂浓度为4.3～7.0g/L,pH值为5.4～5.8；

(3)炼苗及移栽

生根完整小植株在壮苗培养之后进行移栽驯化；移栽介质采用菜园土、腐殖土、沙子、草炭其一或其两种以上混合物；移栽介质121℃高压灭菌30min～2h；将壮苗之后的带根植株冲洗干净，并迅速置于多菌灵或甲基托布津工作液中浸泡5～10min；之后将苗栽植于盆钵中的移栽介质中，浇透蒸馏水之后覆盖带孔塑料膜或带孔保鲜膜保湿。刚移栽的组培苗要置于散射光下，避免日光直射；定期浇蒸馏水使栽培介质的含水量保持在100％田间持水量，从移栽第5～10天开始逐渐揭去保鲜膜或塑料膜；待植株明显开始生长之时再逐渐挪到自然日光下；整个过程的盆土含水量均要保持在80％～100％田间持水量，环境温度保持在18～28℃；

(4)盆栽控水处理及浇灌营养液

对移栽驯化成活的健康盆栽组培苗进行控水处理并定期浇灌1/8改进的MS营养液或1/4改进的MS营养液：每日浇水，使土壤含水量保持在75％～100％田间持水量；间隔10～30天浇灌一次营养液，浇灌营养液的同时要保证土壤含水量与原先设置的相同，即75％～100％田间持水量；盆苗置于日光下，环境温度保持在18～28℃。此步提到的改进的MS营养液不含蔗糖和琼脂；其大量元素及铁盐含量与MS培养基相同；不含硫酸铜和氯化钴,但其它微量元素的含量为MS培养基的1/2；不含肌醇和甘氨酸，但其它有机物质的含量与MS培养基相同。1/8改进的MS营养液的各种物质含量为改进的MS营养液的1/8。1/4改进的MS营养液的各种物质含量为改进的MS营养液的1/4。

本发明的积极效果：可用有茎刺黑果枸杞作为起始材料，成功培育出大量无刺黑果枸杞植株，且无刺植株生长发育良好。本发明证明黑果枸杞茎刺属于植物诱导防御范畴，而非组成型防御。本发明为研究黑果枸杞响应土壤干旱胁迫的茎刺发育机理提供了基础实验材料，并为培育无刺黑果枸杞新品种奠定基础。

附图说明

图1本发明的技术路线示意图。

图2黑果枸杞移栽小植株及无刺植株图；A移栽成活的黑果枸杞植株；B无刺黑果

枸杞植株；C有刺黑果枸杞茎；D无刺黑果枸杞茎。

具体实施方式

下面将结合图1-2和实际操作对本发明作进一步的说明，但本发明的范围并不局限于以下的实施例。

实施例1：

1.培育黑果枸杞组培苗

按照专利(201610206401.1)的方法，切取无菌种苗或再生植株的健康幼嫩叶片为直径5mm 的小块，横向平接到含6-BA 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L+4.5g/L琼脂+40g/L的蔗糖的MS固体培养基上。25℃下置于微弱散射光下培养2周，之后转到14W的led等光下培养，每天光照8h。上述MS固体培养基121℃高压灭菌15min之前用1mol/L KOH溶液将pH值调节到 5.4。外植体接种4周时进行继代，将培养材料转接到相同的培养基上。此时多数叶片外植体形成愈伤的表面出现大量芽丛。待芽长到高度3cm以上时剪下，***不添加任何植物生长调节剂的pH值为5.4的1/2MS固体培养基诱导生根。1/2MS固体培养基除了琼脂含量与上述 MS固体培养基一致，其它蔗糖、大量元素、微量元素、铁盐和有机物质的含量均为MS培养基的1/2。诱导生根的光周期为12光照/12h黑暗。

2.壮苗培养

将生根小植株接种到玻璃瓶内的改良1/4MS固体培养基，改良1/4MS固体培养基是除了KH₂PO₄和KNO₃的含量与MS培养基一样，其它大量元素、微量元素、铁盐及有机物质含量均为MS培养基1/4的一种培养基，培养基121℃高压灭菌15min之前用1mol/L的KOH溶液将pH值调节到5.4。培养基添加20g/L的蔗糖和7.0g/L的琼脂粉。接种完后将玻璃瓶置于自然日光下培养。可以放在房屋南面的窗台上。培养温度保持在25℃，光周期遵从自然日升日落规律。待组培苗茎干粗壮(木质化)且叶片变厚呈深绿色时方可进行移栽。

