CN107223152B - 具有改变的一氧化碳脱氢酶(codh)活性的遗传工程细菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有改变的一氧化碳脱氢酶(CODH)活性的遗传工程微生物和与其相关的方法。具体来说，本发明提供了一种具有降低或消除的CODH1和/或CODH2活性的遗传工程一氧化碳营养型产乙酸细菌。在某些实施方案中，所述细菌还可以具有提高的CODH/ACS活性。本发明还提供了一种用于产生产物的方法，所述方法是通过在包含一氧化碳、二氧化碳、以及氢气中的一种或多种的气体基质存在下培养所述细菌而实现的。

Description

具有改变的一氧化碳脱氢酶(CODH)活性的遗传工程细菌

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年8月11日提交的美国临时专利申请62/036,101、2014年8月11日提交的美国临时专利申请62/036,104、以及2014年8月11日提交的美国临时专利申请62/036,107的权益，这些美国临时专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。

背景技术

某些微生物可以通过使气体基质发酵而产生燃料，如乙醇；以及其它化学品，如2,3-丁二醇，所述气体基质包含一氧化碳(CO)、二氧化碳(CO₂)以及氢气(H₂)中的一种或多种。然而，这些燃料和化学品的高效生产可能受到碳基质向不合需要的副产物的转化或缓慢的微生物生长所限制。因此，仍需要具有改良的产物和/或生长特征的遗传工程微生物。

发明内容

本发明提供了具有改变的一氧化碳脱氢酶(CODH)活性的遗传工程微生物和与其相关的方法。具体来说，本发明提供了一种具有降低或消除的CODH1和/或CODH2活性的遗传工程一氧化碳营养型产乙酸细菌。本发明还提供了一种用于产生产物的方法，所述方法是通过在包含CO、CO₂、以及H₂中的一种或多种的气体基质存在下培养所述细菌来实现的。

所述细菌可以被修饰以在CODH1基因和/或CODH2基因中包含至少一个破坏性突变，这使得CODH1和/或CODH2活性降低或消除。确切地说，所述一个或多个破坏性突变可以减少或消除CODH1基因和/或CODH2基因的表达。在一个实施方案中，所述破坏性突变是基因敲除突变。

此外，所述细菌可以被修饰以具有提高的CODH/ACS活性。在一个实施方案中，所述细菌可以过表达CODH/ACS基因，这使得CODH/ACS活性提高。

所述细菌可以产生许多产物或副产物，包括乙醇、2,3-丁二醇、乙酸盐、和/或乳酸盐。在一个优选的实施方案中，所述细菌产生乙醇和2,3-丁二醇中的一种或多种。与亲本细菌相比，所述细菌还可以具有改变的生长特征，如缩短的迟缓期或提高的生长速率。优选地，与亲本细菌相比，所述细菌产生更高量的乙醇；产生更高量的2,3-丁二醇；产生更低量的乙酸盐；具有更短的迟缓期；和/或具有更高的生长速率。

所述细菌一般消耗气体基质，如包含CO、CO₂、以及H₂中的一种或多种的气体基质。所述气体基质可以源自于例如合成气或工业过程。

在一个优选的实施方案中，所述细菌衍生自自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)或拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)的亲本细菌。

附图说明

图1A-1D是示出了CODH1突变株(三角形)、CODH2突变株(十字形)、以及野生型自产乙醇梭菌DSM10061(圆圈)依靠30psi CO的生长和代谢物特征的图表。具体来说，图1A示出了生长，图1B示出了乙醇产生，图1C示出了乙酸盐产生，并且图1D示出了2,3-丁二醇产生。N＝3。误差棒＝平均值的标准误差。

图2A-2C是示出了CODH1突变株(三角形)和野生型自产乙醇梭菌DSM10061(圆圈)依靠钢厂气的生长和代谢物特征的图表。具体来说，图2A示出了生长，图2B示出了乙醇产生，并且图2C示出了乙酸盐产生。

N＝3。误差棒＝平均值的标准误差。

图3A-3C是示出了CODH1突变株(三角形)、CODH2突变株(十字形)、以及野生型自产乙醇梭菌DSM10061(圆圈)在H₂+CO₂条件下的生长和代谢物特征的图表。具体来说，图3A示出了生长，图3B示出了乙醇产生，并且图3C示出了乙酸盐产生。N＝3。误差棒＝平均值的标准误差。

图4是示出了pMTL83157-CODH/ACS的质粒图谱的示意图。

图5A-5E是示出了CODH/ACS过表达对过表达CODH/ACS(pMTL83157-CODH/ACS)的自产乙醇梭菌DSM10061(正方形)和质粒对照pMTL83157自产乙醇梭菌DSM10061(圆圈)依靠100％CO的生长和代谢物特征的影响的图表。具体来说，图5A示出了生长，图5B示出了乙酸盐产生，图5C示出了乙醇产生，图5C示出了乙醇产生，图5D示出了2,3-丁二醇产生，并且图5E示出了乳酸盐产生。N＝3。误差棒＝平均值的标准误差。

图6A-6B是示出了CODH/ACS失活的自产乙醇梭菌DSM10061(正方形)和野生型自产乙醇梭菌DSM10061(圆圈)的生长的图表。图6A示出了CODH/ACS-KO突变株不能依靠CO生长。图6B示出了CODH/ACS-KO突变株不能依靠CO₂+H₂生长。

图7A-7D是示出了CODH/ACS失活对CODH/ACS KO突变株(正方形)、以质粒pMTL83157-CODH/ACS补充的CODH/ACS KO突变株(三角形)、以及野生型(圆圈)自产乙醇梭菌DSM10061依靠果糖的生长和代谢物特征的影响的图表。具体来说，图7A示出了生长，图7B示出了乙酸盐产生，图7C示出了乙醇产生，并且图7D示出了2,3-丁二醇产生。

图8是示出了以下的示意图：CODH/ACS失活可以防止伍德-扬达尔途径(Wood-Ljungdahl pathway)用作在糖酵解期间产生的还原当量的库(sink)以使得过量的还原当量产生用于产生乙醇和2,3-丁二醇的驱动力。

具体实施方式

本发明尤其提供了具有改变的一氧化碳脱氢酶(CODH)活性的新型遗传工程微生物和与其相关的方法。

CODH酶(EC 1.2.99.2)是根据以下方程式催化CO可逆氧化成CO₂并且产生还原当量的氧化还原酶：CODH的性质是公知的并且已经在各种生物体中被描述，包括一氧化碳营养型产乙酸菌。

CODH可以被广泛地分成两类：(i)来自一氧化碳细菌的需氧Cox型Mo-Cu-Se CODH，它包含高度保守的钼活性位点并且使用氧(有时是硝酸盐)作为末端电子受体；以及(ii)厌氧型Ni-CODH，它将从CO氧化所释放的电子转移到多种生理电子受体，包括铁氧还蛋白、细胞色素、黄素氧还蛋白、红素氧还蛋白、以及NAD(P)⁺。还原当量然后可以在多个途径中被利用，包括产乙酸、产甲烷、硫酸盐还原、产氢、以及金属还原。

O₂敏感性Ni-CODH可以被进一步分成两组：(i)在CO氧化中具有生理功能的单功能CODH；以及(ii)作为使CO₂向CO部分的还原与乙酰辅酶A生物合成偶联的双功能CODH/ACS复合物的一部分的CODH。

自产乙醇梭菌例如能够使用CO作为碳和能量的唯一来源来自养生长。基因组测序揭示了这种产乙酸菌中的三种推定的Ni-CODH：CAETHG_3005(CODH1)、CAETHG_3899(CODH2)、以及CAETHG_1620-1621(AcsA，它编码双功能CODH/ACS复合物的CODH组分)。CODH1在推定的4Fe-4S铁氧还蛋白Fe-S结合蛋白和铁氧还蛋白-NAD(+)还原酶的上游遗传共定位，而CODH2似乎是孤儿。类似地，一氧化碳营养型产乙酸菌扬氏梭菌和食一氧化碳梭菌(C.carboxidivorans)也被描述具有三种CODH，即一种双功能CODH/ACS和两种另外的单功能CODH。此外，在包括扬氏梭菌、拉氏梭菌、艰难梭菌(C.difficile)以及伍氏醋酸杆菌(A.woodii)在内的所有测序的一氧化碳营养型产乙酸菌中至少发现CODH1。

现有技术一般认为包括CODH1和CODH2在内的CODH参与CO利用。举例来说，US2010/0151543描述了产乙酸梭菌内CODH的过表达如何可以增加从合成气组分到氧化核苷酸辅因子NAD⁺和NADP⁺的电子流，由此所述核苷酸辅因子(NADH和NADPH)然后刺激伍德-扬达尔途径中中间化合物的产生。

然而，本申请的发明人已经惊人地鉴定出破坏一氧化碳营养型产乙酸微生物中的CODH1和/或CODH2不会对气体利用有负面影响。实际上，本申请的发明人已经发现破坏一氧化碳营养型产乙酸微生物中的CODH1和/或CODH2会产生与未修饰的亲本微生物相比产生更高量的乙醇、产生更低量的乙酸盐、具有更短的迟缓期、和/或具有更高的生长速率的微生物。

本发明提供了一种具有降低或消除的CODH1和/或CODH2活性的遗传工程一氧化碳营养型产乙酸细菌。本发明还提供了一种用于产生产物的方法，所述方法是通过在包含CO、CO₂、以及H₂中的一种或多种的气体基质存在下培养所述细菌来实现的。

微生物

本发明的微生物是遗传工程的，即非天然存在的。术语“遗传修饰”或“遗传工程化”宽泛地指操作微生物的基因组或核酸。同样，术语“遗传工程的”指的是包含操作的基因组或核酸的微生物。遗传修饰的方法包括例如异源基因表达、基因或启动子***或缺失、核酸突变、改变的基因表达或失活、酶工程化、定向进化、基于知识的设计、随机诱变方法、基因改组、以及密码子优化。

“微生物”是微观生物体，特别是细菌、古菌、病毒、或真菌。本发明的微生物通常是细菌。如本文所用的表述“微生物”应当被认为涵盖“细菌”。

“亲本微生物”是用于产生本发明的微生物的微生物。亲本微生物可以是天然存在的微生物(即野生型微生物)或先前已经被修饰的微生物(即突变或重组微生物)。本发明的微生物可以被修饰以表达或过表达在亲本微生物中不表达或不过表达的一种或多种酶。类似地，本发明的微生物可以被修饰以含有不被亲本微生物所含的一个或多个基因。在一个实施方案中，所述亲本微生物是自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、或拉氏梭菌。在一个优选的实施方案中，所述亲本微生物是自产乙醇梭菌LZ1561，它以DSMZ保藏号DSM23693被保藏。

术语“衍生自”表示核酸、蛋白质或微生物是从不同的(例如亲本或野生型)核酸、蛋白质或微生物修饰或改造而来，以产生新的核酸、蛋白质或微生物。这些修饰或改造通常包括核酸或基因的***、缺失、突变、或取代。一般来说，本发明的微生物衍生自亲本微生物。在一个实施方案中，本发明的微生物衍生自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌。在一个优选的实施方案中，本发明的微生物衍生自自产乙醇梭菌LZ1561，它以DSMZ保藏号DSM23693被保藏。

本发明的微生物可以基于功能特征被进一步分类。举例来说，本发明的微生物可以是或可以衍生自C1固定微生物、厌氧菌、产乙酸菌、产乙醇菌、一氧化碳营养菌、和/或其组合。表1提供了微生物的代表性列表并且标识了它们的功能特征。

¹伍氏醋酸杆菌可以由果糖产生乙醇，但是不能由气体产生乙醇。

²已经报道伍氏醋酸杆菌可以依靠CO生长，但是方法是有问题的。

³尚未研究马氏梭菌是否可以依靠CO生长。

⁴热醋穆尔氏菌的一种菌株穆尔氏菌属菌种(Moorella sp.)HUC22-1已经被报道由气体产生乙醇。

⁵尚未研究卵形鼠孢菌是否可以依靠CO生长。

⁶尚未研究银醋鼠孢菌是否可以依靠CO生长。

⁷尚未研究球形鼠孢菌是否可以依靠CO生长。

“C1”指的是一碳分子，例如CO、CO₂、CH₄、或CH₃OH。“C1含氧化合物”指的是还包含至少一个氧原子的一碳分子，例如CO、CO₂、或CH₃OH。“C1碳源”指的是用作本发明的微生物的部分或唯一碳源的一碳分子。举例来说，C1碳源可以包含CO、CO₂、CH₄、CH₃OH、或CH₂O₂中的一种或多种。优选地，C1碳源包含CO和CO₂之一或这两者。“C1固定微生物”是具有由C1碳源产生一种或多种产物的能力的微生物。通常，本发明的微生物是C1固定细菌。在一个优选的实施方案中，本发明的微生物衍生自表1中所标识的C1固定微生物。

“厌氧菌”是不需要氧气来生长的微生物。如果存在高于一定阈值的氧气，那么厌氧菌可能起不利反应或甚至死亡。通常，本发明的微生物是厌氧菌。在一个优选的实施方案中，本发明的微生物衍生自表1中所标识的厌氧菌。

“产乙酸菌”是产生或能够产生乙酸盐(或乙酸)作为厌氧呼吸产物的微生物。通常，产乙酸菌是专性厌氧细菌，它们使用伍德-扬达尔途径作为它们用于能量保存以及合成乙酰辅酶A和乙酰辅酶A衍生产物，如乙酸盐的主要机制(Ragsdale,Biochim BiophysActa,1784:1873-1898,2008)。产乙酸菌使用乙酰辅酶A途径作为(1)从CO₂还原性合成乙酰辅酶A的机制；(2)末端电子接受、能量保存过程；(3)在细胞碳的合成中固定(同化)CO₂的机制(Drake,《产乙酸原核生物(Acetogenic Prokaryotes)》,《原核生物(TheProkaryotes)》,第3版,第354页,纽约州纽约(New York,NY),2006)。所有天然存在的产乙酸菌均是C1固定的、厌氧的、自养的、以及非甲烷营养的。通常，本发明的微生物是产乙酸菌。在一个优选的实施方案中，本发明的微生物衍生自表1中所标识的产乙酸菌。

