CN107209144B - 干法蛋白质转移 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种用于使用导电聚合物电极将生物大分子从电泳平板凝胶转移至印迹膜的试剂盒、***和方法。

Description

干法蛋白质转移

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2015年2月10日提交的美国临时专利申请号62/114,387的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文。

背景技术

在平板凝胶中通过电泳分离的蛋白质、核酸或其它生物物质在鉴定和定量之前，常被转移至由硝酸纤维素、尼龙、聚二氟乙烯或类似材料制成的印迹膜。电印迹是一种常用的转移技术，其中，将凝胶和膜的平坦表面以直接接触的方式配置。然后，电流沿横向方向流过凝胶和膜，从而通过与物质在凝胶中移动的方式类似的方式将物质转移。当物质为DNA片段时，该转移被命名为Southern印迹，其开发者是英国生物学家Edwin M.Southern。以此类推，RNA片段的转移被命名为northern印迹，蛋白质或多台的转移被命名为western印迹。其它示例是针对翻译后修饰的“eastern”印迹和针对蛋白质相互作用的“far western”印迹。

电印迹可以湿、干或半干的形式进行。在湿法印迹中，凝胶和膜相互层叠成层叠体，将该层叠体浸渍在转膜槽内的转移缓冲液中，该转膜槽的壁上安装有导线或板状电极。随后对电极施加电压以使溶质从凝胶迁移至膜。在半干印迹中，将用转移缓冲液湿润的滤纸配置于层叠体的顶部和底部，将凝胶和膜夹在中间以形成“印迹夹心”。随后将电极配置成与湿润的滤纸的露出的表面直接接触。在干法电印迹中，不使用除凝胶中残留缓冲液以外的液体缓冲液。湿法、干法和半干电印迹的描述以及相关的材料和设备可见Margalit等(英杰公司(Invitrogen))的美国专利申请公开号US 2006/0272946 A1(2006年12月7日)、US 2006/0278531 A1(2006年12月14日)和US 2009/0026079 A1(2009年1月29日)；Littlehales(美国百奥奈特公司(American Bionetics))的美国专利号4,840,714(1989年6月20日)；Dyson等(安玛西亚国际公司(Amersham International))的美国专利号4,889,606(1989年12月26日)；Schuette(生命技术公司(LifeTechnologies,Inc.))的美国专利号5,013,420(1991年5月7日)；Chan等(雅培实验室公司(Abbott Laboratories))的美国专利号5,356,772(1994年10月18日)；Camacho(Hoefer科学仪器公司(Hoefer ScientificInstruments))的美国专利号5,445,723(2005年8月29日)；Boquet(伯齐公司(Bertin&Cie))的美国专利号5,482,613(1996年1月9日)；以及Chen(威泰克企业有限公司(WealtecEnterprise Co.,Ltd.))的美国专利号6,592,734(2003年7月15日)。

在所有的电印迹形式中，有一种或多种水溶液与电泳凝胶或印迹膜接触，或者包含在电泳凝胶或印迹膜内。将金属(例如铂、银、铅、铜或铝)电极应用于电印迹时，在各电极与这些溶液的界面上发生电化学反应。该反应可包括水电解，该水电解在阳极生成O₂气体、氢离子和过氧化氢，并且在阴极生成H₂气体和氢氧根离子。电化学反应也可使电极电离，导致金属离子从电极表面释放至邻近的溶液中。这种反应的产物可与正在电泳凝胶和印迹膜之间进行转移的生物物质相互作用，使得这些物质被化学修饰(例如氧化或还原)、变性或丧失功能。电化学反应产物、尤其是由水电解生成的气体也可使电极的能够传输电流的表面积减小，并导致电印迹的效率降低。

发明内容

本申请提供一种用于通过电印迹将生物大分子从电泳平板凝胶转移至印迹膜的试剂盒、***和方法。

在本发明的第一个方面，提供一种试剂盒。所述试剂盒包括两个导电聚合物电极，各电极包括基质和端子。所述基质包含导电聚合物混合物，该导电聚合物混合物包含共轭有机聚合物。所述端子与所述基质电连接，用于接收来自电源的电能。

在所述试剂盒的一些实施方式中，所述共轭有机聚合物是聚噻吩、聚苯胺、聚吡咯、聚亚苯基或聚(对亚苯基亚乙烯基)。所述共轭有机聚合物可以是聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)。在一些实施方式中，所述导电聚合物混合物还包含聚电解质。在这些实施方式中，所述共轭有机聚合物可以带正电，所述聚电解质可以带负电。所述聚电解质可以是水溶性的和/或磺化聚苯乙烯。所述导电聚合物混合物可包含聚(3,4-乙烯二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸盐/酯)(PEDOT:PSS)。

在所述试剂盒的一些实施方式中，所述导电聚合物混合物是水溶性的。在一些实施方式中，所述导电聚合物混合物具有至少0.1、1、10或100S/cm的电导率。在一些实施方式中，所述基质是纳米复合物，并且可进一步包含合成粘土。在一些实施方式中，所述基质是触变性的。在一些实施方式中，所述基质具有至少0.1、1、10或100S/cm的电导率。在一些实施方式中，所述导电聚合物混合物占所述基质重量的至少百分之0.1、0.3、1、1.3、3、10或30。在一些实施方式中，所述基质还包括多孔性基材，该多孔性基材中设置有所述导电聚合物混合物。

在所述试剂盒的一些实施方式中，各电极还包括包封所述基质的刚性盒体。所述盒体包括底板、与该底板连接的壁、以及从所述壁侧向延伸的唇缘。所述盒体的底板和壁限定一个中央空腔，所述基质设置在该中央空腔内。在这些实施方式中，至少一个电极可进一步包括保护板，该保护板粘附于所述盒体的唇缘并覆盖所述中央空腔，并且设置成能从所述唇缘移除以暴露所述中央空腔。至少一个电极可进一步包括多孔性膜，该多孔性膜安装于所述基质或所述盒体的唇缘，并覆盖所述基质。各电极的端子可设置于所述盒体的外表面上，并通过导电元件与所述基质电连接，该导电元件穿过所述盒体的壁或所述盒体的底板。

