CN107121771A - 自适应光学聚焦干涉补偿方法与*** - Google Patents

自适应光学聚焦干涉补偿方法与*** Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种自适应光学聚焦干涉补偿方法与***。本发明先通过在样品内激发出的荧光被光电倍增管接收，记此时聚焦中心光强为阈值；将数字微镜器件置于物镜后瞳面的共轭面上，并对其分区，每个分区依次将该区入射光束反射到旁侧光路，使其相位补偿之后回到正侧光路，同时保持其他分区光束不变；光电倍增管记录分区光束相位改变后的聚焦中心光强；标记光强大于等于阈值的分区，获得补偿分区；数字微镜器件加载补偿分区后光束再次聚焦，在样品内形成中心光强更强的光斑。本发明从光学干涉原理出发，能够快速改善散射介质内部聚焦光斑的质量，为光遗传学与活体深层高分辨率光学显微成像技术提供了新思路。

Description

自适应光学聚焦干涉补偿方法与***
技术领域
本发明属于光遗传学与光学显微成像领域，特别涉及了一种自适应光学聚焦干涉补偿方法与***，并应用于新一代非侵入性光遗传学光刺激与活体深穿透光学显微成像。
背景技术
在生物医学光学领域，光学散射是制约光学成像质量的主要因素。多数深部组织成像的光学技术(例如，激光共聚焦成像，双光子显微镜和光学相干层析扫描)主要利用非散射光子(即弹道光子)成像。弹道光子的数量随深度增加呈指数式衰减，因此将光学聚焦范围限制在了1mm的深度。
光遗传学技术需要对特定的神经元进行光刺激，以研究其神经环路机理。但是传统的光纤植入式光遗传学对活体生物的损伤严重，不利于长期研究。早先应用在天文学中的自适应光学技术，为实现深层生物组织光刺激与成像提供了新的技术支持。
现有的非侵入式自适应光遗传学技术是基于自适应光学的精确相位校正，通过将空间光调制器分成若干分区，依次等间隔改变分区内的光束附加相位，探测其最佳光学聚焦相位。每个分区依次循环迭代，从而获得最终校正相位，对入射光束进行相位补偿，从而校正其畸变相位，形成良好光学聚焦。
但是以上精确相位校正需要消耗大量的时间，为了获得更好地光学校正，就需要划分更多的分区与更细的相位间隔。由于空间光调制器的图像刷新率较低，导致光学校正消耗大量时间，不利于活体生物中进行实时光遗传学刺激和实时高分辨率光学成像，制约了自适应光遗传技术和显微技术的推广。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明目的在于利用图像刷新率较高的数字微镜器件解决传统自适应光遗传学中空间光调制器耗时较长的问题。从光学干涉原理出发，将光束分为若干区域，并探测各分区内光束对聚焦中心的干涉作用。通过保留对聚焦中心干涉相长的区域内的光束，同时对聚焦中心干涉相消的区域内的光束附加相位差π，使其满足干涉相长条件并将其再次引入光路中。通过将原本对聚焦光斑中心起到负面作用的干涉相消的光束转为能够干涉相长的光束，使得光束得到充分利用，从而提升了光学聚焦的质量，缩短了自适应光刺激的校正时间。
为了实现上述目的，本发明的技术方案包括以下步骤：
一、一种自适应光学聚焦干涉补偿方法：
1)物镜的焦平面处不放置实验样品，用无加载分区的数字微镜器件进行光束聚焦，在物镜的焦平面处得到理想聚焦光斑，记录理想聚焦光斑的聚焦中心位置Of；
2)将实验样品置于物镜的焦平面处，用无加载分区的数字微镜器件进行光强探测，记录获得聚焦中心位置Of的光强值，作为光强阈值Ith；