“产乙醇菌”是产生或能够产生乙醇的微生物。通常，本发明的微生物是产乙醇菌。在一个优选的实施方案中，本发明的微生物衍生自表1中所标识的产乙醇菌。

“自养菌”是能够在不存在有机碳的情况下生长的微生物。相反，自养菌使用无机碳源，如CO和/或CO₂。通常，本发明的微生物是自养菌。在一个优选的实施方案中，本发明的微生物衍生自表1中所标识的自养菌。

“一氧化碳营养菌”是能够利用CO作为唯一碳源的微生物。通常，本发明的微生物是一氧化碳营养菌。在一个优选的实施方案中，本发明的微生物衍生自表1中所标识的一氧化碳营养菌。

更广泛来说，本发明的微生物可以衍生自表1中所标识的任何属或菌种。

在一个优选的实施方案中，本发明的微生物衍生自包括菌种自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、以及拉氏梭菌的梭菌属(Clostridia)的集群。这些菌种是由Abrini,ArchMicrobiol,161:345-351,1994(自产乙醇梭菌)；Tanner,Int J System Bacteriol,43:232-236,1993(扬氏梭菌)；以及Huhnke,WO 2008/028055(拉氏梭菌)首先报道并且表征的。

这三种菌种具有许多相似性。具体来说，这些菌种均是梭菌属的C1固定的、厌氧的、产乙酸型、产乙醇型、以及一氧化碳营养型成员。这些菌种具有相似的基因型和表型以及能量保存和发酵代谢的模式。此外，这些菌种聚集在具有大于99％同一的16S rRNA DNA的梭菌rRNA同源组I中；具有约22mol％-30mol％的DNA G+C含量；是革兰氏阳性的；具有相似的形态和尺寸(0.5-0.7×3-5μm的对数生长细胞)；是嗜温的(在30℃-37℃最佳生长)；具有约4-7.5的相似的pH值范围(最佳pH值是约5.5-6)；缺乏细胞色素；并且经由Rnf复合物保存能量。此外，已经证实在这些菌种中羧酸被还原成它们相应的醇(Perez,BiotechnolBioeng,110:1066-1077,2012)。重要的是，这些菌种还均显示出依靠含CO气体的强自养生长，产生乙醇和乙酸盐(或乙酸)作为主要发酵产物，并且在某些条件下产生少量的2,3-丁二醇和乳酸。

然而，这三种菌种也具有许多差异。这些菌种是从不同的来源分离的：自产乙醇梭菌来自兔肠道，扬氏梭菌来自鸡舍废物，并且拉氏梭菌来自淡水沉积物。这些菌种在对各种糖(例如鼠李糖、***糖)、酸(例如葡萄糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)、以及其它基质(例如甜菜碱、丁醇)的利用率方面有所不同。此外，这些菌种在对某些维生素(例如硫胺素、生物素)的营养缺陷方面有所不同。这些菌种在伍德-扬达尔途径基因和蛋白质的核酸序列和氨基酸序列上具有差异，尽管已经发现这些基因和蛋白质的一般组织和数量在所有菌种中是相同的(Curr Opin Biotechnol,22:320-325,2011)。

因此，综上所述，自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、或拉氏梭菌的特征中有许多不是该菌种特有的，而相反是梭菌属的这一群C1固定的、厌氧的、产乙酸型、产乙醇型、以及一氧化碳营养型成员的一般特征。然而，由于这些菌种实际上是不同的，因此对这些菌种之一的遗传修饰或操作在这些菌种中的另一种中可能没有相同的效果。举例来说，可以观测到生长、性能、或产物产生的差异。

本发明的微生物还可以衍生自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、或拉氏梭菌的分离株或突变株。自产乙醇梭菌的分离株和突变株包括JA1-1(DSM10061)(Abrini,Arch Microbiol,161:345-351,1994)、LBS1560(DSM19630)(WO 2009/064200)、以及LZ1561(DSM23693)。扬氏梭菌的分离株和突变株包括ATCC 49587(Tanner,Int J Syst Bacteriol,43:232-236,1993)、PETCT(DSM13528、ATCC 55383)、ERI-2(ATCC 55380)(US 5,593,886)、C-01(ATCC55988)(US 6,368,819)、O-52(ATCC 55989)(US 6,368,819)、以及OTA-1(Tirado-Acevedo,《使用扬氏梭菌从合成气体产生生物乙醇(Production of bioethanol from synthesisgas using C.ljungdahlii)》,PhD thesis,北卡罗来纳州立大学(North Carolina StateUniversity),2010)。拉氏梭菌的分离株和突变株包括PI 1(ATCC BAA-622、ATCC PTA-7826)(WO 2008/028055)。

酶

“CODH1”指的是根据以下方程式催化CO可逆氧化成CO₂并且产生还原当量的CODH：在本文提到“CODH1”时，应当被认为包括提到其功能上等同的变体。CODH1可以是例如自产乙醇梭菌(SEQ ID NO:1)、拉氏梭菌(SEQ ID NO:5)、扬氏梭菌(ADK13979.1)、艰难梭菌(YP_001086644.1)、或伍氏醋酸杆菌(YP_005269573)的CODH1。

“CODH2”指的是根据以下方程式催化CO可逆氧化成CO₂并且产生还原当量的CODH：在本文提到“CODH2”时，应当被认为包括提到其功能上等同的变体。CODH2可以是例如自产乙醇梭菌(SEQ ID NO:3)、拉氏梭菌(SEQ ID NO:7)、扬氏梭菌(ADK14854.1)、粪味梭菌(SEQ ID NO:9)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(AAK78101.1和AAK80452.1)、食一氧化碳梭菌“P7”(ZP_05390164.1)、生氢氧化碳嗜热菌(C.hydrogenoformans)(ABB14220.1、ABB14432.1以及ABB15066.1)、或拜氏梭菌(C.beijerinckii)(YP_001310115.1)的CODH2。此外，CODH2同源物可以存在于肉毒梭菌(C.botulinum)(CBO_2218；A5I3Y9)中，但是不存在于产气荚膜梭菌(C.perfringens)、热纤梭菌(C.thermocellum)、巴氏梭菌(C.pasteurianum)、或克氏梭菌(C.kluyveri)中。

双功能“CODH/ACS”是产乙酸细菌独有的并且除了CO的可逆氧化之外，还催化从CO、甲基、以及辅酶A合成乙酰辅酶A。CODH/ACS酶复合物由多个亚基组成：CODH亚基(AcsA)；ACS亚基(AcsB)；类咕啉铁硫蛋白大亚基(AcsC)；类咕啉铁硫蛋白小亚基(AcsD)；甲基转移酶亚基(AcsE)；以及CODH辅助蛋白(CooC)。本申请的发明人已经发现提高CODH/ACS的活性水平会提高生长和/或产物形成。惊人的是，CODH/ACS复合物的单个CODH亚基的过表达足以提高复合物的活性。

CODH/ACS的AcsB亚基可以是例如自产乙醇梭菌(CAETHG_1608基因、WP_023162339.1蛋白质)、扬氏梭菌(CLJU_c37550基因、WP_013240359.1蛋白质)、拉氏梭菌(HQ876032.1基因、AEI90761.1蛋白质)、食一氧化碳梭菌(Ccar3245基因、WP_007061841.1)、粪味梭菌(WP_029162953.1蛋白质)、艰难梭菌(CD0728基因、WP_021369307.1蛋白质)、以及伍氏醋酸杆菌(Awo_c10760基因、WP_014357691.1蛋白质)的AcsB。

CODH/ACS的AcsC亚基可以是例如自产乙醇梭菌(CAETHG_1610基因、WP_023162341.1蛋白质)、扬氏梭菌(CLJU_c37570基因、WP_013240361.1蛋白质)、拉氏梭菌(HQ876032.1基因、AEI90763.1蛋白质)、食一氧化碳梭菌(Ccar3247基因、WP_007061843.1蛋白质)、粪味梭菌(WP_029162955.1蛋白质)、艰难梭菌(CD0730基因、WP_021369309.1蛋白质)、或伍氏醋酸杆菌(Awo_c10720基因、WP_014357687.1蛋白质)的AcsC。

CODH/ACS的AcsD亚基可以是例如自产乙醇梭菌(CAETHG_1611基因、WP_023162342.1蛋白质)、扬氏梭菌(CLJU_c37580基因、WP_013240362.1蛋白质)、拉氏梭菌(HQ876032.1基因、AEI90764.1蛋白质)、食一氧化碳梭菌(Ccar3248基因、WP_007061844.1蛋白质)、粪味梭菌(WP_029162956.1蛋白质)、艰难梭菌(CD0731基因、WP_021369310.1蛋白质)、或伍氏醋酸杆菌(Awo_c10710基因、WP_014357686.1蛋白质)的AcsD。

CODH/ACS的AcsE亚基可以是例如自产乙醇梭菌(CAETHG_1609基因、WP_023162340.1蛋白质)、扬氏梭菌(CLJU_c37560基因、WP_013240360.1蛋白质)、拉氏梭菌(HQ876032.1基因、AEI90762.1蛋白质)、食一氧化碳梭菌(Ccar3246基因、WP_007061842.1蛋白质)、粪味梭菌(WP_029162954.1蛋白质)、艰难梭菌(CD0729基因、WP_021369308.1蛋白质)、或伍氏醋酸杆菌(Awo_c10730基因、WP_014357688.1蛋白质)的AcsE。

CODH/ACS的CooC辅助蛋白可以是例如自产乙醇梭菌(CAETHG_1612基因、WP_023162343.1蛋白质)、扬氏梭菌(CLJU_c37590基因、WP_013240363.1蛋白质)、拉氏梭菌(HQ876032.1基因、AEI90765.1蛋白质)、食一氧化碳梭菌(Ccar3249基因、WP_007061845.1蛋白质)、粪味梭菌(WP_029162957.1蛋白质)、艰难梭菌(CD0732基因、WP_021369311.1蛋白质)、或伍氏醋酸杆菌(Awo_c10709基因、WP_014357685.1蛋白质)的CooC。

提供CODH1、CODH2、以及CODH/ACS的序列信息以鉴定适用于本发明的示例性序列并且允许本领域技术人员在没有过度实验的情况下实施本发明的具体实施方案。应当了解的是，CODH1、CODH2以及CODH/ACS的核酸序列和氨基酸序列可以随微生物而不同。因此，本发明不应当被视为限于这些具体序列和实施方案，而是延及本文所提到的任何具体CODH1、CODH2、或CODH/ACS的功能上等同的变体，包括其它菌株和菌种中的同源物。

术语“变体”包括序列不同于参考核酸和蛋白质的序列，如现有技术中所公开的或本文所举例说明的参考核酸和蛋白质的序列的核酸和蛋白质。本发明可以使用与参考核酸或蛋白质发挥基本上相同功能的变体核酸或蛋白质来实施。举例来说，变体蛋白质可以与参考蛋白质发挥基本上相同的功能或催化基本上相同的反应。变体基因可以与参考基因编码相同的或基本上相同的蛋白质。变体启动子可以与参考启动子具有基本上相同的促进一个或多个基因表达的能力。

这样的核酸或蛋白质在本文可以被称为“功能上等同的变体”。举例来说，核酸的功能上等同的变体可以包括等位基因变体、基因的片段、突变基因、多态性等。来自其它微生物的同源基因也是功能上等同的变体的实例。这些包括诸如丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、或扬氏梭菌的菌种中的同源基因，这些基因的细节可在诸如基因库(Genbank)或NCBI的网站上公开获得。功能上等同的变体还包括序列由于针对特定微生物所进行的密码子优化而变化的核酸。核酸的功能上等同的变体将优选地与参考核酸具有至少约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、或更大的核酸序列同一性(同源性百分比)。蛋白质的功能上等同的变体将优选地与参考蛋白质具有至少约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、或更大的氨基酸同一性(同源性百分比)。变体核酸或蛋白质的功能等同性可以使用本领域已知的任何方法来评价。举例来说，用于评估CODH1、CODH2、CODH/ACS以及其变体的活性的酶测定法包括进行CODH的厌氧纯化，继而使用甲基紫精作为电子受体，分光光度测量在604nm处吸光度的变化(Ragsdale,J Biol Chem,258:2364-2369,1983)。

本发明的微生物具有改变的CODH1、CODH2、和/或CODH/ACS活性。“酶活性”或简称“活性”广泛地指酶活性，包括但不限于酶的活性、酶的量、或酶催化反应的可用性。因此，“提高”酶活性包括提高酶的活性、提高酶的量、或提高酶催化反应的可用性。类似地，“降低”或“减少”酶活性包括降低酶的活性、降低酶的量、或降低酶催化反应的可用性。在一个实施方案中，CODH1和/或CODH2的功能或活性降低。在另一个实施方案中，CODH1和/或CODH2的功能或活性被消除或基本上被消除。在另一个实施方案中，CODH/ACS的功能或活性提高。在一个相关实施方案中，CODH/ACS的一个或多个亚基或辅助蛋白的功能或活性提高，特别是CODH亚基的功能或活性。

作为一种方法，酶活性的变化可以通过使编码蛋白质的基因突变来实现。“突变”指的是在本发明的微生物中与作为本发明的微生物的来源的野生型微生物或亲本微生物相比已经被修饰的核酸或蛋白质。在一个实施方案中，所述突变可以是编码酶的基因中的缺失、***、或取代。在另一个实施方案中，所述突变可以是酶中一个或多个氨基酸的缺失、***或取代。

具体来说，“破坏性突变”是减少或消除(即“破坏”)基因或酶的表达或活性的突变。破坏性突变可以使基因或酶部分失活、完全失活、或缺失。破坏性突变可以是基因敲除(KO)突变，由此使得基因或蛋白质不起作用。破坏性突变可以是减少、防止、或阻断由酶产生的产物的生物合成的任何突变。破坏性突变可以包括例如编码酶的基因中的突变、参与编码酶的基因的表达的遗传调节元件中的突变、产生减少或抑制酶活性的蛋白质的核酸的引入、或抑制酶表达的核酸(例如反义RNA、siRNA、CRISPR)或蛋白质的引入。本发明的微生物通常在CODH1基因和/或CODH2基因中包含至少一个破坏性突变。与亲本微生物相比，这样的突变可以降低或消除CODH1基因和/或CODH2基因的表达。