在所述试剂盒的实施方式中，至少一个电极可进一步包括设置于所述基质和所述盒体底板之间的导电板，该导电板与所述基质及所述端子电连接。所述盒体可包含电绝缘材料。所述盒体的唇缘可配置成在所述电极合并在一起时彼此啮合，并且一个盒体的唇缘可以与另一个盒体的唇缘在形状上互补，从而通过所述盒体的唇缘的啮合将所述电极固定在一起并同时保留所述基质之间的间隙。

在所述试剂盒的一些实施方式中，有多个校准桩从至少一个电极的盒体的唇缘突出，有多个校准孔切入至少一个电极的盒体的唇缘，所述校准桩和校准孔配置成在所述电极合并在一起时彼此啮合，并且所述校准孔与所述校准桩在形状上互补，从而通过所述校准桩与所述校准孔的啮合将所述电极固定在一起并同时保留所述基质之间的间隙。在一些实施方式中，可以在各校准桩的表面上设置电绝缘材料，或者在各校准孔的内部排布电绝缘材料。

所述试剂盒的一些实施方式还包括夹子，该夹子用于将两个电极在电泳平板凝胶和印迹膜周围固定在一起。当电极如此固定时，电极的基质彼此面对且平行，电泳平板凝胶和印迹膜则被容纳在两个电极的间隙中，并且所述夹子对电极施力以保持各电极与电泳平板凝胶或印迹膜接触，并保持电泳平板凝胶与印迹膜相互接触。在这些实施方式中，所述夹子可与各电极的端子电连接，并且可以用来将电能从电源输送至所述端子。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括电源，该电源用于经由所述端子向所述电极输送电能，其中，输送至一个电极的电流与输送至另一个电极的电流极性相反。

在本发明的第二个方面，提供一种***，该***用于通过电印迹将生物大分子从电泳平板凝胶转移至印迹膜。所述***包括：以上所述的试剂盒的两个导电聚合物电极；容纳在所述电极之间的间隙中的电泳平板凝胶和印迹膜；以及用于经由所述端子向所述电极输送电能的电源；其中，输送至一个电极的电流与输送至另一个电极的电流极性相反。所述***用于，在不存在与电泳平板凝胶或印迹膜接触的外源的缓冲液、电解质或溶剂的情况下，通过向电极输送电能而将生物大分子从电泳平板凝胶转移至印迹膜。

在一些实施方式中，所述***还包括夹子，该夹子用于将两个电极在电泳平板凝胶和印迹膜周围固定在一起，使得，当电极如此固定时：电极的基质彼此面对且平行，并且所述夹子对电极施力以保持各电极与电泳平板凝胶或印迹膜接触，并保持电泳平板凝胶与印迹膜相互接触。在这些实施方式中，所述夹子可与各电极的端子电连接，并且可以用来将电能从电源输送至所述端子。

在本发明的第三个方面，提供一种方法，该方法用于通过电印迹将生物大分子从电泳平板凝胶转移至印迹膜。所述电泳平板凝胶和所述印迹膜容纳在以上所述的试剂盒的两个导电聚合物电极之间的间隙中，使得，各电极与电泳平板凝胶或印迹膜接触，并且电泳平板凝胶与印迹膜相互接触。此外，所述电极的端子与电源连接。所述方法包括经由所述端子向所述电极输送电能，其中，输送至一个电极的电流与输送至另一个电极的电流极性相反，从而通过电印迹将生物大分子从电泳平板凝胶转移至印迹膜。

在一些实施方式中，所述方法还包括将所述两个电极固定在一起。在所述方法的一些实施方式中，不存在与电泳平板凝胶或印迹膜接触的外源的缓冲液、电解质或溶剂。

附图说明

图1是本发明的一些实施方式中的、被夹在两个导电聚合物电极之间的电泳平板凝胶和印迹膜的示意图。

图2所示为导电聚合物电极，其包括刚性盒体和粘附于所述盒体的唇缘的保护板。例示的电极耗材显示了包封在刚性盒体中的PEDOT:PSS糊料。自粘胶覆盖所述糊料，并且可从耗材移除，从而在电转之前在凝胶和电极之间形成连接。

图3所示为本发明的一些实施方式中的导电聚合物电极。各电极的基质包含PEDOT:PSS导电聚合物混合物，并且被包封在刚性盒体中。校准桩从下电极的盒体的唇缘突出，并且校准孔切入上电极的盒体的唇缘。各电极的端子设置于所述盒体的外表面上，并通过导线与所述基质电连接。

图4是本发明的一些实施方式中的两个导电聚合物电极以及容纳在所述电极之间的间隙中的电泳平板凝胶和印迹膜的分解图。

图5所示为完全组装好的形态的图4的导电聚合物电极。

发明详述

I.介绍

现已发现，可以使用导电聚合物电极来实施蛋白质及其它生物物质的有效的电印迹。各电极包含共轭有机聚合物，该共轭有机聚合物可通过施加外部电势而被氧化或还原。该共轭有机聚合物是诸如PEDOT:PSS之类的导电聚合物混合物中的一部分，该导电聚合物混合物不仅传导电流、而且起到在电泳中迁移的离子的源和汇的作用。这些离子可穿透电极，随着所述共轭有机聚合物的氧化态的改变而与所述导电聚合物混合物结合或从所述导电聚合物混合物解离。由于溶液离子进入或离开所述电极，且电荷(例如电子)在所述电极中自由移动，因此与金属电极相比，在所述电极表面更少发生电化学反应。所以，由水电解或电极溶解导致的电印迹的问题得以缓解。

在本发明的一些实施方式中，各导电聚合物电极包括纳米复合物基质，而所述导电聚合物混合物是该纳米复合物基质的一种组分。另一种组分可将聚合物分子物理桥连和/或赋予所述基质强度。所以，所述基质可具有固态、半固态或触变性的主体和/或平坦的表面。聚合物电极也可以采用刚性盒体来包封所述基质，并且采用与所述基质电连接的端子来供电。在此提供使用导电聚合物电极将生物大分子从电泳凝胶转移至膜的试剂盒、***及方法。

