CN107151267B - 载脂蛋白-ⅲ及其功能、制备方法和应用 - Google Patents

载脂蛋白-ⅲ及其功能、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，涉及载脂蛋白‑Ⅲ的结构及其获得方法、新的生理功能以及在生物医药领域应用。具体地说，本发明涉及载脂蛋白‑Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段的结构及其制备生产方法与功能，以及其在微生物及其相关分子模式检测诊断、促进昆虫血淋巴黑色素产生、诱导昆虫合成抗菌肽等生物医药领域中的应用，制备载脂蛋白‑Ⅲ及其衍生物或类似物或活性片段抗体及其在生物医药领域的应用。本发明所述的天然、重组ApoLp‑Ⅲ及其部分片段或衍生物或类似物获得方法常规、简单、产量高。

Description

载脂蛋白-Ⅲ及其功能、制备方法和应用
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，涉及载脂蛋白-Ⅲ的结构及其获得方法、新的生理功能以及在生物医药领域应用。具体地说，本发明涉及载脂蛋白-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段的结构及其制备生产方法与功能，以及其在微生物及其相关分子模式检测诊断、促进昆虫血淋巴黑色素产生、诱导昆虫合成抗菌肽等生物医药领域中的应用，制备载脂蛋白-Ⅲ及其衍生物或类似物或活性片段抗体及其在生物医药领域的应用。
背景技术：
载脂蛋白(Apolipophorin，ApoLp)作为重要的载脂功能蛋白，可以转运甘油三酯、甾醇类物质等，但是现在未发现在昆虫免疫中有什么作用。载脂蛋白Ⅲ(ApolipophorinIII，ApoLp-Ⅲ)是继ApoLp-Ⅰ和ApoLp-Ⅱ之后发现的又一载脂蛋白Apolipophorin超家族的一员，分子量约为18-20kDa，具有水溶性、热稳定性等特性，在昆虫中普遍存在，且在脂肪体中合成后释放到血淋巴中，主要在昆虫飞行中起到转运脂的作用。这种血淋巴蛋白在昆虫体内主要以两种形式，即非结合脂形式和结合脂形式存在。
现有研究结果表明，载脂蛋白-Ⅲ主要是转运中等大小的脂类物质。昆虫体内ApoLp-Ⅲ含量分析结果表明，一方面，由于在飞行过程提供转载脂质体的功能，ApoLp-Ⅲ在昆虫成虫体内的含量要远远高于幼虫；另一方面，虽然幼虫体内ApoLp-Ⅲ的含量少，但仍比转脂所需用量高很多，由此可以推测幼虫体内ApoLp-Ⅲ可能具有其他的生物学功能。1995年Sun等在研究烟草天蛾时发现，ApoLp-Ⅲ可能参与了先天性免疫反应的某些作用？当注射适量的烟草天蛾ApoLp-Ⅲ到烟草天蛾幼虫体内时发现，昆虫体液的抗菌能力、溶菌能力有一定的增强，并刺激了吞噬作用的产生。相似结果也在美国白蛾中出现。而在家蚕中，将掺入了脂多糖(LPS)的载脂蛋白注入昆虫体内，这种结合物可很快从家蚕体液中被清除。
综上所述，ApoLp-Ⅲ是昆虫体内普遍存在的一种具有载脂能力的功能蛋白，可能参与了昆虫体内的先天性防御中的某些作用。
目前尚未见对鳞翅目(Lepidoptera)的天(大)蚕蛾科昆虫ApoLp-Ⅲ的结构、制备、生物学功能以及功能应用的研究。
发明内容：
本发明所解决的技术问题是提供一系列载脂蛋白-Ⅲ及其制备方法。
所述的载脂蛋白-Ⅲ的氨基酸序列如ID：1或ID：2所示；
编码所述载脂蛋白-Ⅲ的氨基酸序列的基因序列如ID：1所示。
本发明还提供了所述载脂蛋白-Ⅲ的衍生物或类似物或活性片段及其重组载脂蛋白-Ⅲ的衍生物或类似物或活性片段。
所述的载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或活性片段包括ID：3-12所述的氨基酸序列。
本发明进一步提供了所述载脂蛋白-Ⅲ及其衍生物或类似物或活性片段，重组载脂蛋白-Ⅲ及其衍生物或类似物或活性片段，以载脂蛋白-Ⅲ及其衍生物或类似物或活性片段、重组载脂蛋白-Ⅲ及其衍生物或类似物或活性片段作为抗原的抗体在生物领域中的应用，包括(1)针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用；(2)针对微生物相关分子模式的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用；(3)针对载脂蛋白-Ⅲ、载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或活性片段、重组载脂蛋白-Ⅲ、重组载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或活性片段的检测与追踪等生物医药领域应用；(4)诱导昆虫抗菌肽合成及其获得的抗菌肽在生物医药领域应用。
具体地，所述应用包括(1)激活酚氧化酶原激活***，(2)诱导昆虫抗菌肽合成及其获得的抗菌肽(3)在微生物及其相关分子模式检测中的应用，(4)载脂蛋白-Ⅲ、载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或活性 片段、重组载脂蛋白-Ⅲ、重组载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或活性片段的检测与追踪。
本发明是针对鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫体内的ApoLp-Ⅲ，研究天然ApoLp-Ⅲ的制备方法、一级结构(基因和蛋白质)、生物学功能以及其应用，利用基因工程技术获得重组ApoLp-Ⅲ及其衍生物或类似物或活性片段以及其生物学功能和应用。此外，利用天然、重组ApoLp-Ⅲ及其衍生物或类似物或活性片段作为抗原，刺激机体产生抗体，同时研究了该抗体的应用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
首先利用蛋白提取、分离、纯化技术，从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中分离、纯化获得天然ApoLp-Ⅲ。其次，利用蛋白质化学技术以及分子生物学技术，解析ApoLp-Ⅲ的一级结构(基因和蛋白质)并获得其基因。再次，利用基因工程技术，实现ApoLp-Ⅲ基因在宿主细胞的表达，结合蛋白提取、分离、纯化技术获得重组ApoLp-Ⅲ。同时，利用基因重组技术，获得ApoLp-Ⅲ的衍生物或类似物或部分片段。天然、重组ApoLp-Ⅲ以及其衍生物或类似物或部分片段，能特异性识别脂多糖、β-1,3-葡聚糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖等多种微生物相关分子模式以及细菌、真菌等微生物。上述结合，一方面激活昆虫体液免疫中的酚氧化酶原激活***，另一方面激活昆虫细胞免疫，即通过激活Toll途径诱导抗菌肽的合成。本发明的天然、重组ApoLp-Ⅲ以及其衍生物或类似物或部分片段以及其抗体的生物学功能，可广泛应用于针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域；同时，利用本发明的天然、重组ApoLp-Ⅲ以及其衍生物或类似物或部分片段诱导昆虫大量表达抗菌肽，由此制备获得的抗菌肽可应用于微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域。
本发明的ApoLp-Ⅲ，其氨基酸序列如ID：1和ID：2所示。
其制备方法如下：
一、天然ApoLp-Ⅲ的制备
本发明所获得天然ApoLp-Ⅲ是通过如下技术方案实现的，包括：
以昆虫血淋巴作为原料，分别通过亲和层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、盐析、超滤或上述方法的不同组合，分离纯化得到不同纯度乃至电泳纯或HPLC纯的ApoLp-Ⅲ。
其中，昆虫血淋巴(简称血淋巴)，是昆虫血液(或血细胞裂解物)和淋巴液的混合物、昆虫压榨或匀浆的体液，用缓冲溶液或酸性溶液或碱性溶液溶解提取，离心除去不溶杂质得到的抽提液；
ApoLp-Ⅲ的提取、分离、纯化体系基本条件的特征：(1)溶液的酸碱度在pH2～pH10，优选pH4-pH9；(2)调节溶液酸碱度的化学试剂是常规、通用的酸或碱及其溶液。酸及其溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸。碱及其溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂；(3)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对、上述各缓冲离子的组合；(4)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L～0.8mol/L，优选0.01mol/L～0.3mol/L。上述条件既不破坏提取、分离、纯化所采用介质的理化性质，又不影响ApoLp-Ⅲ的生物活性。
昆虫血淋巴的收集：将昆虫用蒸馏水或去离子水反复清洗，采用常规方法，如蜡盘法、离心法、背血管取血法、灌注法、压榨、匀浆法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪开法、穿刺法等，在10℃至～5℃条件下收集昆虫血淋巴。
