CN107192818B - 一种微粒子色度聚类分析方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微粒子色度聚类分析方法及试剂盒。该方法包括：S1、构建生物靶标检测试剂，所述生物靶标检测试剂能够同时与待测标本中的M种不同生物靶标分别发生特异性结合反应；S2、进行生物检测反应，形成彩色微粒子‑生物探针Ⅰ‑待测生物靶标‑分离试剂结合物；S3、分离生物检测反应产物，将与检测试剂未发生结合反应的彩色微粒子‑生物探针Ⅰ聚合物分离出来；S4、检测结果判定，根据彩色微粒子色度与生物靶标种类建立的一一对应关系，统计检测标本中含有的待测生物靶标的种类与含量。同时，本发明对应提供相应的试剂盒。本发明实现了单一样品多重检测和多标本快速多重检测。

Description

一种微粒子色度聚类分析方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种微粒子色度聚类分析方法及试剂盒。

背景技术

生物大分子，包括蛋白质、核酸等，体现或记载着生命与疾病的信息，是生物学研究和疾病诊断中极为重要的分析对象，检测它们的存在与含量，是科学研究和疾病诊断的基础工作；除了生物大分子检测，在疾病诊断和生物学研究中的某些场合，也需要对病毒、细胞进行检测，这些生物分子、病毒颗粒和细胞，在检测实验中称为待测生物靶标(detection biotargets，DBTs)。

如果DBTs是生物大分子，又称为待测靶生物分子(target molecules，TMs)。对单个待测生物分子(TM)的检测，一般有两种技术方案：

其一是夹心法，用一个已知的、能与TM发生特异性结合的生物分子(探针Ⅰ)来结合TM，再加入另一个已知的、标记有可检测信号的、能与TM或探针Ⅰ-TM复合物发生特异性结合的生物分子(探针Ⅱ)，形成探针Ⅰ-TM-探针Ⅱ-可检测信号复合物，分离和测定这种复合物中可检测信号的强弱，根据实验确定的可检测信号强度与TM标准品含量之间的校正曲线，查得TM在待测标本中的含量。实施这一方法，需要TM具有两个以上互不影响的探针识别位点，或者TM只有一个探针识别位点但存在另一种能识别TM-探针Ⅰ复合物的探针；

其二是竞争法，一般用于TM只有一个探针识别位点的情况，将探针Ⅰ标记上可检测信号，分别与TM的标准品反应、与待测标本反应之后再与TM的标准品反应，通过两个反应中形成TM标准品-探针Ⅰ-可检测信号复合物的可检测信号强度差异，来推算待测标本中TM的含量。

如果DBTs是病毒颗粒或者细胞，可以通过对其一个或者多个标志分子的检测来判断待测病毒颗粒是何种病毒、待测细胞是何种细胞。此时，每个标志分子只需要有一个标记有可检测信号的探针Ⅰ。

在上述技术方案中，用于标记生物探针的可检测信号，已知的有酶、量子点、化学发光材料、胶体金、胶体硒、放射性同位素、荧光素等种类，由于不同种类的检测信号的探测方式不同，在一次检测反应中一般不能混合使用，而同一类检测信号往往只有一个或几个可鉴别的信号丰度，使得一次检测反应只可以检测一个或几个待测生物靶标(DBTs)。

疾病的发生、发展与转归，往往受多因素的影响与调节，因此在生物学研究和疾病诊断中一般都需要同时检测多个DBTs。为了提高检测效率、节约样品和节省检测成本、为研究与诊断提供更多的分析指标，人们发明了能在一次检测反应中同步检测多种DBTs的多重检测技术，主要有：

1.微阵列(microarray)技术，又称生物芯片(biochip)技术。该技术从膜杂交技术发展而来，其基本技术思想是将针对不同TM的检测反应放在同一检测反应体系的不同平面位置同时进行。其基本技术实现是将能与不同TM特异性结合的探针Ⅰ，有序地固定在固相基片或基膜的不同位置，即生物芯片；将待测样品与生物芯片进行反应，样品中存在的TMs就被生物芯片中相应阵列位点上的探针Ⅰ捕获，捕获了TM的生物芯片位点由于TM的桥接作用，能特异性结合荧光标记的探针Ⅱ；通过检测生物芯片不同阵列微点是否有荧光信号，就可以确定样品中是否有相应的靶标分子。因为高密度生物芯片点样仪能够在基片上点出大于400点每平方厘米的点阵，使得这一技术可以同步检测数以万计的靶标分子，为基因组学、蛋白质组学等研究提供了高通量的研究方法和工具。但是，该技术中样品与生物芯片的反应属于固液相反应，空间位阻大、结合反应较慢，往往需要数小时，难以满足时限要求较高的医学检测。

