CN107209180A - 检测稀释样品中生物体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测液体样品中的生物体的方法，其包括提供捕获区域，所述捕获区域包含处于液体介质中的颗粒并经受流体动力学流，其中待检测的生物体能够与所述颗粒结合，所述方法包括以下步骤：(a)使样品循环通过所述捕获区域；(b)使生长培养基循环通过所述捕获区域；以及(c)确定所述捕获区域中生物体的存在、性质或浓度；在所述步骤的至少一部分的过程中，所述颗粒以流化床的形式保留在所述捕获区域中本发明还涉及用于实施所述方法的***。

Description

检测稀释样品中生物体的方法
发明领域
本发明涉及用于检测稀释样品中生物体的方法。其还涉及由稀释样品制备生物体的方法。本发明还涉及适于实施这些方法的流体***。
技术背景
生物物种特别是诸如细菌的生物体的检测、表征、鉴定是许多领域所需要的，所述领域例如医疗或兽医诊断、食品安全或环境。这也是各种生物技术和制药的生产领域所需要的。最后，这是许多生命科学和药学研究的领域所需要的。
特别重要的实例是细菌的检测、表征、鉴定。有一些用于食品、化学产品或药物的生产工业，也用于处理废水，而其他的一些被证明可能危害健康。因此在许多情况下，这些细菌的快速检测和鉴定是至关重要的。此外，通常不足以检测痕量的细菌，但也经常有必要了解其状况(生存或死亡)、感染性及其对特定抗生素的抗性。
因此，希望了解如何检测在可能含有很多种微生物的样品中的细菌。响应时间必须尽可能短，可信度尽可能高，并且待进行的处理操作尽可能简单。
目前，用于鉴定细菌的标准***包含：根据情况在具有一定程度选择性的培养基上培养菌落，并且在培养后手工计数或分析菌落含量，例如通过诸如质谱法的分子分析技术。然后需要等待约24-48小时以便细菌生长。并且，即使可使用计算机编程工具，所需的设施以及人员也必须是专业的。为了鉴定细菌菌株，应进一步进行形态学比较、抗生素抗性检测、或比色法鉴定、或这些表征的组合。因此，该方法是便宜的，相当可靠且易于实施，但是它需要高的细菌浓度以及非常长的操作时间。
在文献CN102094062中，提出了一种方法，其中样品通过过滤器，使得细菌积聚在过滤器中；然后通过将过滤器置于培养基中来培养这些细菌，并检测来自细菌生长的代谢物。这种方法很复杂，并且需要长的分析时间。
还已知如何在基于流化床的***中培养细胞。例如，在文献CN201933088中，提出了用于培养粘附在固体基质上的哺乳动物细胞的***，其包括在两个多孔板之间的流化床，并通过气体灌注来促进培养。然而，该***不适于对小体积样品的诊断或检测应用。
在文献CN1303924中，提出了用于在动物细胞内产生病毒的方法，所述动物细胞本身粘附于保持在磁稳定的流化床内的颗粒上。该方法提供了氧合作用、培养基的交换，以及在所述室的出口处收集病毒。该方法适于生产；其需要预注入大量的细胞，因此不能检测稀有细胞。
在文献WO 86/05202中，提出了另一种在流化床上的细胞培养***，其用于组织培养或发酵，包括在辅助室中处理流化床中一部分经处理的流体，并将其再注入该流化床。该***还需要大的细胞初始数量，因此不适于稀有细胞的检测。
其他研究主要集中在微流体设备中的更直接、灵敏的检测方法。
例如，在文献Soft Inertial Microfluidics for High Throughput Separationof Bacteria from Human Blood Cells,Lab Chip,9:1193-1199(2009)中，描述了通过利用待分选物体的惯性与其特征尺寸之间的关系，以物理方法进行细胞的连续分离。该方法使得能以高流速工作，但这种分离在分辨率尺寸方面仍然不准确。此外，许多细菌或不同细胞可能具有相同的尺寸，因此这种分选标准是不充分的。
也可以使用电泳分选方法。实际上，细菌的电泳迁移率取决于电荷和细菌的半径。因此，电泳可以通过在非常短的时间内改变施加的场的电方向来集中期望的细菌，并且丢弃死细菌，如文献Enrichment of viable bacteria in a micro-volume by Free flowelectrophoresis,Lab Chip,12:451-457(2012)中所描述的。或者，可以使用基于待分选物体的介电常数差的介电电泳力。
这类方法必须与PCR(聚合链反应)***或其他基因组分析相结合，以鉴定存在的细菌，如文献A microfluidic chip integrating DNA extraction and real-time PCRfor the detection of bacteria in saliva,Lab Chip,13:1325-1332(2013)中所讨论的。然而，通常特异性和敏感性仍然不足。
另一种方法是通过抗体和抗原之间的结合来捕获。在文献On-chip microfluidicbiosensor for bacterial detection and identification,Sensors and Actuators B,126:508-514(2007)中，可以特别提及使用这种通过在回路的微流体通道上直接移植抗体来捕获细菌的方法。在这种情况下，通过硅烷化来进行抗体的移植，并且有必要让细菌沉降以便捕获是有效的。当需要检测大体积样品中的几种细菌时，例如用于诊断分析和食品安全分析时，流速不足。
在文献Immunomagnetic bead-based cell concentration microdevice fordilute pathogen detection,Biomed Microdevices,10:909-917(2008)中，描述了一种微流体***，其中带有抗体的磁珠被侧磁体固定，以便捕获细菌。然而，捕获效率仅为2CFU/μL，其对于所需的效率水平(例如在诊断或食品分析应用中需要的)非常不足。
在文献WO 2014/037674中，描述了微流体流化床，其具有由外部磁场控制的磁珠循环，其特别地用于通过将特异性抗体移植于磁珠上来捕获细菌。然而，该***对于检测大体积样品中的几种细菌没有足够的灵敏度。此外，其不能区分活细菌和死细菌。
还存在特别令人感兴趣来表征、浓缩、培养和/或扩增的细胞类型：例如酵母或高级真核细胞，尤其是哺乳动物细胞，并且特别是人细胞。例如，生物技术和医学，尤其是再生医学或移植医学，对用于表征、分选和培育干细胞、祖细胞、多能细胞或全能细胞的新方法是感兴趣的。例如，在文献Microfluidic Capture of Endothelial Colony-FormingCells from Human Adult Peripheral Blood:Phenotypic and Functional ValidationIn Vivo,Tissue Engineering Part C,vol.21:274-283(2015),doi:10.1089/ten.tec.2014.0323.,Lin et al.中，描述了允许对人细胞、内皮集落形成细胞(ECFC)进行微流体捕获的方法。然而，在该方法中，微流体仅用于捕获，然后还需要将目标细胞转移到常规培养板中，这导致该方法操作时间长且昂贵。
因此，对于研发以便利、自动和快速的方式在相当大体积的样品中检测稀有细菌，并且鉴定其感染性或其增殖潜力的***存在着实际需求。其他单细胞或多细胞生物体(如酵母或寄生虫)或真核细胞(例如干细胞或癌细胞)也存在着类似的问题。
发明概述
本发明可以克服现有技术的缺陷。特别地，其提供了检测液体样品中的生物体(例如细菌)的方法，该方法通过捕获保留在捕获区域的颗粒上的甚至非常少量的生物体，然后使这些生物体在捕获区域中原位繁殖或生长，最后检测由此繁殖的生物体。
在该方法中使用颗粒的流化床，使得有可能使用相对大的流体流速，并优化在捕获区域中固定的不同物质之间的相互作用(特别是颗粒和能够与其结合的生物体之间的相互作用)。
因此，本发明涉及以下目的。
目的1.用于检测液体样品中的生物体的方法，其包括提供捕获区域，所述捕获区域包含处于液体介质中的颗粒并经受流体动力学流，其中待检测的生物体能够与这些颗粒结合，其中所述方法包括以下步骤：
(a)使样品循环通过所述捕获区域；
(b)使生长培养基循环通过所述捕获区域；以及
(c)确定所述捕获区域中生物体的存在、性质或浓度；
在这些步骤的至少一部分的过程中，所述颗粒以流化床的形式保留在捕获区域中。
本申请中的术语“生物体”是指任何微生物体或任何单细胞或多细胞生物体，其可以在本文中被称为“生长培养基”的合适培养基中生长。
该术语还适用于休眠形式的生物体，例如孢子、壳等。该术语还涵盖来自更复杂生物体的单个细胞或细胞聚集体，例如天然或突变的哺乳动物细胞。
本申请中的术语“流化床”，是指悬浮在流动的液体介质中的颗粒表现得像流体的状态，即颗粒相对于彼此运动，并且可以使它们的相互构型适应于容纳它们的室的形状，但是它们不是由所述流体全局驱动的，下文将更详细地进行讨论。
术语“流化床”被定义为与非流化床(也称为“紧凑型床”)相反，也与简单悬浮液相反，其中颗粒以流体的速度被全局驱动。
因此，本发明在捕获区域原位培养生物体的步骤(b)期间，提供了目标生物体的生长(例如繁殖)。因此，有助于检测，并提高了灵敏度。
另一方面，本发明可以区分活生物体与死生物体；或者区分能够增殖的生物体与不能增殖或发育的生物体；或者区分能够增殖的生物体以及一定程度上快速发育的生物体。
因此，本发明使得能获得在一些环境中一些生物体的代谢、增殖能力或其他性质的信息。
目的2.根据目的1所述的方法，其中所述生长培养基包含所述生物体的营养物。
目的3.根据目的1至2中任一项所述的方法，其中在部分、并且优选地在整个步骤(a)的过程中，所述颗粒以流化床的形式保留在捕获区域中。
目的4.根据目的1至3中任一项所述的方法，其中在部分、并且优选地在整个步骤(b)的过程中，所述颗粒以流化床的形式保留在捕获区域中。
目的5.根据目的1至4中任一项所述的方法，其中在部分、并且优选地在整个步骤(c)的过程中，所述颗粒以流化床的形式保留在捕获区域中。
目的6.根据目的1至5中任一项所述的方法，其中在部分、并且优选地在整个步骤(c)的过程中，所述颗粒以紧凑型床的形式保留在捕获区域中。
目的7.根据目的1至6中任一项所述的方法，其中所述流体动力学流的速度在所述捕获区域中沿所述流体动力学流的方向减小。
目的8.根据目的1至7中任一项所述的方法，其中通过施加与所述流体动力学流相反的力来获得所述颗粒在所述捕获区域中的保留。
目的9.根据目的8所述的方法，其中与所述流体动力学流相反的力在所述捕获区域中沿所述流体动力学流的方向减小。
目的10.根据目的8至9中任一项所述的方法，其中与所述流体动力学流相反的力与所述流体动力学流的方向基本上对齐。
目的11.根据目的8至10中任一项所述的方法，其中与所述流体动力学流相反的力是磁力，所述颗粒是磁性颗粒，优选超顺磁性颗粒。
目的12.根据目的8至10中任一项所述的方法，其中与所述流体动力学流相反的力是静电力，所述颗粒是带电颗粒。
目的13.根据目的8至10中任一项所述的方法，其中与所述流体动力学流相反的力是重力或离心力，所述颗粒的密度不同于周围液体的密度。
目的14.根据目的1至13中任一项所述的方法，其中所述待检测的生物体能够经由配体，优选经由抗体与所述颗粒结合。
目的15.根据目的1至14中任一项所述的方法，其中所述颗粒具有的平均尺寸Dv50为1nm至500μm，优选为50nm至100μm，更特别地为1μm至50μm。
目的16.根据目的1至15中任一项所述的方法，其中所述生物体选自：原核细胞、细菌、酵母、单细胞或多细胞寄生虫、真菌细胞、真核细胞并且特别是哺乳动物细胞或植物细胞，或这类细胞的功能性组装体；根据一些优选的实施方案，所述生物体选自：病原体生物体、干细胞、基因修饰的生物体和癌细胞。
目的16a.根据目的1至15中任一项所述的方法，其中所述生物体选自：内皮细胞、造血细胞、上皮细胞、胎儿细胞、多能细胞、全能细胞和诱导的多能干细胞。
目的17.根据目的1至16a中任一项所述的方法，其中通过测量所述捕获区域中的性质来进行步骤(c)。
目的17a.根据目的1至16a中任一项所述的方法，其中通过测量所述捕获区域外的性质来进行步骤(c)。
目的18.根据目的17或17a所述的方法，其中步骤(c)在步骤(b)的过程中以一次或重复的方式随时间进行。
目的18a.根据目的1至18中任一项所述的方法，其中通过检测、培养或鉴定在步骤(b)的过程中通过流体动力学流从所述捕获区域转移出的生物体或物质来进行步骤(c)。