3.炼苗及移栽

移栽介质为重量比3:2的腐殖土和细河沙。移栽介质121℃高压灭菌2h，凉透的介质可用于移栽。将壮苗之后的带根植株进行移栽。开瓶之后立即将苗取出，放于网眼框内置于自来水龙头下冲洗。整个冲洗过程要尽量避免伤害植株根系。将冲洗干净的组培苗迅速置于多菌灵工作液中浸泡5min。之后将苗栽植于盆钵中的移栽介质中，浇透蒸馏水之后覆盖带孔保鲜膜保湿。刚移栽的组培苗要置于散射光下，避免日光直射。定期浇蒸馏水保持盆土含水量为100％田间持水量，从移栽第5天开始逐渐揭去保鲜膜。具体方法是先将保鲜膜与盆钵之间揭开较小缝隙，如果24小时之后发现小苗尚未萎蔫，则继续将保鲜膜与盆钵之间的缝隙扩大；扩大缝隙之后再观察24小时，如果小苗仍未萎蔫，再继续扩大保鲜膜与盆钵之间的空隙，直到保鲜膜完全揭开为止。待植株明显开始生长之时再逐渐挪到自然日光下。整个过程都要定期浇蒸馏水保持盆土含水量为90％～100％田间持水量。环境温度保持在25℃。

4.盆栽控水处理及浇灌营养液

挑选健康且长势良好的移栽植株用于盆栽控水处理。每日浇水使盆土含水量保持在80％田间持水量，盆苗置于自然日光下，环境温度保持在25℃。在控水的同时，每隔15天浇灌一次过滤除菌(0.22μm滤膜)的1/8改进的MS营养液。注意浇灌营养液当天也要保证盆土含水量是80％田间持水量。此步提到的改进的MS营养液不含蔗糖和琼脂、含有等量的MS大量元素和MS铁盐、含有除去硫酸铜和氯化钴以外的半量MS微量元素、含有除去肌醇和甘氨酸以外的等量MS有机物质。1/8改进的MS营养液的各种物质含量为改进的MS营养液的 1/8(表1)。

此方法可以使整株黑果枸杞植株无一棘刺(茎刺)，无刺植株获得率可达100％。此方法获得的无刺植株均生长发育良好(图2B和2D)。

实施例2：

1.培育黑果枸杞组培苗

按照专利(201610206401.1)的方法，以无菌种苗茎段或再生植株的茎段为外植体进行组织培养。将去叶的无菌嫩茎剪切为0.5～2cm的小段，下端朝下***含6-BA 0.2mg/L+5.0g/L 琼脂+35g/L的蔗糖的pH值为5.6的MS固体培养基上。24℃下每天光照10h。接种4周时，将材料继代到相同的培养基培养。当培养材料产生的叶腋丛生芽或愈伤不定芽高度达4cm的时候，将其剪下***不添加任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养诱导生根。

2.壮苗培养

将生根小植株接种到玻璃瓶内的改良1/2MS固体培养基。改良的1/2MS固体培养基是除了 KH₂PO₄和KNO₃的含量与MS培养基一样，其它大量元素、微量元素、铁盐及有机物质含量均为MS培养基1/2的一种培养基。培养基121℃高压灭菌15min之前用1mol/L的NaOH 溶液将pH值调节到5.8。培养基添加20g/L的蔗糖和4.3g/L的琼脂粉。接种完后将玻璃瓶置于自然日光下培养。培养温度保持在26℃，光周期遵从自然日升日落规律。待组培苗茎干粗壮(木质化)且叶片变厚呈深绿色时方可进行移栽。

3.炼苗及移栽

移栽介质为重量比3:2的菜园土和细河沙。移栽介质121℃高压灭菌1h，凉透的介质可用于移栽。将壮苗之后的带根植株进行移栽。开瓶之后立即将苗取出，放于网眼框内置于自来水龙头下冲洗。整个冲洗过程要尽量避免伤害植株根系。将冲洗干净的组培苗迅速置于多菌灵工作液中浸泡5min。之后将苗栽植于盆钵中的移栽介质中，浇透蒸馏水之后覆盖带孔塑料膜保湿。刚移栽的组培苗要置于散射光下，避免日光直射。定期浇蒸馏水保持盆土含水量为100％田间持水量，从移栽第10天开始可逐渐揭去保鲜膜，具体方法同实施例1。待植株明显开始生长之时再逐渐挪到自然日光下。整个过程都要使盆土含水量保持在80％～100％田间持水量。环境温度保持在26℃。