2.xMAP技术，又称液态芯片技术。该技术从流式细胞术发展而来，其基本思想是将微阵列技术的点阵液态化，从而减少空间位阻、加速检测反应；其基本技术实现是，在具有不同荧光特性的塑料微球上包被不同的探针Ⅰ，用与微球荧光特性不同的荧光素标记能与不同靶标分子特异性结合的探针Ⅱ，将上述不同的塑料微球-探针Ⅰ、探针Ⅱ-荧光素分子混合在一起组成液相的检测试剂，与样品发生结合反应之后，样品中的靶分子将与试剂中相应探针结合，形成塑料微球-探针Ⅰ-TM-探针Ⅱ-荧光素复合物，这种复合物在通过具备双激发(一束激光用于激发微球的荧光、另一束用于激发探针Ⅱ上的荧光分子)的流式分析仪检测单元时，仪器根据微球的荧光特性和向前散射光特性来区别不同的微球，根据不同微球上是否同时有探针Ⅱ的荧光特性，来确定该微球表面是否有结合反应，从而反推样品中有哪些检测靶分子。xMAP技术可同时检测的靶分子数量虽然远远不及微阵列技术，但它不仅显著提升了结合反应的效率，且可以实现半定量检测，更靠近医学检测的要求。但是，这一技术虽然可同时分析多个检测分子，但由于其基于流式检测技术，仪器检测单元对体系中数以千计到数以百万计的微球一个接一个地分析，虽然可以在数分钟内完成单一标本的分析，但很难在短时间内完成数以百计的标本的检测，难以满足临床大量标本的检测需求。

3.πcode技术，该技术使用微细加工技术，在直径数十微米到数百微米的椭圆形碟片上刻上不同的图案，以区别不同的碟片，然后在不同的碟片上包被探针Ⅰ、在磁性材料(如超顺磁磁珠)上包被探针Ⅱ，将不同的碟片-探针Ⅰ、磁性材料-探针Ⅱ组成检测试剂，与样品进行结合反应之后，样品中的靶分子将与试剂中相应探针结合，形成碟片-探针Ⅰ-靶分子-探针Ⅱ-磁性材料的复合物，利用磁性将上述复合物与未发生结合反应的碟片进行分离，然后通过显微成像和图像识别技术，确定参与反应的或未参与反应的碟片的种类和数目，从而推算样品中含有的靶分子种类和含量。这一技术可以在一块微孔板的不同微孔中对不同标本实施检测，不仅可以在一个检测体系中同时检测多个靶分子，还可在较短时间内完成多个标本的检测，解决了xMAP技术很难在短时间内检测百计标本的问题。但是，这一技术的碟片采用微细加工技术，成本难以降低，且碟片在检测体系中容易形成堆叠、形成较大干扰。

可见，人们一直在探索多重检测技术，多重检测技术也一直在进步，可目前仍然没有一种可靠的、性价比高的、可同时实现单一样品多重检测和多标本快速多重检测的技术。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明提供一种微粒子色度聚类分析方法，旨在实现单一样品多重检测和多标本快速多重检测；并对应提供其试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种微粒子色度聚类分析方法，包括以下步骤：

S1：构建生物靶标检测试剂

将不同色度的彩色微粒子分别用不同的生物探针Ⅰ包被，形成彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物，不同的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物用于与不同的待测生物靶标发生特异性结合反应；将M种彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物混合均匀，形成生物靶标检测试剂，所述生物靶标检测试剂能够同时与待测标本中的M种不同生物靶标分别发生特异性结合反应；其中，M为≥1的自然数。

S2：进行生物检测反应

将所述生物靶标检测试剂、待测标本、N种分离试剂加入反应杯Ⅰ，形成反应混悬液，进行生物检测反应，形成彩色微粒子-生物探针Ⅰ-待测生物靶标-分离试剂结合物；N为≥1的自然数。

S3：分离生物检测反应产物

将S2步骤中生成的所有反应产物，与检测试剂未发生结合反应的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物分离。

S4：检测结果判定

将步骤S3中分离的参与生物反应的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物，按照其中的彩色微粒子色度进行聚类计数，根据彩色微粒子色度与生物靶标种类建立的一一对应关系，统计检测标本中含有的待测生物靶标的种类与含量。

或者，将步骤S3中分离反应产物后剩下的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物按照其中的彩色微粒子色度进行聚类计数，并与试剂中所有彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物的种类与数量进行差运算，得到步骤S3中参与反应的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物的聚类计数，再按照彩色微粒子色度与待测生物靶标种类建立的一一对应关系，统计待测标本中含有的待测生物靶标的种类与含量。

进一步，所述的彩色微粒子的直径不大于100μm。

进一步，步骤S3的具体分离方法是：用磁针吸附所有分离试剂以及彩色微粒子-生物探针Ⅰ-待测生物靶标-分离试剂结合物，并置于反应杯Ⅱ中，再加入生物探针-待测生物靶标解聚剂，再使用磁针吸附并丢弃所有磁性组分，留下彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物于反应杯Ⅱ中，再进行步骤S4；