II.试剂盒

本文所述的试剂盒包括两个导电聚合物电极(也称为“聚合物电极”或简称为“电极”)，它们分别包括基质和端子。所述基质包含导电聚合物混合物，所述端子与所述基质电连接。所述基质可具有至少一个平坦的表面，以便与位于该基质附近的电泳凝胶或印迹膜接触或者以其它方式电接触。该平坦的表面可具有与本领域中常用的凝胶和膜相当或更大的维度。各电极的端子用于接收来自电源的电能。经由所述端子，所述电源可以用来从所述电极的基质供给或回收电流，或者在基质之间创造不同的电流和/或电势，以供电印迹。

各电极的基质中的导电聚合物混合物包含共轭有机聚合物。本发明的实施方式中可用的共轭有机聚合物的例子包括聚噻吩、聚苯胺、聚吡咯、聚亚苯基或聚(对亚苯基亚乙烯基)。在一些实施方式中，所述共轭有机聚合物是聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)、聚噻吩。这里所用的共轭有机聚合物可具有任意所需的链长、分支、取代基、杂原子或侧基部分。各导电聚合物电极的基质可包含一种共轭有机聚合物，或以所需的比例包含多种共轭有机聚合物。在两个电极的基质中可以使用相同的共轭有机聚合物，或者也可以使用不同的共轭有机聚合物(或它们的组合)。

在一些实施方式中，所述导电聚合物混合物也包含聚电解质，该聚电解质可增强导电聚合物混合物的稳定性、可溶性和/或导电性。有用的聚电解质包括磺化聚苯乙烯(例如聚(苯乙烯磺酸盐/酯)或聚(苯乙烯磺酸)，均记作PSS)之类的水溶性聚电解质。在水性PSS中聚合PEDOT的方法是本领域已知的，例如在Groenendaal等,Advanced Materials 12,pp.481-494,2000中有记载。所述聚电解质可起到电荷平衡掺杂剂的作用，提供负电荷来中和所述共轭有机聚合物中的正电荷。所以，所述导电聚合物混合物可以有机盐的形式存在，并且在一些实施方式中是水溶性的。在一些实施方式中，所述导电聚合物混合物包含聚(3,4-乙烯二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸盐/酯)(PEDOT:PSS)。

所述导电聚合物混合物可根据需要制备或购得。PEDOT:PSS的水性分散体能够从西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Corporation)(美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,Missouri,USA))获得，PEDOT:PSS的专卖制剂能够从爱克发·吉华集团(Agfa-GevaertN.V.)(比利时莫尔特塞尔(Mortsel,Belgium))以商品名Orgacon^TM获得。在一些实施方式中，PEDOT的聚合在包含过硫酸钠之类的氧化剂的氧化(即p-掺杂)条件下进行。可以在不同时间使用其它试剂，以提高所述导电聚合物混合物的电导率，这例如在

等,Synthetic Metals 139,pp.1-10,2003；Ouyang等,Polymer 45,pp.8443-8450,2004；以及Fan等,Macromolecules 41,pp.5971–5973,2008中有记载。这些试剂可添加至用于制备所述导电聚合物混合物的聚合反应中(例如作为第二掺杂剂)，添加至悬浮或分散有所述导电聚合物混合物的溶液中，或者用于在固态或干燥形态下处理所述导电聚合物混合物。电导率提高剂的例子包括乙二醇、聚乙二醇、二甲亚砜、山梨糖醇、甲基吡咯烷酮、异丙醇、二甲基甲酰胺、甘油、2-硝基乙醇及各种离子型或非离子型表面活性剂。在一些实施方式中，所述导电聚合物混合物具有至少0.1、1、10或100S/cm的电导率。

各导电聚合物电极的基质可以是液态或固态，并且可具有任意所需的稠度。例如，所述基质可以是油灰、糊料、凝胶或浆料。所述基质可以呈图1所示的平板形状或可用于电印迹的任何其它形状。在一些实施方式中，所述基质是纳米复合物，并且包含一种或多种纳米级材料以及所述导电聚合物混合物。一种这样的纳米级材料是合成剥离型粘土，能够从毕克化学公司(BYK-Chemie GmbH)(德国韦塞尔(Wesel,Germany))以商品名

获得。认为剥离型粘土可将所述导电聚合物混合物中的聚合物链桥连，并调节所述基质的流变性。其它有用的纳米级材料包括：金、银和镍纳米颗粒；各种二氧化硅和硅酸盐(例如热解法二氧化硅和硅胶)；有机聚合物(例如非离子型有机聚合物和嵌段共聚物)；碳纳米管；静电纺纱纤维；以及树枝状聚合物(例如聚(酰氨胺))。纳米复合物基质可采用无机材料、有机材料、或同时采用无机材料和有机材料来制备。纳米级材料通常可赋予所述基质所需的物理性质，诸如：更强的机械刚度或强度；更高或更低的粘度；触变性；或更高的电导率。在一些实施方式中，所述基质是触变性的。在一些实施方式中，纳米级材料将共轭有机聚合物和/或聚电解质分子与所述基质桥连或交联起来。

所述基质也可通过将所述导电聚合物混合物加入明胶、琼脂糖或丙烯酰胺之类的增稠剂中来制备。有用的增稠剂也包括多糖及其它有机聚合物。通过所述增稠剂的胶凝、交联、聚集、团聚或聚合，所述基质可以比单独的所述单独聚合物混合物(或例如其水性悬浮液)更粘稠或结实。在一些实施方式中，包含所述导电聚合物混合物、纳米级材料、增稠剂或其它组分的所述基质具有至少0.1、1、10或100S/cm的电导率。所述导电聚合物混合物可与纳米级材料或其它组分以任意所需的比例混合。在一些实施方式中，所述导电聚合物混合物占所述基质重量的至少百分之0.1、0.3、1、1.3、3、10或30。

所述基质也可包括多孔性基材，该多孔性基材中设置有所述导电聚合物混合物。所述多孔性基材可以是海绵、纸张(例如沃特曼纸(Whatman paper))、膜材料或陶瓷之类的能吸收液体的材料。所以，当所述导电聚合物混合物成液态或半液态(例如是水性分散体的一部分)时，可以将所述导电聚合物混合物浸入或注入所述多孔性基材中，为所述导电聚合物混合物提供机械支撑。在另一实施方式中，所述基质包括固体基材，该固体基材上例如以膜的形式涂覆或沉积有所述导电聚合物混合物。所述固体基材可以使用例如玻璃、陶瓷、塑料或金属等材料。如果合适，所述固体基材可具有与电泳凝胶或印迹膜同样的平坦表面。多孔性和/或固体基材通常可用于赋予导电聚合物电极的基质形状，并确保该电极具有可用于电印迹的几何结构。在一些实施方式中，在增加的多孔性或固体基材后，所述导电聚合物混合物***或变得更不易流动。根据需要，所述基材可以是导电性的或绝缘性的。