目的19.根据目的17或17a所述的方法，其中步骤(c)在步骤(b)之后进行。
目的20.根据目的1至16a中任一项所述的方法，其包括：
-在步骤(b)之后将物质转移至捕获区域外，通过测量所转移的物质的性质来进行步骤(c)；所述物质优选为能与所述捕获区域中的颗粒结合的生物体所分泌的物质，或者如果有必要，通过裂解释放的这些生物体的组分。
目的20a.根据目的1至16a或20中任一项所述的方法，其包括：
在步骤(b)之后从所述捕获区域对颗粒取样，通过测量取样颗粒的性质来进行步骤(c)。
目的20b.根据目的1至19中任一项所述的方法，其还包括：
-在步骤(b)之后或在步骤(b)的过程中，将物质转移出所述捕获区域。
目的20c.根据目的20b所述的方法，其中通过测量所转移的物质的性质来进行步骤(c)。
目的20d.根据目的20c所述的方法，其中所述物质由与所述捕获区域中的颗粒结合的生物体分泌，或者为这些生物体的组分，任选地通过裂解释放。
目的20e.根据目的20c所述的方法，其中所述物质为与所述捕获区域中的颗粒结合的生物体，或者为来源于这些生物体的生物体。
目的20f.根据目的17至20e中任一项所述的方法，其中测量的性质是生物或生物化学性质，如亲和力、增殖能力、表型或表型性质、基因型或基因特征、突变、表达水平、形态学或增殖能力。
更通常地，“测量的性质”是指任何可以区分分子与其他分子、分子组装体与其他分子组装体、或者细胞与其他细胞、或者细胞类型与其他细胞类型、或者细胞状况与其他细胞状况、生物体与其他生物体的特征。
目的21.根据目的17至20f中任一项所述的方法，其中测量的性质为力、位移、压力、流速、质量、密度、孔隙度、粘度、弹性、粘弹性、光学密度、浊度、质构特性、强度测量或辐射吸收系数。
目的22.根据目的17至20f中任一项所述的方法，其中测量的性质为，任选地当所述颗粒为紧凑型床的形式时，所述捕获区域中颗粒占据的体积或所述占据的体积的尺寸。
表述“颗粒占据的体积”通常意指颗粒(优选生物体)在所位于的捕获区域中的体积或颗粒床的体积。
目的23.根据目的22所述的方法，其中所述样品中生物体的浓度作为在步骤(b)过程中所述捕获区域中颗粒占据的体积达到阈值所需的时间的函数被确定。
目的24.根据目的1至23中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括生物或生物化学分析，优选为基因分析、蛋白质组分析、毒素分析或代谢活性的测量，更特别地优选为核酸的扩增和/或杂交、核酸测序、免疫凝集或通过结合酶的免疫吸附测定。
目的25.根据目的1至24中任一项所述的方法，其中基于在步骤(a)结束时所述捕获区域中存在的生物体的数量，步骤(b)能使所述捕获区域中生物体的数量增加至少10倍、优选至少100倍、或甚至至少1,000倍、或至少10,000倍、或至少100,000倍。
目的26.根据目的1至25中任一项所述的方法，其在微流体***中实施。
目的27.根据目的1至26中任一项所述的方法，其包括在步骤(c)之前或在步骤(c)的过程中进行分子扩增。
目的28.根据目的1至27中任一项所述的方法，其还包括使包含用于生物体的靶标试剂的培养基循环通过所述捕获区域，优选地在使所述生长培养基循环的步骤之后或在该步骤过程中进行上述操作，更特别优选地将所述靶标试剂并入所述生长培养基中。
目的29.根据目的28所述的方法，用于筛选药物或杀生物剂，其中所述靶标试剂是潜在的药物或杀生物剂。
目的30.根据目的1至29中任一项所述的方法，其中所述样品来自环境、或来自食品、或来自体液。
“环境”意指其最广泛的含义，即任何类型的固体、气体或液体支持物，以及任何类型的应用，例如(以非限制性的方式)，空气、水、土壤、建筑物、人类设施、衣服、表面、植物、餐具、废物或与安全、法医分析相关的要素。
类似地，“体液”意指其最广泛的含义，例如包括通过任何类型的预取样从身体部位(例如活组织***位或手术部位)获得的血液或经处理的血液、血浆、血清、眼泪、奶、唾液、汗液、用拭子在所有身体部位取样获得的样品、尿液、***物或流体样品。体液可以来自人体。或者，其可以来自任何种类的动物或植物物种。
同样，“食品”的概念意指其最广泛的含义，无论其是来自人类或动物食物，还是来自营养或食物生产中涉及的任何原料、转化产品、中间产品、流出物。
本发明的方法尤其可以通过以下目的中的流体***来应用。
目的31.用于检测液体样品中的生物体的流体***，其包括：
-至少一个室，其包括至少一个流体入口和一个流体出口，并且包括捕获区域；
-用于使液体样品循环通过所述捕获区域的装置；
-用于使生长培养基循环通过所述捕获区域的装置；
-用于在所述捕获区域施加力场的装置，所述力场被配置为使得当所述捕获区域经受流体动力学流时，将颗粒以流化床的形式保留在所述捕获区域中，其中待检测的生物体能够与所述颗粒结合；
-用于确定所述捕获区域中生物体的存在、性质或浓度的装置。
目的31a.根据目的31所述的流体***，其包括与所述室的出口流体连通的至少一个另外的室或槽。
目的31b.根据目的31至31a中任一项所述的流体***，其还包括用于调节所述室的温度的设备。
目的32.根据目的31至31b中任一项所述的流体***，其为微流体***。
目的33.根据目的31至32中任一项所述的流体***，其中所述力场与所述捕获区域中的流体动力学流的方向基本上对齐。
目的34.根据目的31至33中任一项所述的流体***，其中所述力场在所述捕获区域中的流体动力学流的方向上具有递减的强度。
目的35.根据目的31至34中任一项所述的流体***，其中所述室具有正交于流体动力学流的平均方向的横截面，所述横截面在所述捕获区域中沿流体动力学流的方向增大。
目的36.根据目的31至35中任一项所述的流体***，其中所述施加力场的装置为施加磁场的装置。
目的37.根据目的31至35中任一项所述的流体***，其中所述施加力场的装置为施加电场的装置。
目的38.根据目的31至37中任一项所述的流体***，其中所述用于确定的装置包括用于测量所述捕获区域中的性质的装置。
目的39.根据目的31至38中任一项所述的流体***，其中所述用于确定的装置包括用于测量与包含捕获区域的室流体连通的第二室中的性质的装置。
目的40.根据目的31至39中任一项所述的流体***，其中用于测量性质的装置是用于测量力、位移、压力、流速、质量、密度、孔隙度、粘度、弹性、粘弹性、光学密度、浊度、质构、强度性质或辐射吸收系数的装置。
目的41.根据目的31至40中任一项所述的流体***，其中所述用于测量性质的装置是用于测量所述捕获区域中颗粒占据的体积的装置。
目的42.根据目的31至41中任一项所述的流体***，其包括用于生物或生物化学分析的装置，并且优选用于基因分析、蛋白质组分析或代谢活性测量的装置，更特别地优选用于核酸扩增和/或核酸杂交、用于核酸测序、用于免疫凝集或通过结合酶的免疫吸附测定的装置。
目的43.根据目的31至42中任一项所述的流体***，其包括用于分子扩增的装置，并且其中所述用于确定的装置是用于检测分子扩增产物的装置。
目的44.根据目的31至43中任一项所述的流体***，其中所述包含捕获区域的室不具有任何可以保留所述颗粒的过滤器。
目的45.计算机程序，当其被执行时，可以实施根据目的1至30中任一项所述的方法。
目的46.用于检测液体样品中的生物体的套件，其包括：
-根据目的31至44中任一项所述的流体***；以及
-目的45所述的计算机程序。
目的47.用于检测液体样品中的生物体的套件，其包括：
-根据目的31至44中任一项所述的流体***；以及
-所述生物体能够与之结合的颗粒。
目的48.用于检测液体样品中的生物体的套件，其包括：
-根据目的31至44中任一项所述的流体***；以及
-生长培养基。
目的49.用于检测液体样品中的生物体的套件，其包括：
-根据目的31至44中任一项所述的流体***；
-所述生物体能够与之结合的颗粒；以及
-生长培养基。
目的50.用于检测液体样品中的生物体的套件，其包括：
-根据目的31至44中任一项所述的流体***；
-根据目的45所述的计算机程序；以及
-所述生物体能够与之结合的颗粒。
目的51.用于检测液体样品中的生物体的组件，其包括：
-根据目的31至44中任一项所述的流体***；
-根据目的45所述的计算机程序；
-所述生物体能够与之结合的颗粒；以及
-生长培养基。
在另一组实施方案中，本发明涉及以下目的，其中不一定提供使生物体生长的步骤(b)。
目的52.用于检测液体样品中的生物体的方法，其包括提供捕获区域，所述捕获区域包含处于液体介质中的颗粒的并经受流体动力学流，其中待检测的生物体能够与这些颗粒结合，所述方法还包括以下步骤：
-使样品循环通过所述捕获区域；
-在样品循环过程中和/或之后，测量所述捕获区域的物理性质，以便由此推断样品中生物体的存在、或浓度、或性质；
在这些步骤的至少一部分的过程中，所述颗粒以流化床的形式保留在所述捕获区域中。
目的53.根据目的52所述的方法，其中所述物理性质测量选自：粘度、粘弹性、体积、渗透性和密度性质。
目的54.根据目的52至53中任一项所述的方法，其中所述测量的物理性质是作为流化床的颗粒的物理性质。
目的55.根据目的52至53中任一项所述的方法，其中所述测量的物理性质是作为紧凑型床的颗粒的物理性质。
目的56.根据目的52至55中任一项所述的方法，其还包括使生长培养基循环的步骤，所述生长培养基优选包含用于所述生物体的营养物；对于通过所述捕获区域的生物体，所述测量步骤与所述使生长培养基循环的步骤同时进行和/或在该步骤之后进行。
目的56a.由存在于液体样品中的母体生物体制备生物体的方法，其包括提供捕获区域，所述捕获区域包含处于液体介质中的颗粒并经受流体动力学流，其中所述母体生物体能够与这些颗粒结合，所述方法包括以下步骤：
(a)使样品循环通过所述捕获区域，并使母体生物体与所述颗粒结合；
(b)使生长培养基循环通过所述捕获区域；以及
(c)在所述捕获区域的出口处收集来自母体生物体***的生物体；
在这些步骤的至少一部分的过程中，所述颗粒以流化床的形式保留在所述捕获区域中。
目的56b.根据目的56a所述的方法，其中步骤(c)在不释放与所述颗粒结合的母体生物体的情况下进行。
目的56c.根据目的56a或56b中任一项所述的方法，其中步骤(c)和步骤(b)至少部分重叠或交替。
目的56d.根据目的56至56c中任一项所述的方法，其中基于初始样品中存在的生物体的数量，使生长培养基循环的步骤能使捕获区域中生物体的数量或在捕获区域的出口处收集的生物体的数量增加至少10倍、优选至少100倍、或甚至至少1,000倍、或至少10,000倍、或至少100,000倍。
目的57.根据目的52至56d中任一项所述的方法，其中在使样品循环的步骤的部分过程中且优选在整个过程中，所述颗粒以流化床的形式保留在所述捕获区域中。
目的58.根据目的52至57中任一项所述的方法，其为目的52所述的检测方法，并且其中在测量步骤的部分过程中且优选在整个过程中，所述颗粒以流化床的形式保留在所述捕获区域中。
目的59.根据目的52至58中任一项所述的方法，其为目的52所述的检测方法，并且其中在测量步骤的部分过程中且优选在整个过程中，所述颗粒以紧凑型床的形式保留在所述捕获区域中。
目的60.根据目的52至59中任一项所述的方法，其中所述流体动力学流的速度在所述捕获区域中沿所述流体动力学流的方向减小。
目的61.根据目的52至60中任一项所述的方法，其中通过施加与所述流体动力学流相反的力来获得所述颗粒在所述捕获区域中的保留。
目的62.根据目的61所述的方法，其中与所述流体动力学流相反的力在所述捕获区域中沿流体动力学流的方向减小。
目的63.根据目的61至62中任一项所述的方法，其中与所述流体动力学流相反的力与所述流体动力学流的方向基本上对齐。
目的64.根据目的61至63中任一项所述的方法，其中与所述流体动力学流相反的力是磁力，所述颗粒是磁性颗粒，优选超顺磁性颗粒。
目的65.根据目的61至63中任一项所述的方法，其中与所述流体动力学流相反的力是静电力，所述颗粒是带电颗粒。
物体66.根据目的61至63中任一项所述的方法，其中与所述流体动力学流相反的力是重力或离心力，所述颗粒的密度不同于周围液体的密度。
目的67.根据目的52至66中任一项所述的方法，其中待检测的生物体、其各自的母体生物体能够经由配体，优选经由抗体与所述颗粒结合。
