CN107177628A - 一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法，包括以下步骤：白花兜兰液体培养基的配制—白花兜兰固体培养基的配制—农杆菌液体浸染液的配制—白花兜兰浸染—白花兜兰暗培养—白花兜兰光照培养—结果检测。本发明利用白花兜兰最敏感的农杆菌LBA4404作浸染基质，成功实现了白花兜兰基因转变技术，第一次公开了白花兜兰基因转变的方法，并且本发明公开的白花兜兰转基因技术操作简便，结果具有可重复性，为白花兜兰的基因工程育种、遗传学、分子生物学研究提供了方便、快速、高效的理论基础和实验导入方法，为进一步通过转基因技术改造白花兜兰奠定了技术基础，值得推广。
Description
技术领域
本发明涉及转基因技术领域，具体涉及一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法。
背景技术
白花兜兰具有很高的观赏价值，已经成为国际花卉市场上十分流行的高档花卉。白花兜兰新品种的选育成为新一轮花卉育种的热点，目前白花兜兰的新品种培育方法主要是杂交育种，但是杂交育种存在远缘杂交不亲和的缺点，难以打破物种之间的生殖隔离，以及在有性生殖过程中，由于重组时染色体的变换量小，难以打破某些基因连锁出现等缺点；并且通过杂交育种方法培育新品种的周期很长，某些优良性状难以保持，给改良某一单一性性状带来了极大的不便。近年来越来越多的花卉工作者利用转基因技术改变花卉的花色、花期、花型、香气等性状。但是白花兜兰的转基因技术体系到目前为止还没有成功的报道。
发明内容
为了克服上述白花兜兰转基因技术中存在的不足，本发明公开了一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法。
本发明是通过以下技术方案得以实现的。
一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法，包括以下步骤：
a、白花兜兰液体培养基的配制：向1L玻璃容器中加入去离子水900ml，松树皮粉末90g，磷肥5g，钾肥3g，氮肥2g，摇动容器直至磷肥、钾肥、氮肥完全溶解，松树皮粉末均匀悬浮在水中，再加入离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min，制得白花兜兰液体培养基；
b、白花兜兰固体培养基的配制：向1L玻璃容器中加入去离子水900ml，松树皮粉末90g，磷肥5g，钾肥3g，氮肥2g，摇动容器直至磷肥、钾肥、氮肥完全溶解，松树皮粉末均匀悬浮在水中，加入离子水定容至1L，再加入150g琼脂粉，搅拌均匀，于15psi高压下蒸汽灭菌20min后，置于冷水浴中，待培养基温度降到室温时加入500mg头孢氨苄毒素，充分摇匀，将培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外光照下光照15分钟后用封口胶封边，倒置，于4℃下保存；
c、农杆菌液体浸染液的配制；将带有基因转变质粒的农杆菌LBA4404培养至OD＝0.6～1.0，于5000r/min的离心机中离心5min，弃上清液，用100mg/L乙酰丁香酮的LB液体培养基悬浮沉淀，室温下静置3h，于5000r/min的离心机中离心5min，弃上清，用白花兜兰液体培养基悬浮沉淀，制得农杆菌液体浸染液；
d、白花兜兰浸染：选择生长良好、无病变的白花兜兰幼苗，灭菌，剪去茎尖和根部，置于农杆菌液体浸染液中浸泡10～20min，每隔2min摇匀一次；
e、白花兜兰暗培养：将上述浸泡后的白花兜兰幼苗挑出浸染液，用灭菌后的滤纸擦干表层液体，置于白花兜兰固体培养基中暗培养3天；
f、白花兜兰光照培养：将上述暗培养3天后的白花兜兰幼苗用500mg/L的头孢氨苄毒素清洗3遍，再用灭菌水冲洗5遍，最后用灭菌后的滤纸擦干后放到含有500mg/L的头孢氨苄毒素的白花兜兰固体培养基中进行光照培养；
g、结果检测：将浸染并培养两周后的白花兜兰用X-Gluc染色液在37℃恒温箱中浸泡3h，取出后用酒精脱色处理，能够产生肉眼可见的深蓝色化合物。
优选的，所述农杆菌LBA4404本身带有链霉素抗性和利福平抗性，培养温度为28℃，摇菌转速为180～220r/min，是一种弱毒的农杆菌，采用YEP培养基进行培养。