本发明的分离分析方法包含如下中的两种或两种以上的组合：
1.离子交换层析分离纯化ApoLp-Ⅲ
取上述方法所获昆虫血淋巴，按ApoLp-Ⅲ提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围下。将处理好的样品上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐浓度阶段方式，分别用0.1mol/L、0.2mol/L、 0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L盐溶液进行阶段洗脱；也可以采用盐浓度梯度方式，梯度为0.00mol/L～3mol/L。利用抗ApoLp-Ⅲ抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有ApoLp-Ⅲ的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐，或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
离子交换层析分离纯化的特征：(1)层析介质选择阳离子交换层析填料，如CM-离子交换层析填料或SP-离子交换层析填料或S-离子交换层析填料等阳离子交换层析填料，此时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7；(2)层析介质选择阴离子交换层析填料，如Q-离子交换层析填料或DEAE-离子交换层析填料或QAE-离子交换层析填料等离子交换层析填料，此时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH12；(3)缓冲液及其浓度选择，按上述ApoLp-Ⅲ提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(4)洗脱的盐溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加中性盐到需要的浓度；(5)中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl，优选NaCl；(6)分离纯化操作温度按上述ApoLp-Ⅲ提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。上述条件既不影响ApoLp-Ⅲ的生物活性，又不影响活性成分的分离纯化。
2.亲和层析分离纯化ApoLp-Ⅲ
取上述方法所获昆虫血淋巴，按ApoLp-Ⅲ提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至ApoLp-Ⅲ的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。将处理好的样品液上样于预先用缓冲液平衡好的亲和层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐(或化学试剂)浓度梯度(0.0mol/L～3.0mol/L或0.0mol/L～6.0mol/L或0.0mol/L～8.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐(或化学试剂)阶段浓度洗脱方式，分别采用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L、8mol/L盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗ApoLp-Ⅲ抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有ApoLp-Ⅲ的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐(或化学试剂)或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
亲和层析分离纯化的特征：(1)亲和填料的配基选择ApoLp-Ⅲ抗体、肝素、刀豆素、甲醛固定后的细菌或真菌、丝氨酸蛋白酶抑制剂(如苯甲咪)、sepharose CL-4B、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖胺、肽聚糖、脂磷壁酸、脂多糖、葡聚糖等；(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按ApoLp-Ⅲ提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(3)洗脱的盐(或化学试剂)溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加盐(或化学试剂)到需要的浓度；(4)洗脱用盐(或化学试剂)可以选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl或尿素或盐酸胍；(5)洗脱用盐(或化学试剂)选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl的最高浓度为3.0mol/L，选择尿素的最高浓度为8.0mol/L，选择盐酸胍的最高浓度为6.0mol/L；(6)如果洗脱用盐(或化学试剂)选择了尿素或盐酸胍而使ApoLp-Ⅲ发生变性作用，可以通过常规、通用的蛋白质复性方法进行复性而获得ApoLp-Ⅲ。
3.疏水层析分离纯化ApoLp-Ⅲ
取上述方法所获昆虫血淋巴，按ApoLp-Ⅲ提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至ApoLp-Ⅲ的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。加中性盐至2mol/L浓度，上样于预先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱，先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用中性盐浓度梯度(2.0mol/L～0.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐浓度阶段洗脱方式，分别采用1.5mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗ApoLp-Ⅲ抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有ApoLp-Ⅲ的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
疏水层析分离纯化的特征：(1)疏水层析介质选择苯基-疏水层析填料或正辛烷-疏水层析填料-或己烷-疏水层析填料-或丁烷-疏水层析填料；(2)中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl；(3)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按ApoLp-Ⅲ提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。
4.凝胶层析分离纯化ApoLp-Ⅲ
取上述方法所获昆虫血淋巴，按ApoLp-Ⅲ提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至ApoLp-Ⅲ的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。样品液上样于预先用缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱并进行分离纯化洗脱，利用抗ApoLp-Ⅲ抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有ApoLp-Ⅲ的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
凝胶层析分离纯化的特征：(1)层析介质可以选择Sephacryl S-100HR或Sephacryl S-200HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75或Sephadex G-100或Sephadex G-150或Superose 12prep grade或Superose 6prep grade或Superdex 30prep grade或Superdex 75prep grade或Superose 12HR或Superose 6HR或Superdex Peptide HR或Superdex75HR或Superdex Peptide PE等凝胶层析填料；(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按ApoLp-Ⅲ提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征，此外洗脱液的浓度，优选在离子浓度大于0.15M及以上。
5.盐析分离纯化ApoLp-Ⅲ