目的68.根据目的52至67中任一项所述的方法，其中所述颗粒的平均尺寸Dv50为1nm至500μm，优选为50nm至100μm，更特别地为1μm至50μm。
目的69.根据目的52至68中任一项所述的方法，其中所述生物体选自：细菌、单细胞或多细胞寄生虫、真菌、真核细胞并且特别是哺乳动物细胞或植物细胞，并且其中优选地所述生物体选自：病原生物体、干细胞和癌细胞。
目的69a.根据目的52至69中任一项所述的方法，其中所述生物体选自：内皮细胞、造血细胞、上皮细胞、胎儿细胞、多能细胞、全能细胞和诱导的多能干细胞。
目的70.根据目的52至69a中任一项所述的方法，其为目的52所述的检测方法，并且其中测量的性质是在所述捕获区域中颗粒占据的体积或所述占据的体积的尺寸。
目的71.根据目的52至70中任一项所述的方法，其在微流体***中实施。
目的72.根据目的52至71中任一项所述的方法，其还包括使包含用于生物体的靶标试剂的培养基循环通过所述捕获区域的步骤，任选地在使所述生长培养基循环的步骤之后进行该步骤。
目的73.根据目的72所述的方法，用于筛选药物或杀生物剂，其中所述靶标试剂是潜在的药物或杀生物剂。
目的74.根据目的52至73中任一项所述的方法，其中所述样品来自环境、或来自食品、或来自体液。
目的75.用于检测液体样品中的生物体的流体***，包括：
-至少一个室，其包括至少一个流体入口和一个流体出口，并且包括捕获区域；
-用于使液体样品循环通过所述捕获区域的装置；
-用于在所述捕获区域施加力场的装置，所述力场被配置为使得当所述捕获区域经受流体动力学流时，将颗粒以流化床的形式保留在所述捕获区域中，待检测的生物体能够与所述颗粒结合；
-用于测量所述捕获区域的物理性质的装置；
-根据该测量结果确定样品中生物体的存在、或浓度、或性质的装置。
目的75a.由存在于液体样品中的母体生物体制备生物体的流体***，其包括：
-至少一个室，其包括至少一个流体入口和一个流体出口，并且包括捕获区域；
-用于使液体样品循环通过所述捕获区域的装置；
-用于在所述捕获区域施加力场的装置，所述力场被配置为使得当所述捕获区域经受流体动力学流时，将颗粒以流化床的形式保留在所述捕获区域中，所述母体生物体能够与颗粒结合；
-用于在所述捕获区域的出口处收集来自母体生物体***的生物体的装置。
目的75b.根据目的75所述的流体***，其中所述用于确定样品中生物体的存在、或浓度、或性质的装置，包括用于收集、培养或繁殖来自所述捕获区域的生物体的装置。
目的76.根据目的75至75b中任一项所述的流体***，其为微流体***。
目的77.根据目的75至76中任一项所述的流体***，其中所述力场与所述捕获区域中的流体动力学流的方向基本上对齐。
目的78.根据目的75至77中任一项所述的流体***，其中所述力场具有在所述捕获区域中的流体动力学流方向上递减的强度。
目的79.根据目的75至78中任一项所述的流体***，其中所述室具有正交于所述流体动力学流的平均方向的横截面，所述横截面在所述捕获区域中沿流体动力学流的方向增大。
目的80.根据目的75至79中任一项所述的流体***，其还包括用于使生长培养基循环通过所述捕获区域的装置。
目的81.根据目的75至80中任一项所述的流体***，其中所述施加力场的装置为施加磁场的装置。
目的82.根据目的75至80中任一项所述的流体***，其中所述施加力场的装置为施加电场的装置。
目的83.根据目的75至82中任一项所述的流体***，其为目的75所述的用于检测的流体***，并且其中所述用于测量性质的装置是用于测量粘度、粘弹性、体积、渗透性和密度的装置。
目的84.根据目的75至83中任一项所述的流体***，其为目的75所述的用于检测的流体***，并且其中所述用于测量性质的装置是用于测量所述捕获区域中颗粒占据的体积的装置。
目的85.根据目的75至84中任一项所述的流体***，其中所述包括捕获区域的室不具有任何可以保留所述颗粒的过滤器。
目的86.计算机程序，当其被执行时，可以实施根据目的52至74中任一项所述的方法。
目的87.用于检测液体样品中的生物体的套件，其包括：
-根据目的75至85中任一项所述的流体***；以及
-根据目的86所述的计算机程序。
目的88.用于检测液体样品中的生物体的套件，其包括：
-根据目的75至85中任一项所述的流体***；以及
-所述生物体能够与之结合的颗粒。
目的89.用于检测液体样品中的生物体的套件，其包括：
-根据目的75至85中任一项所述的流体***；以及
-生长培养基。
目的90.用于检测液体样品中的生物体的套件，其包括：
-根据目的75至85中任一项所述的流体***；
-所述生物体能够与之结合的颗粒；以及
-生长培养基。
目的91.用于检测液体样品中的生物体的套件，其包括：
-根据目的75至85中任一项所述的流体***；
-根据目的86所述的计算机程序；以及
-所述生物体能够与之结合的颗粒。
目的92.用于检测液体样品中的生物体的套件，其包括：
-根据目的75至85中任一项所述的流体***；
-根据目的86所述的计算机程序；
-所述生物体能够与之结合的颗粒；以及
-生长培养基。
附图简述
图1示意性地示出了根据本发明的微流体***的实施方案。
图2A至图2Q示意性地示出了根据本发明的微流体***的室的各种可能的形式。
图3示意性地示出了根据本发明的微流体***的实施方案的细节。
图4是示出具有捕获的细菌的颗粒床的平均荧光(于Y轴，以任意单位计)，对应于在本发明微流体***中用生长培养基孵育颗粒的时间(于X轴，以分钟计)的曲线图。更多详细信息参见实施例2。
图5是示出具有捕获的细菌的颗粒床前端的进展(于Y轴，以mm计)，对应于在本发明微流体***中用生长培养基孵育颗粒的时间(于X轴，以分钟计)的曲线图。不同的曲线对应于初始样品中不同的细菌初始浓度。更多详细信息参见实施例3。
发明实施方案详述
在下文的描述中将以非限制性的方式更详细地描述本发明。
捕获区域
本发明基于在流体***的室中实现捕获区域，用于在其中保留颗粒同时使流体循环通过所述捕获区域(以便在所述捕获区域中生成流，即流体动力学流)。
因此，本发明的流体***包括在捕获区域中施加力场的装置，所述力场被配置为将颗粒保留在所述捕获区域中。
完整描述“与流体动力学流相反的力”，简言之，意指施加在至少一个颗粒上并且与流体动力学流施加在该颗粒上的力相反的力或力的组合。
力场可以是电的、介电的、电磁的、磁的、重力的(来源于重力)或离心的。优选地，所述力场是磁的。在一些实施方案中，施加力场的装置与捕获区域的特定形状相关。
所述施加装置可以特别地包含在捕获区域中限定磁场的磁***，所述磁场具有梯度并且能够将(磁性)颗粒保留在所述捕获区域中。
磁***可以包含一个或多个电磁体，或一个或多个永久磁体，或一个或多个磁极件，或其组合。
因此，获得的磁场可以在捕获区域的至少一部分中具有10T/m至10000T/m，优选为10T/m至5000T/m，更特别优选为100T/m至1000T/m的梯度。
或者，本发明的流体***可以包含在捕获区域中限定电场的电***，所述电场能够将(带电)颗粒保留在所述捕获区域中。
电***可以特别地包含至少两个电极。例如电极可以与捕获区域接触。电极也可以与在辅助槽中的捕获区域之间流体连通的液体接触。
或者，本发明的流体***可以包含在捕获区域中限定电场的电***，所述电场具有能够将(介电)颗粒保留在所述捕获区域中的梯度。
电***可以特别地包含一个或多个电极。电极也可以与捕获区域接触。电极也可以与在辅助槽中的捕获区域流体连通的液体接触。电极也可以位于捕获区域附近，但是通过绝缘体与其分隔：当电场具有交变分量时，该替代方案是优选的。
当使用电***时，其可以生成DC、交变、脉冲电场，或DC分量与非DC分量的组合。捕获区域的至少一部分(优选整个捕获区域)的电场，特别地可具有1至10V/cm、或10至100V/cm、或100至1000V/cm的振幅；在其他情况下，特别是存在与所述室绝缘的电极时，或当电场具有梯度时，振幅可以为1000V/cm至10,000V/cm、或10,000至100,000V/cm。
也可以将上述磁***和电***组合在一起。
捕获区域也可以在重力场中定向，使得捕获区域中的流体流定向为从底部到顶部。当颗粒的密度大于循环流体的密度时，则可以实现颗粒保留。
或者，捕获区域可以在重力场中定向，使得捕获区域中的流体流定向为从顶部到底部。当颗粒的密度小于循环流体的密度时，则可以实现颗粒保留。
也可以进行设备的旋转，以便在所述室的内部生成离心力。当循环流体沿与离心力相反的方向流动，并且颗粒比循环流体更致密时，则可以获得颗粒的保留。
与流体流相反的磁力、静电力、重力或离心力，具有将颗粒保留在捕获区域中的作用。
这种力可以分别由磁敏感性或电敏感性的差异生成，或者由颗粒与周围流体之间的导电性差异或密度差异产生。
与所述流相反的力的振幅可以包含连续分量。其还可以包含交变分量。
当使用介电颗粒时，或当力是由捕获区域的绝缘电极产生的电力时，或这两种情况时，存在交变分量是优选的。
例如，交变分量的频率可以具有1Hz至100Hz；或100Hz到10kHz；或10kHz至1MHz；或1MHz至100MHz的值。
在所述方法的一个或一些步骤的过程中或在整个方法过程中，与所述流相反的力场可以基本上是固定的；即，在捕获区域的各个点，所述力的方向和振幅基本上不随时间变化。当所述力具有交变分量时，在交变分量周期的至少100倍的特征性时期内来评估方向和振幅不随时间变化。
力场也可以是非固定的；即，至少在捕获区域的一些点，在所述方法过程中，所述力的振幅和/或方向变化。
如果所述力是磁力，则可以通过改变线圈中的电流，或者通过移动磁介质或可磁化介质来获得变化，例如通过移动永久磁体或铁磁流体、或磁分路来获得变化。
如果所述力是电力或静电力，则可以通过改变发电机两端之间的电位来获得变化。
如果所述力是重力或离心力，则可以通过改变捕获区域相对于重力场方向的倾斜度、或通过改变旋转速度来获得变化。
与所述流相反的力可以在捕获区域中具有梯度，即，所述力的振幅可以根据捕获区域中的位置而变化。
捕获区域中的力梯度可以是单调梯度，即，力的振幅从捕获区域的一端到另一端以单调方式变化。优选地，在捕获区域的至少一部分中(优选在整个捕获区域中)，所述力的振幅在流体的流动方向上减小。
在整个捕获区域中，所述力的方向优选相同(或基本相同)。在更特别优选的方式中，其基本上与流体的流动方向对齐。
或者，所述力的方向可以相对于流体的流动方向是横向的，或者具有相对于流体的流动方向可变的方向，或者具有取决于在捕获区域中位置的可变方向。
如下文更详细描述的，根据所述室的几何形状和用于保留颗粒的力的性质，可以获得与所述流的方向大致对齐的所述力的总体方向，但不必须在整个室中严格达到这种对齐，一方面因为力场的发散(例如，由所用磁体的形状引发的磁场发散)，另一方面因为流体动力学定律固有的流动现象，例如所述室的边缘上存在不流动状态，以及例如存在泊肃叶曲线(Poiseuille profile)。这就是为什么这种对齐的概念以一般的方式理解，而不一定以绝对的方式理解。
此外，在一些情况下，获得方向与所述流方向略微不同的力场可能是有利的，以促进在流化床状态下室中颗粒的再循环。
流化床和紧凑型床
根据一个实施方案，步骤(a)至(c)中的至少一步，优选两步或三步，更优选所有这些步骤，至少部分在所谓的流化床状态下进行，即，颗粒相对于彼此运动，同时保持全体包含在捕获区域中并且经受流体(在这种情况下为液体)的循环。
通过使颗粒经受与通过捕获区域的流体的流体动力学流相反的力来获得流化床。
这种力优选为磁力，但也可以是电力、重力(或重量)或离心力。也可能是这些力的组合。
流化床优选为致密但非紧凑的床。因此，颗粒相对于彼此移动。
紧凑状态被定义为其中颗粒与相邻颗粒永久或准永久接触的状态。致密但非紧凑的状态是其中颗粒偶尔彼此接触，但是其中颗粒主要与流体接触而不与其他颗粒接触的状态(然而颗粒之间的平均距离优选小于平均颗粒尺寸的100倍、或50倍、或20倍、或15倍、或10倍、或5倍、或3倍)。
因此，对于球形或近似球形的颗粒，在流化床中获得的致密但非紧凑的状态，通常对应于捕获区域中所述颗粒占据的体积分数0.01至0.3，例如0.01至0.05、或者0.05至0.3。
对于非球形的颗粒，特别是对于非常细长的颗粒，在本发明范围内寻求的致密但非紧凑的状态，可以对应于较小的体积分数，例如0.001至0.1，因为这些颗粒更容易相互作用。
根据一个实施方案，本发明方法的一些步骤至少部分以非流化(或紧凑)状态进行，换言之，以其中颗粒相对于彼此基本上固定的状态进行。例如，在非流化或紧凑颗粒床中，颗粒占据的体积分数可以为0.4至0.6(最特别是对于球形或准球形颗粒)。