4.盆栽控水处理及浇灌营养液

挑选健康且长势良好的移栽植株用于盆栽控水处理实验。每日浇水使盆土含水量保持在90％田间持水量，盆苗置于自然日光下，环境温度保持在26℃。在控水的同时，每隔20天浇灌一次过滤除菌(0.22μm滤膜)的1/8改进的MS营养液(表1)。注意浇灌营养液当天也要保证盆土含水量是90％田间持水量。

实施例3：

1.培育黑果枸杞组培苗

采集温室内的有菌有刺黑果枸杞茎。在无菌超净工作台用75％(体积/体积)酒精浸泡茎段30S，再用0.12％(质量/体积)的氯化汞水溶液浸泡3min，无菌水冲洗4遍。将2cm长的带叶腋茎段接种到添加6-BA 0.3mg/L的1/2MS固体培养基上，23℃每天12小时光照培养。待接种的茎段腋芽萌发出嫩枝之后，采集嫩枝的叶片和茎段为外植体。参照专利201610206401.1的方法，嫩茎段外植体接种到含6-BA 0.05mg/L+NAA 0.05mg/L的MS固体培养基诱导愈伤和芽丛；叶片外植体接种到含6-BA 0.4mg/L+NAA 0.05mg/L的MS固体培养基诱导愈伤和芽丛。或者将叶腋萌生嫩枝剪下***不添加任何植物生长调节剂的1/2MS培养基诱导生根，然后采集生根植株的幼嫩茎和叶为外植体获得无性系。也可以继续采集无菌无性系的幼嫩茎和叶为外植体，通过离体培养获得次生无性系。此步用到的1/2MS固体培养基添加蔗糖20g/L，琼脂0.45g/L。 121℃高压灭菌15min之前用1mol/L的KOH溶液将pH值调节到5.6。

2.壮苗培养

将上步获得的无菌无性系或无菌次生无性系小植株接种到玻璃瓶内的改良1/4MS固体培养基，改良1/4MS固体培养基是除了KH₂PO₄和KNO₃的含量与MS培养基一样，其它大量元素、微量元素、铁盐及有机物质含量均为MS培养基1/4的一种培养基。培养基121℃高压灭菌20min之前用1mol/L的KOH溶液将pH值调节到5.6。培养基添加20g/L的蔗糖和6.0g/L 的琼脂粉。接种完后将玻璃瓶置于自然日光下培养。培养温度保持在23℃，光周期遵从自然日升日落规律。待组培苗茎干粗壮(木质化)且叶片变厚呈深绿色时方可进行移栽。

3.炼苗及移栽

移栽介质为重量比2:1的腐殖土和草炭。移栽介质121℃高压灭菌30min，凉透的介质可用于移栽。将壮苗之后的带根植株进行移栽。开瓶之后立即将苗取出，放于网眼框内置于自来水龙头下冲洗。整个冲洗过程要尽量避免伤害植株根系。将冲洗干净的组培苗迅速置于甲基托布津工作液中浸泡7min。之后将苗栽植于盆钵中的移栽介质中，浇透蒸馏水之后覆盖带孔保鲜膜保湿。刚移栽的组培苗要置于散射光下，避免日光直射。定期浇蒸馏水保持盆土含水量为100％田间持水量，从移栽第7天开始可逐渐揭去保鲜膜，具体方法同实施例1。待植株明显开始生长之时再逐渐挪到自然日光下。整个过程都要定期浇蒸馏水保持盆土含水量为 90％～100％田间持水量。环境温度保持在23℃。

4.盆栽控水处理及浇灌营养液

挑选健康且长势良好的移栽植株用于盆栽控水处理。每日浇水使盆土含水量保持在75％田间持水量，盆苗置于自然日光下，环境温度保持在23℃。在控水的同时，每隔30天浇灌一次过滤除菌(0.22μm滤膜)的1/4改进的MS营养液。1/4改进MS营养液各成分的含量是

