CN107177645B - 利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解及降温回收纤维素酶的方法 - Google Patents

利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解及降温回收纤维素酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解及降温回收纤维素酶的方法。该方法将木质纤维素加入缓冲溶液中，再加入两性表面活性剂和纤维素酶，加热反应，得到木质纤维素的糖化水解液，通过固液分离后得到酶解液体，再降低酶解液体温度使两性表面活性剂和纤维素酶同时沉淀出来进行循环利用。本发明方法首次提出了利用两性表面活性剂具有临界溶解温度的特性通过简单的降温回收纤维素酶的方法。本发明方法不仅可以有效地提高木质纤维素的酶解效率，回收一定的纤维素酶，而且操作简单，不需要额外的设备，绿色环保，回收的纤维素酶保留了很高的活性。

Description

利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解及降温回收纤维素 酶的方法
技术领域
本发明涉及木质纤维素酶解技术领域，特别涉及利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解和回收纤维素酶的方法。
背景技术
木质纤维素生物炼制燃料乙醇是替代汽油有效可行的技术之一。在这一炼制过程中，纤维素酶能否高效酶解木质纤维素底物是关键的技术瓶颈。同时,纤维素酶因其具有活力低、耗量大和价格高等特点,直接阻碍了纤维素乙醇的工业化。实现纤维素酶的高效回收利用是降低生物乙醇成本的重要途径。目前,纤维素酶回收利用技术除了超滤膜回收和新鲜底物重吸附法回收。纤维素酶的固定化也是增加酶的稳定性减少纤维素酶费用的有效办法。
研究者们将纤维素酶固定在二氧化矽晶片，二氧化硅，玻璃微珠，海藻酸钙凝胶珠和磁性纳米颗粒上。由于负载的纤维素酶不溶于水，其对可溶性的羧甲基纤维素有较好的水解能力，但是对于真实的木质纤维素底物酶解效率较低。为了让纤维素酶水解效率高且方便回收，具有环境响应(如温度、pH)的智能高分子成了人们研究的对象，由于调节pH过程需要消耗酸和碱，采用具有温度响应的聚合物来回收纤维素酶更加绿色环保，一些非离子聚合物如聚异丙基丙烯酰胺具有灵敏的温度响应性质，将纤维素酶与这些非离子聚合物采用共价键结合在一起，可以使改性后的纤维素酶具有高温析出和低温溶解的性质。
通过具有酰胺基的甲基丙烯酰胺与N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)或N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMa)的共聚合成了两类具有最低临界溶解温度(LCST)的共聚物。实验合成了LCST在20.9-60.5℃范围内的一系列聚合物。将由嗜热菌Pyrococcushorikoshii产生的内切葡聚糖酶通过5-磷酸吡哆醛转氨以产生含酮蛋白质，然后将转氨后的纤维素酶与含有酰胺键的聚合物共聚合成生物缀合物。在两次再循环后内切葡聚糖酶保持了60％以上的活性，并且与单独的未修饰的酶相比可以产生更多的可溶性糖(Journal of the AmericanChemical Society,2013,135:293-300.)。
通过N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMA)与丙烯酸甲酯和N-(羟甲基)丙烯酰胺的聚合而成的热响应聚合物(PNMN)用于与纤维素酶以形成生物缀合物。通过小分子猝灭，调节聚合物(PNMN)的LCST为51.6℃，此时回收率为98.5％，通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺将纤维素酶共价结合到PNMN合成生物缀合物(PNMN-C)，聚合物-纤维素酶生物缀合物在重复5次水解反应循环后依然保持了其初始活性的85.2％(Journal of MolecularCatalysis B:Enzymatic,2016,128:39-45.)。
但是温敏性高分子负载纤维素酶仍然面临着一些问题：1、在较高的温度下回收纤维素酶，纤维素酶容易失活；2、将纤维素酶接枝在聚合物上时纤维素酶容易失活，3、纤维素酶是个多组分的酶系，其接枝反应和回收率不尽相同，回收影响酶系的活性。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种能耗少，绿色环保，只需要自然或通过制冷设备降低酶解液体的温度就可以回收纤维素酶的利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解并通过降温来回收纤维素酶的方法。
本发明两性表面活性剂需要具备适当的临界溶解温度(UCST)，使其在酶解温度下40～60℃完全溶解在缓冲液中，酶解结束后，可以通过降温的方法从酶解液体中沉淀出来。
本发明的目的通过下述方案实现：
利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解及降温回收纤维素酶的方法，包括以下步骤：将木质纤维素加入缓冲溶液中，再加入两性表面活性剂和纤维素酶，加热至40～60℃温度下反应24～96h，得到木质纤维素的糖化水解液，通过固液分离后得到酶解液体，再降低酶解液体温度使两性表面活性剂和纤维素酶同时沉淀出来，进行循环利用；所述两性表面活性剂的UCST为0～40℃。
