CN107164523B - 一种用于数字pcr的方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于数字PCR的方法及装置，该方法的特点在于，首先向水相容器(6)、油相容器(2)和微管道(10)组成的***内充气加压，使***的内部压强大于外部压强，然后通过水相和油相的封堵分别截住一部分高压强的气体，最后将微管道(10)的末端与***的外部导通，使微管道(10)与水相容器(6)和油相容器(2)之间形成压差，于是水相和油相在高压气体的作用下流过微管道(10)。本发明提供的用于数字PCR的方法避免了使用外部设备来为油相和水相的流动提供动力，所以根据该方法设计的数字PCR装置体积较小、结构简单、便于携带，而且具有价格经济、操作简便的优点。
Description
技术领域
本发明涉及数字PCR技术领域，特别是涉及一种用于数字PCR的方法及装置。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，液滴式数字PCR需要在扩增前对样品进行微滴化处理，通过将样品一次性分散到几十甚至上百万个微液滴中来实现单模板分子的隔离。
目前，数字PCR仪大都需要单独的液滴生成设备(液滴发生器)来产生液滴，单独的液滴生成设备结构复杂、尺寸较大，导致数字PCR仪不方便携带，而目前利用微管道生成液滴的方式中，普遍是通过外部设备来为油相和水相的流动提供动力，由于外部设备的存在，数字PCR仪携带不方便的问题同样难以得到解决。另外，液滴生成设备或提供动力的外部设备将使得数字PCR仪造价高昂。
因此，如何能提供一种携带方便、价格经济的数字PCR装置，成为了本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种用于数字PCR的方法及装置，该装置不仅结构简单、便于携带，而且由于无需配置为油相和水相的流动提供动力的外部设备，所以该装置具有价格经济、操作简便的优点。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于数字PCR的方法，包括：
取油相容器和水相容器，所述油相容器和所述水相容器通过三通管路与用于形成液滴的微管道连通；
调整所述油相容器和所述水相容器的位置，使所述油相容器内的油相不封堵所述油相容器与所述三通管路的连接口，使所述水相容器内的水相不封堵所述水相容器与所述三通管路的连接口；
向所述水相容器、所述油相容器和所述微管道组成的***的内腔中充入气体，使所述***的内部压强高于外部压强；
再次调整所述油相容器和所述水相容器的位置，使油相封堵所述油相容器与所述三通管路的连接口，使水相封堵所述水相容器与所述三通管路的连接口；
将所述微管道远离所述三通管路的一端与所述***的外部导通，所述水相容器和所述油相容器的容积保持不变，所述水相容器内的气体推动所述水相流过所述微管道，所述油相容器内的气体推动所述油相流过所述微管道。
优选地，在上述方法中，还包括：
以恒温器作为热源使导热片上的温度形成梯度分布，所述导热片的高温区的温度包含PCR扩增的高温变性温度，所述导热片的低温区的温度包含PCR扩增的低温复性温度；
将所述微管道布设在所述导热片上，且所述微管道以预设次数循环往复地经过所述导热片的高温区和低温区。
优选地，在上述方法中，所述微管道在所述导热片的高温区和低温区之间循环往复20次～80次。
一种用于数字PCR的装置，包括用于形成液滴的微管道，所述微管道的进口连接有进口管，所述进口管远离所述微管道的一端分叉延伸出两个支管，其中一个支管连通油相容器的出口，另一个支管连通水相容器的出口，所述装置还包括用于向所述水相容器、所述油相容器和所述微管道组成的***的内腔中充入气体的加压器。
优选地，在上述装置中，还包括：
导热片，所述微管道以预设匝数缠绕布设在所述导热片上，且所述微管道循环往复地经过所述导热片的上表面和下表面；
位于所述导热片的上表面一侧或下表面一侧的恒温器，所述恒温器用于使所述导热片靠近所述恒温器的一面加热至PCR扩增的高温变性温度，而使所述导热片相对的另一面加热至PCR扩增的低温复性温度。
优选地，在上述装置中，所述预设匝数为20匝～80匝。
优选地，在上述装置中，还包括：
用于作为热源的恒温器；