1/8改进MS营养液(表1)的2倍。注意浇灌营养液当天也要保证盆土含水量是75％田间持水量。

表1.1/8改进的MS营养液成分表

成分	使用浓度(mg/L)
		硝酸铵(NH₄NO₃)	206.25(1/8MS)
硝酸钾(KNO₃)	237.50(1/8MS)
		氯化钙(CaCl₂·2H₂O)	55.00(1/8MS)
硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)	46.25(1/8MS)
		磷酸二氢钾(KH₂PO₄)	21.25(1/8MS)
碘化钾(KI)	0.05(1/16MS)
		硼酸(H₃BO₃)	0.39(1/16MS)
硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)	1.39(1/16MS)
		硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)	0.54(1/16MS)
钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)	0.02(1/16MS)
		硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)	3.48(1/8MS)
乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA·2H₂O)	4.66(1/8MS)
		烟酸(VB5或VPP)	0.06(1/8MS)
盐酸吡哆醇(VB₆)	0.06(1/8MS)
		盐酸硫胺素(VB₁)	0.01(1/8MS)

最佳实施方案：

1.培育黑果枸杞组培苗

以无菌幼嫩黑果枸杞(种苗、组培苗或组培萌枝)的茎段或叶片为外植体，经过愈伤阶段形成再生芽。待芽生长到4cm高时，剪下带顶芽嫩茎接种到不添加任何植物生长调节剂的1/2MS 固体培养基诱导生根。此处的1/2MS固体培养基是添加4.5g/L的琼脂粉(济南中天组培园艺用品有限公司)+20g/L分析纯蔗糖+1/2MS大量元素+1/2MS微量元素+1/2MS铁盐+1/2MS 有机物质的培养基。培养基121℃高压灭菌15min之前用1mol/L的KOH将pH值调节为5.6。培养室温度25℃。叶片外植体在散射光下诱导出愈伤组织之后置于12光照/12黑暗的光周期条件下培养。光照由14W的led灯管(3根一组)提供。此外，值得一提的是大部分茎外植体***培养基的一端会产生结节样愈伤组织，愈伤组织经过培养会产生不定芽；而茎外植体的没有***培养基一端的叶腋处会产生丛生芽。取愈伤组织不定芽用于后续实验，效果好于叶腋丛生芽。

2.壮苗培养

将生根小植株接种到玻璃瓶内的改良1/4MS固体培养基，改良1/4MS固体培养基是除了KH₂PO₄和KNO₃的含量与MS培养基一样，其它大量元素、微量元素、铁盐及有机物质含量均为MS培养基1/4的一种培养基。培养基121℃高压灭菌(15min)之前用1mol/L的 KOH溶液将pH值调节到5.6。改良1/4MS培养基添加20g/L的蔗糖和5.0g/L的琼脂粉。接种完后将玻璃瓶置于房屋南面的窗台上，让其接受自然光照，光周期遵从自然日升日落规律。培养温度保持在25℃。待组培苗茎干粗壮(木质化)、根系发达且叶片变厚呈深绿色时方可进行移栽。此方法的壮苗成功率为100％。

3.炼苗及移栽

移栽介质为重量比3:2的腐殖土和草炭。移栽介质121℃高压灭菌40min，凉透的介质可用于移栽。开瓶之后立即将壮苗连同培养基一起取出，放于网眼框内置于自来水龙头下冲洗。边冲洗边从上往下挤压培养基，注意一定不要左右挤压培养基，以避免伤害植株根系。将冲洗干净的组培苗迅速置于多菌灵工作液中浸泡5min。之后将苗栽植于盆钵中的移栽介质中，浇透蒸馏水之后覆盖带孔保鲜膜保湿。刚移栽的组培苗要置于散射光下，避免日光直射。定期浇蒸馏水保持盆土含水量为100％田间持水量，从移栽第10天开始可逐渐揭去保鲜膜，具体方法同实施例1。待植株明显开始生长之时再逐渐挪到自然日光下。整个过程的环境温度保持在25℃，并要定期浇灌蒸馏水以保持盆土含水量为90％～100％田间持水量。此方法的移栽成活率为96.2～100％。