取上述方法所获昆虫血淋巴，按ApoLp-Ⅲ提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至ApoLp-Ⅲ的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。在样品溶液中加入蛋白质盐析常规、通用的中性盐，至浓度达到ApoLp-Ⅲ仍处于溶解状态，而一些杂蛋白处于沉淀。离心取其上清溶液继续加入盐析常规、通用的中性盐至浓度达到ApoLp-Ⅲ沉淀状态。离心弃上清，沉淀溶于ApoLp-Ⅲ提取、分离、纯化体系基本条件特征的溶液或缓冲液储存备用；沉淀的溶解液，也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去其中的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
盐析分离纯化的特征：(1)分离纯化的缓冲液、酸碱度选择，是按ApoLp-Ⅲ提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(2)盐析使用的中性盐，选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl，优选(NH4)2SO4或Na2SO4；(3)在使ApoLp-Ⅲ处于溶解状态时，选择中性盐在5％—30％，优选15％—30％；(4)在使ApoLp-Ⅲ处于沉淀状态时，选择中性盐在30％—90％，优选35％—75％。
6.超滤分离纯化ApoLp-Ⅲ以及处理ApoLp-Ⅲ溶液
取上述方法所获昆虫血淋巴，按ApoLp-Ⅲ提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至ApoLp-Ⅲ的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。利用常规、通用超滤方法，分离纯化ApoLp-Ⅲ。一种方案，选择一定规格的超滤膜，使ApoLp-Ⅲ透过超滤膜，而一些杂蛋白则被超滤膜截留，从而使ApoLp-Ⅲ得以分离纯化；透过超滤膜的ApoLp-Ⅲ溶液，再选择一定规格的超滤膜，使ApoLp-Ⅲ被截留，而一些杂蛋白则透过超滤膜，从而使ApoLp-Ⅲ得以分离纯化。另一种方案，是选择一定规格的超滤膜，使ApoLp-Ⅲ先被超滤膜截留，随后再选择一定规格的超滤膜，使ApoLp-Ⅲ透过超滤膜，从而使ApoLp-Ⅲ得以分离纯化。
超滤处理ApoLp-Ⅲ溶液的目的，是除去ApoLp-Ⅲ溶液中的盐或小分子杂质或更换缓冲液。此外，对ApoLp-Ⅲ溶液进行浓缩。处理方法同上所述，选择一定规格的超滤膜，使ApoLp-Ⅲ被超滤膜截留，而盐或小分子杂质或缓冲液的缓冲离子对则透过超滤膜，从而实现去除盐、小分子杂质或更换缓冲液或浓缩的目的。
超滤分离纯化和处理的特征：(1)透过ApoLp-Ⅲ的超滤膜选择分子量为20kDa或30kDa或40kDa 或50kDa或60kDa规格的超滤膜，优选20kDa～50kDa的超滤膜，大于或小于优选规格的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；(2)截留ApoLp-Ⅲ的超滤膜选择是分子量为3kDa或10kDa或20kDa或30kDa的超滤膜，优选10kDa～30kDa的超滤膜，大于或小于优选规格的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；(3)超滤分离纯化或处理的操作温度、缓冲液及其酸碱度或浓度选择，是按ApoLp-Ⅲ提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。
通过上述任何一种方法所获得的ApoLp-Ⅲ纯度，有时无法满足相应需要。
本发明是从昆虫血淋巴中分离纯化高纯度ApoLp-Ⅲ，并可以达到电泳纯乃至HPLC纯度。其特征在于，将上述六种分离纯化方法(离子交换柱层析、亲和柱层析、疏水柱层析、凝胶过滤柱层析、盐析、超滤)，进行两种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或三种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或四种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或五种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，纯化方法自由组合及其顺序重排组合，直至样品纯度得到预期要求。
本发明所指昆虫是鳞翅目昆虫，鳞翅目昆虫优选天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕，昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明，以柞蚕作为代表来描述下面的内容，而选择柞蚕作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
本发明所述的重组载脂蛋白-Ⅲ、重组载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或活性片段是利用基因工程表达获得，包括(1)原核生物***的表达载体，表达宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞，(2)酵母细胞***的表达载体，表达宿主细胞为酵母细胞，(3)昆虫细胞***的表达载体，表达宿主细胞为昆虫细胞，(4)哺乳动物细胞***的表达载体，表达宿主细胞为哺乳动物细胞，(5)上述表达形式为细胞内表达或分泌形式表达，(6)上述表达体系中的表达产物作为制备重组载脂蛋白-Ⅲ、重组载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或活性片段的来源。
所述“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
本发明所指微生物以及其相关分子模式是真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌以及其相关分子模式。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明，以毕赤酵母、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌等作为微生物(真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌)代表来描述下面的内容，以Lys-PGN、DAP-PGN、脂磷壁酸、甘露聚糖、β-1,3-葡聚糖、脂多糖等作为微生物相关分子模式代表来描述下面的内容，而选择上述具体的微生物或具体的微生物相关分子模式作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
二、ApoLp-Ⅲ结构解析以及其基因序列解析
按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对ApoLp-Ⅲ进行结构解析。包括：(1)利用生物质谱测定天然ApoLp-Ⅲ的分子量；(2)采用常规蛋白水解酶及其水解条件，针对发明内容所获得ApoLp-Ⅲ进行降解，通过HPLC分离降解片段，利用生物质谱或Edman降解方法解析部分氨基酸序列，从而获得ApoLp-Ⅲ分子内许多片段的氨基酸序列；(3)利用分子生物学技术、方法，从昆虫脂肪体提取总RNA，利用RACE技术构建昆虫cDNApool。根据目的蛋白降解片段的氨基酸序列，设计引物，PCR扩增片段基因。随后结合RACE技术获得ApoLp-Ⅲ基因—cDNA，通过基因序列测定分析获得其碱基序列并由其开放阅读框碱基序列推导获得ApoLp-Ⅲ全长一级结构；(4)利用分子生物学技术、方法等，从昆虫脂肪体提取其染色体基因。设计PCR扩增上下游引物，以昆虫染色体基因为模板，PCR扩增ApoLp-Ⅲ染色体基因，通过基因序列测定分析获得ApoLp-Ⅲ染色体基因中的内含子、外显子序列；(5)通过上述所获得ApoLp-Ⅲ的分子量、分子内部分氨基酸序列、cDNA开放阅读框序列、染色体基因中的外显子序列， 彼此相互验证上述结构信息，获得ApoLp-Ⅲ全长一级结构序列及天然ApoLp-Ⅲ或称成熟ApoLp-Ⅲ一级结构序列(参见ID:1和ID:2)。
三、重组ApoLp-Ⅲ及其部分片段或衍生物或类似物的制备
本发明还包含具有ApoLp-Ⅲ序列的重组ApoLp-Ⅲ及其部分片段或衍生物或类似物。
所述的重组ApoLp-Ⅲ选自Met-载脂蛋白-Ⅲ成熟肽、Met-组氨酸标签-载脂蛋白-Ⅲ成熟肽、Met-载脂蛋白-Ⅲ成熟肽-His6标签、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-载脂蛋白-Ⅲ成熟肽、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-载脂蛋白-Ⅲ成熟肽、Met-载脂蛋白-Ⅲ成熟肽-凝血酶酶切位点-GST标签、Met-His6标签-载脂蛋白-Ⅲ全序列、Met-载脂蛋白-Ⅲ全序列-His6标签、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-ApoLpⅢ全序列、Met-ApoLpⅢ全序列-凝血酶酶切位点-GST标签(参见ID：3-12)。
