CN107118361B - 一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶及其制备方法。所述复合凝胶主要由丝素蛋白和羧甲基壳聚糖的成分构成，质量比为(0.05～2)：1；方法是先用茧层处理获得丝素纤维，然后制备获得丝素溶液，制得羧甲基壳聚糖溶液，将丝素溶液和羧甲基壳聚糖溶液混合均匀得到混合溶液；加入一定量的交联剂，再将溶液在磁力搅拌器上搅拌短时间后立即倒入模具中静置；再浸入乙醇水溶液中，最终得到丝素/羧甲基壳聚糖复合凝胶。本发明以较简单的工艺、较短的时间制备出具有较强力学性能和较好稳定性的凝胶，为改善丝素蛋白复合凝胶的制备方法提供新的思路，也进一步拓展了丝素蛋白的应用途径。

Description

一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于一种再生丝素溶液的加工工艺，具体地说，是一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶及其制备方法。
背景技术
近来，凝胶材料在生物医学领域异军突起，被用于组织工程支架、药物输送载体和创伤敷料等领域，得到科研人员的青睐，许多研究者将凝胶原料锁定再生丝素蛋白这种廉价易得、生物相容好、安全性能高的天然高分子生物材料。再生丝素蛋白溶液是一种热力学不稳定的增液溶胶，在没有任何外部作用的情况下，会由无规卷曲结构向β-折叠结构转变，自发地转变为凝胶状态。一般情况下，这种转变需要的时间达1～2个月，且得到的凝胶力学性能极差，大大限制了丝素蛋白凝胶作为一种优良生物材料的应用。丝素蛋白凝胶材料的改性成为研究热点，主要是为了提高凝胶的力学性能和稳定性。但目前还没有一种方法制得的丝素凝胶能以较简单的工艺、较短的凝胶时间呈现出较高的力学性能。羧甲基壳聚糖是一种水溶性的壳聚糖衍生物，羧甲基壳聚糖类复合材料具有引导神经再生、防止组织黏连、促进伤口愈合、减少瘢痕形成等优点，但用其做成的凝胶材料吸水能力过强，质脆易碎，很难在临床医学领域大规模应用。
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)具有活化羧基的特性，因其具有反应条件温和，产率高，选择性好，对环境友好等特点，作为缩合剂和交联剂在高分子改性中得到普遍应用([J]Desalination，2008，234：134-143)。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明旨在提供了一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶及其制备方法，工艺简单、耗时短，复合凝胶具有优异的力学性能。
本发明所采用的技术方案包括如下步骤：
一、一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶：
所述复合凝胶主要由丝素蛋白和羧甲基壳聚糖的成分构成。
所述复合凝胶中，丝素蛋白和羧甲基壳聚糖的质量比为(0.05～2)：1，优选的是(0.5～2)：1。
二、一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶的制备方法：
将脱胶得到的丝素纤维在LiBr溶液中进行溶解处理，并通过透析制得再生丝素溶液，再将其与羧甲基壳聚糖溶液混合，然后加入交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，最终在乙醇的作用下制备成丝素/羧甲基壳聚糖复合水凝胶。
所述方法具体过程如下：
(1)用茧层处理获得丝素纤维，然后制备获得丝素溶液；
(2)将羧甲基壳聚糖溶于水中，制得羧甲基壳聚糖溶液；
(3)将步骤(1)中得到的丝素溶液和步骤(2)中得到的羧甲基壳聚糖溶液混合均匀得到混合溶液；
(4)在步骤(3)中得到的混合溶液中加入一定量的交联剂，再将溶液在磁力搅拌器上搅拌短时间后立即倒入模具中静置；
(5)再浸入乙醇水溶液中，最终得到丝素/羧甲基壳聚糖复合凝胶。
所述步骤(1)具体为：