4.盆栽控水处理及浇灌营养液

挑选健康且长势良好的移栽植株用于盆栽控水处理。每日浇水使盆土含水量保持在85％田间持水量，盆苗置于自然日光下，环境温度保持在25℃。在控水的同时，每隔15天浇灌一次过滤除菌(0.22μm滤膜)的1/8改进的MS营养液(表1)。注意浇灌营养液当天也要保证盆土含水量是85％田间持水量。在整个控水和浇灌营养液的过程中要保证植株不受其他生物或非生物胁迫，比如病虫害、枝条折断和火烧等。在此前提下，本方法的无刺植株得率可达 100％。

Claims

1.一种培育无刺黑果枸杞的方法，其特征是培育步骤如下：

(1)无性系组培苗的获得

(2)壮苗培养

将上步获得的组培苗接种于改良的1/4或1/2MS固体培养基，置于自然日光下进行壮苗培养；上述改良1/4MS固体培养基，是除了KH₂PO₄ 和KNO₃的含量与MS培养基一样，其它大量元素、微量元素、铁盐及有机物质含量均为MS培养基1/4的一种培养基；而改良的1/2MS固体培养基是除了KH₂PO₄ 和KNO₃的含量与MS培养基一样，其它大量元素、微量元素、铁盐及有机物质含量均为MS培养基1/2的一种培养基；改良的1/4和1/2MS固体培养基的蔗糖浓度为15～20 g/L,琼脂浓度为4.3～7.0 g/L,pH值为5.4～5.8；

（3）炼苗及移栽

生根完整小植株在壮苗培养之后进行移栽驯化；移栽介质采用菜园土、腐殖土、沙子、草炭其一或其两种以上混合物；移栽介质121℃高压灭菌30 min～2 h；将壮苗之后的带根植株冲洗干净，并迅速置于多菌灵或甲基托布津工作液中浸泡5～10 min；之后将苗栽植于盆钵中的移栽介质中，浇透蒸馏水之后覆盖带孔塑料膜或带孔保鲜膜保湿；刚移栽的组培苗要置于散射光下，避免日光直射；定期浇蒸馏水使栽培介质的含水量保持在100%田间持水量，从移栽第5～10天开始逐渐揭去保鲜膜或塑料膜；待植株明显开始生长之时再逐渐挪到自然日光下；整个过程的盆土含水量均要保持在80%～100%田间持水量，环境温度保持在18～28℃；

（4）盆栽控水处理及浇灌营养液

对移栽驯化成活的健康盆栽组培苗进行控水处理并定期浇灌1/8改进的MS营养液或1/4改进的MS营养液：每日浇水，使土壤含水量保持在75%～100%田间持水量；间隔10～30天浇灌一次营养液，浇灌营养液的同时要保证土壤含水量与原先设置的相同，即75%～100%田间持水量；盆苗置于日光下，环境温度保持在18～28℃；此步提到的改进的MS营养液不含蔗糖和琼脂；其大量元素及铁盐含量与MS培养基相同；不含硫酸铜和氯化钴,但其它微量元素的含量为MS培养基的1/2；不含肌醇和甘氨酸，但其它有机物质的含量与MS培养基相同；1/8改进的MS营养液的各种物质含量为改进的MS营养液的1/8；1/4改进的MS营养液的各种物质含量为改进的MS营养液的1/4。