3)将数字微镜器件的反射面分为多块区域，以每一区域依次作为目标区域，对目标区域的反射光束进行相位补偿，遍历各个区域用加载分区的数字微镜器件进行光强探测，获得各个区域对应记录到的聚焦中心位置Of处的一系列光强值；
4)将每一光强值与光强阈值Ith进行比较，并采用以下方式处理得到判断结果：
若光强值小于光强阈值Ith，则该光强值对应的区域为不需相位补偿区域；
若光强值大于等于光强阈值Ith，则该光强值对应的区域为需相位补偿区域；
5)将根据判断结果调整分区并加载到数字微镜器件上进行光强探测，在实验样品内形成干涉补偿后的最终光学聚焦补偿光斑，在聚焦中心位置为Of处激发出更强的荧光。
所述步骤1)中的光束聚焦具体是：激光器发射出光束，经过准直扩束后，在数字微镜器件上反射，然后经过物镜聚焦。
所述步骤3)中所指的相位补偿具体是指，在光束的原相位上附加一个数值为π的相位差。
所述步骤2)、3)和5)中的光强探测具体是：激光器发射出光束，经过准直扩束后，在数字微镜器件上反射，然后经过物镜聚焦到样品上，样品带有荧光材料，在样品内产生畸变散射光斑并激发出荧光，激发出的荧光再经透镜聚焦后由光电倍增管和振镜配合进行扫描探测获得散射光斑激发出的荧光图像，记录聚焦中心位置Of的光强值。
所述步骤3)用加载分区的数字微镜器件进行光强探测具体是指光强探测时，数字微镜器件上的目标区域将自身接收入射光束后产生的反射光束调整反射角度，使反射光束到旁侧光路进行相位补偿后再回到未调整反射角度前的反射光路中，同时除目标区域以外的其他区域保持反射光束的反射角度与所述步骤2)光强探测时反射光束的反射角度相同。
所述步骤5)根据判断结果补偿分区具体是指：经过数字微镜器件时，判断后需相位补偿区域将自身接收入射光束后产生的反射光束调整反射角度，使反射光束到旁侧光路进行相位补偿后再回到未调整反射角度前的反射光路中，同时判断后不需相位补偿区域保持反射光束的反射角度与所述步骤2)光强探测时反射光束的反射角度相同。
所述的荧光材料包括荧光蛋白、荧光小球或者荧光染料。
所述实验样品为但不限于活体生物组织、离体生物组织、含小球的琼脂块等。
所述步骤3)中将数字微镜器件的反射面分为多块区域具体是指将数字微镜器件的微镜像素元以n×n方式均匀分区，从而将准直扩束后的入射光束分为对应的n×n个光束单元。
二、一种自适应光学聚焦干涉补偿***：
***包括激光器、光束准直扩束模块、数字微镜器件、相位补偿模块、分束器、缩束模块、扫描模块、二向色镜、显微物镜、实验样品和光强探测模块。光束准直扩束模块布置在激光器之后，激光器发射出光束经准直扩束模块平行扩束并空间滤波后入射到数字微镜器件，数字微镜器件旁侧出射端前方置有相位补偿模块，数字微镜器件正侧出射端置有分束器和缩束模块，相位补偿模块位于分束器的旁侧处，数字微镜器件的旁侧反射光束经相位补偿模块后再反射到分束器中，数字微镜器件的正侧反射光束直接反射到分束器中；缩束模块前方设有二向色镜；光束经二向色镜反射后经过扫描模块进入显微物镜聚焦，实验样品位于显微物镜焦平面上；实验样品内激发出的荧光经过显微物镜与扫描模块后透过二向色镜被光强探测模块接收进行光强探测。
所述的光束准直扩束模块包括前光束准直扩束模块透镜、光束空间滤波器和后光束准直扩束模块透镜；前光束准直扩束模块透镜、光束空间滤波器和后光束准直扩束模块透镜依次平行布置在激光器出射端的前方，入射光束依次经前光束准直扩束模块透镜、光束空间滤波器和后光束准直扩束模块透镜平行扩束后入射到数字微镜器件。
所述的相位补偿模块包括但不限于光学延迟线、空间光调制器、相位延迟片等。