本发明的重组ApoLp-Ⅲ的部分片段或衍生物或类似物的序列(参见ID：3-12)：(1)ApoLp-Ⅲ成熟肽氨基酸序列及其核苷酸序列；(2)Met-ApoLp-Ⅲ成熟肽氨基酸序列；(3)Met-组氨酸标签-ApoLp-Ⅲ成熟肽氨基酸序列；(4)Met-ApoLp-Ⅲ成熟肽-His6标签氨基酸序列；(5)Met-His6标签-凝血酶酶切位点-ApoLp-Ⅲ成熟肽氨基酸序列；(6)Met-GST标签-凝血酶酶切位点-ApoLp-Ⅲ成熟肽氨基酸序列；(7)Met-ApoLp-Ⅲ成熟肽-凝血酶酶切位点-GST标签氨基酸序列；(8)Met-His6标签-ApoLp-Ⅲ全序列氨基酸序列；(9)Met-ApoLp-Ⅲ全序列-His6标签氨基酸序列；(10)Met-GST标签-凝血酶酶切位点-ApoLp氨基酸全序列；(11)Met-ApoLpⅢ全序列-凝血酶酶切位点-GST标签氨基酸序列。
本发明的重组ApoLp-Ⅲ及其部分片段或衍生物或类似物通过基因工程表达制备获得，通过如下技术方案实现，包括：(1)将ApoLp-Ⅲ及其部分片段或衍生物或类似物编码DNA重组至表达载体；(2)用步骤⑴的重组表达载体转化适当的宿主细胞(原核或真核细胞)；(3)在适合的诱导表达条件下，培养步骤⑵的被转化的宿主细胞；(4)收获并纯化所得到的目的蛋白。
本发明同时提供上述重组ApoLp-Ⅲ及其部分片段或衍生物或类似物的表达产物分离纯化方法。可使用盐析沉淀、超滤、亲和层析、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法以及上述方法的多种组合，从基因工程细胞的溶胞产物或培养液中分离并纯化所需的表达产物。在表达产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(Western)检测表达产物的存在及相应分子大小。
四、ApoLp-Ⅲ及其部分片段或衍生物或类似物的结合特异性及其应用
本发明再一个目的是针对天然、重组ApoLp-Ⅲ其部分片段或衍生物或类似物的体外结合特异性、对微生物的结合与凝集作用以及对激活酚氧化酶原激活***和Toll途径的激活情况的对比，确定了天然、重组ApoLp-Ⅲ及其部分片段或衍生物或类似物的生物活性。同时，考察ApoLp-Ⅲ在机体免疫应答过程的表达，也研究了天然、重组ApoLp-Ⅲ及其部分片段或衍生物或类似物的应用。
此外，本发明也研究了天然、重组ApoLp-Ⅲ及其部分片段或衍生物或类似物作为抗原刺激机体产生抗体、抗体的制备以及其应用。
本发明所述的天然、重组ApoLp-Ⅲ及其部分片段或衍生物或类似物获得方法常规、简单、产量高。
附图说明：
图1为分离纯化天然ApoLp-Ⅲ电泳图谱
泳道1：实施例1中方法-1分离获得天然ApoLp-Ⅲ的电泳图谱；
泳道2：实施例1中方法-2所获天然ApoLp-Ⅲ的电泳图谱；
泳道3：实施例1中方法-3所获天然ApoLp-Ⅲ的电泳图谱。
图2为分离纯化重组ApoLp-Ⅲ(原核表达体系)电泳图谱
泳道1：实施例2中方法-(1)所获得重组ApoLp-Ⅲ的电泳图谱；
泳道2：实施例2中方法-(2)所获重组ApoLp-Ⅲ的电泳图谱；
泳道3：实施例2中方法-(3)所获重组ApoLp-Ⅲ的电泳图谱；
泳道4：实施例2中方法-(4)所获重组ApoLp-Ⅲ的电泳图谱。
图3为分离纯化重组ApoLp-Ⅲ(昆虫表达体系)电泳图谱
泳道1：实施例3中方法-1所获得重组ApoLp-Ⅲ的电泳图谱；
泳道2：实施例3中方法-2所获重组ApoLp-Ⅲ的电泳图谱。
图4为分离纯化重组ApoLp-Ⅲ(酵母表达体系、哺乳动物细胞表达体系)电泳图谱
泳道1：实施例4中方法所获得重组ApoLp-Ⅲ的电泳图谱；
泳道2：实施例5中方法所获重组ApoLp-Ⅲ的电泳图谱。
图5为ApoLp-Ⅲ的结合特异性
A-(1)酶联免疫吸附方法检测Ap-apo-III对可溶性微生物相关分子模式结合特异性；A-(2)热泳动方法检测Ap-apo-III对可溶性微生物相关分子模式的结合特异性；A-(3)蛋白质免疫印迹方法检测Ap-apo-III与不溶性微生物相关分子模式的结合特异性；
B-(1)天然Ap-apo-III对微生物的结合特异性；B-(2)重组His-Ap-apo-III对微生物的结合特异性。
图6为Ap-apo-III对微生物的凝集作用
图7为Ap-apo-III结合微生物细胞后对酚氧化酶原***的激活作用
图8ApoLp-Ⅲ在抗菌肽合成过程中的作用
8-A：ApoLp-Ⅲ对抗菌肽合成的促进作用；8-B：Ap-apo-III干扰对抗菌物质合成的影响。
图9 ApoLp-Ⅲ抗体对酚氧化酶原***的影响。
具体实施方式：
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
实施例1
天然ApoLp-Ⅲ的分离纯化
1.方法-1
将溶于昆虫生理盐水的真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌混合物(10ul)注射柞蚕体内，诱导24～48小时后，将约200ml血淋巴于4℃，4L 20mM Tis-HCl(PH7.4，100mM NaCl，2mMCaCl2)缓冲体系中缓慢透析至少24h。4℃，3000rpm/min离心10min后，将上清液冰浴并超声(50W，40～50s)，4℃，12000prm/min离心10min后，将上清液经0.22um滤膜过滤，再经过截留分子量为100KDa滤膜以除去大分子量的蛋白，透过样品再次经过截留分子量为30kDa滤膜获得进一步纯化及浓缩的样品。将截留的样品溶于Tris-HCl(20mM，pH 7.5)缓冲溶液中，并上样于用相同缓冲溶液平衡的DEAE sepharose CL-6B阴离子交换柱，流速为0.3ml/min。用Tris-HCl(20mM，pH 7.5)缓冲溶液洗涤色谱柱至A280<0.01。用含有0.8M NaCl的Tris-HCl(20mM，pH 7.5)缓冲溶液梯度洗脱结合蛋白。将经进一步纯化的含有目的蛋白的组分更换缓冲溶液为醋酸钠-醋酸(20mM，pH5.0)缓冲溶液，上样于Mono S阳离子交换柱，0-100％0.5M NaCl(醋酸钠-醋酸缓冲溶液，20mM,pH5.0)梯度洗脱条件下洗涤洗脱，得到具有天然活性的ApoLp-Ⅲ纯品。
试验结果如图1泳道1，天然ApoLp-Ⅲ的纯度约99.9％以上。
2.方法-2
将溶于昆虫生理盐水的真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌混合物(10ul)注射柞蚕体内，诱导24～48小时后，将约200ml血淋巴于4℃，4L 20mM Tis-HCl(PH7.4，100mM NaCl，2mMCaCl2)缓冲体系中缓慢透析至少24h。4℃，3000rpm/min离心10min后，将上清液冰浴并超声(50W，40～50s)。经90℃水浴中 加热30min后48000rpm/min，10min离心，将上清液0.22um滤膜过滤，经过截留分子量为100KDa滤膜以除去大分子量的蛋白，透过样品再次经过截留分子量为30kDa滤膜获得进一步纯化及浓缩的样品。将截留的样品溶于Bis-Tris-HCl(20mM，pH 6.5)缓冲溶液中，并上样于用相同缓冲溶液平衡的DEAE sepharoseCL-6B离子交换柱，流速为0.5ml/min。用Bis-Tris-HCl(20mM，pH 6.5)缓冲溶液洗涤色谱柱至A280<0.01。用含有0.5M NaCl的Bis-Tris-HCl(20mM，pH 6.5)缓冲溶液逐级洗脱结合蛋白。
试验结果如图1泳道2。
3.方法-3
将溶于抗凝缓冲溶液的柞蚕体液离心去除血细胞，以不含有血细胞的柞蚕血淋巴作为纯化ApoLp-Ⅲ的样品。将200ml样品进行硫酸铵分级沉淀，取30～35％沉淀组分用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系溶解稀释，上样于Q-Sepharose阴离子交换柱进行洗涤洗脱，将含有目的蛋白的组分上样于羟基磷灰石层析柱进行洗涤洗脱，将流出液上样于肝素层析柱进一步的除杂后，流出液上样于SP-Sepharose阳离子交换柱进行洗涤洗脱，将含有目的片段的组分上样于凝胶过滤层析柱Sepharose CL-6B column进行进一步的分离纯化，从而获得目的蛋白。
试验结果如图1泳道3。
实施例2：
ApoLp-Ⅲ结构解析以及其基因序列解析
按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对ApoLp-Ⅲ进行结构解析。具体方法、手段按照发明内容二中所列内容实施。
获得ApoLp-Ⅲ完整核苷酸序列及其氨基酸序列以及ApoLp-Ⅲ成熟肽氨基酸序列及其核苷酸序列(如ID:1或ID:2所示)。
实施例3：
利用原核生物表达***获得重组ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段
本实施例列举描述原核生物表达***表达本发明ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
原核生物表达***的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