或者，使用外部磁场将所有分离试剂以及彩色微粒子-生物探针Ⅰ-待测生物靶标-分离试剂结合物吸附于反应杯Ⅰ中，将未与分离试剂结合的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物用移液器转移至反应杯Ⅲ中，再进行步骤S4。

其中，所述的生物探针-待测生物靶标解聚剂的作用是使分离试剂脱离彩色微粒子-生物探针Ⅰ-待测生物靶标-分离试剂，以便于后续的检测。常用的生物探针-待测生物靶标解聚剂包括但不限于以下类型：

酸性解离剂：pH值为1.5～3，如甘氨酸溶液等。

碱性解离剂：pH值为10～12.5，如三乙胺溶液等。

高盐解离剂：如浓度为3～5mol/L的MgCl₂溶液，浓度为5-10mol/L的LiCl溶液等。

离子去污剂：如浓度为0.5～2wt％的SDS溶液等。

裂解剂：如浓度为2～8mol/L的尿素，浓度为2～5mol/L盐酸胍，浓度为5～20wt％的硫氰盐酸等。

有机溶剂：如浓度为25～50％乙烯乙二醇，如浓度为5～20％的二氧六环等。

进一步，步骤S4采用的彩色微粒子聚类计数方法是：使用过滤技术将步骤S3得到的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物沉积在滤网上，使其呈单层分散排列；再进行大视场显微彩色拍照，所得照片通过图像处理，提取所有微粒子的色度，并按照色度进行聚类计数；参与反应的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物的种类数反映待测标本中出现待测生物靶标的种类数、彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物中彩色微粒子的色度对应待测生物靶标的品种及每个色度的微粒子个数对应待测生物靶标的含量。

进一步，所述的生物靶标是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸片段、细胞、病毒颗粒和免疫复合物的至少一种。

所述的分离试剂为具有能特异性结合待测生物靶标的生物探针Ⅱ包被的磁性材料、具有能特异性识别前述所有生物靶标-生物探针Ⅰ-彩色微粒子复合物的生物探针Ⅲ包被的磁性材料和M种待测生物靶标包被的磁性材料中的至少一种。

所述的生物探针Ⅰ、生物探针Ⅱ和生物探针Ⅲ为抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸片段、肽核酸中的至少一种。

生物探针Ⅱ是一种能够与待测靶标发生特异性反应的物质，例如：在双抗体夹心法中，待测靶标是抗原，生物探针Ⅰ是靶标的一种抗体，生物探针Ⅱ是靶标的另一种抗体。而在双抗原夹心法，待测靶标是抗体，生物探针Ⅰ是检测靶标的抗原，生物探针Ⅱ也是靶标的抗原，和生物探针Ⅰ是相同的。

生物探针Ⅲ是一种可以与所有生物探针Ⅰ-待测靶标聚合物发生反应的物质，例如：补体c1q，可以与免疫复合物结合；又如：生物探针Ⅰ是抗原，靶标是待检测抗体，由于都是人源抗体，故抗体的Fc段都是一样的，所以可以用动物抗人抗体来作为生物探针Ⅲ。

对应地，反应生成的彩色微粒子-生物探针Ⅰ-待测生物靶标-分离试剂结合物为彩色微粒子-生物探针Ⅰ-待测生物靶标-生物探针Ⅱ-磁性材料、彩色微粒子-生物探针Ⅰ-待测生物靶标-生物探针Ⅲ-磁性材料和/或彩色微粒子-生物探针Ⅰ-待测生物靶标-磁性材料结合物。

一种微粒子色度聚类分析用试剂盒，包括上述S1构建的生物靶标检测试剂。

进一步，还可以包括上述的分离试剂。

进一步，还包括生物探针-待测生物靶标解聚剂。

在本试剂盒中，生物靶标检测试剂、分离试剂和/或生物探针-待测生物靶标解聚剂是相互独立包装的。

所述的彩色微粒子的直径不大于100μm。彩色微粒子是指染有可以区分的颜色的微球，颜色可以是色彩、荧光不同，也可以是同一颜色的深度不同。微球可以是天然高分子微球，如淀粉微球、白蛋白微球、明胶微球、壳聚糖微球等；也可以是合成聚合物微球，如聚苯乙烯微球、聚丙烯酸微球、二氧化硅微球等。

彩色微粒子的染色可以外加染料，也可以在制备的过程中染色。如申请号为0213936.5的中国专利、申请号为20041003508.3的中国专利等。

与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、可在一个检测反应中同时检出多达数万种生物靶标。本发明的检测技术针对形成靶生物分子复合物进行分析，由于色度多达36000种，几乎能满足现有生物医学检测的所有要求。

2、可快速完成多达数百个标本的上述检测。本发明的检测技术，在一个384孔微板上可同时进行384个标本的多指标检测反应，结果分析使用微粒子色度自动聚类分析***，能自动完成检测反应的分析。在实现单标本检测指标高通量分析的同时，能完成多标本的高通量检验。