所述的缩束模块包括前缩束模块透镜和后缩束模块透镜；前缩束模块透镜和后缩束模块透镜依次平行布置在分束器的前侧，数字微镜器件反射的光束依次经前缩束模块透镜和后缩束模块透镜平行缩束后入射到二向色镜的旁侧。
所述的扫描模块包括前扫描振镜、前光束准直透镜、后光束准直透镜、后扫描振镜、前扫描模块透镜和后扫描模块透镜；前扫描振镜、前光束准直透镜、后光束准直透镜、后扫描振镜、前扫描模块透镜和后扫描模块透镜依次布置在二向色镜的前侧，二向色镜反射的光束依次经前扫描振镜、前光束准直透镜、后光束准直透镜、后扫描振镜、前扫描模块透镜和后扫描模块透镜后入射到显微物镜。
所述的光强探测模块包括光学滤波器、聚焦透镜、空间滤波器和光电倍增管；光学滤波器、聚焦透镜、空间滤波器和光电倍增管依次布置在二向色镜的后侧，实验样品发出的荧光依次经显微物镜、后扫描模块透镜、前扫描模块透镜、后扫描振镜、后光束准直透镜、前光束准直透镜、前扫描振镜、二向色镜、光学滤波器、聚焦透镜和空间滤波器后进入光电倍增管进行光强探测。
本发明的有益效果是：
本发明利用数字微镜器件实现了简易的自适应光学聚焦补偿，利用数字微镜器件快速的图像刷新速率，克服了以往利用空间光调制器进行串行相位校正时速度慢的问题，提升了光学聚焦与光学刺激的速度。
本发明基于光学干涉成像原理，通过数字微镜器件判断出对聚焦光斑有干涉相消作用的分区光束，并将在其相位上附加值为π的相位差，使其满足干涉相长的条件，从而使得聚焦中心的光强显著提升，提高了强散射介质内部光学聚焦的质量。
本发明使用数字微镜器件进行自适应光学校正，且有多种简便方式实现相位补偿，降低了实验成本，更利于方法与***在研究实验中的应用。
并且本发明可方便地与已有的各种显微成像技术相结合，有助于非光纤植入式光遗传学光刺激技术发展，实现大脑深处同步的光刺激与显微成像，推动脑科学研究进展。
附图说明
图1为本发明***的结构示意图；
图2为实施例中无数字微镜器件校正时的散射聚焦光斑图像；
图3为实施例中数字微镜器件分区依次补偿后所得光强值与阈值的比较图；
图4为实施例中数字微镜器件判断后需要补偿的分区相位分布图；
图5为实施例中对所有需要补偿的分区进行相位补偿后的聚焦光斑图像。
具体实施方式
以下自适应光学聚焦补偿实施例可以更详细的说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
本发明的实施例及其具体过程如下：
如图1所示，本发明***包括激光器1、前光束准直扩束模块透镜2、光束空间滤波器3和后光束准直扩束模块透镜4、数字微镜器件5、相位补偿模块6、分束器7、前缩束模块透镜8和后缩束模块透镜9、二向色镜10、前扫描振镜11、前光束准直透镜12、后光束准直透镜13、后扫描振镜14、前扫描模块透镜15和后扫描模块透镜16、显微物镜17、实验样品18、光学滤波器19、聚焦透镜20、空间滤波器21和光电倍增管22。
(1)激光器1发出的光束依次经过前光束准直扩束模块透镜2、光束空间滤波器3和后光束准直扩束模块透镜4进行扩束后，照射到数字微镜器件5上。在数字微镜器件5无加载图像且不加载实验样品18时，光束被反射经过分束器7、前缩束模块透镜8和后缩束模块透镜9，照射到二向色镜10的侧面被反射，反射光束经过前扫描振镜11、前光束准直透镜12、后光束准直透镜13、后扫描振镜14、前扫描模块透镜15和后扫描模块透镜16后进入显微物镜17，并在焦平面处形成理想的聚焦光斑，记聚焦光斑中心在焦平面的位置为Of。