导热片，所述导热片的一部分搭接在所述恒温器上，其余部分悬在所述恒温器之外，所述微管道布设在所述导热片的相对所述恒温器的另一面上，且所述微管道以预设次数循环往复地经过所述导热片与所述恒温器搭接的部分和悬在所述恒温器之外的部分。
优选地，在上述装置中，所述水相容器、所述油相容器和所述加压器中的至少一者为注射器。
优选地，在上述装置中，所述微管道的出口一端连通有流量可调的排气阀。
优选地，在上述装置中，所述导热片为PDMS芯片，所述导热片上集成有与所述微管道的出口连通的收集器。
根据上述技术方案可知，本发明提供的用于数字PCR的方法中，首先向水相容器、油相容器和微管道组成的***内充气加压，使***的内部压强大于外部压强，然后通过水相和油相的封堵分别截住一部分高压强的气体，最后将微管道的末端与***的外部导通，使微管道与水相容器和油相容器之间形成压差，于是水相和油相在高压气体的作用下流过微管道。由此可见，该方法避免了使用外部设备来为油相和水相的流动提供动力，所以根据该方法设计的数字PCR装置体积较小、结构简单、便于携带，而且具有价格经济、操作简便的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例一提供的一种用于数字PCR的装置的示意图；
图2是本发明实施例二提供的一种用于数字PCR的装置的示意图；
图3是本发明实施例三提供的一种用于数字PCR的装置的示意图。
图中标记为：
A、液滴生成区；B、PCR扩增区；C、收集区；1、加压器；2、油相容器；3、管接头；4、连接管；5、通气阀；6、水相容器；7、四通管；8、恒温器；9、导热片；10、微管道；11、收集器；12、排气阀。
具体实施方式
为了便于理解，下面结合附图对本发明作进一步的描述。
参见图1，为本发明实施例一提供的一种用于数字PCR的装置的示意图，实施例一提供的用于数字PCR的装置包括微管道10，微管道10用于形成液滴，微管道10的进口连接有进口管(图中未标记)，进口管远离微管道10的一端分叉延伸出两个支管，其中一个支管连通油相容器2的出口，另一个支管连通水相容器6的出口，该装置还包括用于向水相容器6、油相容器2和微管道10组成的***的内腔中充入气体的加压器1。
由图1可见，在实施例一中，微管道10的进口由连接管4连通四通管7的第一接口，四通管7的第二接口和第三接口分别通过连接管4及管接头3与油相容器2和水相容器6连通，四通管7的第四接口依次连接通气阀5、连接管4、管接头3和加压器1。
为了实现PCR扩增，现有技术中一般需要配置热循环仪，由于热循环仪进行温度循环控制普遍需要较为复杂的控制***，所以使得整个数字PCR装置的成本较高，而且，由于控制***结构的需要，一般也会造成数字PCR装置的体积很大。为此，本发明实施例一提供的数字PCR装置还包括恒温器8和导热片9，其中，微管道10以预设匝数缠绕布设在导热片9上，且微管道10循环往复地经过导热片9的上表面和下表面，如图1所示，恒温器8既可以位于导热片9的上表面一侧，也可以位于导热片9的下表面一侧，恒温器8用于使导热片9靠近恒温器8的一面加热至PCR扩增的高温变性温度，而使导热片9相对的另一面加热至PCR扩增的低温复性温度。
微管道10缠绕导热片9的预设匝数可以为20匝～80匝，例如缠绕40匝或60匝。
如图1所示，微管道10的出口连通有收集器11，收集器11连通有排气阀12，荧光检测仪可以放置在微管道10的末端，用于对液滴总数和具有荧光的液滴进行计数。整个数字PCR装置包括液滴生成区A、PCR扩增区B和收集区C，与传统技术相比，利用该数字PCR装置可以将液滴生成，PCR扩增、检测三个过程一次连续进行，在时间上是连续的，省去了复杂的中间操作，如样品的设备间转移等操作。
具体实际应用中，水相容器6、油相容器2和加压器1均可采用注射器或其他密闭容器，为了试验方便，采用其他密闭容器时应尽量选用容积可调的容器。
下面以水相容器6、油相容器2和加压器1均为注射器时的情形为例介绍该数字PCR装置的工作原理：
将除了水相容器6、油相容器2和加压器1以外的部分如图1所示连接起来后，将缠绕了微管道10的导热片9放置在恒温器8上，设置恒温器8的温度为PCR扩增的高温变性温度，例如95℃。导热片9的上、下表面的温差随材质导热率和导热片9的几何尺寸改变，因此可以通过合理的设计使导热片9远离恒温器8的一面的温度为PCR扩增的低温复性温度，例如65℃。