包含水或其它溶剂的基质的实施方式可以湿润形态或干燥形态提供给最终用户。如果为湿润形态，则溶剂在生产时就加入基质中。所以，最终用户可以在不进行改进的情况下方便地在试剂盒中使用导电聚合物电极。而如果基质以干燥形态提供，则用户可以在使用时加入部分或全部的溶剂。加入溶剂的方式例如可包括：将导电聚合物混合物和基质的其它组分用溶剂混合、将溶剂注入设置有导电聚合物混合物的多孔性基材中、或者将溶剂吸移至涂覆有导电聚合物混合物的固体基材上。以干燥形态提供基质可避免共轭有机聚合物与基质的其它组分之间的溶液相副反应，从而延长基质的保存期限。如果需要，可以将一份溶剂(例如水性缓冲液)和基质一起提供给最终用户。这份溶剂的体积可按照使得溶剂和导电聚合物混合物以特定的比例组合的条件来选择。所加入的溶剂的体积、pH或组成也可调整为能赋予基材所需的物理性质。例如，可以向一个电极的基质中加入小体积的溶剂，以使基质更粘稠。可加入含高浓度盐(例如NaCl或KCl)的溶剂，以使电印迹过程中的电流更大。

在一些实施方式中，本文所述的试剂盒还包括一个或多个刚性盒体。各盒体用于包封导电聚合物电极的基质，并为所述基质提供机械支撑。所以，所述盒体可对由任意多孔性或固体基材提供的支撑作出补充。所述盒体也可保护所述基质在不使用时(例如运输过程中及使用前)不发生机械变形、外来物质污染及其它危害。各盒体包括底板、与该底板连接的壁、以及从所述壁侧向延伸的唇缘。所述盒体的几何结构有许多可能性，在一些实施方式中，所述壁与所述底板垂直，或者所述唇缘与所述壁垂直或与所述底板平行。所述盒体的底板和壁限定一个中央空腔，该中央空腔内设置有所述导电聚合物电极的基质。所述盒体可包括陶瓷或塑料之类的电绝缘材料，或者由该电绝缘材料制成。

在一些实施方式中，所述盒体在一侧开口，以提供所述基质和电印迹中使用的电泳凝胶或印迹膜之间的界面。所述基质的露出部分可以是如上所述的平坦表面。在一些实施方式中，所述试剂盒中包括用于至少一个导电聚合物电极的保护板。该保护板粘附于所述盒体的唇缘，并覆盖所述中央空腔以及所述盒体内部的基质(图2)。该保护板设置成能从所述唇缘移除以暴露所述中央空腔，从而将所述基质(或其一部分或其表面)暴露在所述盒体外部的空间。所以，所述保护板可保护所述基质在不使用时(例如在所述导电聚合物电极的使用前的运输或储存时)不发生污染。可选的或附加的，在一些实施方式中，至少一个电极包括安装于所述基质或所述盒体的唇缘的多孔性膜。该多孔性膜覆盖所述基质的能与电泳凝胶或印迹膜电接触的一侧，并且可在电印迹过程中将所述基质与这些元件物理隔离。但是，所述多孔性膜仍然能让电流在两个导电聚合物电极之间流过电泳凝胶和印迹膜。如果需要，所述多孔性膜可以用水或缓冲溶液之类的导电性液体浸渍，或者由金属之类的导电性材料制成。在一些实施方式中，所述多孔性膜将所述盒体内部的基质密封，从而基质没有任何一部分直接暴露在所述盒体外部的空间。在一些实施方式中，至少一个导电聚合物电极同时包括多孔性膜和保护板，在此情况下，该多孔性膜层叠在保护板和基质之间。

所述盒体也可辅助所述基质与导电聚合物电极的端子之间的机械偶联(图3)。在一些实施方式中，所述端子设置于所述盒体的外表面上，并通过导电元件与所述基质电连接。所述导电元件可穿透所述盒体的壁或所述盒体的底板。所以，所述壁或底板可包括孔或通道来容纳所述导电元件，另外也保持所述基质与所述盒体外部的空间隔离。导电元件的例子包括铜、银、金和铂导线，它们在***所述盒体中前可任选地经电绝缘(诸如用聚合物包覆)。所述端子可具有适合于与电印迹用电源连接的形状。例子，所述端子可以是通过香蕉插头或鳄鱼夹与一根或多根导线连接的形状。

在一些实施方式中，导电聚合物电极的基质和端子在所述盒体中通过导电板彼此电连接。该导电板可由任意的方便的导电性材料制成，例如铜、银、金、铂、其它金属或金属合金。所述导电板设置于所述基质和所述盒体的底板之间，因而与电印迹中使用的所有电泳凝胶或印迹膜都物理隔离。在一些实施方式中，所述导电板位于所述基质上的多孔性膜或粘附于所述盒体的唇缘的保护板的相反侧。

所述导电板可通过摩擦或压力而保持与所述基质接触，或者可以用例如导电性粘合剂固定于所述基质。或者，所述导电板可与所述基质直接结合，或者用构成所述基质的导电聚合物混合物或纳米复合物涂覆。所述导电板与所述基质和所述端子电连接，并且可遍布所述基质的整个表面。在一些实施方式中，所述导电板具有与所述基质的面向盒体外部的平坦表面相当或相等的面积，并且与该表面平行。所以，所述导电板可使流过所述基质的整个质量的电流更均匀，进而使电印迹过程中的生物物质的转移更均匀。

在包括分别具有包封基质的盒体的两个导电聚合物电极的试剂盒中，所述盒体的唇缘可配置成在所述电极合并在一起时彼此啮合。例子，一个盒体的唇缘上的槽口可以对准另一个盒体的唇缘上的凹槽。或者，两个盒体的唇缘可具有在各自内部契合或相扣的突出部或凹陷部，在一些情况下，该突出部或凹陷部围绕盒体的整个外周。盒体的唇缘的啮合可避免电印迹过程中的一个电极相对于另一个电极的旋转或侧向移动和/或避免电极的分离。在一些实施方式中，一个盒体的唇缘与另一个盒体的唇缘在形状上互补，从而通过盒体的唇缘的啮合将电极固定在一起并同时保留基质之间的间隙。该间隙可以在电印迹过程中将电泳凝胶和印迹膜容纳在基质和任意多孔性膜之间。