(2)加载实验样品18，数字微镜器件5无加载图像时，激光器1发出的光束依次经过前光束准直扩束模块透镜2、光束空间滤波器3和后光束准直扩束模块透镜4进行扩束后，照射到数字微镜器件5上，光束被反射经过分束器7、前缩束模块透镜8和后缩束模块透镜9，照射到二向色镜10的侧面被反射，反射光束经过前扫描振镜11、前光束准直透镜12、后光束准直透镜13、后扫描振镜14、前扫描模块透镜15和后扫描模块透镜16后进入显微物镜17，并在实验样品18内焦平面处形成畸变的散射聚焦光斑，并激发出荧光。
(3)荧光从实验样品18内发射进入显微物镜17，然后依次经过后扫描模块透镜16、前扫描模块透镜15、后扫描振镜14、后光束准直透镜13、前光束准直透镜12、前扫描振镜11、二向色镜10、光学滤波器19、聚焦透镜20和空间滤波器21后进入光电倍增管22进行光强探测，通过扫描得到无数字微镜器件校正时的散射聚焦光斑图像，如图2所示。记此时Of对应位置的光强值Ith为光强阈值。在本具体实施案例中由于光强最强点偏移，Of对应位置的光强值Ith为15.76。
(4)在本具体实施案例中将数字微镜器件的微镜像素元以32×32方式均匀分为1024个区域，从而将准直扩束后的入射光束分为对应的1024个光束单元。一个分区内的微镜同时向同一方向偏转，将该区光束反射至旁侧光路的相位补偿模块6，使其相位改变π之后回到原反射光路，与此同时，其他分区内的微镜保持不变，使得其光束形成光学聚焦，即仅去除一个分区内的光束，而保持其余1023个分区的光束不变，由光电倍增管记录在Of处的荧光光强值。所有分区依次重复上述步骤直到记录所有分区对应的光强值。
(5)将步骤(4)所得1024个光强值与步骤(3)所得光强阈值Ith相比较，得到如图3所示光强比较图。保持光强值小于阈值的分区不变并将光强值大于等于阈值的分区标记为补偿分区，得到补偿分区图像。在本具体实施案例中数字微镜器件分区依次补偿后所得光强值与阈值的比较图如图3所示；所需补偿的分区相位分布图如图4所示。
(6)将补偿分区图像加载到到数字微镜器件5上，入射光束经前光束准直扩束模块透镜2、光束空间滤波器3和后光束准直扩束模块透镜4进行扩束后，照射到数字微镜器件5上，需要补偿的分区对应的光束被反射至旁侧光路的相位补偿模块6上，从而发生π的相位差改变，并回到分束器7中与被保留的分区对应的光束一起经过前缩束模块透镜8和后缩束模块透镜9，照射到二向色镜10的侧面被反射，反射光束经过前扫描振镜11、前光束准直透镜12、后光束准直透镜13、后扫描振镜14、前扫描模块透镜15和后扫描模块透镜16后进入显微物镜17，并在实验样品18内焦平面处形成最终的光学聚焦补偿光斑，并激发更强的荧光。在本具体实施案例中所用相位补偿模块为光学延迟线。
(7)经过光学聚焦补偿后激发的荧光从实验样品18内发射进入显微物镜17，然后依次经过后扫描模块透镜16、前扫描模块透镜15、后扫描振镜14、后光束准直透镜13、前光束准直透镜12、前扫描振镜11、二向色镜10、光学滤波器19、聚焦透镜20和空间滤波器21后进入光电倍增管22进行光强探测，通过扫描得到数字微镜器件5加载补偿分区进行补偿后的聚焦光斑图像，如图5所示，在本具体实施案例中该图像Of位置对应的光强值为202.2。
传统的最优化自适应光学聚焦技术采用空间光调制器进行相位的逐次校正。假设将空间光调制器分成32×32个分区，每个分区从0到2π以π/5的间隔依次改变对应光束的相位，从而获得具有最好校正效果的相位值。假设空间光调制器工作时的图像加载速率上限为60Hz，则完成一次光学聚焦相位探测所需要的时间为：
而本发明所使用的数字微镜器件的图像刷新率上限为22727Hz，同样将其分为32×32个分区，其完成一次光束聚焦增强分区的判断时间为：