3、既能进行定性分析、又能进行定量检测。由于每个靶生物分子分别与一个色度球形微粒子和一个检测探针分子结合，形成靶生物分子复合物，参与反应的微粒子数目与待测生物靶标的含量呈正相关，可根据参与反应微球的计数算出相应检测靶标的浓度。

4、检测敏感性好。理论上，只要待测标本中有一个待测靶标，就会有一个相应的彩色微粒子被分离，故其分析灵敏度的理论值为单分子水平。

5、成本低。由于本发明使用的彩色微粒子，只要其色度存在区别即可，荧光素不是必须，故染料的成本较之传统的技术有所降低。同时，不使用单分子通道、激光发射器和微加工技术，不仅可以节约大量成本，且更易实现量产。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。在以下实施例中，彩色微粒子的直径为8μm，而显微成像用的光学显微***物方视场为直径6.36mm，光学分辨率3μm，***有效放大倍率为4.44倍。

实施例一

微粒子色度聚类分析法人血型常见意外抗体鉴定

人血型意外抗体是指输血、妊娠之后，机体针对本身不具有的血型抗原或抗原亚型产生的免疫性抗体，不仅导致再次输血时配血困难，如果是育龄妇女产生了意外抗体，怀孕时还可能导致胎儿发生新生儿溶血病。因此，意外抗体筛查和意外抗体鉴定是输血和孕检的重要检验内容。目前，意外抗体筛查和意外抗体鉴定是作为两个检测项目，首先用抗体筛查试剂细胞和待测标本进行反应，有凝集表明有意外抗体、无凝集表明无意外抗体；对于有意外抗体的情况，需要使用一组抗体鉴定试剂细胞分别与待测标本反应，根据不同试剂细胞的凝集反应和试剂细胞上的血型抗原组成，像解方程一样来推断意外抗体是针对那种血型抗原的抗体。由于试剂细胞组由含有不同稀有血型抗原的人红细胞组成，资源稀缺、价格昂贵，且检测操作繁琐、结果分析复杂、检测效率极为低下，亟需一种简便高效的方法来提高检测效率与检测质量。本实施例利用微粒子色度聚类分析法的多分析物检测能力和标本高通量检测能力，实现人血型常见意外抗体鉴定高效率检测。由于人类红细胞血型抗原多达数百种，为便于表述，本实施例仅以发生率最高的抗A2、抗B2、抗D、抗E、抗e、抗C、抗c等7种意外抗体的鉴定为例，具体实现步骤如下：

S1：配制微粒子色度聚类分析法人血型意外抗体鉴定试剂

将7种彩色微球(色度的色调分量分别为10°、20°、30°、40°、50°、60°、70°)，色调为10°的包被A2抗原、色调为20°的包被B2抗原、色调为30°的包被D抗原、色调为40°的包被E抗原、色调为50°的包被e抗原、色调为60°的包被C抗原、色调为70°的包被c抗原，并用聚乙二醇封闭，得到微球(10)-A2、微球(20)-B2、微球(30)-D、微球(40)-E、微球(50)-e、微球(60)-C、微球(70)-c，按照1:1:1:1:1:1:1的比例混悬于pH7.4的PBS缓冲液中，每种微球的浓度约100个/微升，制成微粒子色度聚类分析法人血型意外抗体鉴定主试剂(试剂Ⅰ)，置于4℃备用；

将100纳米的磁珠用鼠抗人IgG包被、聚乙二醇封闭，悬浮液于pH7.4的PBS缓冲液中，磁珠-抗人IgG颗粒的浓度约为10000个/微升，制得微粒子色度聚类分析法人血型意外抗体鉴定分离试剂(试剂Ⅱ)，置于4℃备用；

按常规配制pH为2.5的甘氨酸缓冲液，作为解离试剂(试剂Ⅲ)

微球包被抗原参照陈启龙、刘佳蕙、王曦嘉等报道的方法(北京化工大学学报-自然科学版，第41卷第3期)进行，磁珠包被抗人IgG参照郭慧芳、张文红、温冬青等报道的方法(免疫学杂志，第22卷第5期)进行。

S2：检测反应

取常规384孔塑料微板(每孔容积120微升)，在不同微孔中加入不同的检测标本血浆30微升，再加入S1步骤制得的试剂Ⅰ30微升、试剂Ⅱ40微升，于37℃静置10分钟进行结合反应。

S3：分离反应产物

用电磁针将各孔中所有能被磁场吸附的物质全部转移到另一个384孔微板的相应孔中，反应孔和转入孔一一对应，转入孔各孔底部均有滤孔直径7微米的滤膜；在转入孔中分别加入试剂Ⅲ100微升，置于37℃振摇条件下进行解离反应，反应时间5分钟；之后用电磁针吸去各孔中能被磁场吸附的物质。对各转入孔进行加压滤过，使孔中的彩色微球嵌于滤网上，呈单层排列。