在流化状态和非流化状态之间的切换，可以特别地通过改变捕获区域中的流体流速来进行。
因此，在所述方法的至少一个步骤过程中，且优选地在该方法的几个步骤或该方法的所有步骤过程中，流体流速被有利地控制。
通常，颗粒处于致密状态的流速值，比颗粒床处于流化、致密但非紧凑状态的流速值低5至50倍、甚至高达500倍。
在所述方法过程中，捕获区域中的流体流速可以采用不同的值。优选地，这些值遵循与步骤(a)至(c)中至少一些步骤的执行相关的预先建立的顺序。
或者，可以通过改变除流体流速以外的另一操作参数，特别是与所述流相反的力来进行流化状态和非流化状态之间的切换。因此，该操作参数可以是电场、电流、磁场、机械振动强度、压力等。
机械振动的施加，其独立地或者结合改变流速或改变与流相反的力，也可以帮助控制捕获区域中颗粒的流化或非流化性质。
颗粒
本申请中指明的颗粒尺寸是平均尺寸(Dv50)。
通常，颗粒尺寸根据所使用的流体***的尺寸和预计的流体流速而改变。
颗粒可以特别地为毫米级，即具有1mm至10mm的尺寸；或微米级，即具有1μm至1mm的尺寸；或纳米级，即具有1nm至1μm的尺寸。
优选地，所述颗粒具有50nm至50μm，更优选为100nm至1μm；或者500nm至100μm，更优选为1μm至50μm，或者还更优选为100nm至10μm的尺寸。
可以使用具有单模态分布或多模态分布的颗粒。
例如，可以使用具有双模态分布的颗粒。根据一些实施方案，这种分布包括微米级颗粒和纳米级颗粒，或几种不同类型的微米级、毫米级或纳米级颗粒。
优选地，本发明实施的颗粒具有允许它们以特异性的方式结合至一些生物体的配体。
根据一个实施方案，可以通过存在于所述生物体的表面或与所述生物体相关的识别位点来实现这种特异性结合。
根据另一个实施方案，特异性结合可以间接进行。在这种情况下，一方面在含有生物体的样品存在时，另一方面在颗粒存在时，将加入具有第二识别位点的一类生物体的特异性配体。
“配体”意指对识别位点具有亲和力的物质、分子组或亚组、功能、表面或体积单元(element)。所讨论的亲和力可以特别地为化学、物理或生物性质。特别地，所述亲和力可以依赖于在分子印迹、杂交、超分子结构形成、聚集、通过耗散的缔合中的静电相互作用、磁相互作用、生物化学相互作用、亲水-疏水相互作用等。
根据优选的实施方案，所述配体是针对相关生物体的表面抗原的抗体。
根据另一个优选的实施方案，所述配体对生物体表面上存在的经糖基化的单元或细胞外基质的单元具有亲和力。
此外，根据一些优选的实施方案，可以使用多于一种的配体，例如，如果目的是一次捕获多种类型的生物体。
颗粒可以是磁性颗粒，优选超顺磁性颗粒，特别是当与生成流化床的流相反的力是磁力时。
颗粒也可以是带电的或介电的，特别是当与生成流化床的流相反的力是电力时。
颗粒相对于存在于捕获区域中的流体可以具有密度差异。例如，颗粒的密度可以大于或等于流体密度，优选大于或等于流体密度的1.2倍，或大于或等于流体密度的1.5倍，或大于或等于流体密度的2倍，或大于或等于流体密度的3倍，或大于或等于流体密度的4倍。
或者，流体的密度可以大于或等于颗粒密度，优选大于或等于颗粒密度的1.2倍，或大于或等于颗粒密度的1.5倍，或大于或等于等于颗粒密度的2倍，或大于或等于颗粒密度的3倍，或大于或等于颗粒密度的4倍。
由于本发明可以实现灵敏度的增加，本发明的方法用比现有技术中更少量的颗粒有利地实施。
因此，根据一些实施方案，捕获区域中保留的颗粒的总质量小于1g，优选小于100mg，更优选小于10mg，更优选小于1mg，优选小于100μg，并且在一些情况下小于10、5、4、3、2或甚至1μg。
本发明的流体***
有利地，本发明的整个方法在相同的流体***(即本发明的流体***)中实施。这可以避免通过露天通路，或者通过移液来将流体从一个容器转移到另一个容器，这种转移增大了污染的风险，并且使该方法的自动化更加复杂。
本发明的流体***包括至少一个用于捕获区域的室，其配备有至少一个用于流体的入口和一个用于流体的出口。
流体***可以包括单个室或多个室。当使用多个室时，它们处于流体连通，即它们可以通过至少一个中间导管以连续的方式交换液体。
根据一个实施方案，流体***包括与包含捕获区域的室流体连通的第二室。
根据一个实施方案，流体***包括用于分子扩增的装置和用于检测来自所述分子扩增的产物的装置，其特别地可以与第二室相连。下文更详细地描述了分子扩增。
流体在其中进行循环的流体***部分，优选是整体的，即由单一材料组成。其他材料可用于流体***的其他单元，例如电极、磁体、连接器、粘合剂、附件等。
优选地，包括捕获区域的室在入口处和出口处不包括任何可以保留颗粒的过滤器。在现有技术中，过滤器用于保留颗粒，这在存在含有污染物(例如碎屑或可能具有比待检测的生物体或颗粒更大尺寸的其他物质)的流体时具有堵塞的风险。
本发明的流体***可以包括多个相同或不同的室，以便提供并联、串联或混合的操作(具有包括串联的室的并联回路，或包括并联的室的串联回路)。
可以向不同的室供应样品、颗粒以及相同或不同的介质。
本发明的***还有利地包括一个或多个槽，特别是至少一个容纳生长培养基的槽、一个用于样品的槽、一个用于颗粒的槽，任选地一个用于洗涤溶液的槽，以及任选地用于另外的流体的槽。
包括捕获区域的本发明流体***的室，通常具有流体入口、流体出口和相对于入口和出口加宽的通道区域。任选的流体***的其他室，也可具有相同类型的几何形状。
所述室也可以具有其他形状，例如圆柱形、平行六面体形或更复杂的形状。有利地，所述室可以包括流体均匀化单元。这些均匀化单元可以由连接到所述室的壁的多个结构(如柱)形成，以便产生对于所述流的局部障碍物，并且防止在所述室中形成泊肃叶型流。
本发明的流体***或其一部分可以通过3D打印来制造。或者，本发明的流体***或其一部分可以通过用于材料成形的任何技术来制造，例如机械加工、微加工、通过压力或注射模制、显微光刻法、激光烧蚀、干法或湿法蚀刻。
本发明的流体***，特别是上述的室可以由任何种类的材料制成，例如塑料材料、玻璃、金属。根据一些优选实施方案，流体***包括至少一个允许成像或光学检测的窗口。
流体***可以由彼此组装的多个单元组成。根据一个实施方案，相对于流体***的其余部分，包含包括捕获区域的室的单元是可移除的。这使得可以使用一次性的具有捕获区域的室。在这种情况下，本发明的流体***包含用于实现将可移除单元的至少一个流体入口和一个流体出口与整合至流体***其余部分的用于流体循环的孔口连接的装置。
根据本发明的流体***有利地包括用于调节温度的装置，特别是在捕获区域中。例如这些装置可以由加热装置或冷却装置组成，或由用于加热和冷却的组合装置组成。例如，这些装置可以是Pelletier模块，或者是在与所述***热接触的一个或多个辅助回路中的流体循环。这些装置也可以是通过诸如铟锡氧化物(ITO)层的耐蚀层进行加热的装置。有利地，这些装置由温度调节器调节。还有利地，该温度调节器使用由整合至***中的一个或多个温度传感器提供的信息。
因此，可以调节温度，特别是在所述方法的步骤(b)中调节温度，以促进存在于捕获区域中的生物体的生长。对于一些生物体，优选20℃至60℃、优选30℃至50℃、更特别地35℃至40℃以及例如约37℃的温度。
优选地，本发明的流体***是可转移的。例如其重量可以小于50kg、或小于20kg、或小于10kg。
优选地，本发明的流体***是便携式的。例如其重量可以小于5kg或小于1kg。
根据其他实施方案，本发明的***的尺寸大小不大于50cm，优选地尺寸不大于30cm。
流体***的捕获区域，以及使得颗粒可以保留在捕获区域中的装置如上所述。
本发明的流体***包括用于转移流体(和颗粒)的装置，其在下文更详细地描述。
本发明的流体***还包括检测装置，其在下文更详细地描述。
微流体***
在特别优选的方式中，本发明的流体***是微流体***，即包含在基底表面上的一个或多个微结构的***，所述微结构是适于容纳和/或引导流体的单元。这些微结构具有至少一个小于1mm，更特别优选小于500μm的尺寸。在一些情况下，这些微结构可以具有至少一个小于200μm、或小于100μm、或小于50μm、或小于20μm、或小于10μm、或小于5μm、或小于2μm、或小于1μm的尺寸。
这些微结构可以包括封闭的体积，并且在一些情况下具有开放的表面。
通道(或微通道)是指适用于流体的循环/流动的微结构。它们通常在流体的整个路径上是封闭的。基底优选为板或晶片。基底优选为基本上刚性的，这意味着其可以***作和附接以便保持固定，例如朝向检测器。基底可以由玻璃、硅、陶瓷、金属或聚合物材料/塑料材料制成。基底可以用相同性质的盖子覆盖，或者用柔性材料覆盖，所述柔性材料如硅酮弹性体，例如聚二甲基硅氧烷。或者，基底和盖子可以由柔性材料制成，如硅氧烷弹性体，例如聚二甲基硅氧烷。也可以使用氟化聚合物，如以“Dyneon”为名称的那些氟化聚合物。还可以使用热塑性聚合物如烯烃聚合物或共聚物，特别是环烯烃、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯。优选透明聚合物，任选地与玻璃组合。
微流体***的微结构的制造可以基于微制造技术，例如薄沉积技术、光刻、(化学或等离子体)蚀刻、热成型、模制、注射模制和粘合剂粘合。膜的沉积可以通过离心、通过热氧化、通过化学或物理蒸汽沉积(CVD和PVD)、通过低压CVD、通过等离子体增强CVD、通过喷雾等进行。
微流体***可以是芯片上实验室或包括芯片上实验室。
微流体***可以包括通道网络，即位于基底与其盖子之间或整个被基底包围的多个通道，并且它们彼此之间或与一个或多个***外部的流体源流体连通。
微流体***还可以包括在同一基底上的一系列通道，即多个未连接通道的组或未连接通道的网络。
微流体***可以通过管或管道或连接器(例如Y或X连接器)连接至流体或样品的槽以及连接至其他辅助装置，以便使流体流向***或从***收集流体。或者，这些管或管道以及任选的槽和其他辅助装置可以被认为是微流体***的一部分。
可以有利地使用针对所关注的尺寸具有相对高的流体流速的微流体***，以便将高灵敏度与小尺寸相结合。
样品的流速可以特别地为1nL/min至10mL/min，优选的流速为1μL/min至100μL/min、100μL/min至1mL/min、1至10mL/min。
捕获区域可以具有从1nL到10mL的体积。可能的体积范围是：1mL至10mL、或100μL至1mL、或10μL至100μL、或1μL至10μL、或100nL至1μL、或10nL至100nL、或甚至1nL到10nL。
根据本发明的替代方案，本发明的流体***可以是毫流体***，即，其包括一个或多个用于流体流的通道，其至少一个尺寸小于1cm，优选地在1mm至5mm(但没有小于1mm的尺寸，因为这是微流体***中的情况)。
流体和颗粒的转移
在本发明的方法中，必须将颗粒引入捕获区域，然后各种流体必须循环通过所述捕获区域，特别是被研究的样品和生长培养基。其他流体可循环通过捕获区域以进行中间的清洗步骤，或用于实施检测步骤(c)。为了检测步骤(c)或之后的步骤，通常必须从捕获区域中取出颗粒。
根据本发明，流体(和颗粒)的转移可以通过流体驱动***来进行，所述流体驱动***可以特别地包含泵、压力控制器、振动单元、阀。在一些替代方案中，流体和/或颗粒的转移也可以至少部分地通过重力或离心力的作用进行。
通过泵，可以特别地使用微制造的泵或外部泵，如微流体控制泵、注射泵、蠕动泵、隔膜泵、活塞泵、旋转泵。
优选地，使用没有任何脉冲的泵，如压力控制的微流体泵。这种***避免了基于体积控制的泵送***(例如注射泵)可能遇到的滞后问题。实际上，在后者中，所述流的每个停顿都倾于产生磁性颗粒朝向通道入口的紧凑堆积，阻塞通道的入口并且可能导致压力的累积，然后导致爆发颗粒的紧凑堆积，并且导致当流速重新恢复时颗粒的损失。
通过压力控制的微流体泵，例如来自Fluigent的MFCS***或来自Dolomite的Mythos泵，可以避免过度压力的累积，并限制上述风险。
优选地，本发明的***包括用于测量压力的装置或用于测量捕获区域中流速的装置，以及用于测量压力和流速的装置的组合。
优选使用通过来自流量计的信息来动态调节压力的***。这可以逐渐增大压力，以便增大或快速减小通过颗粒床的流体流速，以便将流速保持在预定限度内，从而避免颗粒床的任何突发现象。