可以使用本领域已知的任何方法来引入破坏性突变。具体来说，可以通过将外来DNA靶向***到编码序列中来使基因永久失活以引入破坏性突变。可以使用被称为ClosTron的遗传工具来将内含子(1.8kb)稳定***到指定的基因座中。确切地说，ClosTron利用来自乳酸乳球菌(L.lactis)的移动II型内含子Ll.ltrB经由RNA介导的反转录归巢(retro-homing)机制来繁殖到指定位点中的特异性(Heap,J Microbiol Meth,80:49-55,2010)。另一种方法涉及转移具有同源臂的质粒以通过利用同源重组使部分或全部基因永久缺失。举例来说，可以使用被称作“ACE”或等位基因偶联交换的遗传方法(Heap,NuclAcids Res,40:e59,2012)来实现这一缺失而不依赖于使用反向选择标记。

在一些实施方案中，本发明的微生物具有提高的CODH/ACS活性与降低或消除的CODH1和/或CODH2活性的组合。具体来说，所述微生物可以过表达CODH/ACS基因。在本文，“CODH/ACS基因”指的是编码CODH/ACS酶复合物的任何亚基或辅助蛋白的任何基因。在一个优选的实施方案中，所述微生物表达编码CODH/ACS酶复合物的CODH亚基的基因。“过表达”指的是在本发明的微生物中与作为本发明的微生物的来源的野生型微生物或亲本微生物相比核酸或蛋白质的表达增加。过表达可以通过本领域已知的任何手段来实现，包括改变基因拷贝数、基因转录速率、基因翻译速率、或酶降解速率。

可以使用本领域已知的任何方法将核酸递送到本发明的微生物中。举例来说，核酸可以作为裸核酸被递送或可以用一种或多种试剂，如脂质体来配制。在适当时，核酸可以是DNA、RNA、cDNA或其组合。在某些实施方案中可以使用限制性酶切抑制剂。另外的载体可以包括质粒、病毒、噬菌体、粘粒、以及人工染色体。在一个优选的实施方案中，使用质粒将核酸递送到本发明的微生物中。举例来说，可以通过电穿孔、超声处理、聚乙二醇介导的转化、化学或自然感受态、原生质体转化、原噬菌体诱导或缀合来实现转化(包括转导或转染)。在具有活性限制性内切酶***的某些实施方案中，可能需要在将核酸引入到微生物中之前将所述核酸甲基化。

此外，核酸可以被设计成包含调节元件，如启动子以提高或以其它方式控制特定核酸的表达。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。理想的是，所述启动子是伍德-扬达尔途径启动子、铁氧还蛋白启动子、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合物操纵子启动子、ATP合酶操纵子启动子、或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。

可以对本发明的核酸进行密码子优化以在特定的菌株或菌种，特别是自产乙醇梭菌(包括自产乙醇梭菌LZ1561)、扬氏梭菌或拉氏梭菌中表达。“密码子优化”指的是核酸，如基因的突变，所述突变用于使所述核酸在特定的菌株或菌种中的翻译得到优化或改良。密码子优化可以引起更快的翻译速率或更高的翻译准确性。

生长和产物

本发明的微生物与作为它的来源的亲本微生物相比具有改变的生长和/或代谢特征。举例来说，与亲本微生物相比，所述微生物可以产生更高量的乙醇；产生更高量的2,3-丁二醇；产生更低量的乙酸盐；具有更短的迟缓期；和/或具有更高的生长速率。

本发明的微生物可以具有改变的迟缓期。“迟缓期”或“生长迟缓期”指的是微生物的培养物或群体在接种之后达到早期对数生长期或对数/指数生长期所花费的时间量。在一个实施方案中，所述微生物与亲本微生物相比具有更短的迟缓期。举例来说，所述微生物可以具有比亲本微生物的迟缓期短约20％、25％、或30％的迟缓期。在一个实施方案中，所述微生物具有比亲本微生物的迟缓期短约25％至30％的迟缓期。在其它实施方案中，所述微生物可以具有为亲本微生物的迟缓期的约1/3、1/5、或1/8的迟缓期。在一个实施方案中，所述迟缓期可以比亲本微生物的迟缓期短约7.8天至8天。在另一个实施方案中，所述迟缓期可以是约1天-4天或更短或约2.9天或更短。在一些情况下，所述微生物可以比亲本微生物具有显著更短的迟缓期。举例来说，所述微生物可以具有为亲本微生物的迟缓期的约1/10、1/50、1/100或1/200的迟缓期。在一个实施方案中，所述迟缓期可以是约0.1天或更短。

本发明的微生物可以具有改变的生长速率。“生长速率”或“生长的速率”指的是微生物的培养物或群体随时间增加的速率。生长速率在本文通常使用单位h^-1来表示。在一个实施方案中，所述微生物与亲本微生物相比具有提高或更高的生长速率。举例来说，所述微生物可以具有比亲本微生物的生长速率高约20％、40％、60％、80％、或100％的生长速率。在某些实施方案中，所述微生物具有为亲本微生物的生长速率的约2倍、3倍、4倍或5倍的生长速率。

本发明的微生物可以产生改变量的生物质。“生物质”指的是由生长或发酵过程产生的微生物的集合群体。在一个实施方案中，与亲本微生物的发酵相比，所述微生物的发酵产生增加或更高量的生物质。举例来说，与亲本微生物的发酵相比，所述微生物的发酵可以多产生约20％、30％、40％、50％、80％、100％、120％、150％、180％、200％或220％的生物质。在一个实施方案中，与亲本微生物的发酵相比，所述微生物的发酵多产生约200％至220％的生物质。

本发明的微生物可以产生改变量的乙醇。在一个实施方案中，与亲本微生物相比，所述微生物产生增加或更高量的乙醇。举例来说，与亲本微生物相比，所述微生物可以多产生约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、或120％的乙醇。在一个实施方案中，与亲本微生物相比，所述微生物多产生约20％至113％的乙醇。

本发明的微生物可以产生改变量的2,3-丁二醇。在一个实施方案中，与亲本微生物相比，所述微生物产生增加或更高量的2,3-丁二醇。举例来说，与亲本微生物相比，所述微生物可以多产生约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、220％、240％、260％、270％、280％、300％、320％、或340％的2,3-丁二醇。在一个实施方案中，与亲本微生物相比，所述微生物多产生约220％至230％的2,3-丁二醇。在另一个实施方案中，与亲本微生物相比，所述微生物多产生至少约330％的2,3-丁二醇。在另一个实施方案中，与亲本微生物相比，所述微生物多产生约300％至330％的2,3-丁二醇。在另一个实施方案中，所述微生物产生约0.5g/L-20g/L的2,3-丁二醇。

本发明的微生物可以产生改变量的乙酸盐。术语“乙酸盐”包括单独的乙酸盐以及分子或游离乙酸和乙酸盐的混合物这两者。在一个实施方案中，与亲本微生物相比，所述微生物产生降低或更低量的乙酸盐。举例来说，与亲本微生物相比，所述微生物可以少产生约10％、20％、30％、40％、或50％的乙酸盐。在一个实施方案中，与亲本微生物相比，所述微生物少产生约18％至37％的乙酸盐。在另一个实施方案中，所述微生物产生约0g/L-5g/L的乙酸盐。

本发明的微生物可以产生改变量的乳酸盐。在一个实施方案中，与亲本微生物相比，所述微生物产生降低或更低量的乳酸盐。

在一个特别优选的实施方案中，与亲本微生物相比，本发明的微生物产生增加量的乙醇和/或2,3-丁二醇以及降低量的乙酸盐。

本文所述的微生物和方法可以用于提高发酵过程的效率。“提高效率”、“提高的效率”等包括但不限于提高微生物生长速率、产物产生速率或体积、每单位所消耗的基质体积的产物体积、或产物选择性。效率可以相对于作为本发明的微生物的来源的亲本微生物的性能来测量。

本发明的微生物还可以产生一种或多种另外的产物。举例来说，自产乙醇梭菌产生或可以被工程化以产生乙醇(WO 2007/117157)、乙酸盐(WO 2007/117157)、丁醇(WO2008/115080和WO 2012/053905)、丁酸盐(WO 2008/115080)、2,3-丁二醇(WO 2009/151342)、乳酸盐(WO 2011/112103)、丁烯(WO 2012/024522)、丁二烯(WO 2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(WO 2012/024522和WO 2013/185123)、乙烯(WO 2012/026833)、丙酮(WO2012/115527)、异丙醇(WO 2012/115527)、脂质(WO 2013/036147)、3-羟基丙酸盐(3-HP)(WO 2013/180581)、异戊二烯(WO 2013/180584)、脂肪酸(WO 2013/191567)、2-丁醇(WO2013/185123)、1,2-丙二醇(WO 2014/0369152)、以及1-丙醇(WO 2014/0369152)。在某些实施方案中，微生物生物质本身可以被认为是产物。

本发明还提供了用于产生一种或多种产物，如乙醇和/或2,3-丁二醇的方法，所述方法是通过培养本发明的微生物而实现的。本发明还提供了用于减少来自工业过程的总大气碳排放的方法，所述方法是通过使用本发明的微生物将工业废气中的CO、CO₂和/或H₂转化成有用产物而实现的。

基质

“基质”指的是本发明的微生物的碳源和/或能量源。通常，所述基质是气体并且包含C1碳源，例如CO、CO₂、和/或CH₄。优选地，所述基质包含CO或CO+CO₂的C1碳源。所述基质还可以包含其它非碳组分，如H₂、N₂或电子。

所述基质一般包含至少一定量的CO，如约1mol％、2mol％、5mol％、10mol％、20mol％、30mol％、40mol％、50mol％、60mol％、70mol％、80mol％、90mol％、或100mol％的CO。所述基质可以包含一定范围的CO，如约20mol％-80mol％、30mol％-70mol％、或40mol％-60mol％的CO。优选地，所述基质包含约40mol％-70mol％的CO(例如钢厂气或高炉气)、约20mol％-30mol％的CO(例如碱性氧气转炉气)、或约15mol％-45mol％的CO(例如合成气)。在一些实施方案中，所述基质可以包含相对低量的CO，如约1mol％-10mol％或1mol％-20mol％的CO。本发明的微生物通常将基质中CO的至少一部分转化成产物。在一些实施方案中，所述基质不含或基本上不含CO。

所述基质可以包含一定量的H₂。举例来说，所述基质可以包含约1mol％、2mol％、5mol％、10mol％、15mol％、20mol％、或30mol％的H₂。在一些实施方案中，所述基质可以包含相对高量的H₂，如约60mol％、70mol％、80mol％、或90mol％的H₂。在另外的实施方案中，所述基质不含或基本上不含H₂。富含H₂的气流可以例如经由烃的蒸汽重整，特别是天然气的蒸汽重整；煤或烃的部分氧化、水的电解、以及来自用于产生氯的电解池和来自炼油厂或化学物流的捕集副产物而产生。

所述基质可以包含一定量的CO₂。举例来说，所述基质可以包含约1mol％-80mol％或1mol％-30mol％的CO₂。在一些实施方案中，所述基质可以包含少于约20mol％、15mol％、10mol％、或5mol％的CO₂。在另一个实施方案中，所述基质不含或基本上不含CO₂。富含CO₂的气流包括例如来自烃燃烧，如天然气或石油燃烧的废气；来自氨、石灰或磷酸盐生产的副产物；以及天然二氧化碳井。

尽管基质通常是气体，但是所述基质还可以替代形式提供。举例来说，可以使用微泡分散发生器将基质溶解在用含CO气体饱和的液体中。再举例来说，可以使基质吸附到固体载体上。

所述基质和/或C1碳源可以是作为工业过程的副产物或从某种其它来源，如从汽车尾气或生物质气化获得的废气。在某些实施方案中，所述工业过程选自由以下各项组成的组：铁金属产品制造(如钢厂制造)、非铁产品制造、石油炼制过程、煤气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产、以及焦炭制造。在这些实施方案中，所述基质和/或C1碳源可以在将它排放到大气中之前，使用任何简便的方法从工业过程来捕集。

所述基质和/或C1碳源可以是合成气，如通过煤或炼油厂残渣的气化、生物质或木质纤维素材料的气化、或天然气的重整所获得的合成气。在另一个实施方案中，所述合成气可以由城市固体废物或工业固体废物的气化而获得。

所述基质的组成可能对反应的效率和/或成本具有显著的影响。举例来说，氧气(O₂)的存在可能会降低厌氧发酵过程的效率。根据所述基质的组成，可能期望处理、洗涤、或过滤基质以去除任何不希望有的杂质，如毒素、不希望有的组分、或尘粒、和/或增加所期望的组分的浓度。

基质和遗传修饰的影响

所述基质的组成可能影响本发明的微生物的生长和/或代谢特征。举例来说，与依靠CO₂+H₂生长的微生物相比，依靠CO生长的微生物可以具有不同的生长和/或代谢特征。此外，遗传修饰的特定组合可能影响本发明的微生物的生长和/或代谢特征。举例来说，与在CODH2基因中包含破坏性突变的微生物相比，在CODH1基因中包含破坏性突变的微生物可以具有不同的生长和/或代谢特征，与在CODH1基因和CODH2基因这两者中包含破坏性突变的微生物相比，所述在CODH2基因中包含破坏性突变的微生物可以具有不同的生长和/或代谢特征。在这些微生物中的任一种中CODH/ACS的过表达可以进一步改变所述微生物的生长和/或代谢特征。在策略上组合遗传修饰并且使微生物依靠特定基质生长可以产生适合于特定应用或生产目标的生长和/或代谢特征。

使CODH1基因敲除菌株依靠CO生长一般引起生物质产生减少、乙酸盐产生减少、乙醇产生增加、以及相似的2,3-丁二醇产生。使CODH1基因敲除菌株依靠CO₂+H₂生长一般引起迟缓期缩短以及更快的生长。举例来说，依靠CO₂+H₂生长的CODH1基因敲除菌株可以没有迟缓期并且可以产生约0.4g/L的生物质。

使CODH2基因敲除菌株依靠CO生长一般引起迟缓期缩短、乙醇产生减少、乙酸盐产生减少、以及增加或相似的2,3-丁二醇产生。举例来说，依靠CO生长的CODH2基因敲除菌株可以具有2天-4天的迟缓期并且可以产生约0.1g/L-4g/L的乙酸盐。使CODH2基因敲除菌株依靠CO₂+H₂生长一般引起迟缓期缩短以及更快的生长。举例来说，依靠CO₂+H₂生长的CODH2基因敲除菌株可以具有4天的迟缓期。