S4：检测与结果判定

使用彩色微粒子聚类分析***对每个转入孔的滤膜进行微球聚焦拍照、分析照片中每个微球的色度，并按照色度进行分类计数。如果微球(10)的计数大于零，表明该标本中有抗A2抗体，且微球(10)的个数与抗A2抗体的浓度正相关；如果微球(20)的计数大于零，表明该标本中有抗B2抗体，且微球(20)的个数与抗B2抗体的浓度正相关；如果微球(30)的计数大于零，表明该标本中有抗D抗体，且微球(30)的个数与抗D抗体的浓度正相关；如果微球(40)的计数大于零，表明该标本中有抗E抗体，且微球(40)的个数与抗E抗体的浓度正相关；如果微球(50)的计数大于零，表明该标本中有抗e抗体，且微球(50)的个数与抗e抗体的浓度正相关；如果微球(60)的计数大于零，表明该标本中有抗C抗体，且微球(60)的个数与抗C抗体的浓度正相关；如果微球(70)的计数大于零，表明该标本中有抗c抗体，且微球(70)的个数与抗c抗体的浓度正相关。检测靶标与微球计数的量效关系由校正曲线确定。

彩色微粒子聚类分析***能对上述微板的转入孔进行自动化逐孔进行分析，迅速得到1个到384个待测标本的人意外血型抗体鉴定结果。

应当理解，本实施例仅用于描述微粒子色度聚类分析法用于人血型意外抗体鉴定的实施过程，所能检测的人血型抗体不限于上述7种。

实施例二

微粒子色度聚类分析法肿瘤标志物检测

肿瘤是常见病、多发病，严重危及患者的生命安全。实验室诊断是早期发现肿瘤、为患者赢得治疗时机的重要方法。由于肿瘤的多样性，往往需要同时对数十个肿瘤标志物进行联合检测，以期广谱发现肿瘤。本实施例利用微粒子色度聚类分析法的多分析物检测能力和标本高通量检测能力，实现肿瘤标志物的高效率检测。由于现已发现的肿瘤标志物多达数十种，为便于表述，本实施例仅以最常见的甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、鳞状上皮癌相关抗原(SCC-Ag)、***特异性抗原(PSA)、细胞角质素片段抗原21-1(CYFRA21-1)、糖类抗原242(CA242)等7种肿瘤标志物的检测为例进行说明，具体实现步骤如下：

S1：配制微粒子色度聚类分析法肿瘤标志物检测试剂

将粒径8μm的7种彩色微球(色度的色调分量分别为10°、20°、30°、40°、50°、60°、70°)，色调为10°的包被鼠抗人AFP抗体、色调为20°的包被鼠抗人CEA抗体、色调为30°的包被鼠抗人NSE抗体、色调为40°的包被鼠抗人SCC-Ag抗体、色调为50°的包被鼠抗人PSA抗体、色调为60°的包被鼠抗人CYFRA-1抗体、色调为70°的包被鼠抗人CA242抗体，并用聚乙二醇封闭，得到微球(10)-抗AFP、微球(20)-抗CEA、微球(30)-抗NSE、微球(40)-抗SCC-Ag、微球(50)-抗PSA、微球(60)-抗CYFRA21-1、微球(70)-CA242，按照1:1:1:1:1:1:1的比例混悬于pH7.4的PBS缓冲液中，每种微球的浓度约100个/微升，制成微粒子色度聚类分析法人血型意外抗体鉴定主试剂(试剂Ⅰ)，置于4℃备用；

将100纳米的磁珠用兔抗鼠IgG包被、聚乙二醇封闭，悬浮液于pH7.4的PBS缓冲液中，磁珠-抗鼠IgG颗粒的浓度约为10000个/微升，制得微粒子色度聚类分析法肿瘤标志物检测分离试剂(试剂Ⅱ)，置于4℃备用；

按常规配制pH为2.0的甘氨酸缓冲液，作为解离试剂(试剂Ⅲ)

微球包被抗原参照陈启龙、刘佳蕙、王曦嘉等报道的方法(北京化工大学学报-自然科学版，第41卷第3期)进行，磁珠包被抗鼠IgG参照郭慧芳、张文红、温冬青等报道的方法(免疫学杂志，第22卷第5期)进行。

S2：检测反应

取常规384孔塑料微板(每孔容积120微升)，在不同微孔中加入不同的检测标本血浆30微升，再加入S1步骤制得的试剂Ⅰ30微升、试剂Ⅱ40微升，于37℃静置10分钟进行结合反应。