实际上，在该实施方案中，可以将所述流停止或将其流速减小至低的值，同时保持与所述流相反的力场，并且在室的入口处施加受限且受控的正压力。因此，避免了从捕获区域上游的颗粒的回流。
流体和/或颗粒的转移也可以通过施加电场，通过产生电泳、介电电泳或电渗力来进行。特别地，流体的流动可以是电渗的。其可以通过在流体***的壁上或在流体***中包含的颗粒(在捕获区域中或在捕获区域外)上存在电荷来直接产生。
当通过施加电场来转移流体和/或颗粒时，所述电场可以是DC、交变、脉冲的电场，或者具有DC分量和非连续分量。特别地，其可以具有1至10V/cm、或10至100V/cm、或100至1000V/cm的振幅；在其他情况下，特别是存在与流体绝缘的电极时，或者当电场具有梯度时，振幅可以为1000V/cm至10,000V/cm，或10,000至100,000V/cm。
根据一个实施方案，将机械振动施加于本发明的流体***，或施加于使流体流向流体***的通道。特别地，这种振动可以具有1Hz至10Hz；或10Hz至100Hz；或100Hz至1kHz；或1kHz至10kHz；或10kHz至100kHz；或100kHz至1MHz的频率。可以通过包括压电单元、扬声器、电磁单元、旋转单元或交变单元的惯性振动器来以非限制性的方式产生机械振动。
施加机械振动可以减少流体中气泡的自然存在，从而提高所述流的质量。其也可以在所述流中引起振动分量或交替分量，这可以尤其是通过促进接触动力学来有助于控制生物与颗粒的结合；或者相反地，分离可能通过非特异性亲和力与颗粒结合的生物体。
在本发明的方法的范围内，流体连续循环时期可以与流体停止时期交替(特别地，这可以使孵育或反应步骤成为可能)。以第一流速循环流体的时间，也可以与以第二流速循环流体的时间交替，所述第二流速优选地比第一流速小至少10倍或至少50倍。
特别地，可以使用的流速值为1nL/min至10mL/min，特别是1μL/min至100μL/min。
具有磁捕获的微流体***
在优选实施方案中，本发明的流体***是微流体***，其由于施加磁场的装置而允许在捕获区域中磁捕获颗粒。
参考图1，本发明的微流体***1因此可以包括至少一个用于流体流的室2，其具有入口4和出口5以及用于施加磁场6的装置。
其可以是组件的形式，一方面包含用于循环流体的设备(微结构的基底，包括与其流体连通的室、以及管道、槽和其他单元)，另一方面包含施加磁场的装置，其不一定被固定或附接至所述用于循环流体的设备。
参考流体(样品、生长培养基等)的流的主要方向，来选择入口和出口。然而，为了某些程序的目的，可能以相反方向(从出口到入口)或在不同的入口和出口之间进行一些流体的短暂循环，例如为了冲洗操作。
在假定其为分支通道的情况下，所述室可以包括多个入口和/或多个出口。
再次参考图1，室2包括捕获区域3，其适于容纳磁性颗粒床(特别是以流化床形式)。
室2通常具有细长的形状，在入口4和出口5之间具有纵轴7。
纵轴7通常(至少在室2的捕获区域3中)是直线，例如，如图1所示，但是在一些情况下，如果所述室包括弯曲或曲线或方向改变，则其可以由直线段组成或被弯曲(例如，参见图2N)。
室2的纵轴7通常对应于所述室中流体的平均流动方向(其可以被定义为非湍流模式的所述室中流体的平均速度矢量的方向)。
纵轴7可以是室2的对称轴，或至少是形成捕获区域3的室2部分的对称轴。
所述室的横截面被定义为正交于室2的纵轴7的截面。
优选地，室2任何点的横截面大于或等于(优选大于)所述室的入口4的横截面；和/或室2任何点的横截面大于或等于(优选大于)室2的出口5的横截面。
根据本发明，捕获区域3沿着纵轴7在所述流的方向上加宽，即室2的横截面沿着纵轴7从室2的入口4到出口5增大。
例如，所述室可以沿其纵轴具有圆锥形状。或者优选地，为了更容易制造，所述室可以具有矩形横截面，其具有高度(或厚度，在垂直于基底平面的方向)和宽度，所述宽度在所述流的方向上增大(所述高度保持不变)，或者所述高度在所述流的方向上增大(所述宽度保持不变)，或者所述宽度和高度在所述流的方向上增大。
所述室有利地具有不变的高度(厚度)，以便更容易制造。
通常，所述室可以具有圆形、椭圆形、三角形、正方形、矩形或其他形状的横截面(包括沿着纵轴不同位置处的不同形状)，并且其可以在一侧向外部环境开放(顶部的一侧)，所述开放是在所述室的整个长度上，或者仅在所述室的一部分。优选地所述室还可以是封闭的，除了入口和出口。
所述室可以是毛细通道。
优选地，横截面的增大是连续的，例如是线性的。
在捕获区域下游，所述室可以包括下游区域，因此所述下游区域位于捕获区域和出口之间。该下游区域可以具有不变的或增大的横截面，但是优选地具有向出口减小的横截面，以便向通常具有减小的尺寸的出口提供所需要的转移。
优选地，所述捕获区域具有大致细长的形状。优选地，整个室具有大致细长的形状。
优选地，所述室的长度和/或捕获区域的长度大于所述室在其横截面的最大尺寸，并且特别地为至少2倍、或至少3倍、或至少5倍，并且该倍数可以高达20倍、100倍或500倍。
所述捕获区域在一些情况下可以是分支的，在这种情况下，横截面由不同分支的横截面的组合形成。
根据实施方案，横截面的最大尺寸可以为，例如小于或等于5mm、或1mm、或500μm、或200μm、或100μm、或60μm、或50μm、或40μm、或30μm、或20μm、或10μm、或3μm、或1μm、或300nm、或100nm、或30nm、或10nm。
此外，所述捕获区域的长度(沿纵轴的尺寸)与横截面的最大尺寸的比例可以为，例如1至500，并且优选为2至50，更特别地为3至5、5至20，或者更少见地为20至50。
所述室的高度或厚度通常可以为1μm至5mm，优选为10μm至100μm、或者100μm至1mm。
所述室的捕获区域可以具有高达10mL的体积。然而，优选地其具有小的体积，例如1mL至10mL、或100μL至1mL、或10μL或100μL、或1μL至10μL、或100nL至1μL、或10nL至100nL，或甚至1nL至10nL。小于10μL的体积是优选的。
可以适合地，所述室并且特别是其捕获区域或位于捕获区域下游的所述室的区域，通过具有与光学观察(特别是高分辨率显微镜观察)相容的厚度的透明材料在其一侧封闭，形成窗口。窗口的厚度优选小于500μm，特别是小于200μm，以特别地用于显微镜观察。
在一些其他实施方案中，例如对于低成本应用，优选地不需要显微镜观察，并且在这种情况下，所述室具有厚度大于200μm、或甚至大于500μm的壁。
图2A至2P示出了上述室的形状的各种替代方案，入口被标记为4，出口被标记为5。磁场的总体方向由图表中的矢量示出。
图2A示出了具有单个入口4和单个出口5的室，其具有不变的厚度，长度L，以及宽度I，所述宽度从入口4处的最小值线性增大直至最大值(小于长度L)，然后线性减小至出口5。因此，室的整体形状是不对称的菱形。捕获区域3位于入口4与所述室宽度最大的区域之间。
图2B示出了宽度以非线性方式变化的替代方案。并且，在所述室的上表面或下表面上设置有窗口15(如上所述)，和/或在所述室的下游设置有窗口16。
图2C示出了一个替代方案，其中所述室具有圆锥形的三维加宽。
图2D示出了一个替代方案，其中所述室具有菱锥形的三维加宽。
图2E示出了接近图2B的室的替代方案。
图2F示出了接近图2A的室的替代方案，但是具有基本上对称的菱形形状。
图2G示出了一个替代方案，其中在所述室的上游，入口4分支成三个供应通道。
图2H示出了一个具有四个出口5的替代方案，所述出口向平行的各自的下游通道开放。在该替代方案中，所述室的宽度从入口4连续增大至出口5，而不通过最大值，并且因此从顶部看到的室的形状整体上是三角形。
图2I示出了接近图2H的替代方案，其仅有两个出口5。
图2J示出了一个替代方案，其在入口4下游具有三角形的多个分支。
图2K示出了一个具有三个出口5的替代方案，所述出口在发散方向上向下游通道开放。
图2L示出了一个替代方案，其中所述室在入口4和出口5之间分成三个分支，所述分支平行地位于微流体***的基底的同一平面，每个分支包括捕获区域3(分支从入口4至出口5加宽)。
图2M示出了一个替代方案，其中所述室在入口4和出口5之间分成三个分支，其在微流体***的基底的不同厚度叠覆，每个分支包括捕获区域3(分支从入口4至出口5加宽)。这种布置特别地可以增大独特形状***的整体流速，同时保持其特性。
图2N示出了一个替代方案，其具有在出口5处形成弯曲的室。
图2O示出了一个替代方案，其具有在入口4处形成弯曲的室。
图2P示出了一个替代方案，其具有包括两个入口4的室，该室包括汇合的两个分支，以及在汇合点下游的单个出口5。
图2Q示出了(在水平截面)一个替代方案，其具有包括将流17均匀化的单元的室。
再参考图1，本发明提供了用于施加磁场6的装置，所施加的磁场基本上平行于室2的纵轴7。在图中，用箭头示出了磁场的方向。
特别地，在室2的捕获区域3的任何点处，磁场的方向相对于室2的轴线7形成小于或等于20°、或小于15°、或小于10°、或小于5°的角度；或者，在所述室的捕获区域3的任何点处，磁场的方向平行于所述室的纵轴7。
或者，可以在所述室的横截面上考虑磁场的平均矢量。该平均矢量与沿着所述室的捕获区域的所述室的纵轴形成小于或等于20°、或15°、或10°、或5°的角度；或者该平均矢量平行于沿着捕获区域的所述室的纵轴。
这种磁场与所述室的几何形状的对齐也表述为磁场与流体流的对齐。
因此，根据优选的实施方案：
-在所述室的捕获区域的任何点处，磁场的方向相对于所述室中流体在该点的速度矢量形成小于或等于20°、或15°、或10°、或5°的角度(在非湍流中)；
-所述室的横截面上的平均磁场矢量，相对于沿着所述室的捕获区域的所述横截面上的流体平均速度矢量形成小于或等于20°、或15°、或10°、或5°的角度，或者与所述流体平均速度矢量平行。
另一个限定磁场相对于所述室的捕获区域的平行度的基本上等同的方式(受到少量的发散或小的局部或时间偏差的影响)在于，强制使所述室的捕获区域中的磁场线与该捕获区域中的流体动力学场线基本上对齐(在非湍流中)，即，在捕获区域的任何点处，各个场线之间的角度小于或等于20°、或15°、或10°、或5°。
垂直于室2的纵轴7的所述基底平面中的磁场分量(横向分量)，在任何点处小于沿所述纵轴的磁场分量的30％或20％(或15％、或10％、或5％)，因此该磁场在整个室2中几乎沿着纵轴7定向。应当注意的是，在该磁场中存在沿所述纵轴的减小意味着由于所述流量的守恒、所述磁场的发散，以及在某些点、特别是朝向所述室的壁的磁场发散，因此所述磁场具有非零的横向分量。
该磁场可以通过永久磁体、或电磁体或其组合产生，任选地连有由能够引导场线的软磁性材料形成的极性部分。优选地，这种极性部分不具有任何可以产生所述磁场的多个局部最大值的微结构。
在使用不具有任何线圈(例如电线圈)的电磁铁的情况下，认为电磁体的磁极是对应于线圈中磁通量的入口和出口的两个平面。
在下文中，除非另外说明，将永久磁体和电磁体定名为通用术语“磁体”。
在一些实施方案中，磁场可以是可激活的或可调节的。特别地，有利的是，在不改变磁场方向(即其方向或场线的形状)的情况下能够改变磁场的强度(振幅)。
根据一个实施方案，本发明提供将磁体定位为其北/南极轴基本上与所述室的纵轴对齐。优选将磁体定位在所述室入口的侧面。这与现有技术中提出的几何形状不同，其中磁体或电磁***于所述室的侧面、或者在室的上方和/或下方，即在任何情况下，靠近所述室的壁，基本平行于流的方向。
根据实施方案，面向捕获室的极性部分或永久磁体的表面，可以是平坦的或具有各种形状。例如，其可以按照一个或多个方向弯曲，或者甚至在一些情况下包括一个或多个边缘。优选地，其被配置为产生在捕获区域内逐渐且连续地减小的场。如果存在边缘，优选地，它们应该具有钝角，优选大于60°或大于80°。此外，如果所述极性部分或磁体的表面是弯曲和凸面的(弓形的)，则优选地其具有大于捕获区域部分的长度的曲率半径，旨在接收和保留磁性颗粒。极性部分(或磁体)的形状调节可以调控磁场的发散，并因此根据所述室及其捕获区域的形状，通过试错法或通过数值模拟来优化***的性能。
因此，本发明中提供的磁场优选地在捕获区域中沿着纵轴或流动方向从入口到出口以连续且单调的方式变化(递减)。因此避免了任何局部的最大强度，局部的最大强度可导致磁性颗粒的局部和因此紧凑的捕获。
在一些情况下，根据期望的流速和流体的停留时间，在所述室的横截面，流体的平均流速以及磁场的强度进行非线性变化或甚至非连续的变化是可能的。