本实施是为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.ApoLp-Ⅲ的表达载体构建
根据天然ApoLp-Ⅲ的N末端和C末端氨基酸序列，分别设计相应寡核苷酸引物，同时在上述两个寡核苷酸引物的5′端，分别加上限制性核酸内切酶水解位点序列；以昆虫脂肪体cDNA pool为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收；经过限制性核酸内切酶酶切后与同样进行双酶切表达质粒，在DNA连接酶的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞；经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行DNA序列测定。通过上述基因工程的方法，构建ApoLp-Ⅲ基因的表达载体。
本实施例表达载体构建的特征：1。以大肠杆菌为宿主，表达载体可选择pTYB11、pMAL-C2X、pET-28a、pGEX-2T、pBV220、pQE30、pET20b等；2.可以在ApoLp-Ⅲ的N端前融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；3.可以在ApoLp-Ⅲ的C段后融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；4.标签可以选择His-Tag(连续六个及以上组氨酸)、GST-Tag等；5.可以在亲和层析标签与ApoLp-Ⅲ之间，添加蛋白水解酶水解 位点的氨基酸序列，如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等，以获得与天然ApoLp-Ⅲ蛋白结构一致的重组ApoLp-Ⅲ蛋白。
2.重组ApoLp-Ⅲ蛋白及其衍生物、类似物、活性片段的获得
利用基因工程技术，将ApoLp-Ⅲ基因表达载体转化大肠杆菌，挑取单菌落后接种至含抗生素的LB，诱导ApoLp-Ⅲ基因的表达，从而获得含有ApoLp-Ⅲ的培养液或菌体。含有ApoLp-Ⅲ的菌体首先经裂解液裂解、超声破碎，释放目的蛋白后利用离心方法收集上清液作为重组ApoLp-Ⅲ的原料液备用。
重组目的基因表达的特征：1.表达载体转化进入宿主的方式可以选择热转化法和电转化方法；2.诱导表达的方式包括化学诱导—异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和加温诱导；3.ApoLp-Ⅲ基因可表达于细胞内或细胞外；3.存在于细胞内的ApoLp-Ⅲ需通过裂解液裂解、超速破碎等方式，将目的蛋白释放至溶液中。
按照实施例1的方法、原理、策略等，从上述含ApoLp-Ⅲ的原料液中分离纯化重组ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段至需要的纯度，直至达到电泳纯或HPLC纯。
例如：(1)采用pTYB11构建无标签ApoLp-Ⅲ表达载体，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经IPTG诱导，ApoLp-Ⅲ表达于细胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化ApoLp-Ⅲ的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化ApoLp-Ⅲ至电泳纯(图2-泳道1)。
(2)采用pET-28a构建N端前融合组氨酸标签的ApoLp-Ⅲ基因，热转化大肠杆菌，经IPTG诱导，His-ApoLp-Ⅲ表达于细胞内。采用裂解缓冲液(50m mol/LPBS,0.15mol/L NaCl,50m mol/L咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化ApoLp-Ⅲ的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化ApoLp-Ⅲ至电泳纯(图2-泳道2)。
(3)采用pGEX-2T构建C端后融合GST标签的ApoLp-Ⅲ表达载体，热转化大肠杆菌，经加温诱导表达，ApoLp-Ⅲ-GST表达于胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化ApoLp-Ⅲ的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化ApoLp-Ⅲ至电泳纯(图2-泳道3)。
(4)采用pET20b构建C端后融合组氨酸标签的ApoLp-Ⅲ基因，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经加温诱导表达，ApoLp-Ⅲ-His表达于胞外。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化ApoLp-Ⅲ至电泳纯(图2-泳道4)。
上述表达重组的ApoLp-Ⅲ，分离纯化获得的重组表达产物，经过SDS-PAGE验证其纯度如图2所示。
上述含标签的纯化后表达产物经过上述常规、通用的蛋白水解酶(如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等)的水解作用，去除表达产物中的融合肽段，再经分离纯化从而获得ApoLp-Ⅲ，该重组ApoLp-Ⅲ的结构与天然的ApoLp-Ⅲ的结构相同。
实施例3：
利用昆虫细胞表达***获得重组ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段
本实施例列举描述昆虫细胞表达***表达本发明ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
昆虫细胞表达***的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
本实施例是使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
对于表达产物的分离纯化方法，采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.利用pFastBac1-sf9昆虫表达体系获得重组ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段
将ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段基因连接到pFastBac1质粒中，构建pFastBac1-βGRP重组表达质粒。转座大肠杆菌DH10，Blu-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞sf9，Western blot验证重组ApoLp-Ⅲ在细胞内表达。
收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于抗ApoLp-Ⅲ抗体—sepharose CL-6B为配基的亲和层析柱，采用0mol/L-3mol/L NaCl的裂解缓冲液进行梯度洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。纯化后的电泳鉴定结果如图3-泳道1。
2.利用pMIB/V5-His-Sf21昆虫表达体系获得重组ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段
将ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段基因连接到pMIB/V5-His质粒中，构建pMIB/V5-His-ApoLp-Ⅲ重组表达质粒。转座大肠杆菌DH5，Blue-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞Sf21，Western blot验证重组ApoLp-Ⅲ在细胞内表达。
收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)进行洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。纯化后的电泳鉴定结果如图3-泳道2。
实施例4：
利用酵母表达***获得重组ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段
本实施例列举描述酵母细胞表达***表达本发明ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
酵母细胞表达***的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以pPIC9K表达载体、毕赤酵母GS115为代表进行描述。
对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1的方法、原理、策略等。
利用常规、通用的基因工程技术，将ApoLp-Ⅲ基因连接到pPIC9K表达载体中，构建pPIC9K-His6-ApoLp-Ⅲ(或pPIC9K-ApoLp-Ⅲ)重组表达质粒，转化大肠杆菌，挑取阳性重组菌中重组质粒，经酶切形成线性分子，利用电转化方法将其转入毕赤酵母GS115中与基因组同源重组，经过初筛、复筛及Mut表型鉴定，筛选出阳性重组子，进行发酵及诱导表达，经Western blot验证，N末端带有His6-tag的重组ApoLp-Ⅲ为分泌型表达。