由于最优化自适应光学聚焦技术需要多次迭代运算，完成光束聚焦校正的时间较长。而本发明利用数字微镜器件快速的图像刷新率，极大地减少了光束聚焦增强所需要的处理时间，显著提升了光学聚焦补偿的处理速度。
由上述实施例可见，本发明自适应光学聚焦干涉补偿方法与***简单、便捷，能够在简单、快速的串行光束判断之后，将目标聚焦点的光强提升约1183％。相比于利用空间光调制器进行逐次相位校正，本发明能够在提升聚焦光斑中心光强的同时缩短校正时间，为非光纤植入式光遗传学光刺激与深穿透实时成像提供了更低成本更便捷的实验技术，提升了实验效率。

Claims (10)

1.一种自适应光学聚焦干涉补偿方法，其特征在于包括以下步骤：
1)物镜的焦平面处不放置实验样品，用无加载分区的数字微镜器件(5)进行光束聚焦，在物镜的焦平面处得到理想聚焦光斑，记录理想聚焦光斑的聚焦中心位置Of；
2)将实验样品置于物镜的焦平面处，用无加载分区的数字微镜器件(5)进行光强探测，记录获得聚焦中心位置Of的光强值，作为光强阈值Ith；
3)将数字微镜器件(5)的反射面分为多块区域，以每一区域依次作为目标区域，对目标区域的反射光束进行相位补偿，遍历各个区域用加载分区的数字微镜器件(5)进行光强探测，获得各个区域对应记录到的聚焦中心位置Of处的一系列光强值；
4)将每一光强值与光强阈值Ith进行比较，并采用以下方式处理得到判断结果：
若光强值小于光强阈值Ith，则该光强值对应的区域为不需相位补偿区域；
若光强值大于等于光强阈值Ith，则该光强值对应的区域为需相位补偿区域；
5)将根据判断结果补偿分区并加载到数字微镜器件上进行光强探测，在实验样品内形成干涉补偿后的最终光学聚焦补偿光斑，在聚焦中心位置为Of处激发出更强的荧光。
2.根据权利要求1所述的一种自适应光学聚焦干涉补偿方法，其特征在于：
所述步骤1)中的光束聚焦具体是：激光器发射出光束，经过准直扩束后，在数字微镜器件(5)上反射，然后经过物镜聚焦。
3.根据权利要求1所述的一种自适应光学聚焦干涉补偿方法，其特征在于：所述步骤3)中所指的相位补偿具体是指，在光束的原相位上附加一个数值为π的相位差。
4.根据权利要求1所述的一种自适应光学聚焦干涉补偿方法，其特征在于：
所述步骤2)、3)和5)中的光强探测具体是：激光器发射出光束，经过准直扩束后，在数字微镜器件上反射，然后经过物镜聚焦到样品上，样品带有荧光材料，在样品内产生畸变散射光斑并激发出荧光，激发出的荧光再经透镜聚焦后由光电倍增管(22)和振镜配合进行扫描探测获得散射光斑激发出的荧光图像，记录聚焦中心位置Of的光强值。
5.根据权利要求1所述的一种自适应光学聚焦干涉补偿方法，其特征在于：
所述步骤3)用加载分区的数字微镜器件(5)进行光强探测具体是指光强探测时，数字微镜器件上的目标区域将自身接收入射光束后产生的反射光束调整反射角度，使反射光束到旁侧光路进行相位补偿后再回到未调整反射角度前的反射光路中，同时除目标区域以外的其他区域保持反射光束的反射角度与所述步骤2)光强探测时反射光束的反射角度相同。
6.根据权利要求1所述的一种自适应光学聚焦干涉补偿方法，其特征在于：
所述步骤5)根据判断结果调整分区具体是指：经过数字微镜器件时，判断后需相位补偿区域将自身接收入射光束后产生的反射光束调整反射角度，使反射光束到旁侧光路进行相位补偿后再回到未调整反射角度前的反射光路中，同时判断后不需相位补偿区域保持反射光束的反射角度与所述步骤2)光强探测时反射光束的反射角度相同。