根据图4所示的替代实施方案，磁场基本上与所述室的纵轴7正交，而不是基本上平行。例如，用于施加磁场6的装置可以包含位于所述室的捕获区域3的两侧并彼此面对的第一磁体6a和第二磁体6b，第一磁体6a的北极朝向所述室，并且第二磁体6b的南极朝向所述室。
第一磁体6a的北极表面与第二磁体6b的南极表面不平行，使得在捕获区域3中磁场强度沿着流动方向减小(在捕获区域3中，相比下游侧，磁体的表面更接近上游侧)。
在所示实例中，捕获区域3由所述室的侧面限定，所述侧面不平行并且朝流动方向分开，并且磁体6a和6b定位为平行于所述室的这些侧面。
通过适当调节磁场强度和流体流速，在磁力和流体动力之间达到平衡，从而可以将磁性颗粒保留在捕获区域中。
微流体***还可以包括所用不同流体的多个其他通道、另外的入口和出口、阀以及槽。
在图1所示的实例中，微流体***1包括与上述室2的入口4流体连通的供应通道8。该供应通道8包括第一入口9、第二入口10和第三入口11，其中这些入口中的每一个可以连接至不同流体的槽和/或连接至用于控制压力的装置。在上述室2的出口5处连接有第二导管13，导管13连接至出口12，出口12可连接至流体槽和/或连接至用于控制压力的装置。
在所示的实例中，供应通道8与主室2形成具有大于90°的角度的弯曲，这可以有利于将磁性颗粒从槽引入室2。
弯曲的常规性质，结合该区域(其中磁场不沿着通道的轴线定向，并且因此该区域不具有本发明捕获区域的性质)中通道的小截面，可以防止一些磁性颗粒被捕获留在所述通道的该部分中，并且相反地可以使大部分(在最有利的情况下将所有的)在所述通道中所包含的磁性颗粒进入捕获区域3并保留在其中。但是也可能有任何其他的结构，特别是与室2对齐。而且，在所示实例中，第二导管13沿着室2的纵轴7对齐，但是可能有任何其他的结构。
本发明的微流体***还可以连接有或包含任何计算机、电子控制器或电控制器，以便例如控制温度和不同分量的操作，从而使操作和记录数据自动化。
根据一个实施方案，本发明的***包括具有比室2更高的流体阻力的第二导管，其处于上游(在所述室的入口之前)或下游(在所述室的出口之后)，相对于上述室(主室)串联。该实施方案允许更好地控制室中的流。
在图1的实例中，通过对第二导管13的长度和横截面进行适当选择(例如所述横截面可以等于、或小于等于室2在其出口5处的横截面)，第二导管13具有大于室2的流体阻力。
优选地，第二导管的流体阻力是上述室的捕获区域的至少2倍、或至少5倍、或至少10倍，例如10倍至100倍(在不存在磁性颗粒的情况下)。
第二导管可以是在与所述室相同的基底中形成的第二通道，或者其可以是连接至所述室的管或管道。
方法的步骤
该方法的步骤(a)至(c)可以是按顺序的(并且任选地在时间上分开)；换言之，步骤(a)全部进行；然后步骤(b)全部进行；然后步骤(c)全部进行。或者，所述步骤可以至少部分地以同时的方式进行。
例如，检测步骤(c)可以与步骤(a)和/或步骤(b)同时进行。例如，这允许在所述方法过程中测量生物体的数量或尺寸的变化。
在此类实施方案中，检测结果可以用于修改步骤(a)和/或步骤(b)，特别是用于修改步骤的持续时间或步骤过程中的液体流速，或者另一个如上定义的操作参数的值。
根据替代方案，检测方法被应用于多个样品，在这种情况下，在步骤(a)过程中将多个样品注入捕获区域。
生物体的生长
在步骤(b)过程中，生长培养基在捕获区域中循环。该培养基可以控制样品中生物体的生长，任选地所述样品在步骤(a)过程中通过与颗粒结合在捕获区域中被捕获。
优选地，其为营养性培养基(nutritive medium)或培养基(culture medium)。
生长培养基可以对一种特定生物体具有特异性。或者，其可以是非选择性培养基。
“生长”意指生物体的代谢扩增，即生物体的数量或质量或细胞数量(在多细胞生物体的情况下)增加的重要过程。这种生长可以对应于发育、培养、***、增殖或扩张。优选地，当生物是单个细胞时，生长对应于一系列细胞***。
有利地，在步骤(b)过程中，至少一些通过细胞***产生的生物体与颗粒结合。
在一些实施方案中，在步骤(b)之前、之后或其过程中，将任选地捕获的生物体置于寻求研究的所述生物体与之反应的物质的存在下。
特别地，这些物质可以为潜在的毒性剂，或者相反地为生长或***的刺激物，引发一些特定的代谢反应的信号转导剂，或其他所寻求的以确定所述生物体的代谢潜力的底物。
这些物质也可能是其他生物体。因此，本发明可以实现共培养。特别地，可以在其他生物体，特别是细菌或真菌存在时，实现真核细胞，特别是哺乳动物或植物细胞的共培养。一个特别的应用是细菌研究中的共培养。
优选地，不提供生长培养基的氧合作用。因此，避免了气泡的存在，这允许更有规律且更好地受控的流体流。
在步骤(b)过程中，捕获区域中可能捕获的生物体可经历指数生长。这为检测提供了宽的动态范围，并且例如与现有技术中在固体培养基上的培养方法相比，使本发明非常有利。
步骤(a)中使用的样品，在生长前可以包含的目标生物体浓度小于1,000,000个/mL(或1,000,000个/g)、优选小于1000个/mL(或1000个/g)、更优选小于100个/mL(或100个/g)、更优选小于10个/mL(或10个/g)、甚至可能小于1个/mL(或1个/g)、或小于1个生物体/10mL(或1个生物体/10g)、或小于1个生物体/25mL(或1个生物体/25g)。
步骤(a)中使用的样品，在生长前可以含有以下的待检测生物体总数：小于100,000个、优选小于10,000个、更优选小于1,000个、更优选小于100个、更优选小于50个、更优选小于20个、更优选小于10个，并且在一些应用中优选小于5、4、3、2个，甚至可以含有单个生物体。因此本发明提供了在非常稀释的样品中的特别感兴趣的检测灵敏度。
优选地，所述检测步骤涉及的生物体的量大于样品中最初含有的生物体的量，优选大于该量2倍、优选大于该量10倍、优选大于该初始量100倍、优选大于1,000倍、优选大于10,000倍、并且有时优选大于100,000倍，或甚至大于1,000,000倍。
检测
步骤(c)中进行检测的目的是确定目标生物体是否存在；或者将其计数(或确定其在所调查的样本中的浓度)，或者表征其性质或其类型。
所述检测基于对性质的测量。也可以使用多个性质测量的组合。每个测量可以是直接或间接的。
所述性质测量可以在位于捕获区域的颗粒床上原位地进行，或非原位地进行，即在捕获区域外进行。
所述原位测量具有简单和紧凑的优点。所述非原位测量可以允许更大的分析领域，并且特别地允许将捕获的生物体分型。
根据非原位替代方案的实施方案，将包含在捕获区域的颗粒或部分颗粒(待检测的生物体可能与其结合)从捕获区域中取出(例如通过增大流体流速以克服与所述流相反的力，或通过抑制与所述流相反的力)，并在检测步骤(c)之前转移到设备的另一区域。
根据非原位替代方案的另一个实施方案，可能与捕获区域中的颗粒结合的生物体完全或部分地从所述颗粒释放(例如，通过在捕获区域中循环可改变生物体与颗粒之间的相互作用的介质)，被从捕获区域中取出并转移到设备的另一区域，然后进行检测步骤(c)。
根据非原位替代方案的另一个实施方案，可能与捕获区域中的颗粒结合的生物体分泌的物质或这些生物体的组分，被从捕获区域中取出并转移到设备的另一区域，然后进行检测步骤(c)。在该实施方案中，特别地可提供细胞裂解，更特别地是细胞蛋白水解的预备步骤。
“分泌物质”意指由所述床上存在的生物体自然产生或在特定的刺激、凋亡或裂解后产生的任何类型的分子的、多分子的、有机的或细胞的物质。这些物质可以例如是分泌的蛋白质或肽、信号转导因子、外来体、代谢物、核酸或任何类型的分子聚集体、裂解产物、以及来自所述床中存在的生物体进行***或修饰的生物体(例如细胞)。
优选地，步骤(c)的检测是在步骤(b)结束时有至少20％的生物体被捕获时进行，更特别地优选至少50％，甚至更优选至少80％。
例如，测量的性质可以是，可对应于力、位移、压力、流速、质量或密度的测量的机械性质、流体动力学性质、尺寸性质。
所述性质也可以是光学性质，如光学密度、浊度、在一个或多个波长或在一个波长范围内的光辐射强度、在一个或多个波长或在一个波长范围内的辐射吸收系数。
例如，测量的性质是捕获区域中颗粒(以及结合的生物体)占据的体积。在生长步骤过程中观察到，由于生物体的生长，颗粒占据的体积增大。这种体积的增大可以直接地测量，或通过根据一个或多个方向上颗粒床的表面或长度的改变来测量。
特别地，测量由颗粒占据的体积达到预定阈值所需的时间，使得可以推断在步骤(b)开始时存在于捕获区域中的生物体浓度，并由此推断样品中生物体的浓度。
测量的性质还可以是流体动力学性质，如孔隙度、粘度、弹性或粘弹性。
测量的性质还可以是质构特性，如颗粒团，或影响颗粒床(或颗粒的样品部分)的图像的视觉方面的任何性质，或影响可从该图像导出的功能的任何性质。
测量的性质还可以是光学性质；因此可以进行对光强度、吸收、荧光或发光的测量。
步骤(c)还可以实施生物或生物化学检测，如基因分析、蛋白质组分析或代谢活性的测量。
尤其是，ELISA型的测量(通过结合酶的免疫吸附剂量)、免疫凝集、化学物质或代谢物的浓度的测量、DNA或RNA测序或基因分型、PCR、杂交网络或DNA芯片或蛋白质芯片上的杂交，或涉及DNA扩增或杂交步骤的任何其他方法。
当在捕获区域中原位进行测量时，优选对物理性质、或质构特性、或光学性质或其组合的直接测量。
在非流化(紧凑型)颗粒床上原位进行测量可以是有利的，例如当测量涉及所述床的体积时，还可以用于一些生物化学测量，如通过结合酶的免疫吸附测定。
在非原位测量的情况下，可以例如沿着连接至捕获区域出口的出口通道进行。优选地，该出口通道不连接至捕获区域的入口，这简化了流体的处理。
检测可以包括分子扩增步骤或以分子扩增步骤开始。“分子扩增”意指从目标分子获得大量待检测分子的方法。
特别地，分子扩增可以是核酸的扩增，更特别地是PCR(聚合链反应)。
核酸扩增的其他实例是逆转录(RT)、等温扩增DNA、循环复制(“滚环扩增(rollingcircular amplification)”，RCA)、分支循环复制、环-环扩增(circle to circleamplification，C2CA)、由回路促进的DNA扩增(“回路介导扩增(loop-mediatedamplification)”，LAMP)、NASBA扩增(“基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification)”)、TMA扩增(“转录介导的扩增(transcription-mediatedamplification)”)、SMART(“信号介导的RNA扩增技术(signal mediated amplificationof RNA technology)”)、HDA扩增(“解旋酶依赖性扩增(helicase-dependentamplification)”)、RPA扩增(“重组酶聚合酶扩增(recombinase polymeraseamplification)”)、(CPA)扩增(“交叉引物扩增(cross-priming amplification)”)、SMART-AMP(“Smart扩增”)、RAM扩增(“分枝扩增(ramification amplification)”)、SDA扩增(“链置换扩增(strand displacement amplification)”)、NEAR扩增(“切口酶扩增反应(nicking enzyme amplification reaction)”)、NEMA扩增(“切口酶扩增反应(nickingenzyme amplification reaction)”)、ICA扩增(“等温链扩增(isothermal chainamplification)”)、EX-PAR扩增(“指数扩增反应(exponential amplificationreaction)”)、BAD扩增(“信标辅助检测扩增(beacon-assisted detectionamplification)”)和使用Phi29DNA聚合酶的扩增。关于该主题可参考Trends inBiotechnology,29.240-250(2011)中Niemz等人的文章。
分子扩增也可以是酶扩增。在这种情况下，使用特异性地(直接或间接地)与目标分子结合并且可以转化多个底物分子的酶，其中这种转化可以比初始目标分子更容易检测。酶扩增的一个实例是ELISA技术。
分子扩增也可以是PLA扩增(“邻位连接测定(proximity ligation assay)”)，或基于多重和/或多重化杂交。用于实施这些技术的试剂盒是可商购的，商品名为或