本发明的一些实施方式的盒体的特征可参照图4和5来理解。图4是的中间夹着电泳凝胶401和印迹膜402的两个导电聚合物电极400的分解图。各导电聚合物电极包括刚性盒体403、404，该刚性盒体403、404具有底板403a、404a，与底板连接的壁403b、404b，以及从壁侧向延伸的唇缘403c、404c。导电板405、406设置于各盒体的底板上。各导电板具有从底板延伸出来、并且通往盒体外部的空间的延长部405a、406a。该延长部可与用于接收电能的端子电连接，或者作为用于接收电能的端子。在各导电聚合物电极中，包含导电聚合物混合物的基质407、408设置于由盒体的底板和壁限定的中央空腔内。该基质通过盒体的底板附近的基质的表面与导电板电连接。该表面和与电泳凝胶或印迹膜相接、并且面向盒体外部的平坦表面大致平行。各基质通过多孔性膜409、410与电泳凝胶和印迹膜隔离。当导电聚合物电极合并在一起时，盒体的唇缘彼此啮合，从而将电极固定在一起并同时保留基质之间的间隙。该间隙容纳电泳凝胶和印迹膜。

图5是本发明的实施方式的试剂盒的截面图，其中导电聚合物电极彼此分离。图5所示为完全组装好、并且与电泳凝胶401和印迹膜402对齐(但隔离)的图4的导电聚合物电极。各电极501、502包括刚性盒体、导电板、基质和多孔性膜。导电板的延长部501a、502a从盒体的相反侧延伸出来，并且可与电源(未显示)连接。电极可在电印迹的电泳凝胶401和印迹膜402周围合并在一起。

本文所述的盒体的一些实施方式中，采用具有互补形状的校准桩和校准孔作为唇缘的替代或补充。在这些实施方式中，有多个校准桩从至少一个电极的盒体的唇缘突出，并且有多个校准孔切入至少一个电极的盒体的唇缘(图3)。可以在一个盒体上具有桩、在另一个盒体上具有孔，也可以在同一个盒体上同时具有桩和孔。校准桩和校准孔配置成在电极合并在一起时彼此啮合，并且在形状上彼此互补。所以，通过校准桩与校准孔的啮合将电极固定在一起并同时保留基质之间的间隙。校准桩和校准孔可达到与具有互补形状的盒体唇缘相同的目的，例如避免电极的移动或分离。

如果需要，校准桩可以在***校准孔中时扩张，以便更有效地将电极固定在一起。替代的或附加的，桩和孔可以加载弹簧或具有蚀刻表面以增大摩擦。在一些实施方式中，在各校准桩的表面上设置有电绝缘材料，或者在各校准孔的内部排布有电绝缘材料。所以，盒体间的机械接触可以是电绝缘的，并且避免盒体间的导电。

在本发明的一些实施方式中，试剂盒包括夹子，该夹子用于将两个导电聚合物电极在电泳凝胶和印迹膜周围固定在一起。该夹子可以任意的方便的几何结构与所述电极连接，并且可在采用或不采用刚性盒体来包封所述电极的基质的实施方式中使用。当用所述夹子固定在一起时，所述电极的基质彼此面对且平行，电泳平板凝胶和印迹膜则被容纳在所述电极的间隙中，并且所述夹子对所述电极施力以保持各电极与电泳平板凝胶或印迹膜接触，并保持电泳平板凝胶与印迹膜相互接触。任何能有效地保持电极的基质之间的、流经凝胶和印迹膜的电通路的力均可采用。在采用盒体的实施方式中，所述电极可通过盒体唇缘的啮合或者以上所述的校准桩和校准孔的啮合而固定在一起，并且在这里，所述夹子可确保所述电极如此固定。在不采用盒体的实施方式中，所述夹子可与所述基质直接接触并用力将它们相互靠近。优选地，所述夹子并不为所述电极间的电流提供另外的通路，从而，电流不会偏离而不流过凝胶和印迹膜。所以，所述夹子可整个或部分由塑料之类的非导电性材料制成。但是，在一些实施方式中，所述夹子可与各电极的端子电连接，并且用来将电能从电源输送至所述端子。所以，所述夹子可同时达到以机械方式将所述电极固定在一起的目的以及将电流导向和导出所述电极的目的。

试剂盒的实施方式也可包括电源。任何在与本文所述的导电聚合物电极电连接时能有效地引发生物大分子的电印迹的电源均可采用。该电源用于经由所述端子向所述电极输送电能，其中，输送至一个电极的电流与输送至另一个电极的电流极性相反。合适的电源的例子是由伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules,California,USA))销售的PowerPac^TM产品线。

III.***

本申请也提供一种用于通过电印迹将生物大分子从电泳平板凝胶转移至印迹膜的***。***可包括一对导电聚合物电极和以上所述的电源，以及凝胶和印迹膜。

本文所述的***中可采用任何电泳凝胶。例如，所述凝胶可具有任意维度，具有任意数量的泳道，以及通过手工或机器制备(灌胶)。在一些实施方式中，所述凝胶包含聚丙烯酰胺或琼脂糖，其可以任何百分比或浓度存在，包括以多于一种浓度(例如，在凝胶的浓缩胶和分离胶部分)或浓度梯度存在。所述凝胶也可包含十二烷基硫酸钠或尿素之类的变性剂，以及三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、甘氨酸或N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)之类的缓冲剂。电泳凝胶、尤其是用于分离蛋白质或核酸的凝胶的其它常用成分对于技术人员是显而易见的。

在一些实施方式中，所述凝胶包含添加剂，与在不存在这些添加剂的情况下实施时相比，该添加剂让蛋白质在更高的施加电压下在凝胶中更快地迁移。所述添加剂也通过防止条带重叠来改善蛋白质的分离，所述条带重叠可由凝胶与支持该凝胶的容器之间的间隙或不希望的相互作用所致(参见，例如美国专利第7,056,426号)。此类添加剂的示例包括：聚(乙烯醇)、琼脂糖、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(丙二醇)、聚(丙二醇)/聚(乙二醇)共聚物，以及直链聚丙烯酰胺。包含一种或多种这些添加剂的电泳凝胶能够从Bio-Rad公司以‘TGX’名称获得。