7.根据权利要求1所述的一种自适应光学聚焦干涉补偿方法，其特征在于：
所述实验样品为但不限于活体生物组织、离体生物组织、含小球的琼脂块等。
8.用于实施权利要求1所述方法的一种自适应光学聚焦干涉补偿***，其特征在于：包括激光器(1)、光束准直扩束模块、数字微镜器件(5)、相位补偿模块(6)、分束器(7)、缩束模块、扫描模块、二向色镜(10)、显微物镜(17)、实验样品(18)和光强探测模块；光束准直扩束模块布置在激光器(1)之后，激光器发射出光束经准直扩束模块平行扩束并空间滤波后入射到数字微镜器件(5)，数字微镜器件(5)旁侧出射端置有相位补偿模块(6)，数字微镜器件(5)正侧出射端置有分束器(7)和缩束模块，相位补偿模块(6)位于分束器(7)的旁侧处，数字微镜器件(5)的旁侧反射光束经相位补偿模块(6)后再反射到分束器(7)中，数字微镜器件(5)的正侧反射光束直接反射到分束器(7)中；缩束模块前方设有二向色镜(10)；光束经二向色镜(10)反射后经过扫描模块进入显微物镜(17)聚焦，实验样品(18)位于显微物镜(17)焦平面上；实验样品(18)内激发出的荧光经过显微物镜(17)与扫描模块后透过二向色镜(10)被光强探测模块接收进行光强探测。
9.根据权利要求8所述的一种自适应光学聚焦干涉补偿***，其特征在于：所述的光束准直扩束模块包括前光束准直扩束模块透镜(2)、光束空间滤波器(3)和后光束准直扩束模块透镜(4)；前光束准直扩束模块透镜(2)、光束空间滤波器(3)和后光束准直扩束模块透镜(4)依次平行布置在激光器(1)出射端的前方，入射光束依次经前光束准直扩束模块透镜(2)、光束空间滤波器(3)和后光束准直扩束模块透镜(4)平行扩束后入射到数字微镜器件(5)；
所述的缩束模块包括前缩束模块透镜(8)和后缩束模块透镜(9)；前缩束模块透镜(8)和后缩束模块透镜(9)依次平行布置在分束器(7)的前侧，数字微镜器件(5)反射的光束依次经分束器(7)、前缩束模块透镜(8)和后缩束模块透镜(9)平行缩束后入射到二向色镜(10)的旁侧；
所述的扫描模块包括前扫描振镜(11)、前光束准直透镜(12)、后光束准直透镜(13)、后扫描振镜(14)、前扫描模块透镜(15)和后扫描模块透镜(16)；前扫描振镜(11)、前光束准直透镜(12)、后光束准直透镜(13)、后扫描振镜(14)、前扫描模块透镜(15)和后扫描模块透镜(16)依次布置在二向色镜(10)的前侧，二向色镜(10)反射的光束依次经前扫描振镜(11)、前光束准直透镜(12)、后光束准直透镜(13)、后扫描振镜(14)、前扫描模块透镜(15)和后扫描模块透镜(16)后入射到显微物镜(17)；
所述的光强探测模块包括光学滤波器(19)、聚焦透镜(20)、空间滤波器(21)和光电倍增管(22)；光学滤波器(19)、聚焦透镜(20)、空间滤波器(21)和光电倍增管(22)依次布置在二向色镜(10)的后侧，实验样品(18)发出的荧光依次经显微物镜(17)、后扫描模块透镜(16)、前扫描模块透镜(15)、后扫描振镜(14)、后光束准直透镜(13)、前光束准直透镜(12)、前扫描振镜(11)、二向色镜(10)、光学滤波器(19)、聚焦透镜(20)和空间滤波器(21)后进入光电倍增管(22)进行光强探测。
10.根据权利要求8所述的一种自适应光学聚焦干涉补偿***，其特征在于：所述的相位补偿模块(6)包括但不限于光学延迟线、空间光调制器、相位延迟片。
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