S3：分离反应产物

用电磁针将各孔中所有能被磁场吸附的物质全部转移到另一个384孔微板的相应孔中，反应孔和转入孔一一对应，转入孔各孔底部均有滤孔直径7微米的滤膜；在转入孔中分别加入试剂Ⅲ100微升，置于37℃振摇条件下进行解离反应，反应时间5分钟；之后用电磁针吸去各孔中能被磁场吸附的物质。对各转入孔进行加压滤过，使孔中的彩色微球嵌于滤网上，呈单层排列。

S4：检测与结果判定

使用彩色微粒子聚类分析***对每个转入孔的滤膜进行微球聚焦拍照、分析照片中每个微球的色度，并按照色度进行分类计数。如果微球(10)的计数大于零，表明该标本中有AFP，且微球(10)的个数与AFP的浓度正相关；如果微球(20)的计数大于零，表明该标本中有CEA，且微球(20)的个数与CEA的浓度正相关；如果微球(30)的计数大于零，表明该标本中有NSE，且微球(30)的个数与NSE的浓度正相关；如果微球(40)的计数大于零，表明该标本中有SCC-Ag，且微球(40)的个数与SCC-Ag的浓度正相关；如果微球(50)的计数大于零，表明该标本中有PSA，且微球(50)的个数与PSA的浓度正相关；如果微球(60)的计数大于零，表明该标本中有CYFRA21-1，且微球(60)的个数与CYFRA21-1的浓度正相关；如果微球(70)的计数大于零，表明该标本中有CA242，且微球(70)的个数与CA242的浓度正相关。检测靶标与微球计数的量效关系由校正曲线确定。

彩色微粒子聚类分析***能对上述微板的转入孔进行自动化逐孔进行分析，迅速得到1个到384个待测标本的多肿瘤标志物检测结果。

应当理解，本实施例仅用于描述微粒子色度聚类分析法用于肿瘤标志物的实施过程，所能检测的肿瘤标志物不限于上述7种。

实施例三

微粒子色度聚类分析法献血者感染筛查

为避免输血传播疾病，对献血者标本进行经血传播病原体筛查是采供血行业的国际通行做法，我国法规规定的强制筛查项目包括HIV-1抗体、HIV-p24、HBsAg、HCV抗体和TP抗体等6种检测指标，血站往往需要同时对数十个乃至数百个献血者重复进行上述筛查。本实施例利用微粒子色度聚类分析法的多分析物检测能力和标本高通量检测能力，实现献血者感染筛查。为便于表述，本实施例中以HIV-GP41抗体作为HIV-1抗体的代表、HCV-NS3抗体作为HCV抗体的代表、TP-47抗体作为梅毒抗体的代表，与HBsAg和HIV-p24同时检测为例，具体实现步骤如下：

S1：配制微粒子色度聚类分析法献血者感染筛查

将粒径8μm的5种彩色微球(色度的色调分量分别为10°、20°、30°、40°、50°)，色调为10°的包被HIV-GP41抗原、色调为20°的包被HCV-NS3抗原、色调为30°的包被TP-47抗原、色调为40°的包被人抗HIV-p24抗体、色调为50°的包被人抗HBsAg抗体，并用聚乙二醇封闭，得到微球(10)-HIV-GP41、微球(20)-HCV-NS3、微球(30)-TP-47、微球(40)-抗HIV-p24、微球(50)-抗HBsAg，按照1:1:1:1:1的比例混悬于pH7.4的PBS缓冲液中，每种微球的浓度约100个/微升，制成微粒子色度聚类分析法人血型意外抗体鉴定主试剂(试剂Ⅰ)，置于4℃备用；

将100纳米的磁珠用补体C1q亚单位包被、聚乙二醇封闭，悬浮液于pH7.4的PBS缓冲液中，磁珠-C1q颗粒的浓度约为10000个/微升，制得微粒子色度聚类分析法人血型意外抗体鉴定分离试剂(试剂Ⅱ)，置于4℃备用；

按常规配制pH为2.0的甘氨酸缓冲液，作为解离试剂(试剂Ⅲ)

微球包被抗原参照陈启龙、刘佳蕙、王曦嘉等报道的方法(北京化工大学学报-自然科学版，第41卷第3期)进行，磁珠包被补体C1q参照郭慧芳、张文红、温冬青等报道的方法(免疫学杂志，第22卷第5期)进行。

S2：检测反应

取常规384孔塑料微板(每孔容积120微升)，在不同微孔中加入不同的检测标本血浆30微升，再加入S1步骤制得的试剂Ⅰ30微升、试剂Ⅱ40微升，于37℃静置10分钟进行结合反应。

S3：分离反应产物

用电磁针将各孔中所有能被磁场吸附的物质全部转移到另一个384孔微板的相应孔中，反应孔和转入孔一一对应，转入孔各孔底部均有滤孔直径7微米的滤膜；在转入孔中分别加入试剂Ⅲ100微升，置于37℃振摇条件下进行解离反应，反应时间5分钟；之后用电磁针吸去各孔中能被磁场吸附的物质。对各转入孔进行加压滤过，使孔中的彩色微球嵌于滤网上，呈单层排列。