使CODH/ACS过表达菌株依靠CO生长一般引起迟缓期缩短、乙醇产生增加、相似的乙酸盐产生、以及乳酸盐产生增加。

发酵

通常，在生物反应器中进行培养。术语“生物反应器”包括由一个或多个容器、塔、或管道布置组成的培养/发酵装置，如连续搅拌釜式反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器、或适用于气-液接触的其它容器或其它装置。在一些实施方案中，所述生物反应器可以包括第一生长反应器和第二培养/发酵反应器。可以将基质提供到这些反应器之一或这两者中。如本文所用的术语“培养”和“发酵”可互换使用。这些术语涵盖了培养/发酵过程的生长期和产物生物合成期这两者。

一般将培养物维持在含有足以容许微生物生长的营养素、维生素、和/或矿物质的水性培养基中。优选地，水性培养基是厌氧微生物生长培养基，如基本厌氧微生物生长培养基。合适的培养基是本领域公知的。

所述培养/发酵应当理想地在用于产生目标产物的适当条件下进行。通常，所述培养/发酵在厌氧条件下进行。要考虑的反应条件包括压力(或分压)、温度、气体流速、液体流速、培养基pH值、培养基氧化还原电位、搅拌速率(如果使用连续搅拌釜式反应器的话)、接种物水平、确保液相中的气体不会成为限制的最大气体基质浓度、以及避免产物抑制的最大产物浓度。具体来说，可以控制基质的引入速率以确保液相中气体的浓度不成为限制，这是因为产物可能会在气体受限的条件下被培养物消耗。

在高压下操作生物反应器允许从气相向液相的气体质量传递的速率增加。因此，一般优选在高于大气压的压力下进行培养/发酵。而且，由于给定的气体转化率部分地随基质保留时间而变化并且保留时间决定了生物反应器的所需体积，因此使用加压***可以大幅减小所需的生物反应器的体积，并且因此减少培养/发酵设备的资金成本。这进而意味着在将生物反应器维持在高压而不是大气压时可以缩短保留时间，所述保留时间被定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速。最佳的反应条件将部分地取决于所使用的具体微生物。然而，一般来说，优选在高于大气压的压力下操作发酵。而且，由于给定的气体转化率部分地随基质保留时间而变化，并且实现所期望的保留时间进而要求生物反应器具有所需的体积，因此使用加压***可以大幅减小所需的生物反应器的体积，并且因此减少发酵设备的资金成本。

可以使用本领域已知的任何方法或方法的组合从发酵液中分离或纯化目标产物，所述方法包括例如分馏、蒸发、全蒸发、气提、相分离、以及萃取发酵，包括例如液-液萃取。在某些实施方案中，通过连续地从生物反应器中取出一部分发酵液，(方便地通过过滤)从所述发酵液中分离微生物细胞，并且从所述发酵液中回收一种或多种目标产物来从发酵液中回收目标产物。可以例如通过蒸馏回收醇和/或丙酮。可以例如通过吸附在活性炭上来回收酸。优选地将分离的微生物细胞放回生物反应器中。还优选地将在已经去除了目标产物之后剩余的无细胞渗透物放回生物反应器中。在使所述无细胞渗透物回到生物反应器中之前，可以将另外的营养素(如B族维生素)添加到所述无细胞渗透物中以补充培养基。

实施例

下列实施例进一步说明了本发明，但是当然，不应当被解释为以任何方式限制它的范围。

实施例1

这个实施例描述了参与自产乙醇梭菌DSM10061中的碳固定的CODH1基因和CODH2基因的基于II型内含子的***失活。

自产乙醇梭菌DSM10061是从DSMZ(德国布伦瑞克英豪丰大街7B的德国微生物和细胞培养物保藏中心(邮编：38124)(German Collection of Microorganisms and CellCultures,Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig,Germany))获得的。大肠杆菌缀合菌株CA434是由Nigel Minton教授(英国的诺丁汉大学(University of Nottingham,UK))友情提供的。

自产乙醇梭菌DSM10061的基因组编码一氧化碳脱氢酶(CODH)CODH1(SEQ ID NO:1和2)和CODH2(SEQ ID NO:3和4)。使用ClosTron II型内含子介导的基因破坏工具使这些CODH失活(Heap,J Microbiol Meth,80:49-55,2010)。使用在ClosTron网站上托管的Perutka算法来分别鉴定出CODH1基因和CODH2基因的有义链上的碱基600/601之间和528/529之间的II型内含子靶位点。使用相同的算法来设计CODH1(SEQ ID NO:15)和CODH2(SEQID NO:16)的内含子靶向区域，这些区域由DNA2.0公司(加利福尼亚州)商业合成并且在pTML007C-E2载体(HQ263410.1)中递送。最终载体pMTL007C-E2-CODH1-600！601s和pMTL007C-E2-CODH2-528！529s含有反转录转座激活ermB标记(RAM)，它在***到靶位点中时赋予对抗生素克拉霉素(clarithromycin)的抗性。

如上文和WO 2012/053905中所述将pMTL007C-E2-CODH1-600！601s和pMTL007C-E2-CODH2-528！529s质粒引入到自产乙醇梭菌DSM10061中。将转化混合物在YTF琼脂培养基上点样并且在厌氧工作站内在37℃孵育。在24小时之后，将细胞刮落并且重悬于500μL的PBS中并且涂铺在补充有7.5μg/mL的甲砜霉素(thiamphenicol)(西格玛公司(Sigma))的YTF琼脂培养基上。使用7.5μg/mL的甲砜霉素选择转化株。在孵育3天之后观测到菌落。

首先在补充有7.5μg/mL甲砜霉素和10μg/mL甲氧苄啶(trimethoprim)的YTF培养基上，继而在含有6μg/mL克拉霉素的YTF培养基上依次进行单个菌落的划线接种。使用侧接寡核苷酸，通过PCR(Maxime PCR预混合试剂盒)针对II型***来随机筛选>8个菌落。

使用侧接寡核苷酸扩增克拉霉素抗性菌落和凝胶电泳分析显示存在更大的ClosTron条带(>2kb)，而不是更小的野生型条带(<520bp)，这表明ClosTron II型内含子已经成功地***指定的CODH位点(CODH1::CTermB-601s和CODH2::CTermB-529s)中。将这些扩增子使用QIAquick PCR纯化试剂盒(快而精公司(Qiagen))纯化并且通过桑格测序(Sangersequencing)(英国的Source Bioscience公司(Source Bioscience,UK))进行序列验证。

作为最终的验证步骤，对PCR验证的克隆进行DNA印迹分析以确认单一ClosTron***。根据Bertram,Arch Microbiol,151:551-557,1989分离ClosTron突变株的基因组DNA，然后用限制性内切酶HindIII消化所述基因组DNA。使用随机标记的DIG探针(罗氏公司(Roche))对消化物进行DNA印迹分析，并且根据制造商的说明书进行。使用寡核苷酸EBS2(SEQ ID NO:27)和内含子-SalI-R1(SEQ ID NO:28)以使用质粒pMTL007C-E2作为模板来产生探针。所得的探针与II型内含子杂交。DNA印迹分析检测到每个突变克隆的单个条带，这表明II型内含子***到自产乙醇梭菌DSM10061的基因组中的单个事件。这些验证的突变株被称作CODH1::CTermB-601s(或“CODH1突变株”)和CODH2::CTermB-529s(或“CODH2突变株”)。

实施例2

这个实施例表明了在CO条件下培养的自产乙醇梭菌DSM10061中CODH1失活的作用。

在一式三份的250mL血清瓶中测试CODH1突变株用100％CO自养生长的能力，所述血清瓶容纳50mL PETC培养基并且用30psi CO加压。将0.5OD600当量的活性培养物接种到每一个血清瓶中并且收集液相样品以在600nm的波长下测量OD以及通过HPLC分析代谢物。

通过使用装备有在35℃操作的RID(折射率检测器)和保持在60℃的Alltech IOA-2000有机酸柱(150mm×6.5mm，粒度：5μm)的Agilent 1100系列HPLC***进行HPLC来对代谢物进行分析。以0.7毫升/分钟的流速使用略微酸化的水(0.005M H₂SO₄)作为流动相。为了去除蛋白质和其它细胞残余物，将400μl样品与100μl的2％(w/v)5-磺基水杨酸混合并且以14,000×g离心3分钟以分离沉淀的残余物。然后将10μl上清液注射到HPLC中以进行分析。

如图1A-1D中所示，CODH1突变株以乙醇增加的形式表现出有利的代谢物特征，这是以生物质(少42％)和乙酸盐的形成作为代价。与野生型相比，CODH1突变株多产生64％的乙醇(图1B)，少产生25％的乙酸盐(图1C)，并且产生相似的2,3-丁二醇(图1D)。

当在来自新西兰格兰布鲁克(Glenbrook,New Zealand)的钢厂的包含51.24％CO、31.22％N₂、11.98％CO₂、以及3.05％H₂的钢厂气中培养CODH1突变株和WT时也观测到类似的模式。在一式三份的250mL血清瓶中进行实验，所述血清瓶容纳100mL PETC培养基并且用钢厂气加压到30psi。在依靠(钢厂气中的)CO生长方面，CODH1突变株比WT多产生113％的乙醇(图2B)，这再次是以生物质(少17％)(图2A)和乙酸盐(少18％)(图2C)作为代价。

实施例3

这个实施例表明了在CO条件下培养的自产乙醇梭菌DSM10061中CODH2失活的作用。

在上文所述的与CODH1突变株相同的条件下测试CODH2突变株在100％CO中自养生长的能力。与WT相比，在利用100％CO作为基质时，CODH2突变株显示迟缓期缩短了1天(图1A)。CODH2突变株的早期指数期发生在第3.8天，相比之下，WT的指数期发生在第4.8天(图1A)。CODH2突变株比WT少产生27％的乙酸盐(图1C)并且少产生27％的乙醇(图1B)。然而，CODH2突变株的峰值2,3-丁二醇产量高于WT(图1D)。

实施例4

这个实施例表明了在H₂+CO₂条件下培养的自产乙醇梭菌DSM10061中CODH1或CODH2失活的作用。

为了测试CODH1突变株和CODH2突变株在氢气和二氧化碳中生长的能力，将WT和CODH突变株按一式三份分别接种到250mL血清瓶中的50mL PETC培养基(不含果糖)中，并且用20psi H₂+10psi CO₂交换顶空。使培养物在37℃在搅拌下生长并且收集样品以用于OD600测量和HPLC分析。

在H₂+CO₂条件下，与WT相比，CODH1突变株显示出显著改良的生长特征。WT在第22.7天达到0.184的最大OD600之前经历6天的迟缓期，而CODH1突变株能够在没有明显的迟缓期的情况下生长并且在第1.6天达到0.40的最大OD600(图3A)。CODH2突变株比WT显示出更短的迟缓期和更快的生长并且达到0.20的峰值OD600(图3A)。HPLC分析显示在H₂+CO₂条件下CODH1突变株、CODH2突变株、以及WT产生非常相似水平的乙酸盐和乙醇(图3B-5C)。

实施例5

这个实施例描述了在CO条件下培养的自产乙醇梭菌DSM10061中CODH1和CODH2的组合失活的预期作用。

鉴于CODH1突变株在CO条件下的所期望的代谢物特征以及CODH1突变株和CODH2突变株在CO条件和H₂+CO₂条件这两者下的迟缓期缩短，CODH1和CODH2的组合失活可能产生在自养条件下具有优越的生长和代谢物特征的菌株。虽然不希望受任何具体理论所束缚，但是这两种CODH的失活可能提高CO和/或CO₂对于与CODH/ACS的反应的可用性并且使得更有效地形成乙酰辅酶A。

举例来说，可以使用等位基因偶联交换或ACE(Heap,Nucl Acids Res,40:e59,2012)产生双重CODH(即CODH1和CODH2)破坏。使用这种技术，可以使自产乙醇梭菌DSM10061的pyrE基因(SEQ ID NO:19)缺失以使得pyrE可以用作阳性和阴性选择标记以用于遗传操作的后期阶段。具有缺失的pyrE的突变株是尿嘧啶营养缺陷型的并且对前药5'-氟乳清酸具有抗性。作为下一步，可以将靶向CODH之一的ClosTron质粒引入到pyrE缺失突变株中，并且可以通过PCR、测序、以及DNA印迹法验证克拉霉素抗性菌落。一旦已经在这一pyrE缺失突变株中确认了一种CODH的ClosTron失活，就可以引入含有pyrE作为阴性选择标记的ACE缺失质粒以使另一种CODH缺失。作为最后一步，可以引入具有pyrE基因的ACE质粒以恢复pyrE完整性，从而产生在具有功能性pyrE基因的WT背景下组合的CODH1和CODH2破坏突变株。

实施例6

这个实施例表明了CODH/ACS过表达质粒的构建以及将所述质粒引入自产乙醇梭菌DSM10061中。

自产乙醇梭菌DSM 10061是从DSMZ(德国布伦瑞克英豪丰大街7B的德国微生物和细胞培养物保藏中心(邮编：38124))获得的。大肠杆菌菌株DH5α-T1^R和XL1-Blue MRF'分别购自英杰公司(Invitrogen)和Stratagene公司。

伍德-扬达尔启动子(P_WL)(SEQ ID NO:18)和双功能一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶(CODH/ACS)亚基AcsA(SEQ ID NO:12)和AcsB(SEQ ID NO:14)(这两者来自自产乙醇梭菌DSM10061)的DNA序列是由基因组测序获得的。发现自产乙醇梭菌的伍德-扬达尔簇在自养条件下高表达(Curr Opin Biotechnol,22:320-325,2011)，因此使用P_WL表达CODH/ACS。