分子扩增也可以是催化型的。
分子扩增也可以是化学发光、电化学发光或电化学技术。
本发明的方法可以允许对样品的生物体进行分型。
这种分型可以特别地是细胞分型。
细胞分型可以包括确定生物体(例如细菌)的特定品种，或确定这些生物体的类别、群体、物种、变种或任何其他的物种分类的特征。
细胞分型也可以检测一些细胞的异常等，例如尤其是针对多细胞生物体的细胞。
分型也可以包括确定基因修饰的生物的一种或多种目标性质。
分型也可以是基因分型。其可以包括确定病原生物体、癌细胞、胎儿细胞的基因型。其可以包括识别开启/关闭突变或大规模的基因组修饰，如缺失、扩增、重组或***。
分型也可以是表型。其可以包括确定生物体的形态学、结构、蛋白质组或转录组，或确定核酸的修饰，如细胞内核酸的甲基化、磷酸化或其他修饰。
分型也可以是功能分型。其可以包括评估一些蛋白质、代谢物或核酸(例如微RNA)的产生，一些物质的代谢，或对一些物质的抗性，特别是对毒性剂或药物的抗性。功能分型还可以涉及评估增殖能力、分化能力、多能特性。
为了允许本方法步骤(c)的实施，本发明的流体***包括适当的装置，特别是用于测量至少一种物理、化学或生物性质的***。
该测量***可以与包括捕获区域(用于原位测量)的室相连，或者与流体***的另一个室(用于非原位测量)相连，该室可以被描述为检测室。
测量***可以包括用于对流体***的内含物成像，特别是对检测室或捕获区域的内含物成像的设备。该成像设备优选地与图像分析软件相连。
测量***可以包括一个或多个光源，以及一个或多个光强度检测器。其可以包括光谱仪、频率分析仪、阻抗分析仪或电导计(带有电极)。
测量***可以包括用于测量流体动力学阻力、粘度、渗透性、压力或流速的装置。
测量***还可以包括用于测量生物学性质的装置，例如测序仪、电泳设备、质谱仪、PCR仪、等离子体共振***、石英微量天平或荧光计。
进行测量可以推断与样品中生物体的存在、死亡或生存状况、浓度或生物体种类有关的信息。
该信息的推断可以通过计算机程序或任选地通过算盘或数学公式来进行。
分析应用
本发明可以对样品中存在的生物体进行至少一种识别、检测、分析、鉴定、基因分型、定量或表型分型的操作。
本发明可以确定样品是否含有活生物体(与死生物体相反)。
本发明也可以对生物体进行计数(或确定样品中生物体的浓度)。
本发明也可以确定样品中可能存在的生物体的种类。
本发明也可以确定生物体发育、增殖或***的能力。
本发明尤其对于检测选自细菌、单细胞或多细胞寄生虫、真菌、哺乳动物细胞和植物细胞的生物体感兴趣。
根据具体实施方案，所关注的生物体是病原生物体；或是干细胞；或是癌细胞。
本发明特别适用于检测分子特别是药物对细胞或其他生物体的作用。为此，可以在步骤(a)之后，特别是在步骤(a)和步骤(b)之间，或在步骤(b)过程中，或在步骤(b)之后，在捕获区域中提供含有分子或所研究的药物的流体的循环步骤。
本发明可以用于实施诊断分析(在人类医学或兽医学中)。
本发明可以用于实施环境分析，如研究或鉴定在水中或在土壤中的生物体(特别是细菌或病原生物体)。
本发明可以用于实施在动物，特别是哺乳动物中存在的细菌(消化道细菌、皮肤细菌等)的分析。
本发明可以用于鉴定或选择基因修饰的生物体。本发明可以对生物体(特别是病原生物体)的进行基因分型或表型分型。
用于本发明方法的样品可以是诸如血液、唾液、脑脊液、羊水、尿、淋巴液、活检穿刺、粪便的体液样品，或源自这些体液之一的样品。
本发明可以特别地应用于***的诊断；其也可以应用于败血病的诊断。
本发明也可以应用于检测病原体的感染，例如检测大肠杆菌(E.coli)，沙门氏菌(Salmonella)，艰难梭菌(C.difficile)，链球菌(Streptococcus)或SARS传染物的感染。
或者，样品也可以来源于食品，或者可以在环境中进行取样。
作为示例，本发明的方法可以应用于在食品中，特别是在乳制品(例如奶粉、奶酪、黄油、冰淇淋等)中检测以下生物体的存在：
-沙门氏菌(salmonellas)(检测25g产品中是否存在至少一个沙门氏菌)；
-肠杆菌(Enterobacteriaceae)(特别是检测浓度大于或等于1或5cfu/mL，或检测10g产品中是否存在至少一个单位)；
-大肠杆菌(E.coli)(特别是检测浓度大于或等于10或102或103cfu/g)；
-具有阳性凝固酶的葡萄球菌(staphylococci)(特别是检测浓度大于或等于10、或102、或103、或104、或105cfu/g)；
-蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)(特别是检测浓度大于或等于1cfu/mL、或50或500cfu/g)；
-需氧菌群(特别是检测浓度大于或等于1cfu/mL)；
-亚硫酸盐还原细菌(特别是检测浓度大于或等于1cfu/mL)；
-单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(特别是检测在25g产品中浓度大于或等于1单位)。
制备应用
本发明也可以应用于生物体的制备或微制备。实际上，其可以在紧凑且高度自动化的设备中捕获非常少量的生物体，以便将其增殖并任选地将其表征。
因此，本发明的制备生物体的方法通过与任何上述检测方法相同的方式实施，除了：
-液体样品含有能够与捕获区域的颗粒结合的母体生物体；
-在捕获区域的出口处，提供针对来自母体生物体***的生物体的收集步骤。
在这种制备方法中，确定捕获区域中生物体的存在、性质或浓度的步骤，或测量捕获区域的物理性质的步骤是可选的。
然而，有利地，这些步骤中至少一步是实际存在的，在这种情况下，本发明的方法既是用于检测液体样品中的生物体的方法，也是用于从该液体样品制备生物体的方法。
有利地，本发明的用于制备生物体的方法在本发明的流体***中实施。
因此，这种流体***包括用于在捕获区域的出口处收集来自母体生物体***的生物体的装置。其可以包括或可以不包括用于测量捕获区域的物理性质的装置，和/或用于确定与检测专用的流体***连通的上文描述的样品中生物体的存在、或浓度、或性质的装置。
特别地，制备方法可用于生物技术，用于选择和制备对于具体应用具有感兴趣的特征的生物体。
其也可用于选择和产生祖细胞、干细胞、造血细胞、造血干细胞或内皮集落形成细胞。
例如其可以具有从患者的血液样品捕获和繁殖内皮集落形成细胞的应用，再生医学应用，或捕获和繁殖原代或诱导的干细胞。
由于在下文的实施例5中证实了以下能力：根据特定标准捕获细胞，然后连续释放由这些细胞产生的物质，以及特别地来自第一阶段捕获的细胞的相同或不同的其他细胞所产生的物质，本发明尤其可用于这些应用中。
实施例
以下实施例说明了本发明，但未对其进行限制。
实施例1-捕获率的估计
根据图1制作微流体***。室2的长度为21mm，厚度为50μm，宽度从100μm到2mm(最大宽度区域)变化。
根据Mohamadi等人在Biomicrofluidics，5,044114(2011)中的文章描述的显微光刻法程序，在聚二甲基硅氧烷中制备微流体***。
为了产生磁场，使用放置在室2附近的NdFeB1型永久磁体：磁体与微流体***之间的距离为2mm。磁体以其最大尺寸被磁化，并且具有1.47T的永久磁场。其尺寸为30×20×20mm。
该***类似于文献WO 2014/037674的实施例1、2、3、4和5中的***，该文献清楚地提及了更多细节。
在本实施例中，目的是捕获沙门氏菌(salmonellas)。
使用的颗粒是抗沙门氏菌(由销售)，总量为50μg。
所研究的生物体是沙门氏菌(鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))。通过在添加了0.1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液中稀释来自培养皿中生长的菌落的细菌而制备含有沙门氏菌的样品。
为了通过颗粒床进行细菌的捕获，将样品以1,000nL/min的流速注射通过捕获区域。该步骤持续50分钟，样品为50μL(含有400个细菌)。
然后用含有0.1％BSA的磷酸盐缓冲液进行洗涤。流速调整为1500nL/min，而注射的液体积为40μL。
通过测量在***出口处回收的液体(90μL对应于样品和洗涤缓冲液的通过)中的细菌含量，来实现细菌捕获率的第一次估计。通过在培养皿上培养并对形成的菌落计数来进行测量。
通过去除微流体***的颗粒，并通过培养所捕获的细菌来实现第二次估计。
这两次估计一致提供约90％的捕获率。
此外，文献WO 2014/037674的实施例5中已经特别地说明了细菌捕获的特异性。
实施例2-细菌原位生长并通过荧光观察
在该实施例中，使用荧光沙门氏菌(用绿色荧光蛋白或GFP标记)。
重复与实施例1相同的程序，但是在捕获细菌的步骤之后，使营养培养基进入通过捕获区域(LB培养基，即“溶菌液体培养基(lysogeny broth)”)。流速调节至150nL/min。
通过由铟锡氧化物层覆盖的玻璃侧壁、由PID型调节来控制的热电偶和电源组成的***，进行自调节加热。在粘附至氧化物层并连接至电源***的两个铜电极中流通电流，其通过焦耳效应引起对板的加热。将温度调节至设定值37℃。
培养阶段，在生长培养基中以规律的间隔切断电源，以便将流化床状态切换到紧凑型床状态，然后在测量后回到流化床模式。
这使得可以通过获取用显微镜拍摄的图像来以规律的间隔测量紧凑颗粒床的荧光平均强度。
图4示出了荧光随时间的变化。其表达出在生长步骤过程中细菌数量的猛烈增长。
实施例3-细菌原位生长并通过光学成像观察
重复与实施例2相同的程序，但不进行任何荧光测量。
使用相机拍摄所述床的图像(处于紧凑模式)。随着细菌***，逐渐地可以观察处于紧凑模式的所述床的总体积，或床前端(即，包含捕获区域的室中所述床的纵向尺寸)的进展。
Image J软件用于测量处于紧凑模式的床的前端随着时间的进展。
可以看出，在第一阶段过程中，颗粒床的尺寸不变。然后，所述床的尺寸开始快速增大，这由测量的前端的进展表示。如果细菌的生长是指数型生长，鉴于所述室的宽度沿其轴线增大，则前端的进展移动是近似线性的。
通过在样品中使用多种沙门氏菌的初始浓度可以看出，颗粒床体积的扩张具有类似的情况，只是所述床扩张的开始时间变化。因此，可以从所述床扩张的起始时间来推断细菌的初始浓度，或通过确定使该浓度达到一定阈值所经过的时间来推断细菌的初始浓度。例如，对于简单的指数生长模型，所述床的扩张所需的时间t，遵循对数定律作为初始细菌数N的函数，其形式为t＝-a ln(N)+b。
因此，参考图5，针对含有400个细菌(曲线A)、或100个细菌(曲线B)、或30个细菌(曲线C)、或5个细菌(曲线D)的50μL样品，将通道中颗粒床前端的进展进行比较。由这些曲线，可以推断在这些实验条件下参数a≈45，并且b≈510。
实施例4：包括在生长步骤后通过PCR进行DNA分子扩增步骤的方法
如上所述，在磁性颗粒上捕获细菌后，通过在磁性颗粒床中注射溶液(10μL)来裂解细菌，使其裂解并释放DNA，并且其与通过qPCR扩增直接兼容(Lysis and Go PCR试剂，Thermo)。为了改善细菌裂解的性能并使核酸外切酶失活，整个***经历下表所示的温度循环。将该裂解步骤后回收的溶液与市售的用于PCR的混合物(或混合物(mix))(例如iQ-Check Salmonella II Kit)直接混合，因此对扩增基因组或质粒DNA是有效的。为此，将裂解物置于热循环仪中以便进行PCR，通过将引物加入管中进行PCR，并所述PCR混合物中裂解物/混合物比(1:10，v/v)。通过比较PCR结果分析软件提供的“Ct”来检查初始样品中沙门氏菌的存在：选择小于30的Ct作为沙门氏菌存在的指标。
循环 温度(℃) 时间(秒)
1 65 30
2 8 30
3 65 90
4 97 180
5 8 60
6 65 180
7 97 60
8 65 60
9 80 维持
实施例5-包括释放在流化床中产生的生物体的步骤的方法
在如上所述，在磁性颗粒上捕获细菌之后，以10μl等份的形式，每小时1等份的速度，随时间收集离开流化床的离开液体。然后以常规方式通过在培养板上涂布来测量每个等份中含有的细菌数量。下表提供了随着时间推移释放的细菌数量，初始量为50μL中500个细菌，即初始浓度为10μL中100个细菌。
时间(h) 10μL中的细菌数
1 3
2 3
3 6
4 50
5 512
6 8488