为进一步实现本发明目的，优选地，所述两性表面活性剂为氨基酸型两性表面活性剂、甜菜碱型两性表面活性剂、磺基甜菜碱型两性表面活性剂和磷酸酯甜菜碱两性表面活性剂中的至少一种。
优选地，所述两性表面活性剂为C8H18(CH3)2N+(CH2)OSO3 ﹣、C12H26(CH2)2N+CH2PO4 ﹣、C18H38(CH3)2N+O﹣、C14H30(CH3)2N+(CH2)3SO3 ﹣、C16H34(CH3)2N+(CH2)3SO3 ﹣和C8H17P(CH3)2O中至少一种。
优选地，通过固液分离得到酶解液体的方法为自然沉降法、倾析法、过滤法、离心法或这些方法的联合使用。
优选地，降低酶解液体的温度的方法为自然冷却法或通过制冷设备冷却。
优选地，所述缓冲溶液为pH＝4.5～6.2，离子强度为5～200mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液。
优选地，所述木质纤维素为松木、桉木、杨木、水曲柳、沙棘、伯树、杉木、桦木、玉米芯、玉米秸秆、麦秆、甘蔗渣、稻草、稻壳、食用菌基质和花生壳中的至少一种。
优选地，所述缓冲液的量为木质纤维素质量的5～50倍。
优选地，所述两性表面活性剂与木质纤维素的质量比为10～50：100。
优选地，所述纤维素酶的用量以木质纤维素中的葡聚糖含量计为3～30FPU/g。
本发明的机理为：由于一般的两性表面活性剂都具有临界溶解温度(UCST)，当温度高于UCST时，两性表面活性剂溶解于缓冲液中，减少纤维素酶在木质素上的无效吸附，促进木质纤维素的酶解；当温度低于UCST时，两性表面活性剂析出，由于两性表面活性剂与纤维素酶有一定的疏水作用，所以在两性表面活性剂析出时会将溶液中的纤维素酶一起沉淀下来。本发明两性表面活性剂需要具备适当的临界溶解温度(UCST)，使其在酶解温度下(40～60℃)完全溶解在缓冲液中，酶解结束后，可以方便的通过降温的方法从酶解液体中沉淀出来。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明以两性表面活性剂作为酶解助剂，对纯纤维素的酶解没有抑制作用，可使木质纤维素的酶解糖化得率提高13.7～72.1％。
(2)本发明中回收纤维素酶的操作简单，只需要自然或通过制冷设备降低酶解液体的温度就可以回收纤维素酶。
(3)本发明与目前普遍研究的将纤维素酶固定在非离子聚合物上通过升高温度来回收纤维素酶相比可以避免纤维素酶的高温失活和固定化反应的失活。
(4)本发明在操作的过程中不需要用到额外的设备，能耗小，绿色环保。
附图说明
图1为SB3-16在pH4.8(50mM)醋酸钠缓冲液中的溶解度随温度的变化。
图2是两性表面活性剂促进木质纤维素酶解和通过降温来回收纤维素酶的工艺流程图，实施例1-6都是按工艺流程图来进行操作，但是操作中没有补加两性表面活性剂和纤维素酶。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中所用试剂均可从市场购买得到。实施例中的微晶纤维素型号为PH101(购自西格玛奥德里奇)，纤维素酶是目前被广泛使用的Cellic CTec2，底物包含有稀酸预处理的桉木(桉木-DA)和酸性亚硫酸法处理过的松木(松木-SPORL)；用到的两性表面活性剂有SB3-16、C8APSO4、C12PPS和C18DAO。水解液中葡萄糖浓度是通过生物传感分析仪(SBA-40E，山东省生物科学研究院)测定的。
实施例1
如图2所示，取100质量份微晶纤维素，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入50质量份SB3-16，再加入10FPU/g以微晶纤维素质量计的纤维素酶，在50℃温度下反应48h，反应结束后，离心分离获得酶解液体，降低酶解液体的温度至0℃，待溶液中出现大量沉淀时进行离心分离，再将得到的固体加入到与初始酶解条件(底物和缓冲液)相同的样品中再次酶解48h(不补充纤维素酶和两性表面活性剂)，通过生物传感分析仪测定两次酶解的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例2
如图2所示，取100质量份桉木-DA，加入到5000质量份pH为5.0，离子强度为25mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，加入50质量份SB3-16，再加入5FPU/g以底物中葡聚糖计的纤维素酶，在50℃温度下反应48h，反应结束后，离心分离获得酶解液体，降低酶解液体的温度至0℃，待溶液中出现大量沉淀时进行离心分离,再将得到的固体加入到与初始酶解条件(底物和缓冲液)相同的样品中再次酶解48h(不补充纤维素酶和两性表面活性剂)，通过生物传感分析仪测定两次酶解的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例3
如图2所示，取250质量份松木-SPORL，加入到5000质量份pH为5.5，离子强度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中，加入100质量份C12PPS，再加入10FPU/g以底物中葡聚糖计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h，反应结束后，离心分离获得酶解液体，降低酶解液体的温度至0℃，待溶液中出现大量沉淀时进行离心分离,再将得到的固体加入到与初始酶解条件(底物和缓冲液)相同的样品中再次酶解72h(不补充纤维素酶和两性表面活性剂)，通过生物传感分析仪测定两次酶解的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例4