在一些实施方式中，所述凝胶也包含三氯乙醇或三氯乙酸之类的卤代有机化合物作为成分。该化合物可在原位与所述凝胶中的蛋白质的色氨酸残基反应，生成可检测的荧光产物。该反应以及用于实施该反应并检测其产物的相关试剂、设备和方法有时被称为‘Stain-Free^TM’(Bio-Rad)。

在电印迹之前，可通过实施电泳或“跑”胶在所述凝胶中分离生物大分子。这可采用任意所需的技术来实施，并且可使用任何可获得的材料或设备。在标准操作中，将所述凝胶与电极缓冲液接触并置于具有相反极性的两个电极之间。由电极间产生的电场来驱动电泳。加载到所述凝胶中的蛋白质或其它大分子在凝胶中迁移，远离加载位置，并基于分子量、尺寸或电荷而彼此分离。电泳也可将大分子与污染物分离，所述污染物可能会作为生物样品的一部分加载到凝胶上。当施加电势差时，所述污染物可能无法进入凝胶，其可能从该凝胶扩散进入周围的缓冲液，或可能比感兴趣的大分子更慢或更快地通过该凝胶。出于方便且必要时，可将分子量标志物和生物样品一起加载进入所述凝胶，从而允许操作者在迁移过程中或迁移后跟踪大分子的位置。

在一些实施方式中，电泳和电印迹使用不同的***或设备来实施。例如，可以在将所述凝胶保留在一个设备中的情况下实施电泳，随后将所述凝胶从该设备中移出并***本发明的电印迹的导电聚合物电极之间。

本发明也可使用任何电印迹用印迹膜。标准印迹膜由硝酸纤维素、尼龙或聚偏氟乙烯(PVDF)制成。应认识到，一个特定***中最适合使用的印迹膜取决于欲转移的生物大分子的类型、电泳凝胶的组成、转移后实施的任何检测方案的细节或其它考虑因素。在一些实施方式中，所述印迹膜的尺寸至少和平板凝胶一样大，从而使得分布在凝胶中的任何生物大分子无论其位置在哪里均可迁移至所述印迹膜。

在该***中，电泳凝胶和印迹膜容纳在电极之间的间隙中。如上所述，该间隙可由包括在电极中的任意刚性盒体上的凸起产生。如上所述，所述电源用于经由所述端子向所述电极输送电能，其中，输送至一个电极的电流与输送至另一个电极的电流极性相反。通过将电泳凝胶和印迹膜夹在电极之间，经由端子输送的电流可在电极间流动，流经所述凝胶和膜并促进电印迹。所述***还用于，在不存在与电泳平板凝胶或膜接触的外源的缓冲液、电解质或溶剂的情况下，通过向电极输送电能而将生物大分子从电泳平板凝胶转移至膜。可以在完全干燥的结构、只存在源自凝胶的任何必要的液体和电解质的条件下进行有效的转移，其部分原因在于，与普通的金属电极相比，在所述导电聚合物电极表面更少发生电化学反应。

在一些实施方式中，所述***也包括夹子，该夹子如上所述用于将两个电极在电泳平板凝胶和印迹膜周围固定在一起。当电极如此固定时，电极的基质彼此面对且平行，并且所述夹子对电极施力以保持各电极与电泳平板凝胶或印迹膜接触，并保持电泳平板凝胶与印迹膜相互接触。所以，所述夹子确保电流可以在电极的基质之间流动并同时流经电泳平板凝胶和印迹膜。优选地，当电极用夹子如此固定时，各电极的基质与电泳平板凝胶或印迹膜的接触面积达到最大，进而所述凝胶或印迹膜的可供电流流通以及生物大分子转移的面积达到最大。这可通过将力均匀地施加在电极基质的整个面积上、或者将夹子与电极盒体联用来实现，所述电极盒体通过形状互补的唇缘或校准桩、校准孔而彼此啮合。如果需要，所述夹子可与各电极的端子电连接，并且用来将电能从电源输送至所述端子。

IV.方法

本发明的实施方式也包括一种用于通过电印迹将生物大分子从电泳平板凝胶转移至印迹膜的方法。可以用本申请的试剂盒、***和方法来转移的生物大分子(本文章也称为生物物质)包括但不限于：蛋白质、核酸、脂质、烃类以及它们的变体(例如经翻译后修饰的蛋白质、糖基化的蛋白质、天然蛋白质、变性蛋白质、抗体、抗体片段、蛋白质－小分子偶联物、蛋白质－核酸偶联物、DNA和RNA)。这种生物大分子可以是天然存在的、化学合成的或化学修饰的。

方法可采用以上所述的任何导电聚合物电极来实施。两个导电聚合物电极的基质可彼此面对配置，使得各电极与电泳平板凝胶或印迹膜接触，并且电泳平板凝胶与印迹膜相互接触。如上所述，电泳平板凝胶和印迹膜可容纳在电极之间的间隙中。通过与电源连接的电极端子，可经由端子向电极输送电能，其中，输送至一个电极的电流与输送至另一个电极的电流极性相反。于是，生物大分子通过电印迹从电泳平板凝胶转移至印迹膜。

在一些实施方式中，通过跟踪电极端子之间的电流或电势差来监测电印迹的进度。这可采用例如电源的数字显示器来实施。电流或电压可随着各电极中的导电聚合物化合物发生氧化或还原而上升、下降或波动。因此，可以对电极供电，直至电流或电压到达预定水平(例如下降至低于阈值或上升至高于阈值)为止。在一些实施方式中，以恒定的电压供电，直至电流下降至低于阈值为止。在一些实施方式中，以恒定的电流供电，直至电压超过阈值为止。

或者或附加的，可通过观察电极基质的颜色来监测电印迹的进度，该颜色可因电变色而随时间变化。例如，在PEDOT:PSS电极中，深蓝色或浅蓝色分别可表示还原或氧化的PEDOT。因此，在本方法中，可以供电直至一个电极呈现所需的颜色、或两个电极呈现可区分的颜色为止。这些颜色可根据需要进行定性或定量的测定。例如，一个电极基质的颜色可通过在所需的波长处测定被基质(或其一部分)吸收、传播或反射的光量来定量地测定。为了观察电极基质的颜色，可将各基质周围的任意外壳的一部分、例如刚性盒体设置成透明的。