S4：检测与结果判定

使用彩色微粒子聚类分析***对每个转入孔的滤膜进行微球聚焦拍照、分析照片中每个微球的色度，并按照色度进行分类计数。如果微球(10)的计数大于零，表明该标本中有抗HIV-GP41抗体，且微球(10)的个数与抗HIV-GP41抗体的浓度正相关；如果微球(20)的计数大于零，表明该标本中有抗HCV-NS3抗体，且微球(20)的个数与抗HCV-NS3抗体的浓度正相关；如果微球(30)的计数大于零，表明该标本中有抗TP-47抗体，且微球(30)的个数与抗TP-47抗体的浓度正相关；如果微球(40)的计数大于零，表明该标本中有HIV-p24，且微球(40)的个数与HIV-p24的浓度正相关；如果微球(50)的计数大于零，表明该标本中有HBsAg，且微球(50)的个数与HBsAg的浓度正相关。检测靶标与微球计数的量效关系由校正曲线确定。

彩色微粒子聚类分析***能对上述微板的转入孔进行自动化逐孔进行分析，迅速得到1个到384个待测标本的感染筛查结果。

应当理解，本实施例仅用于描述微粒子色度聚类分析法用于献血者感染筛查的实施过程，所能检测的感染标志物不限于上述5种。

实施例四

微粒子色度聚类分析法人红细胞血型检测

人红细胞血型是人红细胞表面的同种异体抗原，输入血型不合的血液，可能导致溶血和意外抗体产生，危急患者的生命和生育安全，因此，对献血者和受血者都必须进行人红细胞血型检测。现已发现的红细胞血型多达数百种，本实施例利用微粒子色度聚类分析法的多分析物检测能力和标本高通量检测能力，来实现人红细胞上多种血型的检测，为便于表述，本实施例中以同时检测A抗原、B抗原、D抗原、E抗原、e抗原、C抗原、c抗原为例，具体实现步骤如下：

S1：配制微粒子色度聚类分析法人红细胞血型检测试剂

将粒径8μm的7种彩色微球(色度的色调分量分别为10°、20°、30°、40°、50°、60°、70°)，色调为10°的包被抗-A抗体、色调为20°的包被抗-B抗体、色调为30°的包被抗-D抗体、色调为40°的包被抗-E抗体、色调为50°的包被抗-e抗体、色调为60°的包被抗-C抗体、色调为70°的包被抗-e抗体，并用聚乙二醇封闭，得到微球(10)-抗A、微球(20)-抗B、微球(30)-抗D、微球(40)-抗E、微球(50)-抗e、微球(60)-抗C、微球(70)-抗c，按照1:1:1:1:1:1:1的比例混悬于pH7.4的PBS缓冲液中，每种微球的浓度约100个/微升，制成微粒子色度聚类分析法人血型意外抗体鉴定主试剂(试剂Ⅰ)，置于4℃备用；

将100纳米的磁珠用植物血凝素包被、聚乙二醇封闭，悬浮液于pH7.4的PBS缓冲液中，磁珠-血凝素颗粒的浓度约为10000个/微升，制得微粒子色度聚类分析法人血型意外抗体鉴定分离试剂(试剂Ⅱ)，置于4℃备用；

用去离子水，作为解离试剂(试剂Ⅲ)

微球包被抗原参照陈启龙、刘佳蕙、王曦嘉等报道的方法(北京化工大学学报-自然科学版，第41卷第3期)进行，磁珠包被血凝素参照郭慧芳、张文红、温冬青等报道的方法(免疫学杂志，第22卷第5期)进行。

S2：检测反应

取常规384孔塑料微板(每孔容积120微升)，在不同微孔中加入不同的检测标本2％红细胞生理盐水悬液30微升，再加入S1步骤制得的试剂Ⅰ30微升、试剂Ⅱ40微升，于37℃静置10分钟进行结合反应。

S3：分离反应产物

用电磁针将各孔中所有能被磁场吸附的物质全部转移到另一个384孔微板的相应孔中，反应孔和转入孔一一对应，转入孔各孔底部均有滤孔直径7微米的滤膜；在转入孔中分别加入试剂Ⅲ100微升，置于37℃振摇条件下进行解离反应，反应时间5分钟；之后用电磁针吸去各孔中能被磁场吸附的物质。对各转入孔进行加压滤过，使孔中的彩色微球嵌于滤网上，呈单层排列。

S4：检测与结果判定

使用彩色微粒子聚类分析***对每个转入孔的滤膜进行微球聚焦拍照、分析照片中每个微球的色度，并按照色度进行分类计数。如果微球(10)的计数大于零，表明该标本红细胞上有A抗原；如果微球(20)的计数大于零，表明该标本红细胞上有B抗原；如果微球(30)的计数大于零，表明该标本红细胞上有D抗原；如果微球(40)的计数大于零，表明该标本红细胞上有E抗原；如果微球(50)的计数大于零，表明该标本红细胞上有e抗原；如果微球(60)的计数大于零，表明该标本红细胞上有C抗原；如果微球(70)的计数大于零，表明该标本红细胞上有c抗原。