取20ml注射器作为加压器1，取两个5ml注射器分别作为油相容器2和水相容器6，将油相容器2固定在4ml位置，里面加入200微升矿物油；将水相容器6固定在1ml位置，里面加入20微升核酸溶液。待导热片9上表面温度平衡后，将三个注射器接入管接头3，关闭末端排气阀12，打开通气阀5，将油相容器2和水相容器6水平放置(液体不淹没注射器出口即可)，将加压器1由20ml位置压缩到5ml位置并固定，此时***内部压力高于外界大气压，一段时间(10s即可)后，关闭通气阀5，将油相容器2和水相容器6竖直放置(液体淹没注射器出口)，缓慢打开排气阀12，油相和水相即可流向微管道10并在微管道10内产生微小液滴，液滴沿着微管道10循环往复地经过导热片9的上表面和下表面，最后进入收集器11。
由上述工作原理可知，使用本发明提供的用于数字PCR的装置时，首先向水相容器6、油相容器2和微管道10组成的***内充气加压，使***的内部压强大于外部压强，然后通过水相和油相的封堵分别截住一部分高压强的气体，最后将微管道10的末端与***的外部导通，使微管道10与水相容器6和油相容器2之间形成压差，于是水相和油相在高压气体的作用下流过微管道10。由此可见，该装置避免了使用外部设备来为油相和水相的流动提供动力，所以该装置体积较小、结构简单、便于携带，而且具有价格经济、操作简便的优点。
本发明提供的用于数字PCR的装置采用***内部高于外部环境的内部压力作为动力，能够实现液滴的自发形成和流动，通过设计油相容器2和水相容器6之间的空气体积比可以得到所需的油相和水相液滴体积的比例，其具体原理是：在油相容器2和水相容器6内部压力相同的情况下，当两者末端压降相同时，油相容器2和水相容器6会分别排出与各自内部空气体积成相同比例的矿物油和核酸溶液。
为了控制液滴的PCR扩增时间。可以通过改变排气阀12的空气通量来改变液滴的流速，因此排气阀12可以选用流量可调的排气阀。具体实际应用中，排气阀12可以选用透气性材料，如微型透气管道、硅胶管等。
图2和图3分别为本发明实施例二和实施例三提供的用于数字PCR的装置的示意图，实施例二和实施例三中，导热片9为PDMS芯片，实施例三与实施例二的不同仅在于将Y型管(三通管)和收集器11集成到了导热片9上。
实施例二和实施例三与实施例一的区别之处除了将四通管7改用Y型管(三通管)之外，还包括PCR扩增区的不同。在实施例二和实施例三中，导热片9的一部分搭接在恒温器8上，其余部分悬在恒温器8之外，微管道10布设在导热片9的相对恒温器8的另一面上，且微管道10以预设次数循环往复地经过导热片9与恒温器8搭接的部分和悬在恒温器8之外的部分。与实施例一相类似，微管道10可以在导热片9的表面循环往复20次～80次，例如循环往复40次或60次。
由于实施例二和实施例三采用了Y型管(三通管)连接油相容器2、水相容器6和微管道10，所以在对***进行充气加压时，加压器1可以通过排气阀12向***内充入气体，即采用末端加压的方式。
本发明还提供了一种用于数字PCR的方法，该方法包括：
取油相容器2和水相容器6，油相容器2和水相容器6通过三通管路与用于形成液滴的微管道10连通；
调整油相容器2和水相容器6的位置，使油相容器2内的油相不封堵油相容器2与三通管路的连接口，使水相容器6内的水相不封堵水相容器6与三通管路的连接口；
向水相容器6、油相容器2和微管道10组成的***的内腔中充入气体，使***的内部压强高于外部压强；
再次调整油相容器2和水相容器6的位置，使油相封堵油相容器2与三通管路的连接口，使水相封堵水相容器6与三通管路的连接口；
将微管道10远离三通管路的一端与***的外部导通，水相容器6和油相容器2的容积保持不变，水相容器6内的气体推动水相流过微管道10，油相容器2内的气体推动油相流过微管道10。
具体实际应用中，为了便于实现PCR扩增所需的温度变化，本发明提供的用于数字PCR的方法还包括：
以恒温器8作为热源使导热片9上的温度形成梯度分布，导热片9的高温区的温度包含PCR扩增的高温变性温度，导热片9的低温区的温度包含PCR扩增的低温复性温度；
将微管道10布设在导热片9上，且微管道10以预设次数循环往复地经过导热片9的高温区和低温区。