一方面，该实验示出了本发明的高捕获效率，因为开始时在10μL中仅释放3个细菌(相对于设备入口处的100个)，还示出了本发明以远高于初始样品的浓度，连续且高效地产生大量细菌的能力。

Claims (50)

1.检测液体样品中的生物体的方法，其包括提供捕获区域，所述捕获区域包含处于液体介质中的颗粒并经受流体动力学流，其中待检测的生物体能够与这些颗粒结合，其中所述方法包括以下步骤：
(a)使所述样品循环通过所述捕获区域；
(b)使生长培养基循环通过所述捕获区域；以及
(c)确定所述捕获区域中生物体的存在、性质或浓度；
在这些步骤的至少一部分的过程中，所述颗粒以流化床的形式保留在所述捕获区域中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生长培养基包含所述生物体的营养物。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述流体动力学流的速度在所述捕获区域中沿所述流体动力学流的方向减小。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过施加与所述流体动力学流相反的力，优选磁力，来获得所述颗粒在所述捕获区域中的保留，所述颗粒是磁性颗粒，更优选超顺磁性颗粒。
5.根据权利要求4所述的方法，其中与所述流体动力学流相反的力在所述捕获区域中沿所述流体动力学流的方向减小。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述生物体选自：原核细胞、细菌、酵母、单细胞或多细胞寄生虫、真菌细胞、真核细胞并且特别是哺乳动物细胞或植物细胞，或这些细胞的功能性组装体；或者其中所述生物体选自：病原生物体、干细胞、基因修饰的生物体和癌细胞；或者其中所述生物体选自：内皮细胞、造血细胞、上皮细胞、胎儿细胞、多能细胞、全能细胞和诱导的多能干细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中通过检测、培养或鉴定在步骤(b)过程中通过流体动力学流从所述捕获区域转移出的生物体或物质来进行步骤(c)。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中通过测量所述捕获区域中的性质，或通过测量所述捕获区域外的性质来进行步骤(c)。
9.根据权利要求8所述的方法，其包括：
-在步骤(b)之后或在步骤(b)过程中，将物质转移至所述捕获区域外，通过测量所转移的物质的性质来进行步骤(c)；所述物质优选为能与所述捕获区域中的颗粒结合的所述生物体分泌的物质，或者为任选地通过裂解释放的这些生物体的组分，或者为与所述捕获区域中的颗粒结合的其他生物体或来源于这些生物体的生物体。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其包括：
-在步骤(b)之后从所述捕获区域对颗粒取样，通过测量取样颗粒的性质来进行步骤(c)。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中测量的性质是生物或生物化学性质，如亲和力、增殖能力、表型或表型性质、基因型或基因特征、突变、表达水平、形态学或增殖能力。
12.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中测量的性质是：力、位移、压力、流速、质量、密度、孔隙度、粘度、弹性、粘弹性、光学密度、浊度、质构特性、强度测量或辐射吸收系数。
13.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中测量的性质为，任选地当所述颗粒为紧凑型床的形式时，所述捕获区域中所述颗粒占据的体积或所述占据的体积的尺寸。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述样品中生物体的浓度作为在步骤(b)过程中所述捕获区域中的颗粒占据的体积达到阈值所需的时间的函数被确定。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括生物或生物化学分析，优选基因分析、蛋白质组分析、毒素分析或代谢活性的测量，更特别优选核酸的扩增和/或杂交、核酸测序、免疫凝集或通过结合酶的免疫吸附测定。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中基于在步骤(a)结束时所述捕获区域中存在的生物体的数量，步骤(b)能使所述捕获区域中生物体的数量增加至少10倍、优选至少100倍、或至少1,000倍、或至少10,000倍、或至少100,000倍。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其在微流体***中实施。
18.检测液体样品中的生物体的流体***，其包括：
-至少一个室，其包括至少一个流体入口和一个流体出口，并且包括捕获区域；
-用于使所述液体样品循环通过所述捕获区域的装置；
-用于使生长培养基循环通过所述捕获区域的装置；
-用于在所述捕获区域施加力场的装置，所述力场被配置为使得当所述捕获区域经受流体动力学流时，将颗粒以流化床的形式保留在所述捕获区域中，其中待检测的生物体能够与所述颗粒结合；
-用于确定所述捕获区域中生物体的存在、性质或浓度的装置。
19.根据权利要求18所述的流体***，其包括与所述室的出口流体连通的至少一个另外的室或槽。
20.根据权利要求18至19中任一项所述的流体***，其还包括用于调节所述室的温度的设备。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的流体***，其为微流体***。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的流体***，其中所述用于确定的装置包括用于测量与包含所述捕获区域的室流体连通的第二室中的性质的装置。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的流体***，其包括生物或生物化学分析装置，并且优选基因分析、蛋白质组分析或代谢活性测量装置，更特别优选用于核酸扩增和/或核酸杂交、用于核酸测序、用于免疫凝集或通过结合酶的免疫吸附测定的装置。
24.检测液体样品中的生物体的套件，其包括：
-根据权利要求18至23中任一项所述的流体***；以及
-所述生物体能够与之结合的颗粒。
25.检测液体样品中的生物体的套件，其包括：
-根据权利要求18至23中任一项所述的流体***；以及
-生长培养基。
26.检测液体样品中的生物体的方法，其包括提供捕获区域，所述捕获区域包含处于液体介质中的颗粒并经受流体动力学流，其中待检测的生物体能够与这些颗粒结合，所述方法包括以下步骤：
-使所述样品循环通过所述捕获区域；
-在所述样品循环过程中和/或之后，测量所述捕获区域的物理性质，以便由此推断所述样品中生物体的存在、或浓度、或性质；
在这些步骤的至少一部分的过程中，所述颗粒以流化床的形式保留在所述捕获区域中。
27.根据权利要求26所述的方法，其中测量的物理性质选自：粘度、粘弹性、体积、渗透性和密度性质。
28.由存在于液体样品中的母体生物体制备生物体的方法，其包括提供捕获区域，所述捕获区域包含处于液体介质中的颗粒并经受流体动力学流，其中所述母体生物体能够与这些颗粒结合，所述方法包括以下步骤：
(a)使所述样品循环通过所述捕获区域，并使母体生物体与所述颗粒结合；
(b)使生长培养基循环通过所述捕获区域；以及
(c)在所述捕获区域的出口处收集来自母体生物***的生物体；
在这些步骤的至少一部分的过程中，所述颗粒以流化床的形式保留在所述捕获区域中。
29.根据权利要求28所述的方法，其中步骤(c)在不释放与所述颗粒结合的母体生物体的情况下进行。
30.根据权利要求28或29中任一项所述的方法，其中步骤(c)和步骤(b)至少部分重叠或交替。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中基于初始样品中存在的生物体的数量，使生长培养基循环的步骤能使所述捕获区域中的生物体的数量或在所述捕获区域的出口处收集的生物体的数量增加至少10倍、优选至少100倍、或甚至至少1,000倍、或至少10,000倍，或至少100,000倍。
32.根据权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述流体动力学流的速度在所述捕获区域中沿所述流体动力学流的方向减小。
33.根据权利要求26至32中任一项所述的方法，其中通过施加与所述流体动力学流相反的力来获得所述颗粒在所述捕获区域中的保留。
34.根据权利要求33所述的方法，其中与所述流体动力学流相反的力在所述捕获区域中沿所述流体动力学流的方向减小。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中与所述流体动力学流相反的力与所述流体动力学流的方向基本上对齐。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中与所述流体动力学流相反的力是磁力，所述颗粒是磁性颗粒，优选超顺磁性颗粒。
37.根据权利要求26至36中任一项所述的方法，其中待检测的生物体、其各自的母体生物体能够经由配体、优选经由抗体与所述颗粒结合。
38.根据权利要求26至37中任一项所述的方法，其中所述颗粒的平均尺寸Dv50为1nm至500μm，优选为50nm至100μm，更特别地为1μm至50μm。
39.根据权利要求26至38中任一项所述的方法，其中所述生物体选自：细菌、单细胞或多细胞寄生虫、真菌、真核细胞并且特别是哺乳动物细胞或植物细胞，并且其中优选地所述生物选自：病原生物体、干细胞和癌细胞；或者选自：内皮细胞、造血细胞、上皮细胞、胎儿细胞、多能细胞、全能细胞和诱导的多能干细胞。
40.根据权利要求26至39中任一项所述的方法，其是权利要求26所述的检测方法，并且其中测量的性质是所述捕获区域中所述颗粒占据的体积或所述占据的体积的尺寸。
41.根据权利要求26至40中任一项所述的方法，其在微流体***中实施。
42.根据权利要求26至41中任一项所述的方法，其还包括使包含用于生物体的靶标试剂的培养基循环通过所述捕获区域的步骤，其任选地在使所述生长培养基循环的步骤之后。
43.根据权利要求42所述的方法，其用于筛选药物或杀生物剂，其中所述靶标试剂是潜在的药物或杀生物剂。
44.检测液体样品中的生物体的流体***，其包括：
-至少一个室，其包括至少一个流体入口和一个流体出口，并且包括捕获区域；
-用于使所述液体样品循环通过所述捕获区域的装置；
-用于在所述捕获区域施加力场的装置，所述力场被配置为使得当所述捕获区域经受流体动力学流时，将颗粒以流化床的形式保留在所述捕获区域中，待检测的生物体能够与所述颗粒结合；
-用于测量所述捕获区域的物理性质的装置；
-根据该测量结果确定所述样品中生物体的存在、或浓度、或性质的装置。
45.由存在于液体样品中的母体生物体制备生物体的流体***，其包括：
-至少一个室，其包括至少一个流体入口和一个流体出口，并且包括捕获区域；
-用于使所述液体样品循环通过所述捕获区域的装置；
-用于在所述捕获区域施加力场的装置，所述力场被配置为使得当所述捕获区域经受流体动力学流时，将颗粒以流化床的形式保留在所述捕获区域中，所述母体生物体能够与所述颗粒结合；
-用于在所述捕获区域的出口处收集来自母体生物体***的生物体的装置。
46.根据权利要求44所述的流体***，其中用于确定所述样品中生物体的存在、或浓度、或性质的装置包括用于收集、培养或繁殖来自所述捕获区域的生物体的装置。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的流体***，其包括：
-用于使生长培养基循环通过所述捕获区域的装置。
48.根据权利要求44至47中任一项所述的流体***，其为微流体***。
49.检测液体样品中的生物体的套件，其包括：
-根据权利要求44至48中任一项所述的流体***；以及
-所述生物体能够与之结合的颗粒。
50.检测液体样品中的生物体的套件，其包括：
-根据权利要求44至48中任一项所述的流体***；以及
-生长培养基。
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