如图2所示，取100质量份微晶纤维素，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入50质量份C8APSO4，再加入10FPU/g以微晶纤维素质量计的纤维素酶，在45℃温度下反应48h，反应结束后，离心分离获得酶解液体，降低酶解液体的温度至0℃，待溶液中出现大量沉淀时进行离心分离,再将得到的固体加入到与初始酶解条件(底物和缓冲液)相同的样品中再次酶解48h(不补充纤维素酶和两性表面活性剂)，通过生物传感分析仪测定两次酶解的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例5
如图2所示，取100质量份桉木-DA，加入到5000质量份pH为6.0，离子强度为25mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，加入50质量份C8APSO4，再加入20FPU/g以底物中葡聚糖计的纤维素酶，在52℃温度下反应48h，反应结束后，离心分离获得酶解液体，降低酶解液体的温度至5℃，待溶液中出现大量沉淀时进行离心分离,再将得到的固体加入到与初始酶解条件(底物和缓冲液)相同的样品中再次酶解48h(不补充纤维素酶和两性表面活性剂)，通过生物传感分析仪测定两次酶解的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例6
如图2所示，取250质量份松木-SPORL，加入到5000质量份pH为5.5，离子强度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中，加入100质量份C18DAO，再加入10FPU/g以底物中葡聚糖计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h，反应结束后，离心分离获得酶解液体，降低酶解液体的温度至0℃，待溶液中出现大量沉淀时进行离心分离,再将得到的固体加入到与初始酶解条件(底物和缓冲液)相同的样品中再次酶解72h(不补充纤维素酶和两性表面活性剂)，通过生物传感分析仪测定两次酶解的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
以上实施例做了对应的空白对比例，空白样是指其它酶解条件一样，不加入两性表面活性剂且酶解相同时间的样品。纤维素酶蛋白回收率(r)是通过对比回收前后纤维素酶在278nm的紫外吸收峰计算得到：
Figure BDA0001303498660000062
h0是回收前纤维素酶溶液在278nm的紫外吸光度，h1是回收后剩下纤维素酶溶液在278nm的紫外吸光度。
根据表1中可以看出，两性表面活性剂可以有效地促进木质纤维素的酶解，并且可以回收一定的纤维素酶，同时两性表面活性剂也可以在过程中得到循环利用。
图1为SB3-16在pH4.8(50mM)醋酸钠缓冲液中的溶解度随温度的变化，说明了通过降低温度回收纤维素酶的可行性。
图2是两性表面活性剂促进木质纤维素酶解和通过降温来回收纤维素酶的工艺流程图，过程中没有涉及到复杂的工艺，不需要额外的设备，能耗低，绿色环保。
表1两性表面活性剂促进木质纤维素酶解和回收纤维素酶的情况
Figure BDA0001303498660000061
Figure BDA0001303498660000071
本发明的实施方式不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解及降温回收纤维素酶的方法，其特征在于包括以下步骤：将木质纤维素加入缓冲溶液中，再加入两性表面活性剂和纤维素酶，加热至40～60℃温度下反应24～96h，得到木质纤维素的糖化水解液，通过固液分离后得到酶解液体，再降低酶解液体温度使两性表面活性剂和纤维素酶同时沉淀出来，进行循环利用；所述两性表面活性剂的UCST为0～40℃；
所述两性表面活性剂为磺基甜菜碱型两性表面活性剂和磷酸酯甜菜碱两性表面活性剂和C18DAO中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两性表面活性剂为SB3-16、C8APSO4和C12PPS中至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过固液分离得到酶解液体的方法为自然沉降法、倾析法、过滤法、离心法或这些方法的联合使用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，降低酶解液体的温度的方法为自然冷却法或通过制冷设备冷却。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为pH=4.5～6.2，离子强度为5～200 mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素为松木、桉木、杨木、水曲柳、沙棘、柏树、杉木、桦木、玉米芯、玉米秸秆、麦秆、甘蔗渣、稻草、稻壳、食用菌基质和花生壳中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的量为木质纤维素质量的5～50倍。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两性表面活性剂与木质纤维素的质量比为10～50：100。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素酶的用量以木质纤维素中的葡聚糖含量计为3～30FPU/g。
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