彩色微粒子聚类分析***能对上述微板的转入孔进行自动化逐孔进行分析，迅速得到1个到384个待测标本的人红细胞血型检测结果。

应当理解，本实施例仅用于描述微粒子色度聚类分析法用于人红细胞血型的实施过程，所能检测的人红细胞血型不限于上述7种。

本发明的上述实施例仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.一种微粒子色度聚类分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：构建生物靶标检测试剂

将不同色度的彩色微粒子分别用不同的生物探针Ⅰ包被，形成彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物，不同的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物用于与不同的待测生物靶标发生特异性结合反应；将M种彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物混合均匀，形成生物靶标检测试剂，所述生物靶标检测试剂能够同时与待测标本中的M种不同生物靶标分别发生特异性结合反应；其中，M为≥1的自然数；所述的彩色微粒子的直径为微米 级且≤100μm；

S2：进行生物检测反应

将所述生物靶标检测试剂、待测标本、N种分离试剂加入反应杯Ⅰ，形成反应混悬液，进行生物检测反应，形成彩色微粒子-生物探针Ⅰ-待测生物靶标-分离试剂结合物；N为≥1的自然数；

S3：分离生物检测反应产物

将S2步骤中生成的所有反应产物，与检测试剂中未发生结合反应的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物分离；

S4：检测结果判定

将步骤S3中分离的参与生物反应的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物，按照其中的彩色微粒子色度进行聚类计数，根据彩色微粒子色度与生物靶标种类建立的一一对应关系，统计检测标本中含有的待测生物靶标的种类与含量；

和/或，将步骤S3中分离反应产物后剩下的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物按照其中的彩色微粒子色度进行聚类计数，并与试剂中所有彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物的种类与数量进行差运算，得到步骤S3中参与反应的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物的聚类计数，再按照彩色微粒子色度与待测生物靶标种类建立的一一对应关系，统计待测标本中含有的待测生物靶标的种类与含量；

所述聚类计数为使彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物呈单层分散排列，再进行大视场显微彩色拍照，所得照片通过图像处理，提取所有微粒子的色度，并按照色度进行聚类计数。

2.根据权利要求1所述的微粒子色度聚类分析方法，其特征在于：步骤S3的具体分离方法是：用磁针吸附所有分离试剂以及彩色微粒子-生物探针Ⅰ-待测生物靶标-分离试剂结合物，并置于反应杯Ⅱ中，再加入生物探针-待测生物靶标解聚剂，再使用磁针吸附并丢弃所有磁性组分，留下彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物于反应杯Ⅱ中，再进行步骤S4；

或者，使用外部磁场将所有分离试剂以及彩色微粒子-生物探针Ⅰ-待测生物靶标-分离试剂结合物吸附于反应杯Ⅰ中，将未与分离试剂结合的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物用移液器转移至反应杯Ⅲ中，再进行步骤S4。

3.根据权利要求1所述的微粒子色度聚类分析方法，其特征在于：步骤S4采用的彩色微粒子聚类计数方法是：使用过滤技术将步骤S3得到的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物沉积在滤网上，使其呈单层分散排列；再进行大视场显微彩色拍照，所得照片通过图像处理，提取所有微粒子的色度，并按照色度进行聚类计数；参与反应的彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物的种类数反映待测标本中出现待测生物靶标的种类数、彩色微粒子-生物探针Ⅰ聚合物中彩色微粒子的色度对应待测生物靶标的品种及每个色度的微粒子个数对应待测生物靶标的含量。

4.根据权利要求1所述的微粒子色度聚类分析方法，其特征在于，所述的生物靶标是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸片段、细胞、病毒颗粒和免疫复合物的至少一种。

5.根据权利要求1所述的微粒子色度聚类分析方法，其特征在于，所述的分离试剂为具有能特异性结合待测生物靶标的生物探针Ⅱ包被的磁性材料、具有能特异性识别前述所有生物靶标-生物探针Ⅰ-彩色微粒子复合物的生物探针Ⅲ包被的磁性材料和M种待测生物靶标包被的磁性材料中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的微粒子色度聚类分析方法，其特征在于，所述的生物探针Ⅰ、生物探针Ⅱ和生物探针Ⅲ为抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸片段、肽核酸中的至少一种。

7.一种微粒子试剂盒在如权利要求1所述的微粒子色度聚类分析方法中的应用，其特征在于，所述的微粒子试剂盒包括如权利要求1的S1中构建的生物靶标检测试剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的微粒子试剂盒中还包括如权利要求5所述的分离试剂。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的微粒子试剂盒还包括生物探针-待测生物靶标解聚剂。