使用Bertram,Arch Microbiol,151:551-557,1989的修改方法分离来自自产乙醇梭菌DSM10061的基因组DNA。收集100ml过夜培养物(6,000×g，15分钟，4℃)，用磷酸钾缓冲液(10mM，pH 7.5)洗涤并且悬浮在1.9mlSTE缓冲液(50mM Tris-HCl、1mM EDTA、200mM蔗糖；pH 8.0)中。添加300μl溶菌酶(约100,000U)并且将混合物在37℃孵育30分钟，继而添加280μl的10％(w/v)SDS溶液并且再孵育10分钟。在室温通过添加240μl的EDTA溶液(0.5M，pH8)、20μl Tris-HCl(1M，pH 7.5)以及10μlRNA酶A(富酶泰斯公司(Fermentas))来消化RNA。然后，添加100μl蛋白酶K(0.5U)并且在37℃进行蛋白水解，持续1小时-3小时。最终，添加600μl的高氯酸钠(5M)，继而进行苯酚-氯仿萃取和异丙醇沉淀。用分光光度测定法对DNA的量和质量进行检查。

通过PCR，使用Phusion高保真DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司(New EnglandBiolabs))扩增CODH/ACS基因和P_WL。使用NotI和NdeI限制性酶切位点以及菌株DH5α-T1^R(英杰公司)将扩增的573bp P_WL克隆到大肠杆菌-梭菌穿梭载体pMTL 83151(基因库登录号：FJ797647；Nigel Minton,诺丁汉大学；Heap,J Microbiol Meth,78:79-85,2009)中，从而产生质粒pMTL83157。由于CODH/ACS的编码序列含有一个内部NdeI位点，因此使用拼接重叠(SOE)PCR(Warrens,Gene,186:29-35,1997)去除这一NdeI位点而不改变密码子。将CODH/ACS的1946bp PCR产物和质粒pMTL83157这两者使用NdeI和SacI消化，并且连接以产生质粒pMTL83157-CODH/ACS(图4)(SEQ ID NO:20)。

使用寡核苷酸CODH/ACS-NdeI-F(SEQ ID NO:31)和CODH/ACS-SacI-R(SEQ ID NO:32)对表达质粒pMTL83157-CODH/ACS的***序列进行完全测序。使用引物CODH/ACS-NdeI-F和CODH/ACS-SacI-R的桑格测序确认CODH/ACS的内部NdeI位点被成功改变并且不含突变。

靶标	寡核苷酸
		P<sub>WL</sub>	P<sub>WL</sub>-NotI-F
P<sub>WL</sub>	P<sub>WL</sub>-NdeI-R
		CODH/ACS	CODH/ACS-NdeI-F
CODH/ACS	CODH/ACS-SacI-R
		CODH/ACS	CODH/ACS-SOE-B
CODH/ACS	CODH/ACS-SOE-C

通过与作为供体的供体大肠杆菌菌株CA434缀合来将质粒pMTL83157和pMTL83157-CODH/ACS引入自产乙醇梭菌DSM10061中。将供体菌株在补充有25μg/mL氯霉素(chloramphenicol)和100μg/mL壮观霉素(spectinomycin)的LB培养基中培养过夜。通过离心收集来自1.5mL培养物的细胞并且在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤。在厌氧工作站内，将供体细胞沉淀物重悬在200μL指数生长的接受体自产乙醇梭菌DSM10061中。将缀合混合物在YTF琼脂培养基上点样并且在厌氧工作站内在37℃孵育。在24小时之后，将细胞刮落并且重悬于500μL的PBS中并且涂铺在补充有7.5μg/mL甲砜霉素(西格玛公司)和10μg/mL甲氧苄啶(西格玛公司)的YTF琼脂培养基上。使用7.5μg/mL甲砜霉素选择自产乙醇梭菌转化缀合株，而使用10μg/mL甲氧苄啶反向选择大肠杆菌CA434菌株。在孵育3天之后观测到菌落并且将它们重新划线接种到相同的选择性琼脂培养基上以进行纯化。

同样，可以使用相似的方案将质粒引入其它一氧化碳营养型产乙酸菌，如扬氏梭菌或拉氏梭菌中。

为了检查转化缀合株的身份，将16s rRNA扩增并且使用寡核苷酸Univ-0027-F(SEQ ID NO:25)和Univ-1492-R(SEQ ID NO:26)进行桑格测序。将质粒DNA从自产乙醇梭菌转化缀合株中提取并且转化到大肠杆菌XL1-Blue MRF'(Stratagene公司)中，之后进行质粒限制性酶切消化分析。这通常被称为‘质粒拯救’，这是因为从梭菌中分离的质粒对于限制性酶切消化分析来说没有足够的质量。从pMTL83157转化缀合株中拯救的经过PmeI和FseI限制性酶切消化的质粒的凝胶电泳显示存在预期的片段(2600bp和2424bp)。从pMTL83157-CODH/ACS转化缀合株中拯救的经过NdeI和SacI限制性酶切消化的质粒的凝胶电泳显示存在预期的片段(4995bp和1932bp)。

实施例7

这个实施例表明了在CO条件下培养的自产乙醇梭菌DSM10061中CODH/ACS过表达的作用。

在使用CO作为唯一的碳源和能量源的分批生长实验中比较CODH/ACS的过表达相对于质粒对照(pMTL83157)的作用。在100％CO下，与质粒对照相比，CODH/ACS过表达菌株显示生长迟缓期缩短了4.2天，多产生21％的乙醇，并且产生2.7倍的乳酸盐滴度，同时产生相似量的乙酸盐(图5A-5E)。

使这两种菌株在100％CO中自养生长并且在一式三份的250mL血清瓶中测试，所述血清瓶容纳50mL PETC培养基并且用30psi CO加压。补充甲砜霉素达到最终浓度7.5μg/mL。将OD₆₀₀值0.5的活性培养物接种到每一个血清瓶中并且收集液相样品以在600nm的波长下测量OD以及通过HPLC分析代谢物。

使用装备有在35℃操作的RID(折射率检测器)和保持在35℃的Biorad AminexHPX-87H柱(1300mm×7.8mm，粒度9μm)的Varian ProStar HPLC***对代谢物进行分析。以0.5毫升/分钟的流速使用略微酸化的水(0.005M H₂SO₄)作为流动相。为了去除蛋白质和其它细胞残余物，将样品以14000rpm离心5分钟并且用Spartan 13/0.2RC过滤器过滤上清液。然后将20μl上清液注射到HPLC中以进行分析。

实施例8

这个实施例描述了在CO条件下培养的扬氏梭菌中CODH/ACS过表达的预期作用。

也可以将上文所述的CODH/ACS过表达质粒引入扬氏梭菌中。可以使扬氏梭菌依靠100％CO生长。在这些条件下，过表达CODH/ACS的扬氏梭菌应当显示生长迟缓期缩短，同时使乙醇和乳酸盐产量提高至少20％。

实施例9

这个实施例描述了在CO₂+H₂条件下培养的自产乙醇梭菌中CODH/ACS过表达的预期作用。

可以使自产乙醇梭菌的CODH/ACS过表达菌株和质粒对照菌株在PETC-MES培养基上在存在作为碳和能量的唯一来源的80％CO₂和20％H₂的情况下生长。在这些条件下，过表达CODH/ACS的自产乙醇梭菌应当显示生长迟缓期缩短，以及乙醇和乳酸盐产量提高至少20％。

实施例10

这个实施例表明了自产乙醇梭菌DSM10061中CODH/ACS的失活。

使用ClosTron II型内含子介导的基因破坏工具(Heap,J Microbiol Meth,80:49-55,2010)使自产乙醇梭菌DSM10061的上游CODH/ACS(CAETHG_1621)失活。使用在ClosTron网站上托管的Perutka算法鉴定CAETHG_1621的有义链上的碱基142/143之间的II型内含子靶位点。使用相同的算法来设计内含子靶向区域(SEQ ID NO:17)，该区域由DNA2.0公司(加利福尼亚州)商业合成并且在pTML007C-E2载体(基因库登录号：HQ263410.1)中递送。最终载体pMTL007C-E2-CODH/ACS-142！143s含有反转录转座激活ermB标记(RAM)，它在***到靶位点中时赋予对抗生素克拉霉素的抗性。

如上文所述使pMTL007C-E2-CODH/ACS-142！143s质粒缀合到自产乙醇梭菌DSM10061中。使用7.5μg/mL甲砜霉素选择自产乙醇梭菌转化缀合株，而使用10μg/mL甲氧苄啶反向选择大肠杆菌CA434菌株。在孵育3天之后观测到菌落。首先在补充有7.5μg/mL甲砜霉素和10μg/mL甲氧苄啶的YTF培养基上，继而在含有6μg/mL克拉霉素的YTF培养基上依次进行单个菌落的划线接种。通过PCR(Maxime PCR预混合试剂盒)，使用侧接寡核苷酸针对II型***随机筛选>8个菌落。

使用侧接寡核苷酸扩增克拉霉素抗性菌落以及凝胶电泳分析显示存在更大的ClosTron条带(>2kb)而不是更小的野生型条带(<520bp)，这表明ClosTron II型内含子成功***指定的CODH/ACS位点中。将这些扩增子使用QIAquick PCR纯化试剂盒(快而精公司)纯化并且通过桑格测序(英国的Source Bioscience公司)进行序列验证。

作为最终的验证步骤，对PCR验证的克隆进行DNA印迹分析以确认单一ClosTron***。根据Bertram,Arch Microbiol,151:551-557,1989分离ClosTron突变株的基因组DNA，然后用限制性内切酶HindIII消化所述基因组DNA。使用随机标记的DIG探针(罗氏公司)对消化物进行DNA印迹分析。使用寡核苷酸EBS2(SEQ ID NO:27)和内含子-SalI-R1(SEQ IDNO:28)以使用质粒pMTL007C-E2作为模板产生探针。所得的探针与II型内含子杂交。DNA印迹分析检测到每个突变克隆的单个条带，这表明II型内含子***到自产乙醇梭菌DSM10061的基因组中的单个事件。验证的突变株被称作CODH/ACS::CTermB-143s(或“CODH/ACS KO突变株”)。对于补充测定，使过表达质粒pMTL83157-CODH/ACS缀合到CODH/ACS KO突变株中。

因此，CODH/ACS是为自产乙醇梭菌的自养生长(CO或H₂+CO₂)所需的。

实施例11

这个实施例表明了在果糖上生长的自产乙醇梭菌DSM10061中CODH/ACS失活的作用。

虽然在CODH/ACS酶失活之后自产乙醇梭菌不能依靠CO(图6A)或CO₂和H₂(图6B)生长，但是所述菌株仍能在诸如果糖的糖上生长。惊人的是，已发现在这些条件下，CODH/ACS失活的菌株停止产生乙酸盐。这是特别惊人的，因为乙酸盐形成通常是产乙酸菌的一个标志性特征。在异养生长期间，产乙酸菌通常在H₂存在下在CODH/ACS和来自伍德-扬达尔途径(也被称为还原乙酰辅酶A途径)的其它基因的作用下将CO₂(在糖代谢期间产生)固定到生物质和产物中。

在N₂气氛下在250mL血清瓶中按一式三份培养CODH/ACS失活突变株、补充菌株、以及WT自产乙醇梭菌DSM10061，所述血清瓶容纳补充有10g/L果糖(最终浓度)的50mL PETC培养基。将0.5OD₆₀₀当量的活性培养物接种到每一个血清瓶中并且收集液相样品以在600nm的波长下测量OD以及通过HPLC分析代谢物。

CODH/ACS的失活使峰值OD₆₀₀从4.53的WT水平显著降低了61％，达到1.77(图7A)。这还伴有CODH/ACS KO突变株的生长迟缓期延长(图7A)。在KO突变株中通过pMTL83157-CODH/ACS的质粒表达补充CODH/ACS活性使峰值OD₆₀₀增加到3.11并且还使生长迟缓期缩短到更接近WT水平(图7A)。

CODH/ACS KO突变株的一个惊人的特征是缺乏乙酸盐产生，这是因为在第2.8天时仅短暂检测到2.61mM的乙酸盐(图7B)。相反，WT在第3.0天时产生多达85.96mM的乙酸盐(图7B)。

在没有显著的乙酸盐产生的情况下，在CODH/ACS KO突变株中来自果糖的大部分的碳转向还原产物乙醇和2,3-丁二醇。CODH/ACS的失活使峰值乙醇水平从48.3mM的WT水平提高了113％，达到102.7mM(图7C)。此外，CODH/ACS KO突变株的峰值2,3-丁二醇水平也比WT高138％(10.95mM对比4.61mM)(图7D)。在CODH/ACS KO突变株中补充质粒pMTL83157-CODH/ACS的表达成功地使乙酸盐、乙醇、以及2,3-丁二醇水平恢复到更接近WT水平(图7B-7D)，这确认了CODH/ACS在自产乙醇梭菌中在异养生长期间的作用。

不希望受任何具体理论所束缚，看来CODH/ACS失活防止伍德-扬达尔途径用作在糖酵解期间产生的还原当量的库以使得过量的还原当量产生用于产生乙醇和2,3-丁二醇的驱动力(图8)。

序列说明

本文所提到的核酸序列和氨基酸序列简要汇总如下。

本文所引用的包括出版物、专利申请、以及专利在内的所有参考文献在此以引用的方式并入，该引用的程度就如同每一篇参考文献被单独地和具体地指示以引用的方式并入并且在本文整体阐述一般。在本说明书中对任何现有技术的提及不是并且不应当被视作承认该现有技术构成了任何国家在此研究领域中的公知常识的一部分。

除非在本文中另外指明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求书的上下文中)术语“一个/种(a)”和“一个/种(an)”和“所述”以及类似的指代对象的使用应当被理解为包括单数和复数这两种形式。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”以及“含有”应当被理解为开放性术语(即，意指“包括但不限于”)。除非在本文中另外指明，否则在本文中对值的范围的表述仅意图用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值被并入到本说明书中，如同它在本文中被单独叙述一般。除非在本文中另外指明或另外与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以按照任何合适的顺序进行。除非另外要求，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“如”)的使用仅意图更好地阐明本发明而不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言不应当被理解成将任何未要求保护的要素指示为对实施本发明来说是必要的。

在本文描述了本发明的优选的实施方案。在阅读上述说明时，那些优选的实施方案的变化方案对于本领域的普通技术人员来说可以变得显而易见。本申请的发明人期望本领域技术人员在适当时利用这些变化方案，并且本申请的发明人意图以除本文具体描述的方式之外的方式来实施本发明。因此，本发明包括如由适用法律所允许的所附权利要求书中所叙述的主题的所有改动方案和等同方案。此外，除非本文另外指明或另外与上下文明显矛盾，否则其所有可能的变化方案中上述要素的任何组合由本发明所涵盖。