优选的，所述乙酰丁香酮的LB液体培养基的配制方法为：在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，然后加入去离子水定容至1L，最后在15psi高压下蒸汽灭菌20min。
优选的，所述白花兜兰暗培养方法为在黑暗、室温条件下，将白花兜兰置于白花兜兰固体培养基中培养3天。
优选的，所述头孢氨苄毒素为头孢氨苄缓释片的液体溶液。
优选的，所述白花兜兰的光照培养方法为在光照强度5000Lux、温度24～26℃、湿度55～65％、二氧化碳浓度350～450ppm、光照时间12h/d的培养条件下温室培养，每30天继代一次。
优选的，所述X-Gluc染色液为β-葡糖醛酸酶基因检测的显色底物。
本发明的有益效果为：本发明通过将浸染并培养两周后的白花兜兰用X-Gluc染色液在37℃恒温箱中浸泡3h，取出后用酒精脱色处理，如果能够产生肉眼可见的深蓝色化合物，则说明外源基因已经在白花兜兰上得以表达，从而可以说明白花兜兰已实现了基因转变。本发明公开的一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法造作简单、基因转变效果显著、成本低廉，为进一步通过转基因技术改造白花兜兰奠定了技术基础与理论依据，将此发明用于白花兜兰遗传学上，可有效地改变白花兜兰的花色、花期、花型、香气等性状，前景十分广阔。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进一步作详细的说明。
实施例1
一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法，包括以下步骤：
a、白花兜兰液体培养基的配制：向1L玻璃容器中加入去离子水900ml，松树皮粉末90g，磷肥5g，钾肥3g，氮肥2g，摇动容器直至磷肥、钾肥、氮肥完全溶解，松树皮粉末均匀悬浮在水中，再加入离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min，制得白花兜兰液体培养基；
b、白花兜兰固体培养基的配制：向1L玻璃容器中加入去离子水900ml，松树皮粉末90g，磷肥5g，钾肥3g，氮肥2g，摇动容器直至磷肥、钾肥、氮肥完全溶解，松树皮粉末均匀悬浮在水中，加入离子水定容至1L，再加入150g琼脂粉，搅拌均匀，于15psi高压下蒸汽灭菌20min后，置于冷水浴中，待培养基温度降到室温时加入500mg头孢氨苄毒素，充分摇匀，将培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外光照下光照15分钟后用封口胶封边，倒置，于4℃下保存；
c、农杆菌液体浸染液的配制；将带有基因转变质粒的农杆菌LBA4404培养至OD＝1.0，于5000r/min的离心机中离心5min，弃上清液，用100mg/L乙酰丁香酮的LB液体培养基悬浮沉淀，室温下静置3h，于5000r/min的离心机中离心5min，弃上清，用白花兜兰液体培养基悬浮沉淀，制得农杆菌液体浸染液；
d、白花兜兰浸染：选择生长良好、无病变的白花兜兰幼苗，灭菌，剪去茎尖和根部，置于农杆菌液体浸染液中浸泡20min，每隔2min摇匀一次；
e、白花兜兰暗培养：将上述浸泡后的白花兜兰幼苗挑出浸染液，用灭菌后的滤纸擦干表层液体，在室温、黑暗条件下置于白花兜兰固体培养基中暗培养3天；
f、白花兜兰光照培养：将上述暗培养3天后的白花兜兰幼苗用500mg/L的头孢氨苄毒素清洗3遍，再用灭菌水冲洗5遍，最后用灭菌后的滤纸擦干后放到含有500mg/L的头孢氨苄毒素的白花兜兰固体培养基中进行光照培养，光照强度为5000Lux、温度为25℃、湿度为60％、二氧化碳浓度为400ppm、光照时间为12h/d每30天继代一次；
g、结果检测：将浸染并培养两周后的白花兜兰用X-Gluc染色液在37℃恒温箱中浸泡3h，取出后用酒精脱色处理，能够产生肉眼可见的深蓝色化合物；