微管道10在导热片9的高温区和低温区之间一般循环往复20次～80次。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (9)
1.一种用于数字PCR的方法，其特征在于，包括：
取油相容器（2）和水相容器（6），所述油相容器（2）和所述水相容器（6）通过三通管路与用于形成液滴的微管道（10）连通；
调整所述油相容器（2）和所述水相容器（6）的位置，使所述油相容器（2）内的油相不封堵所述油相容器（2）与所述三通管路的连接口，使所述水相容器（6）内的水相不封堵所述水相容器（6）与所述三通管路的连接口；
向所述水相容器（6）、所述油相容器（2）和所述微管道（10）组成的***的内腔中充入气体，使所述***的内部压强高于外部压强；
再次调整所述油相容器（2）和所述水相容器（6）的位置，使油相封堵所述油相容器（2）与所述三通管路的连接口，使水相封堵所述水相容器（6）与所述三通管路的连接口；
将所述微管道（10）远离所述三通管路的一端与所述***的外部导通，所述水相容器（6）和所述油相容器（2）的容积保持不变，所述水相容器（6）内的气体推动所述水相流过所述微管道（10），所述油相容器（2）内的气体推动所述油相流过所述微管道（10），所述微管道（10）内发生PCR扩增。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
以恒温器（8）作为热源使导热片（9）上的温度形成梯度分布，所述导热片（9）的高温区的温度包含PCR扩增的高温变性温度，所述导热片（9）的低温区的温度包含PCR扩增的低温复性温度；
将所述微管道（10）布设在所述导热片（9）上，且所述微管道（10）以预设次数循环往复地经过所述导热片（9）的高温区和低温区。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微管道（10）在所述导热片（9）的高温区和低温区之间循环往复20次~80次。
4.一种用于数字PCR的装置，其特征在于，包括用于形成液滴的微管道（10），PCR扩增发生于所述微管道（10）内，所述微管道（10）的进口连接有进口管，所述进口管远离所述微管道（10）的一端分叉延伸出两个支管，其中一个支管连通油相容器（2）的出口，另一个支管连通水相容器（6）的出口，所述装置还包括用于向所述水相容器（6）、所述油相容器（2）和所述微管道（10）组成的***的内腔中充入气体的加压器（1），所述微管道（10）的出口一端连通有流量可调的排气阀（12），所述加压器（1）与所述排气阀（12）连接。
5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，还包括：
导热片（9），所述微管道（10）以预设匝数缠绕布设在所述导热片（9）上，且所述微管道（10）循环往复地经过所述导热片（9）的上表面和下表面；
位于所述导热片（9）的上表面一侧或下表面一侧的恒温器（8），所述恒温器（8）用于使所述导热片（9）靠近所述恒温器（8）的一面加热至PCR扩增的高温变性温度，而使所述导热片（9）相对的另一面加热至PCR扩增的低温复性温度。
6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述预设匝数为20匝~80匝。
7.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，还包括：
用于作为热源的恒温器（8）；
导热片（9），所述导热片（9）的一部分搭接在所述恒温器（8）上，其余部分悬在所述恒温器（8）之外，所述微管道（10）布设在所述导热片（9）的相对所述恒温器（8）的另一面上，且所述微管道（10）以预设次数循环往复地经过所述导热片（9）与所述恒温器（8）搭接的部分和悬在所述恒温器（8）之外的部分。
8.根据权利要求4~7中任意一项所述的装置，其特征在于，所述水相容器（6）、所述油相容器（2）和所述加压器（1）中的至少一者为注射器。
9.根据权利要求5~7中任意一项所述的装置，其特征在于，所述导热片（9）为PDMS芯片，所述导热片（9）上集成有与所述微管道（10）的出口连通的收集器（11）。
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