序列表

<110> 朗泽科技新西兰有限公司

<120> 具有改变的一氧化碳脱氢酶（CODH）活性的遗传工程细菌

<130> LT105WO1

<150> 62/036,101

<151> 2014-08-11

<150> 62/036,104

<151> 2014-08-11

<150> 62/036,107

<151> 2014-08-11

<160> 36

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 626

<212> PRT

<213> 自产乙醇梭菌

<400> 1

Met Ser Asn Asn Lys Ile Cys Lys Ser Ala Asp Lys Val Leu Glu Lys

1 5 10 15

Phe Ile Gly Ser Leu Asp Gly Val Glu Thr Ser His His Arg Val Glu

20 25 30

Ser Gln Ser Val Lys Cys Gly Phe Gly Gln Leu Gly Val Cys Cys Arg

35 40 45

Leu Cys Ala Asn Gly Pro Cys Arg Ile Thr Pro Lys Ala Pro Arg Gly

50 55 60

Val Cys Gly Ala Ser Ala Asp Thr Met Val Ala Arg Asn Phe Leu Arg

65 70 75 80

Ala Val Ala Ala Gly Ser Gly Cys Tyr Ile His Ile Val Glu Asn Thr

85 90 95

Ala Arg Asn Val Lys Ser Ile Gly Glu Thr Gly Gly Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Met Asn Ala Leu Asn Thr Leu Ala Glu Lys Leu Gly Ile Thr Glu Ser

115 120 125

Asp Pro His Lys Lys Ala Val Leu Val Ala Asp Ala Val Leu Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Lys Pro Lys Phe Glu Lys Met Glu Val Ile Asn Lys Leu Ala

145 150 155 160

Tyr Ala Pro Arg Leu Glu Asn Trp Asn Lys Leu Asn Ile Met Pro Gly

165 170 175

Gly Ala Lys Ser Glu Val Phe Asp Gly Val Val Lys Thr Ser Thr Asn

180 185 190

Leu Asn Ser Asp Pro Val Asp Met Leu Leu Asn Cys Leu Lys Leu Gly

195 200 205

Ile Ser Thr Gly Ile Tyr Gly Leu Thr Leu Thr Asn Leu Leu Asn Asp

210 215 220

Ile Val Leu Gly Glu Pro Ala Ile Arg Pro Ala Lys Val Gly Phe Lys

225 230 235 240

Val Val Asp Thr Asp Tyr Ile Asn Leu Met Ile Thr Gly His Gln His

245 250 255

Ser Met Ile Ala His Leu Gln Glu Glu Leu Val Lys Pro Glu Ala Val

260 265 270

Lys Lys Ala Gln Ala Val Gly Ala Lys Gly Phe Lys Leu Val Gly Cys

275 280 285

Thr Cys Val Gly Gln Asp Leu Gln Leu Arg Gly Lys Tyr Tyr Thr Asp

290 295 300

Val Phe Ser Gly His Ala Gly Asn Asn Phe Thr Ser Glu Ala Leu Ile

305 310 315 320

Ala Thr Gly Gly Ile Asp Ala Ile Val Ser Glu Phe Asn Cys Thr Leu

325 330 335

Pro Gly Ile Glu Pro Ile Ala Asp Lys Phe Met Val Lys Met Ile Cys

340 345 350

Leu Asp Asp Val Ser Lys Lys Ser Asn Ala Glu Tyr Val Glu Tyr Ser

355 360 365

Phe Lys Asp Arg Glu Lys Ile Ser Asn His Val Ile Asp Thr Ala Ile

370 375 380

Glu Ser Tyr Lys Asn Arg Arg Ser Lys Val Thr Met Asn Ile Pro Lys

385 390 395 400

Asn His Gly Phe Asp Asp Val Ile Thr Gly Val Ser Glu Gly Ser Leu

405 410 415

Lys Ser Phe Leu Gly Gly Ser Trp Lys Pro Leu Val Asp Leu Ile Ala

420 425 430

Ala Gly Lys Ile Lys Gly Val Ala Gly Ile Val Gly Cys Ser Asn Leu

435 440 445

Thr Ala Lys Gly His Asp Val Phe Thr Val Glu Leu Thr Lys Glu Leu

450 455 460

Ile Lys Arg Asn Ile Ile Val Leu Ser Ala Gly Cys Ser Ser Gly Gly

465 470 475 480

Leu Glu Asn Val Gly Leu Met Ser Pro Gly Ala Ala Glu Leu Ala Gly

485 490 495

Asp Ser Leu Lys Glu Val Cys Lys Ser Leu Gly Ile Pro Pro Val Leu

500 505 510

Asn Phe Gly Pro Cys Leu Ala Ile Gly Arg Leu Glu Ile Val Ala Lys

515 520 525

Glu Leu Ala Glu Tyr Leu Lys Ile Asp Ile Pro Gln Leu Pro Leu Val

530 535 540

Leu Ser Ala Pro Gln Trp Leu Glu Glu Gln Ala Leu Ala Asp Gly Ser

545 550 555 560

Phe Gly Leu Ala Leu Gly Leu Pro Leu His Leu Ala Ile Ser Pro Phe

565 570 575

Ile Gly Gly Ser Lys Val Val Thr Lys Val Leu Cys Glu Asp Met Glu

580 585 590

Asn Leu Thr Gly Gly Lys Leu Ile Ile Glu Asp Asp Ile Ile Lys Ala

595 600 605

Ala Asp Lys Leu Glu Glu Thr Ile Leu Ala Arg Arg Lys Ser Leu Gly

610 615 620

Leu Asn

625

<210> 2

<211> 1881

<212> DNA

<213> 自产乙醇梭菌

<400> 2

atgtcaaata acaaaatttg taaatcagca gataaggtac ttgaaaagtt tataggttct 60

ctagatggtg tagaaacttc tcatcatagg gtagaaagcc aaagtgttaa atgtggtttt 120

ggtcagctag gagtctgctg tagactctgt gcaaacggtc cctgtaggat aacacctaaa 180

gctccaagag gagtatgtgg tgctagtgct gataccatgg ttgcaagaaa ctttcttaga 240

gctgtagctg ccggcagtgg atgttatatt catatagtcg aaaatacagc tagaaacgta 300

aaatccatag gtgaaaccgg cggcgagata aaaggaatga atgctctcaa tacactggca 360

gaaaaattag gtataacaga atctgaccca cataaaaaag ctgtactagt agctgatgcc 420

gtattaaagg acttatacaa accaaaattt gaaaaaatgg aagttataaa taaattagct 480

tatgcaccta gactagaaaa ttggaacaaa ttaaatataa tgcctggcgg tgcaaaatca 540

gaagtttttg atggtgtagt aaaaacttct acaaatctaa acagtgaccc tgtagatatg 600

cttctaaatt gtttaaaact tggaatatcc actggaattt atggacttac ccttacaaat 660

ttattaaatg acatagtttt aggtgaacct gctataagac ctgcaaaagt tggttttaaa 720

gttgtagata cggattatat aaatttgatg ataacaggcc accagcactc catgattgcc 780

catcttcaag aagaacttgt aaaacctgaa gctgtaaaaa aggcccaagc agttggtgct 840

aaaggattca aactagttgg atgtacctgt gtaggacagg atttacagtt aagaggtaaa 900

tactatactg atgttttctc cggccatgca ggaaataatt ttacaagtga agccttaata 960

gcaactggag gtatagatgc aatagtatct gaattcaact gtactcttcc tggcatcgag 1020

ccaatagctg ataagttcat ggttaaaatg atatgcctag atgacgtttc taaaaaatca 1080

aatgcagaat atgtagaata ttcctttaaa gatagagaaa aaataagcaa ccatgttata 1140

gatacagcta ttgaaagcta taagaacaga agatctaaag ttacaatgaa tattcctaaa 1200

aaccatggct ttgatgacgt cataacaggt gtaagtgaag gttccttaaa atctttctta 1260

ggtggcagct ggaaacctct agtagactta attgctgctg gaaaaattaa aggtgttgct 1320

ggaatagtag gttgttcaaa cttaactgcc aaaggtcatg atgtatttac agtagaactt 1380

acaaaagaac ttataaagag aaatataatt gtgctttctg caggttgttc aagtggtgga 1440

cttgaaaatg taggacttat gtctccagga gctgctgaac ttgcaggaga tagcttaaaa 1500

gaagtatgta agagcctagg aataccacct gtactaaatt ttggtccatg tcttgctatt 1560

ggaagattgg aaattgtagc aaaagaacta gcagaatatc taaaaataga tattccacag 1620

cttccacttg tactttctgc acctcaatgg cttgaagaac aagcattagc agatggaagt 1680

tttggtcttg cccttggatt accacttcac cttgctatat ctccttttat tggtggaagt 1740

aaagtggtaa caaaagtttt atgtgaagac atggaaaatc taacaggcgg caagcttata 1800

atagaagacg atataataaa agctgcagat aaattagaag aaaccatact tgcaagaagg 1860

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<213> 自产乙醇梭菌

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Glu Lys Ile Arg Cys Lys Phe Cys Leu Glu Gly Leu Ser Cys Gln Leu

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Leu Lys Asn Ile Met Gly Ala Gly Thr Tyr Ser His His Ala Tyr Glu

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Ile Lys Asp Leu Asp Lys Leu Lys Trp Met Cys Gln Lys Val Gly Ile

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Ala Val Leu Lys Ala Leu Gly Asn Lys Leu Asp Pro Leu Val Asp Val

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Ile Lys Ala Gly Lys Ile Lys Gly Ile Val Ala Leu Ala Asn Cys Ser

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Met Asn Ala Leu Asn Thr Leu Ala Glu Lys Leu Gly Ile Thr Glu Ser

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Gln Lys Ala Ile Ala Gly Phe Ser Thr Glu Ala Val Leu Gly Ala Leu

420 425 430

Gly Asn Lys Leu Asp Pro Leu Val Asp Val Ile Ala Ala Gly Lys Ile

435 440 445

Lys Gly Val Val Ala Leu Ala Asn Cys Ser Thr Leu Arg Asn Gly Pro

450 455 460

Gln Asp Trp Val Thr Ile Asn Leu Thr Lys Glu Leu Ile Lys Lys Asp

465 470 475 480

Ile Leu Val Val Ser Gly Gly Cys Gly Asn His Ala Leu Glu Val Ala

485 490 495

Gly Leu Cys Thr Val Glu Ala Ala Asn Glu Leu Ala Gly Glu Gly Leu

500 505 510

Lys Glu Val Cys Asn Met Leu Lys Ile Pro Pro Val Leu Ser Phe Gly

515 520 525

Thr Cys Thr Asp Thr Gly Arg Ile Ser Met Leu Val Thr Ala Leu Ala

530 535 540

Asp His Leu Asp Val Asp Val Ser Asp Leu Pro Ile Ala Val Thr Ala

545 550 555 560

Pro Glu Trp Met Glu Gln Lys Ala Thr Ile Asp Gly Ile Phe Ala Leu

565 570 575

Ala Tyr Gly Ala Tyr Thr His Leu Ser Pro Thr Pro Phe Met Thr Gly

580 585 590

Ala Pro Gln Leu Val Glu Leu Leu Thr Lys Lys Val Glu Asp Val Thr

595 600 605

Gly Gly Lys Ile Ala Leu Gly Asp Asn Pro Val Glu Val Ala Asn Asn

610 615 620

Ile Glu Ala His Ile Ile Ser Lys Arg Lys Gly Leu Gly Leu Ser

625 630 635

<210> 10

<211> 1920

<212> DNA

<213> 粪味梭菌

<400> 10

atgagtgaaa ctatactaga aaaatcagaa ggtagagtaa gttatcatga ttctgtagaa 60

gaaatgatca aaagaattag agaagatgga atgtctaatg catttgatag atatgcactt 120

caagacaaaa ttaggtgcaa attttgcctt gagggtttaa gttgtcaatt atgttcaaat 180

ggtccatgta gaataagtga gaaaacaggt caaactaaag gtgtatgtgg aatatctgct 240

gatgcaatgg caatgagaaa ttttctttta aaaaatataa tgggcgcagg tacatatagt 300

catcatgctt atgaagcttt tagaacattg aaagctacag cagaaggaaa aactccattt 360

aaaattacag atgtaaataa acttaaatgg atgtgtgaaa aagtaggtat aaatacaaat 420

caagaaatca atgatatggc catagaatta gctgttctac ttgaagatca acaaataatt 480

ggtatagaag ataagaacat catgattgaa gcttttgcac caaaaaaaag aaaagaatta 540

tggaggaaac tagatatata tcctggtgga acagttcacg aagaacaaaa ttgtgtagct 600

agttgtctta caaatgtaga tggaagccat gtttctttag ctatgaaagc tcttagactc 660

ggtatagcaa ctatatataa ttctcaaata ggtctagaaa tggttcaaga catattattt 720

ggaacaccaa ccccacatga agttaatatg gatttaggaa ttatggaccc agaatatgta 780

aacatagtat ttaatggtca tcaaccttgg cctggagttg ccactatatt aaaagcaaga 840

actaaagaag ttcaagaaaa agcaaaagct gctggtgcta aaggacttag aatagttggt 900

tcaatagaaa cagggcaaga attattgcaa agatttgaaa tagatgatgt atttgtgggt 960

catatgggaa actggcttac tatagaacca ttgttagcta ctggtactgt agatgtcttt 1020

gcaatggaag aaaattgctc gccaccagct attgatatgt atgctgaaaa atatcaagta 1080

actttagtat ctgtaagtac tataattgat ctaccaggtc ttgatgaaaa aattccttat 1140

gatccttcta aagtgaacgc tatggctgat agattaattg aacttgctat acaaaatttt 1200

aaaaagagaa aagaaagaaa tattcaacca atggttccta aaaaaattca aaaagctata 1260

gctgggttct caactgaagc tgtgttaggc gctcttggaa ataaacttga tcctttagta 1320

gatgtaatag ctgctgggaa aattaaggga gttgtagctc ttgcaaattg ttctacttta 1380

agaaatggtc ctcaagactg ggttacaata aatcttacaa aagagcttat aaaaaaagat 1440

atattagttg ttagtggtgg ctgtggaaat catgctcttg aagttgcagg attatgtaca 1500

gtagaagcag ctaatgaatt agctggtgaa ggattaaaag aagtatgcaa tatgttaaaa 1560

atccctccag tactaagctt tggaacctgt actgatacag gtagaatatc tatgcttgtt 1620

actgctctag cagatcattt ggatgttgat gtatctgacc ttccaatagc tgttactgct 1680

ccagaatgga tggagcaaaa agcaaccata gatggaattt ttgcattagc ctatggagct 1740

tatactcatt tatctcctac tccttttatg acaggagctc ctcagcttgt agagcttcta 1800

actaaaaaag tagaagatgt aacaggtgga aaaatcgcac taggagataa tcctgttgag 1860

gttgcaaaca atatagaggc tcacataata agtaaaagaa aagggttagg attaagttaa 1920

<210> 11

<211> 400

<212> PRT

<213> 粪味梭菌

<400> 11

Met Glu Glu Lys Ala Lys Ser Ile Asp Gln Ala Thr Leu Gln Leu Leu

1 5 10 15

Asp Lys Ala Lys Gln Asp Gly Val Glu Thr Val Trp Asp Arg Lys Ala

20 25 30

Asp Met Lys Val Gln Cys Gly Phe Gly Ser Ala Gly Val Cys Cys Arg

35 40 45

Asn Cys Ser Met Gly Pro Cys Arg Val Ser Pro Val Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Val Glu Arg Gly Ile Cys Gly Ala Thr Ala Asp Val Ile Val Ser Arg