将重组菌GS115/pPIC9K-His6-ApoLp-Ⅲ(或GS115/pPIC9K-ApoLp-Ⅲ)接种于50mlBMGY液体培养基中，于30℃，250rpm/min，震荡培养过夜。3000g、4℃离心5min，收集菌体。用10ml BMMY培养基重悬菌体并开始甲醇诱导表达6h，重组蛋白以分泌表达形式存在于培养基中，12,000g、4℃离心4min，得上清液，并以此为纯化初始液。
如果表达产物是His6-ApoLp-Ⅲ，直接将纯化初始液上样于0.05M Tris-HCl(pH8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)进行洗脱并收获该洗脱液。该表达产物为His6-ApoLp-Ⅲ。纯化后的电泳鉴定结果如图4-泳道1。
如果表达产物是ApoLp-Ⅲ，采用实施例1的方法、原理、策略等分离纯化获得重组ApoLp-Ⅲ。
实施例5：
利用哺乳动物细胞表达***获得重组ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段
本实施例列举描述哺乳动物表达***表达本发明ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
哺乳动物细胞表达***的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以pCDNA3.0(neo+)质粒、CHO-K1细胞为代表进行描述。
对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1和实施例2的方法、原理、策略等。
利用常规、通用的基因工程技术，将C型凝集素基因连接到pCDNA3.0(neo+)质粒中，构建pCDNA3.0(neo+)-His6-ApoLp-Ⅲ(或pCDNA3.0(neo+)-ApoLp-Ⅲ)重组表达质粒。将其转染哺乳动物细胞株CHO-K1，对转染成功细胞株于5％CO2培养箱中，37℃贴壁培养72h，收集细胞及培养液，经Western blot验证，N末端带有His6-tag的重组ApoLp-Ⅲ得以表达。
用15ul重组质粒pCDNA3.0(neo+)-His6-ApoLp-Ⅲ(或pCDNA3.0(neo+)-ApoLp-Ⅲ)转染8ml IMDM medium(含有CHO-K1cell，2X105cell/ml)，于37℃，15％CO2培养箱中，37℃贴壁培养72h。用0.25％胰蛋白酶消化细胞2～3min，使细胞悬浮，收集细胞。用5ml裂解液(NP40)使细胞裂解，12,000g、4℃离心5min，得上清液作为纯化初始液。
如果表达产物是His6-ApoLp-Ⅲ，直接将纯化初始液上样于0.05M Tris-HCl(pH8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02mol/L咪唑(pH 8.0)分别充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH8.0)进行洗脱并收获该洗脱液。该表达产物为His6-ApoLp-Ⅲ。纯化后的电泳鉴定结果如图4-泳道2。
如果表达产物是ApoLp-Ⅲ，采用实施例1的方法、原理、策略等分离纯化获得重组ApoLp-Ⅲ。
实施例6：
ApoLp-Ⅲ抗体的获得
按照常规、通用的抗体产生的技术，利用实施例1、3、4、5获得的各种ApoLp-Ⅲ作为抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的免疫***产生相应抗体。
利用常规、通用的抗体检测方法，检测被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清中ApoLp-Ⅲ抗体产生情况。
当被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛产生了ApoLp-Ⅲ抗体后，采用常规、通用的动物血清采集与存储方法，采集被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清并存储，该血清可以直接应用。
利用常规、通用的抗体分离纯化技术，如盐析、各种类型层析介质、抗体亲和层析介质等，从存储的含有ApoLp-Ⅲ抗体的血清中分离纯化不同纯度的ApoLp-Ⅲ抗体，直至获得电泳纯或HPLC纯的ApoLp-Ⅲ抗体，以适于不同要求的应用。
实施例7：
重组以及天然ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段的生物活性
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。本实施例中天然ApoLp-Ⅲ、重组ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段具有相同的生物活性。以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以天然ApoLp-Ⅲ、重组ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段的生物活性为核心与基础，进一步拓展天然ApoLp-Ⅲ、重组ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段的应用范围。
1.ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段与微生物相关分子模式的结合特异性
(1)采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测天然及重组ApoLp-Ⅲ(Met-组氨酸标签-ApoLp-Ⅲ成熟肽)对6种具有代表性的，可溶性微生物相关分子模式的识别能力。相同浓度的微生物相关分子模式被包被在 96孔板上，依次将重组及天然ApoLp-Ⅲ，高效纯化的兔源抗ApoLp-Ⅲ多克隆抗血清(一抗)以及偶联有辣根过氧化酶的山羊抗兔IgG(二抗)加入96孔板孵育并彻底洗涤未结合组分，最后加入辣根过氧化酶底物。孵育后，通过检测在450nm处底物显色情况，间接计算出ApoLp-Ⅲ与可溶性微生物相关分子模式的结合情况。如图5-A(1)所示，ApoLp-Ⅲ对6种可溶性PAMPs均有不同程度的识别，但从整体趋势看，ApoLp-Ⅲ对laminarin(β-1,3-glucan)和LTA识别能力最强，而对mannose和Lys-PGN识别能力最弱。同时，随着ApoLp-Ⅲ含量的增加，ApoLp-Ⅲ对6种PAMPs的结合能力也增加，当蛋白浓度达到5μg/孔以上时，随着蛋白浓度增加，A450值增加趋势缓慢，当蛋白浓度>10μg/孔时，A450趋于不变。
(2)采用微量热泳动仪(MST)检测三种ApoLp-Ⅲ类似物、活性片段：Met-His6标签-凝血酶酶切位点-ApoLp-Ⅲ成熟肽、Met-ApoLp-Ⅲ成熟肽-凝血酶酶切位点-GST标签、Met-ApoLp-Ⅲ全序列-His6标签对6种代表性、可溶性微生物相关分子模式的识别能力。相同浓度的微生物相关分子模式被包被在探头上，将上述三种ApoLp-Ⅲ类似物、活性片段分别与探头共孵育，通过测定样品在微观温度梯度场中分子的定向运动，检测三种ApoLp-Ⅲ类似物、活性片段与可溶性微生物相关分子模式的结合情况。如图5-A(2)所示，与阴性对照淀粉相比，在0.03ng/μl—1μg/μl浓度范围内，三种ApoLp-Ⅲ类似物、活性片段与6种可溶性PAMPs均有明显的识别结合作用。
(3)采用Western-blot方法检测三种ApoLp-Ⅲ类似物、活性片段：Met-GST标签-凝血酶酶切位点-ApoLp-Ⅲ成熟肽、Met-ApoLpⅢ全序列-凝血酶酶切位点-GST标签、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-ApoLp全序列与3种不溶性微生物相关分子模式的结合能力。相同浓度的三种ApoLp-Ⅲ类似物、活性片段与不溶性微生物相关分子模式共孵育后，分别取上清液(未结合部分)和沉淀(结合部分)进行SDS/PAGE，采用高效纯化的兔源抗ApoLp-Ⅲ多克隆抗血清检测ApoLp-Ⅲ与不可溶性微生物相关分子模式的结合情况。如图5-A(3)所示，ApoLp-Ⅲ对3种可溶性PAMPs均有结合能力。
2.ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段与典型微生物的结合特异性
本实验采用ELISA检测天然ApoLp-Ⅲ对4种微生物细胞的识别结合能力(毕赤酵母S.cerevisiae-真菌、白色念珠菌C.albican-真菌、金黄色葡萄球菌S.aureus-G+菌、大肠杆菌E.coli-G-菌)。相同浓度的微生物细胞被包被在96孔板上，与上述实验方法相同，间接计算出ApoLp-Ⅲ与微生物细胞的结合情况。如图5-B(1)所示，天然ApoLp-Ⅲ对4种微生物细胞均有不同程度的结合，但从整体趋势看，ApoLp-Ⅲ对白色念珠菌C.albican识别能力最强，对金黄色葡萄球菌S.aureus识别能力最弱。同时，随着ApoLp-Ⅲ含量的增加ApoLp-Ⅲ对4种微生物细胞的结合能力也增加，当蛋白浓度从0μg增加至5μg时，随着蛋白浓度增加，A450值增加趋势最明显，当蛋白浓度继续增加，达到约50μg/孔时，A450增加趋势趋于稳定，由此可以看出，随着蛋白浓度增加，ApoLp-Ⅲ对微生物细胞的结合能力也随之增强，同时这种结合能力也可被饱和。