在电印迹之前，两个电极的导电聚合物混合物可具有相同、相似或不同的氧化态。例如，一个电极(例如阴极)最初可以是被氧化的，而另一个电极(例如氧化)最初可以是被还原的。电极的初始氧化态可根据需要例如在电极基质的制备过程中设立。不受理论的限制，电印迹过程中的电流流动导致自由电子从阳极经由电源迁移至阴极，而带正电的电解质(例如钠离子)从阳极的基质经由电泳平板凝胶和阴极膜迁移至阴极的基质。阳极中的共轭有机聚合物可因被氧化而带更多正电，并且与聚电解质或其它抗衡离子更强地结合。在一些实施方式中，所述阳极在电印迹过程中与电泳平板凝胶接触并电相接。在另一实施方式中，所述阳极在电印迹过程中与印迹膜接触并相接。相对于阳极和阴极的电泳平板凝胶和印迹膜的合适的位置取决于电印迹过程中被转移的生物大分子所携带的电荷(如果有的话)。

可以在电印迹之前实施标准程序，以使生物大分子在电泳凝胶中分离或分布。类似地，可以在电印迹之后用标准程度来检测印迹膜上的生物大分子。

在一些实施方式中，可以对电极进行重整，以逆转电印迹过程中发生的电极的氧化态变化。重整可通过在电极之间放置空白电泳凝胶或其它导电性的含有电解质的介质、并使电流在电极间沿着与电印迹中所用的电流方向相反的方向流动来实施。或者，重整可在电极的循环使用过程中实施。例如，电极可设置成使得各电印迹程序中的电流方向与上一道程序中所用的电流方向相反。所以，在一道程序中被氧化的电极可在下一道程序中被还原，反之亦然。电极之间的电泳凝胶和印迹膜的方向可适当地切换，以确保在每一道程序中都能实现生物大分子从电泳凝胶到印迹膜的生产性电印迹。重整可增加一对导电聚合物电极可使用的电印迹程序的数量，并延长电极的使用寿命。

在一些实施方式中，对电极进行预调节，从而在电印迹之前优化电极的氧化态。例如，可将空白电泳凝胶置于电极之间，并且可使电流在电极间流动，从而将一个电极充分氧化并将一个电极充分还原。如上所述，电极的氧化态可采用电流或电压的变化、或采用电变色来监测。然后，可将空白电泳凝胶替换成含有生物大分子的电泳凝胶和印迹膜。为了实现电印迹，随后可使电流在电极间沿着与预调节中所用的电流方向相反的方向流动。预调节步骤可增加在电印迹过程中能够在两个导电聚合物电极间流动的电流量。

根据需要，可以在本方法的一次执行或多次执行中使用一对导电聚合物电极。单次使用的(即一次性的)电极可通过省去在电印迹之后清洁或重整电极的需要而提供方便。所以，在每道电印迹程序中都使用新的一对电极可在使用时节省时间和/或能量。若各对电极是一致性地制备的，则就初始氧化态和基质组成等因素而言，单次使用的电极也可提供比多次使用的电极更好的电印迹程序间的再现性。另一方面，多次使用的电极可节约成本。在一些实施方式中，导电聚合物电极设置成具有可替换的基质，使得，例如可在多次使用的盒体中安装单次使用的基质。

在本方法的一些实施方式中，也包括将两个电极固定在一起。如上所述，该电极例如可使用夹子或包封基质的刚性盒体的特征来固定。在一些实施方式中，不存在与电泳平板凝胶或印迹膜接触的外源的缓冲液、电解质或溶剂。

实施例

由皮氏培养皿构建两个导电聚合物电极，并用该导电聚合物电极来实施蛋白质的电印迹。

在各皮氏培养皿的底板上切入一个矩形贯通孔，并用一块作为多孔性膜的硝酸纤维素覆盖。将该矩形贯通孔用塑料挡板围住，该塑料挡板与皮氏培养皿的底板垂直并连结在一起，从而在硝酸纤维素上方限定一个空腔。向该空腔内填充PEDOT:PSS(1.3重量％)的水性分散体，并将导线末端浸没在该分散体中。随后向该分散体中加入3nm

颗粒，形成触变性纳米复合物。

将两块皮氏培养皿放在一起，以使皮氏培养皿的底板彼此面对，并使硝酸纤维素对齐。将一块已经通过电泳进行了分离的、含有经染色的蛋白质的电泳凝胶和印迹膜一起放置于皮氏培养皿之间。空腔内的导线与电源连接，电流在导电聚合物电极间流动，因而导致蛋白质从电泳凝胶转移至印迹膜。电印迹后，经染色的蛋白质在印迹膜上可见。

* * *

在所附的权利要求书中，术语“一个”或“一种”意图表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包括”及其变体如“包含”和“含有”位于一个步骤或元件之前的时候，意图表示其它步骤或元件的进一步加入是任选的并且非排他性的。

在此引用的所有文献(例如专利、专利申请、书籍、杂志或其它出版物)通过引用全文纳入本文并用于所有目的，就好像将各篇文献特定和单独地通过引用全文纳入本文并用于所有目的一样。对于通过引用纳入的这些文献与本说明书中包含的记载相矛盾的情况，本说明书意图取代和/或优先于任何矛盾之处。

可以在不偏离本发明的范围和精神的条件下对本发明进行多种修改和改变，这对本领域技术人员来说显而易见的。本文所述的具体实施方式仅以举例的方式提供，并不意味着以任何方式受到限定。本说明书和实施例应仅仅视为示例,本发明真正的范围和精神由所附权利要求书来限定。

Claims (30)