65 70 75 80

Asn Phe Ala Arg Met Val Ala Ala Gly Thr Ala Ala His Ser Asp His

85 90 95

Gly Arg Ser Ile Ala Leu Ser Leu Tyr His Thr Ser Lys Asp Gly Asp

100 105 110

Ile Lys Val Lys Asp Glu Asn Lys Leu Lys Glu Val Ala Lys Ser Phe

115 120 125

Asn Val Glu Thr Glu Gly Arg Asp Ile Tyr Asp Ile Ala His Asp Val

130 135 140

Ala Lys Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Gly Lys Gln Leu Gly Glu Val Thr

145 150 155 160

Leu Pro Pro Ser Leu Pro Glu Lys Arg Lys Glu Leu Trp Arg Lys Leu

165 170 175

Gly Val Tyr Pro Arg Ala Val Asp Arg Glu Ile Ala Ala Val Met His

180 185 190

Ser Thr His Ile Gly Cys Asn Ala Asp Ala Glu Ala Met Ile Lys Met

195 200 205

Ser Met Arg Cys Ser Leu Thr Asp Gly Trp Met Gly Ser Phe Met Gly

210 215 220

Thr Glu Phe Ser Asp Ile Met Phe Gly Thr Pro His Ser Ile Asp Thr

225 230 235 240

Glu Ala Asn Leu Gly Val Leu Glu Lys Asn Ser Val Asn Val Val Leu

245 250 255

His Gly His Glu Pro Leu Leu Ser Glu Met Val Val Glu Ala Ala Ser

260 265 270

Asp Pro Glu Leu Val Glu Leu Ala Lys Ser Val Gly Ala Asp Gly Ile

275 280 285

Asn Leu Cys Gly Met Cys Cys Thr Gly Asn Glu Val Ser Met Arg His

290 295 300

Gly Ile Lys Ile Ala Gly Asn Phe Met Gln Gln Glu Leu Ala Val Val

305 310 315 320

Thr Gly Ala Val Asp Gly Leu Ile Val Asp Val Gln Cys Ile Met Pro

325 330 335

Ala Leu Ala Lys Leu Ser Lys Ser Tyr His Thr Lys Phe Ile Thr Thr

340 345 350

Ser Pro Lys Ala His Ile Thr Asp Ser Ile Tyr Met Glu Phe Asp Glu

355 360 365

Glu Asn Pro Leu Asp Ser Ala Lys Lys Ile Leu Lys Glu Ala Ile Leu

370 375 380

Asn Phe Lys Asn Arg Asp Gln Ser Lys Val Met Ile Pro Glu Leu Lys

385 390 395 400

<210> 12

<211> 1278

<212> DNA

<213> 粪味梭菌

<400> 12

atggaagaaa aagcaaaatc aattgatcag gctactttac aattattgga caaggcaaaa 60

caagatgggg tcgaaacagt ttgggataga aaagcagaca tgaaggtaca gtgtggattt 120

ggatcagcag gagtttgctg tagaaattgc agcatgggcc catgtagagt aagtccagtg 180

ccaggaaaag gtgtagaaag aggtatatgt ggagctacag cagatgtaat tgtatctaga 240

aattttgcaa gaatggttgc agcaggtact gcagcacact cagatcatgg tagaagtata 300

gcacttagct tgtatcacac tagtaaagat ggagatataa aagttaaaga tgaaaataaa 360

ttgaaagaag ttgcaaagag ctttaatgtt gaaactgagg gaagagatat atatgacata 420

gctcatgatg tagcaaaaga aggattaagt aattatggta aacagcttgg agaagttact 480

ttaccacctt ctttaccaga aaagagaaaa gaattgtgga gaaaattagg tgtatatcca 540

agggcagttg atagagaaat agctgcagtt atgcattcaa cacatatagg atgtaatgca 600

gatgcagaag ctatgattaa aatgtctatg agatgttcac taactgatgg atggatgggc 660

tcattcatgg gaacagaatt cagtgatata atgtttggaa cacctcattc cattgataca 720

gaggcaaatc ttggagtact tgaaaagaat tctgtaaatg tagttttaca cggacatgaa 780

ccacttcttt cagaaatggt agtagaagca gcatcagatc cagagttagt tgaacttgct 840

aaatcagtag gtgctgatgg aataaattta tgtggaatgt gctgtactgg aaatgaagtt 900

tccatgagac atggcatcaa aatagcagga aactttatgc agcaggaatt ggctgtagtt 960

acaggagcag tagatggact tatagttgat gtacagtgta ttatgccagc actagcaaaa 1020

ttgtccaagt catatcatac taagtttata acaacttcac caaaggcaca catcacagat 1080

tcaatttata tggaatttga tgaagaaaac ccacttgatt cagctaagaa gattctaaaa 1140

gaagcaatat taaactttaa aaatagagat cagagcaaag taatgattcc tgaattgaaa 1200

tgaaaggcaa ttttgggata cagtgttgaa gaaattataa ataaattaga caaggttgta 1260

aatacacaaa taggacca 1278

<210> 13

<211> 227

<212> PRT

<213> 粪味梭菌

<400> 13

Met Gly Tyr Ser Val Glu Glu Ile Ile Asn Lys Leu Asp Lys Val Val

1 5 10 15

Asn Thr Gln Ile Gly Pro Met Gln Thr Val Lys Pro Leu Ala Asp Val

20 25 30

Leu Val Ser Gly Val Leu Arg Gly Ala Ala Ala Val Val Gly Cys Asn

35 40 45

Asn Pro Lys Val Val Gln Asp Ser Ala His Ile Glu Thr Ile Lys Gly

50 55 60

Leu Ile Lys Asn Asp Val Ile Val Val Val Thr Gly Cys Ala Ala Gln

65 70 75 80

Ala Ala Ala Lys Tyr Gly Leu Leu Gln Lys Glu Ala Ala Glu Lys Tyr

85 90 95

Ala Gly Pro Gly Leu Ala Thr Val Cys Lys Leu Val Asp Ile Pro Pro

100 105 110

Val Leu His Met Gly Ser Cys Val Asp Ile Ser Arg Ile Leu Asp Leu

115 120 125

Val Gly Arg Val Ala Asn Leu Leu Gly Val Asp Met Ser Asp Leu Pro

130 135 140

Val Ala Gly Val Ala Pro Glu Trp Met Ser Glu Lys Ala Val Ala Ile

145 150 155 160

Gly Thr Tyr Val Val Thr Ser Gly Ile Asp Thr Trp Leu Gly Val Ala

165 170 175

Pro Pro Val Thr Gly Gly Pro Glu Val Val Asp Ile Leu Thr Asn Lys

180 185 190

Met Glu Asp Trp Val Gly Ala Lys Phe Phe Ile Glu Thr Asp Pro His

195 200 205

Lys Ala Val Glu Gln Ile Val Asn Arg Met Asn Glu Lys Arg Lys Lys

210 215 220

Leu Gly Ile

225

<210> 14

<211> 617

<212> DNA

<213> 粪味梭菌

<400> 14

atgcaaactg taaaaccttt ggcagatgtt ttagtatcag gagtattaag aggtgctgca 60

gctgtggttg gatgtaataa tcctaaagtt gtacaagatt ctgcacacat tgaaactata 120

aaaggattaa taaaaaatga tgtaattgtt gttgttacag gttgtgcagc tcaagcagca 180

gcaaaatatg gcttattaca aaaagaagca gcagaaaaat atgcaggacc aggactagct 240

actgtatgta aacttgtaga cataccacct gtacttcata tgggttcttg tgttgatata 300

agtcgtatat tagatttggt tggaagagtg gctaatttat tgggcgttga catgagtgac 360

cttccagttg caggtgtagc acctgaatgg atgtcagaaa aagccgtagc aataggtact 420

tatgtagtaa cttcaggtat agatacttgg cttggagtag cacctccagt aacaggcggc 480

ccagaagttg ttgacattct tactaataag atggaagact gggtaggagc taaattcttt 540

atagaaacag atcctcataa agcagttgaa caaattgtaa ataggatgaa tgaaaaacgt 600

aaaaaattag gtatcta 617

<210> 15

<211> 617

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 15

atgcaaactg taaaaccttt ggcagatgtt ttagtatcag gagtattaag aggtgctgca 60

gctgtggttg gatgtaataa tcctaaagtt gtacaagatt ctgcacacat tgaaactata 120

aaaggattaa taaaaaatga tgtaattgtt gttgttacag gttgtgcagc tcaagcagca 180

gcaaaatatg gcttattaca aaaagaagca gcagaaaaat atgcaggacc aggactagct 240

actgtatgta aacttgtaga cataccacct gtacttcata tgggttcttg tgttgatata 300

agtcgtatat tagatttggt tggaagagtg gctaatttat tgggcgttga catgagtgac 360

cttccagttg caggtgtagc acctgaatgg atgtcagaaa aagccgtagc aataggtact 420

tatgtagtaa cttcaggtat agatacttgg cttggagtag cacctccagt aacaggcggc 480

ccagaagttg ttgacattct tactaataag atggaagact gggtaggagc taaattcttt 540

atagaaacag atcctcataa agcagttgaa caaattgtaa ataggatgaa tgaaaaacgt 600

aaaaaattag gtatcta 617

<210> 16

<211> 344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 16

aagcttataa ttatccttaa gtgtcatggt agtgcgccca gatagggtgt taagtcaagt 60

agtttaaggt actactctgt aagataacac agaaaacagc caacctaacc gaaaagcgaa 120

agctgatacg ggaacagagc acggttggaa agcgatgagt tacctaaaga caatcgggta 180

cgactgagtc gcaatgttaa tcagatataa ggtataagtt gtgtttactg aacgcaagtt 240

tctaatttcg attacacttc gatagaggaa agtgtctgaa acctctagta caaagaaagg 300

taagttatct accatgactt atctgttatc accacatttg taca 344

<210> 17

<211> 344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 17

aagcttataa ttatccttag agttcgctgt agtgcgccca gatagggtgt taagtcaagt 60

agtttaaggt actactctgt aagataacac agaaaacagc caacctaacc gaaaagcgaa 120

agctgatacg ggaacagagc acggttggaa agcgatgagt tacctaaaga caatcgggta 180

cgactgagtc gcaatgttaa tcagatataa ggtataagtt gtgtttactg aacgcaagtt 240

tctaatttcg attaactctc gatagaggaa agtgtctgaa acctctagta caaagaaagg 300

taagttatct acagcgactt atctgttatc accacatttg taca 344

<210> 18

<211> 562

<212> DNA

<213> 自产乙醇梭菌

<400> 18

ggccgcagat agtcataata gttccagaat agttcaattt agaaattaga ctaaacttca 60

aaatgtttgt taaatatata ccaaactagt atagatattt tttaaatact ggacttaaac 120

agtagtaatt tgcctaaaaa attttttcaa ttttttttaa aaaatccttt tcaagttgta 180

cattgttatg gtaatatgta attgaagaag ttatgtagta atattgtaaa cgtttcttga 240

tttttttaca tccatgtagt gcttaaaaaa ccaaaatatg tcacatgcaa ttgtatattt 300

caaataacaa tatttatttt ctcgttaaat tcacaaataa tttattaata atatcaataa 360

ccaagattat acttaaatgg atgtttattt tttaacactt ttatagtaaa tatatttatt 420

ttatgtagta aaaaggttat aattataatt gtatttatta caattaatta aaataaaaat 480

agggttttag gtaaaattaa gttattttaa gaagtaatta caataaaaat tgaagttatt 540

gctttaagga gggaattatt ca 562

<210> 19

<211> 573

<212> DNA

<213> 自产乙醇梭菌

<400> 19

atggataatt tagttataaa tacattgaaa gaagtaggag cacttttgga agggcatttt 60

ctactttctt caggaaaaca cagtgatagg tattgtcagt gtgcaaaact tttacagtat 120

cctgacaggg caaaagatgt aatagcagtt attgcagaca aattagagaa tgttgactat 180

gataaaatag ttggacctgc aatggggggg atattagttt cctatgaact tgcaaggcaa 240

acgggcaaac caggaatatt tgctgaaagg caaaatggaa atatgactat aagaagggga 300

tttgaaataa aagaaggaga aaaaattata atttctgaag atgtggtaac tacaggaaaa 360

tcatctgtag aggttgctaa ggtaattcag gaattaggtg gagaggttgt aggcatatgt 420

tgcatagtag acagaagagc agaaggtgtc aaaatagaat atccaattta tagtgcagta 480

aaacttaata taaacactta tgataaggaa aattgtccta tgtgtaagca aggacaagaa 540

tatgtaaagc ctggaagtag agtattcaaa taa 573

<210> 20

<211> 6927

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 20

cctgcaggat aaaaaaattg tagataaatt ttataaaata gttttatcta caattttttt 60

atcaggaaac agctatgacc gcggccgcag atagtcataa tagttccaga atagttcaat 120

ttagaaatta gactaaactt caaaatgttt gttaaatata taccaaacta gtatagatat 180

tttttaaata ctggacttaa acagtagtaa tttgcctaaa aaattttttc aatttttttt 240

aaaaaatcct tttcaagttg tacattgtta tggtaatatg taattgaaga agttatgtag 300

taatattgta aacgtttctt gattttttta catccatgta gtgcttaaaa aaccaaaata 360

tgtcacatgc aattgtatat ttcaaataac aatatttatt ttctcgttaa attcacaaat 420

aatttattaa taatatcaat aaccaagatt atacttaaat ggatgtttat tttttaacac 480

ttttatagta aatatattta ttttatgtag taaaaaggtt ataattataa ttgtatttat 540

tacaattaat taaaataaaa atagggtttt aggtaaaatt aagttatttt aagaagtaat 600

tacaataaaa attgaagtta ttgctttaag gagggaatta ttcatatgga agaaaaagca 660

aaatcaattg atcaggctac tttacaatta ttggacaagg caaaacaaga tggggtcgaa 720

acagtttggg atagaaaagc agacatgaag gtacagtgtg gatttggatc agcaggagtt 780

tgctgtagaa attgcagcat gggcccatgt agagtaagtc cagtgccagg aaaaggtgta 840

gaaagaggta tatgtggagc tacagcagat gtaattgtat ctagaaattt tgcaagaatg 900

gttgcagcag gtactgcagc acactcagat catggtagaa gtatagcact tagcttgtat 960