采用相同试验方法，考察三种ApoLp-Ⅲ类似物、活性片段：Met-His6标签-凝血酶酶切位点-ApoLp-Ⅲ成熟肽、Met-ApoLp-Ⅲ成熟肽-凝血酶酶切位点-GST标签、Met-ApoLp-Ⅲ全序列-His6标签对6种微生物细胞的识别能力(毕赤酵母、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌)，如图5-B(2)所示，其试验结果与天然ApoLp-Ⅲ对微生物细胞的识别能力一致。
3.ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段对微生物的凝集作用
在0.1mM Ca2+存在的情况下，将10ul 100ug/ml重组His-ApoLp-Ⅲ(溶于PBS)与10ul溴乙锭染色的微生物细胞—大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、藤黄微球菌、白色念珠菌、绿脓杆菌(2×108个/ml)于室温下孵育30min。以牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照。取10ul孵育后的混合物置于载玻片上，在荧光显微镜下观察细胞凝集情况。如图6所示，重组His-ApoLp-Ⅲ对三种微生物具有明显的凝集作用。
4.参与昆虫的酚氧化酶原激活***以及激活Toll信号传递途径
根据“昆虫、昆虫血淋巴及其组装活性物和应用”(张嵘，专利申请号201210436927.0)，以及专利“β-1,3-葡聚糖识别蛋白及其制备方法和应用”张嵘，专利申请号201210437330.8)所述，昆虫体内存在受微生物及其相关分子模式诱导的酚氧化酶原激活***以及Toll信号传递途径。
考察ApoLp-Ⅲ结合微生物细胞后对pro-PO***的影响，如图7所示：3个阴性对照，即单纯柞蚕血淋巴、柞蚕血淋巴与重组ApoLp-Ⅲ孵育以及柞蚕血淋巴与抗ApoLp-Ⅲ抗体孵育对血淋巴pro-PO***几乎无影响，在图中省略显示，仅显示天然血淋巴与微生物细胞孵育以及血淋巴与微生物细胞和重组ApoLp-Ⅲ共孵育后产生PO活力柱状图，如图所示：额外加入重组蛋白后，PO活力激活程度均远远高于天然血淋巴被单纯微生物细胞激活产生PO活力的程度，且重组蛋白组产生的额外PO活力要远远高出天然血淋巴组200％以上(藤黄微球菌M.Luteus组除外)。
分别将重组ApoLp-Ⅲ、微生物细胞(大肠杆菌)以及重组ApoLp-Ⅲ和大肠杆菌的共孵育混合物分别注射5龄期柞蚕幼虫体内，经24h诱导后，提取各组柞蚕血淋巴，将诱导血淋巴与生长于固体LB培养基中的大肠杆菌共孵育，通过管碟法检测诱导血淋巴产生抑菌圈的大小，从而鉴定各组诱导血淋巴中抗菌(抑菌)物质含量的多少。如图8-(A)所示，作为阴性对照，单纯柞蚕血淋巴及昆虫生理盐水诱导的血淋巴几乎不存在抗菌物质；重组ApoLp-Ⅲ和微生物细胞(大肠杆菌)分别诱导产生的血淋巴的抑菌活性与单纯血淋巴产生的抑菌活力相比，均有明显提高；而重组ApoLp-Ⅲ和大肠杆菌的共孵育混合物所诱导产生的血淋巴抑菌活力与其他组产生的抑菌活力相比，抑菌效果更为显著。
以dsEGFP为阴性对照，采用显微注射法将ApoLp-Ⅲ特异性dsRNA导入柞蚕幼虫体内，再将微生物细胞(金黄色葡萄球菌)注射入柞蚕幼虫体内，经24h诱导后，收集脂肪体，测定抗菌物质的mRNA含量以判断ApoLp-Ⅲ对抗菌肽合成的影响。如图8-(B)所示，将ApoLp-Ⅲ特异性dsRNA导入柞蚕幼虫体内可显著降低ApoLp-Ⅲ的合成，且ApoLp-Ⅲ表达量的降低能够显著抑制Attacin、Cecropin B、Lysozyme等抗菌物质的合成。
上述实验结果表明：本发明专利的天然、重组ApoLp-Ⅲ以及其衍生物、类似物、活性片段作为昆虫体内模式识别蛋白与微生物及其分子模式结合后，可以激活昆虫体内酚氧化酶原激活***，也可激活Toll信号传递途径。
实施例8：
天然、重组ApoLp-Ⅲ以及其衍生物、类似物、活性片段及其抗体的应用
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以ApoLp-Ⅲ的生物活性为代表进行描述，ApoLp-Ⅲ衍生物、类似物、活性片段也具有相同的生物活性。同时也以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段及其抗体的生物活性为核心与基础，进一步拓展ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段及其抗体的应用范围。
1.ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段诱导昆虫产生抗菌肽
如实施例7中所描述，利用微生物或结合了微生物相关分子模式的ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段可以诱导昆虫产生抗菌肽。基于此，从产生抗菌肽的昆虫体内制备相应的抗菌肽，该抗菌肽可以用于医药领域。
2.ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段用于微生物的检测
如实施例7中所描述，ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段作为酚氧化酶原激活***的成分—起始激活因子，与微生物或其分子模式结合后，能够激活昆虫体内酚氧化酶原激活***(激活的酚氧化酶引发黑化)进而也激活Toll信号传递途径的生物活性。
取任何待检测真菌的样品，首先与ApoLp-Ⅲ包括及其衍生物、类似物、活性片段)混合，注入柞蚕 幼虫体内，在一定时间观察柞蚕黑化程度和死亡率；对照组是将同样剂量的待检测微生物的样品注入柞蚕幼虫体内，在相同时间观察柞蚕黑化程度和死亡率。实验组与对照组具有显著差异，表明检测样品中含有微生物或其相关分子模式。
同样，利用柞蚕血淋巴替代柞蚕观察血淋巴的黑化程度。在一定时间，实验组与对照组的黑化程度具有显著差异；或血淋巴黑化程度达到同一程度所需时间缩短并具有显著差异；表明检测样品中含有微生物或其相关分子模式。
3.ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段抗体的应用
针对实施例6获得的ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段作的抗体，利用免疫学以及分子生物学等常规、通用技术、方法等，通过ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段的抗体，用于鳞翅目昆虫样品的ApoLp-Ⅲ免疫检测。同样，也适用于从鳞翅目昆虫分离纯化制备ApoLp-Ⅲ过程中的免疫检测跟踪分析以及样品的定性、定量检测分析。此方面的实验已经在上述的天然、重组ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段分离纯化制备过程中的实施例应用。
将足够剂量的ApoLp-Ⅲ抗体首先注入柞蚕幼虫体内，再将脂磷壁酸注入该柞蚕幼虫体内后，脂磷壁酸并不能引发柞蚕的黑化乃至死亡；同样，用柞蚕血淋巴替代柞蚕，事先加入足够剂量的ApoLp-Ⅲ抗体也可以阻断柞蚕血淋巴的黑化。同理，如图9所示，将充分结合ApoLp-Ⅲ凝集素抗体的脂磷壁酸注入柞蚕幼虫体内，脂磷壁酸不引发柞蚕的黑化乃至死亡；同样，用柞蚕血淋巴替代柞蚕，充分结合ApoLp-Ⅲ蛋白抗体的脂磷壁酸也不引发柞蚕血淋巴的黑化。以其他类型微生物相关分子模式代替脂磷壁酸重复上述试验，均可得到相同的试验结果，说明ApoLp-Ⅲ抗体可以抑制由微生物及其相关分子模式诱导的酚氧化酶原激活***的激活。
在任何待检测微生物的样品中，加入足够剂量的ApoLp-Ⅲ抗体。按照本实施例中的ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段用于微生物的检测所述方法，进行待检测样品的微生物检测。同上结果，即便是样品中有能够被检测出微生物的量也不能检测出(阴性结果)，此实验的设计作为样品微生物检测的阴性对照组加以应用。
上述结果表明：ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段的抗体，通过与ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段的结合而屏蔽了与微生物及其相关分子模式的结合生物活性，从而使ApoLp-Ⅲ及其衍生物、类似物、活性片段失去了原有的生物活性。基于这种结合屏蔽作用原理可以广泛应用。
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Claims (13)

1.天然载脂蛋白-Ⅲ，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID：2所示。
2.如权利要求1所述的天然载脂蛋白-Ⅲ，其特征在于：编码氨基酸序列的基因序列如SEQ ID：1所示。