2.根据权利要求1所述的培育无刺黑果枸杞的方法，其特征是以有刺黑果枸杞的茎段为最初的外植体培养无菌组培苗：采集温室内的有菌有刺黑果枸杞茎，在无菌超净工作台用70-75%(体积/体积)酒精浸泡茎段30 S～1 min，再用0.1～0.2%（质量/体积）的氯化汞水溶液或者2%（质量/体积）次氯酸钠溶液浸泡2～5 min，无菌水冲洗3～6遍；将1～3 cm长的茎段接种到添加 6-BA 0.05～1.0 mg/L+NAA 0～0.5 mg/L的1/2MS或MS固体培养基上，20～28℃每天8～16小时光照培养；待接种的茎段腋芽萌发出嫩枝之后，采集嫩枝的叶片或茎段为外植体：将生长良好的幼叶片横向剪或切为直径3～5mm的小块，接种到含6-BA 0.05～1.0 mg/L+NAA 0～0.5 mg/L的MS固体培养基上，20～28℃下置于微弱散射光下培养1～4周；之后转到正常光照下培养，每天光照8～12 h；将茎剪切为0.5～2 cm的小段，下端朝下***含6-BA 0.05～1.0 mg/L+NAA 0～0.5 mg/L的MS固体培养基上，20～28℃下每天光照8～12 h；或者将萌发嫩枝插于生根培养基，获得生根小植株之后，再取其茎、叶作为外植体来培养无性系；也可以继续采集无菌无性系的幼嫩茎和叶为外植体，通过离体培养获得次生无性系；此步和以下各步用到的MS固体培养基均添加0.43～0.7%（质量/体积）的固化剂琼脂，3～4%（质量/体积）的蔗糖；121℃高压灭菌15～20min之前用NaOH或KOH溶液将pH值调节到5.4～5.8；1/2MS固体培养基添加蔗糖、大量元素、微量元素、铁盐和有机物质浓度均为MS固体培养基的一半，琼脂含量、pH值及灭菌条件等与MS培养基一致。

3.根据权利要求1所述的培育无刺黑果枸杞的方法，其特征是：无性系组培苗的获取的最佳实施方案是以叶片或茎段为外植体，经过愈伤组织阶段产生的不定芽诱导出的完整小植株最适宜用于后续实验；待愈伤不定芽生长到4 cm高时，剪下带顶芽嫩茎接种到不添加任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基诱导生根；此处的1/2MS固体培养基是添加4.5 g/L的琼脂粉+ 20 g/L分析纯蔗糖+ 1/2MS大量元素+1/2 MS微量元素+ 1/2 MS铁盐+ 1/2MS有机物质的培养基；培养基121℃高压灭菌15 min之前用1 mol/L的KOH将pH值调节为5.6；培养室温度25℃；叶片外植体在散射光下诱导出愈伤组织之后置于12光照/12黑暗的光周期条件下培养；光照由14 W的led灯管提供。

4.根据权利要求1所述的培育无刺黑果枸杞的方法，其特征是：关于壮苗培养的最佳实施方案是将生根小植株接种到玻璃瓶内的改良1/4MS固体培养基；培养基121℃高压灭菌15min之前用1mol/L的KOH溶液将pH值调节到5.6；培养基添加20 g/L的蔗糖和5.0 g/L的琼脂；接种完后将玻璃瓶置于房屋南面的窗台上，让其接受自然光照，光周期遵从自然日升日落规律；培养温度保持在25℃；待组培苗茎干粗壮、根系发达且叶片变厚呈深绿色时方可进行移栽。

5.根据权利要求1所述的培育无刺黑果枸杞的方法，其特征是：关于炼苗及移栽的最佳实施方案是移栽介质为质量比3:2的腐殖土和草炭；移栽介质121℃高压灭菌40 min，凉透的介质可用于移栽；开瓶之后立即将壮苗连同培养基一起取出，放于网眼框内置于自来水龙头下冲洗；边冲洗边从上往下挤压培养基，注意一定不要左右挤压培养基，以避免伤害植株根系；将冲洗干净的组培苗迅速置于多菌灵工作液中浸泡5 min；之后将苗栽植于盆钵中的移栽介质中，浇透蒸馏水之后覆盖带孔保鲜膜保湿；刚移栽的组培苗要置于散射光下，避免日光直射；定期浇蒸馏水保持盆土含水量为100%田间持水量，从移栽第10天开始可逐渐揭去保鲜膜；待植株明显开始生长之时再逐渐挪到自然日光下；整个过程的环境温度保持在25℃，并要定期浇灌蒸馏水以保持盆土含水量为90%～100%田间持水量。

6.根据权利要求1所述的培育无刺黑果枸杞的方法，其特征是：关于盆栽控水处理及浇灌营养液的最佳实施方案是，挑选健康且长势良好的移栽植株用于盆栽控水处理；每日浇水使盆土含水量保持在85%田间持水量，盆苗置于自然日光下，环境温度保持在25℃；在控水的同时，每隔15天浇灌一次用0.22 μm滤膜过滤除菌的1/8改进的MS营养液；注意浇灌营养液当天也要保证盆土含水量是85%田间持水量；在整个控水和浇灌营养液的过程中要保证植株不受其他生物或非生物胁迫。