cacactagta aagatggaga tataaaagtt aaagatgaaa ataaattgaa agaagttgca 1020

aagagcttta atgttgaaac tgagggaaga gatatatatg acatagctca tgatgtagca 1080

aaagaaggat taagtaatta tggtaaacag cttggagaag ttactttacc accttcttta 1140

ccagaaaaga gaaaagaatt gtggagaaaa ttaggtgtat atccaagggc agttgataga 1200

gaaatagctg cagttatgca ttcaacacat ataggatgta atgcagatgc agaagctatg 1260

attaaaatgt ctatgagatg ttcactaact gatggatgga tgggctcatt catgggaaca 1320

gaattcagtg atataatgtt tggaacacct cattccattg atacagaggc aaatcttgga 1380

gtacttgaaa agaattctgt aaatgtagtt ttacacggac atgaaccact tctttcagaa 1440

atggtagtag aagcagcatc agatccagag ttagttgaac ttgctaaatc agtaggtgct 1500

gatggaataa atttatgtgg aatgtgctgt actggaaatg aagtttccat gagacatggc 1560

atcaaaatag caggaaactt tatgcagcag gaattggctg tagttacagg agcagtagat 1620

ggacttatag ttgatgtaca gtgtattatg ccagcactag caaaattgtc caagtcatat 1680

catactaagt ttataacaac ttcaccaaag gcacacatca cagattcaat ttatatggaa 1740

tttgatgaag aaaacccact tgattcagct aagaagattc taaaagaagc aatattaaac 1800

tttaaaaata gagatcagag caaagtaatg attcctgaat tgaaatgaaa ggcaattttg 1860

ggatacagtg ttgaagaaat tataaataaa ttagacaagg ttgtaaatac acaaatagga 1920

ccaatgcaaa ctgtaaaacc tttggcagat gttttagtat caggagtatt aagaggtgct 1980

gcagctgtgg ttggatgtaa taatcctaaa gttgtacaag attctgcaca cattgaaact 2040

ataaaaggat taataaaaaa tgatgtaatt gttgttgtta caggttgtgc agctcaagca 2100

gcagcaaaat atggcttatt acaaaaagaa gcagcagaaa aatatgcagg accaggacta 2160

gctactgtat gtaaacttgt agacatacca cctgtacttc acatgggttc ttgtgttgat 2220

ataagtcgta tattagattt ggttggaaga gtggctaatt tattgggcgt tgacatgagt 2280

gaccttccag ttgcaggtgt agcacctgaa tggatgtcag aaaaagccgt agcaataggt 2340

acttatgtag taacttcagg tatagatact tggcttggag tagcacctcc agtaacaggc 2400

ggcccagaag ttgttgacat tcttactaat aagatggaag actgggtagg agctaaattc 2460

tttatagaaa cagatcctca taaagcagtt gaacaaattg taaataggat gaatgaaaaa 2520

cgtaaaaaat taggtatcta ataataaaga caagcaattg ccatgccaga gctcggtacc 2580

cggggatcct ctagagtcga cgtcacgcgt ccatggagat ctcgaggcct gcagacatgc 2640

aagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca 2700

acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg 2760

caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgct agcataaaaa 2820

taagaagcct gcatttgcag gcttcttatt tttatggcgc gccgccatta tttttttgaa 2880

caattgacaa ttcatttctt attttttatt aagtgatagt caaaaggcat aacagtgctg 2940

aatagaaaga aatttacaga aaagaaaatt atagaattta gtatgattaa ttatactcat 3000

ttatgaatgt ttaattgaat acaaaaaaaa atacttgtta tgtattcaat tacgggttaa 3060

aatatagaca agttgaaaaa tttaataaaa aaataagtcc tcagctctta tatattaagc 3120

taccaactta gtatataagc caaaacttaa atgtgctacc aacacatcaa gccgttagag 3180

aactctatct atagcaatat ttcaaatgta ccgacataca agagaaacat taactatata 3240

tattcaattt atgagattat cttaacagat ataaatgtaa attgcaataa gtaagattta 3300

gaagtttata gcctttgtgt attggaagca gtacgcaaag gcttttttat ttgataaaaa 3360

ttagaagtat atttattttt tcataattaa tttatgaaaa tgaaaggggg tgagcaaagt 3420

gacagaggaa agcagtatct tatcaaataa caaggtatta gcaatatcat tattgacttt 3480

agcagtaaac attatgactt ttatagtgct tgtagctaag tagtacgaaa gggggagctt 3540

taaaaagctc cttggaatac atagaattca taaattaatt tatgaaaaga agggcgtata 3600

tgaaaacttg taaaaattgc aaagagttta ttaaagatac tgaaatatgc aaaatacatt 3660

cgttgatgat tcatgataaa acagtagcaa cctattgcag taaatacaat gagtcaagat 3720

gtttacataa agggaaagtc caatgtatta attgttcaaa gatgaaccga tatggatggt 3780

gtgccataaa aatgagatgt tttacagagg aagaacagaa aaaagaacgt acatgcatta 3840

aatattatgc aaggagcttt aaaaaagctc atgtaaagaa gagtaaaaag aaaaaataat 3900

ttatttatta atttaatatt gagagtgccg acacagtatg cactaaaaaa tatatctgtg 3960

gtgtagtgag ccgatacaaa aggatagtca ctcgcatttt cataatacat cttatgttat 4020

gattatgtgt cggtgggact tcacgacgaa aacccacaat aaaaaaagag ttcggggtag 4080

ggttaagcat agttgaggca actaaacaat caagctagga tatgcagtag cagaccgtaa 4140

ggtcgttgtt taggtgtgtt gtaatacata cgctattaag atgtaaaaat acggatacca 4200

atgaagggaa aagtataatt tttggatgta gtttgtttgt tcatctatgg gcaaactacg 4260

tccaaagccg tttccaaatc tgctaaaaag tatatccttt ctaaaatcaa agtcaagtat 4320

gaaatcataa ataaagttta attttgaagt tattatgata ttatgttttt ctattaaaat 4380

aaattaagta tatagaatag tttaataata gtatatactt aatgtgataa gtgtctgaca 4440

gtgtcacaga aaggatgatt gttatggatt ataagcggcc ggccagtggg caagttgaaa 4500

aattcacaaa aatgtggtat aatatctttg ttcattagag cgataaactt gaatttgaga 4560

gggaacttag atggtatttg aaaaaattga taaaaatagt tggaacagaa aagagtattt 4620

tgaccactac tttgcaagtg taccttgtac ctacagcatg accgttaaag tggatatcac 4680

acaaataaag gaaaagggaa tgaaactata tcctgcaatg ctttattata ttgcaatgat 4740

tgtaaaccgc cattcagagt ttaggacggc aatcaatcaa gatggtgaat tggggatata 4800

tgatgagatg ataccaagct atacaatatt tcacaatgat actgaaacat tttccagcct 4860

ttggactgag tgtaagtctg actttaaatc atttttagca gattatgaaa gtgatacgca 4920

acggtatgga aacaatcata gaatggaagg aaagccaaat gctccggaaa acatttttaa 4980

tgtatctatg ataccgtggt caaccttcga tggctttaat ctgaatttgc agaaaggata 5040

tgattatttg attcctattt ttactatggg gaaatattat aaagaagata acaaaattat 5100

acttcctttg gcaattcaag ttcatcacgc agtatgtgac ggatttcaca tttgccgttt 5160

tgtaaacgaa ttgcaggaat tgataaatag ttaacttcag gtttgtctgt aactaaaaac 5220

aagtatttaa gcaaaaacat cgtagaaata cggtgttttt tgttacccta agtttaaact 5280

cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 5340

agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 5400

ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 5460

accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct 5520

tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 5580

cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 5640

gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 5700

gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 5760

gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 5820

cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 5880

tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 5940

ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 6000

ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat 6060

taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc 6120

agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcagggcc ccctgcttcg gggtcattat 6180

agcgattttt tcggtatatc catccttttt cgcacgatat acaggatttt gccaaagggt 6240

tcgtgtagac tttccttggt gtatccaacg gcgtcagccg ggcaggatag gtgaagtagg 6300

cccacccgcg agcgggtgtt ccttcttcac tgtcccttat tcgcacctgg cggtgctcaa 6360

cgggaatcct gctctgcgag gctggccggc taccgccggc gtaacagatg agggcaagcg 6420

gatggctgat gaaaccaagc caaccaggaa gggcagccca cctatcaagg tgtactgcct 6480

tccagacgaa cgaagagcga ttgaggaaaa ggcggcggcg gccggcatga gcctgtcggc 6540

ctacctgctg gccgtcggcc agggctacaa aatcacgggc gtcgtggact atgagcacgt 6600

ccgcgagctg gcccgcatca atggcgacct gggccgcctg ggcggcctgc tgaaactctg 6660

gctcaccgac gacccgcgca cggcgcggtt cggtgatgcc acgatcctcg ccctgctggc 6720

gaagatcgaa gagaagcagg acgagcttgg caaggtcatg atgggcgtgg tccgcccgag 6780

ggcagagcca tgactttttt agccgctaaa acggccgggg ggtgcgcgtg attgccaagc 6840

acgtccccat gcgctccatc aagaagagcg acttcgcgga gctggtgaag tacatcaccg 6900

acgagcaagg caagaccgat cgggccc 6927

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 21

tggagtgctg gtggcctgtt 20

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 22

aaaagctgta ctagtagctg atgccgt 27

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 23

gagctggtac atatagccat catgc 25

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 24

ctgtaccatt tcaagtccta tttgtgc 27

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 25

gcgagagttt gatcctggct cag 23

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 26

cgcggttacc ttgttacgac tt 22

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 27

cgaaattaga aacttgcgtt cagtaaac 28

<210> 28

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 28

attactgtga ctggtttgca ccaccctctt cg 32

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 29

aagcggccgc agatagtcat aatagttcc 29

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 30

ttccatatga ataattccct ccttaaagc 29

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 31

gggaattagc catatggaag aaaaagc 27

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 32

atttgagctc tggcatggc 19

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 33

caagaaccca tgtgaagtac agg 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 34

cctgtacttc acatgggttc ttg 23

<210> 35

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 35

aggctacttt acaattattg gacaaggc 28

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 36

gcccttggat atacacctaa ttttctcc 28

Claims (17)

1.一种遗传工程一氧化碳营养型产乙酸细菌，所述细菌与亲本细菌相比具有降低或消除的CODH1和/或CODH2活性,其中所述亲本细菌是自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)或拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)。

2.如权利要求1所述的细菌，其中所述细菌在CODH1基因和/或CODH2基因中包含至少一个破坏性突变。

3.如权利要求2所述的细菌，其中与亲本细菌相比，所述破坏性突变降低或消除所述CODH1基因和/或所述CODH2基因的表达。

4.如权利要求2所述的细菌，其中所述破坏性突变是基因敲除突变。

5.如权利要求1所述的细菌，其中与所述亲本细菌相比，所述细菌另外具有提高的CODH/ACS活性。

6.如权利要求5所述的细菌，其中与所述亲本细菌相比，所述细菌过表达CODH/ACS基因。

7.如权利要求1所述的细菌，其中所述细菌产生乙醇和2,3-丁二醇中的一种或多种。

8.如权利要求1所述的细菌，其中与所述亲本细菌相比，所述细菌产生更高量的乙醇，产生更低量的乙酸盐，具有更短的迟缓期，和/或具有更高的生长速率。

9.如权利要求1所述的细菌，其中所述细菌消耗包含CO、CO₂以及H₂中的一种或多种的气体基质。

10.一种用于产生产物的方法，所述方法包括在包含CO、CO₂、以及H₂中的一种或多种的气体基质存在下培养如权利要求1所述的细菌，由此所述细菌产生产物。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述细菌在CODH1基因和/或CODH2基因中包含至少一个破坏性突变。

12.如权利要求11所述的方法，其中与亲本细菌相比，所述破坏性突变降低或消除所述CODH1基因和/或所述CODH2基因的表达。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述破坏性突变是基因敲除突变。

14.如权利要求10所述的方法，其中与所述亲本细菌相比，所述细菌另外具有提高的CODH/ACS活性。

15.如权利要求14所述的方法，其中与所述亲本细菌相比，所述细菌过表达CODH/ACS基因。

16.如权利要求10所述的方法，其中所述产物包含乙醇和2,3-丁二醇中的一种或多种。

17.如权利要求10所述的方法，其中与所述亲本细菌相比，所述细菌产生更高量的乙醇，产生更低量的乙酸盐，具有更短的迟缓期，和/或具有更高的生长速率。