1.一种用于通过电印迹将生物大分子从电泳平板凝胶转移至印迹膜的***，所述***包括两个导电聚合物电极，其中各电极包括：

基质，该基质包含导电聚合物混合物，该导电聚合物混合物包含共轭有机聚合物；以及

端子，该端子与所述基质电连接，其中所述端子用于接收来自电源的电能；

其中，各电极还包括包封所述基质的刚性盒体，所述盒体包括底板、与该底板连接的壁、以及从所述壁侧向延伸的唇缘；

所述盒体的底板和壁限定一个中央空腔；并且

所述基质设置在该中央空腔内；

并且其中：

(a)各电极的端子设置于所述盒体的外表面上，并通过导电元件与所述基质电连接，该导电元件穿过所述盒体的壁或所述盒体的底板；或者

(b)有多个校准桩从至少一个电极的盒体的唇缘突出，有多个校准孔切入至少一个电极的盒体的唇缘，所述校准桩和校准孔配置成在所述电极合并在一起时彼此啮合，并且所述校准孔与所述校准桩在形状上互补，从而通过所述校准桩与所述校准孔的啮合将所述电极固定在一起并同时保留所述基质之间的间隙；

容纳在所述电极之间的间隙中的电泳平板凝胶和印迹膜；以及

用于经由所述端子向所述电极输送电能的电源，其中，输送至一个电极的电流与输送至另一个电极的电流极性相反；

其中，所述***用于使电泳平板凝胶或印迹膜分别与两个导电聚合物电极中的不同电极接触，在不存在与电泳平板凝胶或印迹膜接触的外源的缓冲液、电解质或溶剂的情况下，通过向电极输送电能而将生物大分子从电泳平板凝胶转移至印迹膜。

2.如权利要求1所述的***，其中，所述共轭有机聚合物是聚噻吩、聚苯胺、聚吡咯、聚亚苯基或聚(对亚苯基亚乙烯基)。

3.如权利要求2所述的***，其中，所述共轭有机聚合物是聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)。

4.如权利要求1所述的***，其中，所述导电聚合物混合物还包含聚电解质。

5.如权利要求4所述的***，其中，所述共轭有机聚合物带正电，所述聚电解质带负电。

6.如权利要求4所述的***，其中，所述聚电解质是水溶性的。

7.如权利要求4所述的***，其中，所述聚电解质是磺化聚苯乙烯。

8.如权利要求4所述的***，其中，所述导电聚合物混合物包含聚(3,4-乙烯二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸盐/酯) (PEDOT:PSS)。

9.如权利要求1所述的***，其中，所述导电聚合物混合物是水溶性的。

10.如权利要求1所述的***，其中，所述导电聚合物混合物具有至少0.1 S/cm的电导率。

11.如权利要求1所述的***，其中，所述基质是纳米复合物。

12.如权利要求11所述的***，其特征在于，所述基质还包含合成粘土。

13.如权利要求1所述的***，其中，所述基质是触变性的。

14.如权利要求1所述的***，其中，所述基质具有至少0.1 S/cm的电导率。

15.如权利要求1所述的***，其中，所述导电聚合物混合物占所述基质重量的至少百分之0.1。

16.如权利要求1所述的***，其中，所述基质还包括多孔性基材，该多孔性基材中设置有所述导电聚合物混合物。

17.如权利要求1所述的***，其中，至少一个电极还包括保护板，该保护板粘附于所述盒体的唇缘并覆盖所述中央空腔，并且设置成能从所述唇缘移除以暴露所述中央空腔。

18.如权利要求1所述的***，其中，至少一个电极还包括多孔性膜，该多孔性膜安装于所述基质或所述盒体的唇缘，该多孔性膜覆盖所述基质。

19.如权利要求1所述的***，其中，各电极的端子设置于所述盒体的外表面上，并通过导电元件与所述基质电连接，该导电元件穿过所述盒体的壁或所述盒体的底板。

20.如权利要求1所述的***，其中，至少一个电极还包括设置于所述基质和所述盒体底板之间的导电板，该导电板与所述基质及所述端子电连接。

21.如权利要求1所述的***，其中，所述盒体包含电绝缘材料。

22.如权利要求1所述的***，其中，所述盒体的唇缘配置成在所述电极合并在一起时彼此啮合，并且一个盒体的唇缘与另一个盒体的唇缘在形状上互补，从而通过所述盒体的唇缘的啮合将所述电极固定在一起并同时保留所述基质之间的间隙。

23.如权利要求1所述的***，其中：

有多个校准桩从至少一个电极的盒体的唇缘突出，

有多个校准孔切入至少一个电极的盒体的唇缘，

所述校准桩和校准孔配置成在所述电极合并在一起时彼此啮合，并且

所述校准孔与所述校准桩在形状上互补，从而通过所述校准桩与所述校准孔的啮合将所述电极固定在一起并同时保留所述基质之间的间隙。

24.如权利要求23所述的***，其中，在各校准桩的表面上设置电绝缘材料，或者在各校准孔的内部排布电绝缘材料。

25.如权利要求1所述的***，其中，所述***还包括夹子，该夹子用于将两个电极在电泳平板凝胶和印迹膜周围固定在一起，使得，当电极如此固定时：

电极的基质彼此面对且平行；

电泳平板凝胶和印迹膜容纳在两个电极的间隙中；并且

所述夹子对电极施力以保持各电极与电泳平板凝胶或印迹膜接触，并保持电泳平板凝胶与印迹膜相互接触。

26.如权利要求25所述的***，其中，所述夹子与各电极的端子电连接，并且用来将电能从电源输送至所述端子。

27.如权利要求1所述的***，其中，所述***还包括电源，该电源用于经由所述端子向所述电极输送电能，其中，输送至一个电极的电流与输送至另一个电极的电流极性相反。

28.一种用于通过电印迹将生物大分子从电泳平板凝胶转移至印迹膜的方法，其中：

所述电泳平板凝胶和所述印迹膜容纳在权利要求1所述的***的两个导电聚合物电极之间的间隙中，使得，各电极与电泳平板凝胶或印迹膜接触，并且电泳平板凝胶与印迹膜相互接触；并且

所述电极的端子与电源连接；

所述方法包括：

经由所述端子向所述电极输送电能，其中，输送至一个电极的电流与输送至另一个电极的电流极性相反，

从而通过电印迹将生物大分子从电泳平板凝胶转移至印迹膜。

29.如权利要求28所述的方法，其中，所述方法还包括将所述两个导电聚合物电极固定在一起。

30.如权利要求28所述的方法，其中，不存在与电泳平板凝胶或印迹膜接触的外源的缓冲液、电解质或溶剂。

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