h、实际种植效果：将培养后的白花兜兰幼苗按常规白花兜兰种植方法进行移栽，结果表明，白花兜兰香味更加浓郁，花期提前将近1个月。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、白花兜兰液体培养基的配制：向1L玻璃容器中加入去离子水900ml，松树皮粉末90g，磷肥5g，钾肥3g，氮肥2g，摇动容器直至磷肥、钾肥、氮肥完全溶解，松树皮粉末均匀悬浮在水中，再加入离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min，制得白花兜兰液体培养基；
b、白花兜兰固体培养基的配制：向1L玻璃容器中加入去离子水900ml，松树皮粉末90g，磷肥5g，钾肥3g，氮肥2g，摇动容器直至磷肥、钾肥、氮肥完全溶解，松树皮粉末均匀悬浮在水中，加入离子水定容至1L，再加入150g琼脂粉，搅拌均匀，于15psi高压下蒸汽灭菌20min后，置于冷水浴中，待培养基温度降到室温时加入500mg头孢氨苄毒素，充分摇匀，将培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外光照下光照15分钟后用封口胶封边，倒置，于4℃下保存；
c、农杆菌液体浸染液的配制；将带有基因转变质粒的农杆菌LBA4404培养至OD＝0.6～1.0，于5000r/min的离心机中离心5min，弃上清液，用100mg/L乙酰丁香酮的LB液体培养基悬浮沉淀，室温下静置3h，于5000r/min的离心机中离心5min，弃上清，用白花兜兰液体培养基悬浮沉淀，制得农杆菌液体浸染液；
d、白花兜兰浸染：选择生长良好、无病变的白花兜兰幼苗，灭菌，剪去茎尖和根部，置于农杆菌液体浸染液中浸泡10～20min，每隔2min摇匀一次；
e、白花兜兰暗培养：将上述浸泡后的白花兜兰幼苗挑出浸染液，用灭菌后的滤纸擦干表层液体，置于白花兜兰固体培养基中暗培养3天；
f、白花兜兰光照培养：将上述暗培养3天后的白花兜兰幼苗用500mg/L的头孢氨苄毒素清洗3遍，再用灭菌水冲洗5遍，最后用灭菌后的滤纸擦干后放到含有500mg/L的头孢氨苄毒素的白花兜兰固体培养基中进行光照培养；
g、结果检测：将浸染并培养两周后的白花兜兰用X-Gluc染色液在37℃恒温箱中浸泡3h，取出后用酒精脱色处理，能够产生肉眼可见的深蓝色化合物。
2.根据权利要求1所述的一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述农杆菌LBA4404本身带有链霉素抗性和利福平抗性，培养温度为28℃，摇菌转速为180～220r/min，是一种弱毒的农杆菌，采用YEP培养基进行培养。
3.根据权利要求1所述的一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述乙酰丁香酮的LB液体培养基的配制方法为：在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，然后加入去离子水定容至1L，最后在15psi高压下蒸汽灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法，其特征在于，步骤(e)中，所述白花兜兰暗培养方法为在黑暗、室温条件下，将白花兜兰置于白花兜兰固体培养基中培养3天。
5.根据权利要求1所述的一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法，其特征在于，步骤(f)中，所述头孢氨苄毒素为头孢氨苄缓释片的液体溶液。
6.根据权利要求1所述的一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法，其特征在于，步骤(f)中，所述白花兜兰的光照培养方法为在光照强度5000Lux、温度24～26℃、湿度55～65％、二氧化碳浓度350～450ppm、光照时间12h/d的培养条件下温室培养，每30天继代一次。
7.根据权利要求1所述的一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法，其特征在于，步骤(f)中，所述X-Gluc染色液为β-葡糖醛酸酶基因检测的显色底物。
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