3.天然载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物、重组载脂蛋白-Ⅲ、重组载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物，其特征在于：选自：Met-载脂蛋白-Ⅲ成熟肽、Met-组氨酸标签-载脂蛋白-Ⅲ成熟肽、Met-载脂蛋白-Ⅲ成熟肽-His6标签、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-载脂蛋白-Ⅲ成熟肽、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-载脂蛋白-Ⅲ成熟肽、Met-载脂蛋白-Ⅲ成熟肽-凝血酶酶切位点-GST标签、Met-His6标签-载脂蛋白-Ⅲ全序列、Met-载脂蛋白-Ⅲ全序列-His6标签、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-ApoLpⅢ全序列、Met-ApoLpⅢ全序列-凝血酶酶切位点-GST标签，所述天然载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或活性片段、重组载脂蛋白-Ⅲ、重组载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或活性片段的核苷酸序列是SEQ ID NO：1，氨基酸序列是SEQ ID：2。
4.如权利要求1或2所述的天然载脂蛋白-Ⅲ的制备方法，其特征在于：利用鳞翅目天蚕蛾科昆虫的血淋巴，以昆虫血液或血细胞裂解物和淋巴液的混合物、昆虫压榨或匀浆的体液作为分离纯化的原料液；该原料液经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化载脂蛋白-Ⅲ活性组分；再通过离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤分离纯化方法中的两个或多个的组合以及其分离纯化方法顺序的重排组合，分离纯化获得载脂蛋白-Ⅲ的纯度可以到达电泳纯乃至HPLC纯，所述的离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤方法中(1)操作温度在0℃-45℃；(2)溶液的酸碱度在pH2-pH10；(3)调节溶液酸碱度的试剂是常规、通用的酸、碱、酸溶液或碱溶液；(4)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液；(5)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L-0.5mol/L。
5.如权利要求1或2所述的天然载脂蛋白-Ⅲ的制备方法，其特征在于：利用鳞翅目天蚕蛾科昆虫的血淋巴，以昆虫血液或血细胞裂解物和淋巴液的混合物、昆虫压榨或匀浆的体液作为分离纯化的原料液；该原料液经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化载脂蛋白-Ⅲ活性组分；再通过离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤分离纯化方法中的两个或多个的组合以及其分离纯化方法顺序的重排组合，分离纯化获得载脂蛋白-Ⅲ的纯度可以到达电泳纯乃至HPLC纯，所述的离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤方法中(1)操作温度在0℃-10℃；(2)溶液的酸碱度在pH4-pH9；(3)调节溶液酸碱度的试剂为酸溶液或碱溶液，酸或酸溶液为HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸或它们的溶液，碱或碱溶液为NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂或它们的溶液；(4)缓冲液是柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对或上述各缓冲离子的组合；(5)溶液或缓冲液的离子强度在0.01mol/L-0.1mol/L。
6.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述的鳞翅目天蚕蛾科昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕，所述的昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。
7.权利要求1或2所述的天然载脂蛋白-Ⅲ或权利要求3所述的天然载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物的重组表达产物的基因表达方法，其特征在于，它包括(1)利用基因工程技术表达天然载脂蛋白-Ⅲ、天然载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或活性片段(2)从上述表达体系中分离纯化重组的天然载脂蛋白-Ⅲ、重组的天然载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或活性片段，上述表达产物经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化重组天然载脂蛋白-Ⅲ、重组的天然载脂蛋白-Ⅲ衍生物活性组分，上述表达产物通过离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化方法中两个或几个分离纯化方法的组合以及分离纯化方法顺序的重排组合获得电泳纯至HPLC纯度的重组天然载脂蛋白-Ⅲ、重组天然载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或活性片段。
8.如权利要求7所述的基因表达方法，其特征在于，所述的基因表达体系包括(1)原核生物***的表达载体，表达宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞，(2)酵母细胞***的表达载体，表达宿主细胞为酵母细胞，(3)昆虫细胞***的表达载体，表达宿主细胞为昆虫细胞，(4)哺乳动物细胞***的表达载体，表达宿主细胞为哺乳动物细胞，(5)上述表达形式为细胞内表达或分泌形式表达，(6)上述表达体系中的表达产物作为制备重组载脂蛋白-Ⅲ、重组载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或活性片段的来源。
9.权利要求1或2所述的天然载脂蛋白-Ⅲ或权利要求3所述的天然载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物、重组载脂蛋白-Ⅲ、重组载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物的抗体，其特征在于，以载脂蛋白-Ⅲ、载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或活性片段地、重组载脂蛋白-Ⅲ、重组载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或活性片段作为抗原。
10.权利要求1或2所述的天然载脂蛋白-Ⅲ、权利要求3所述的天然载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物、重组载脂蛋白-Ⅲ、重组载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或权利要求9所述的抗体在微生物检测中的应用。
11.权利要求1或2所述的天然载脂蛋白-Ⅲ、权利要求3所述的天然载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物、重组载脂蛋白-Ⅲ、重组载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或权利要求9所述的抗体在微生物相关分子模式的检测中的应用。
12.权利要求1或2所述的天然载脂蛋白-Ⅲ、权利要求3所述的天然载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物、重组载脂蛋白-Ⅲ、重组载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或权利要求9所述的抗体在载脂蛋白-Ⅲ、载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物、重组载脂蛋白-Ⅲ、重组载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物的检测与追踪中的应用。
13.权利要求1或2所述的天然载脂蛋白-Ⅲ、权利要求3所述的天然载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物、重组载脂蛋白-Ⅲ、重组载脂蛋白-Ⅲ衍生物或类似物或权利要求9所述的抗体在制备昆虫抗菌肽合成诱导剂中的应用。
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