(1)将茧层置于质量分数为0.5％的Na2CO3沸水溶液中脱胶两次，每次30min，得到的丝素纤维用去离子水冲洗后拧干，并在烘箱中烘干；
(2)将步骤(1)中得到的丝素纤维置于9M LiBr溶液中，在60℃条件下溶解处理4h，得到的液体经过滤后装入透析袋于去离子水中透析4d，期间不断换水，最后得到的丝素溶液。
所述步骤(1)的丝素溶液浓度为0.5～10％w/v，所述步骤(2)的羧甲基壳聚糖溶液浓度为1～5％w/v，所述步骤(3)中丝素溶液和羧甲基壳聚糖溶液的混合体积比为1:1。
最终能够使得混合后溶质丝素和羧甲基壳聚糖的质量比例要在(0.05～2)：1范围内。优选的所述丝素溶液和羧甲基壳聚糖溶液的浓度比为(0.1～2)：1。
所述羧甲基壳聚糖的脱乙酰度为55％～99％，取代度为60％～99％。
优选地，所述步骤(1)中丝素溶液的浓度为0.5～8％w/v，步骤(2)中羧甲基壳聚糖溶液的浓度为1～4％w/v，羧甲基壳聚糖的脱乙酰度为90％，取代度为90％。
更优选地，所述步骤(1)中丝素溶液的浓度分别为0.5～4％w/v以及步骤(2)中羧甲基壳聚糖溶液的浓度均为4％w/v。
作为最优选的，本发明丝素溶液的浓度为4％w/v以及羧甲基壳聚糖溶液的浓度为4％w/v，混合体积比为1:1，由此使得本发明中丝素和羧甲基壳聚糖溶液制备更为简单，且容易控制，混合更加均匀，得到的复合凝胶成型更好，力学性能更强，复合凝胶吸水性稳定性优异。
所述步骤(1)中透析袋的分子量8000～14000。
所述步骤(4)中，交联剂采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)的固体粉末，交联剂的加入量为体系的0.3～0.75％w/v。
体系是指步骤(4)获得的混合溶液。
优选地，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)的加入量为丝素蛋白/羧甲基壳聚糖溶液体系的0.45％～0.6％w/v。
更优选地，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)的加入量为丝素蛋白/羧甲基壳聚糖溶液体系的0.6％w/v。由此使得到的复合凝胶的交联效果优异，也不至于造成交联剂的过量。
所述交联剂的加入方式分两种：一种为固体粉末直接加入体系，一种为将固体粉末溶于水中再加入体系，只要保证交联剂粉末能够溶解且加入水的体积必须尽可能的小就可以。
作为优选，本发明所述步骤(5)中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)的加入方式为先将固体粉末溶于少量水中再加入体系，由此使得交联剂在混合溶液中的分布更均匀，反应会更迅速高效，得到的复合凝胶结构更加紧密，性能更优。
所述步骤(4)中，搅拌时间为20s，静置时间为6-12h；所述步骤(5)中，乙醇水溶液中的乙醇浓度是60～90％v/v，浸入乙醇水溶液的时间为12h。
优选地，所述步骤(4)中溶液体系倒入模具的静置时间为12h。
优选地，乙醇水溶液的乙醇浓度为75％v/v。
本发明的产物通过实施例测试获得了较高的力学性能和稳定的保水性能，弹性模量达到(363.94±45.57)kPa，压缩回复率达到100％，在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中体积相对稳定，溶胀率为(9.32±0.09)×100％。
本发明通过EDC·HCL的交联作用以及乙醇促使丝素蛋白发生β化转变的特点，促使丝素/羧甲基壳聚糖形成复合凝胶。以较简单的工艺、较短的时间制备出具有较强力学性能和较好稳定性的凝胶，为改善丝素蛋白复合凝胶的制备方法提供新的思路，也进一步拓展了丝素蛋白的应用途径。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、工艺简单：现有技术制备丝素蛋白复合凝胶往往需要有机溶剂、超声处理、光学交联等方法，而本发明在室温环境中即可完成；
2、凝胶时间短：现有技术制备丝素蛋白复合凝胶一般所需时间较长，而本发明只需1～2天左右，大大提高了效率；
3、本发明所需交联剂作为活性剂，可通过水洗法轻松除去，生物安全性高；
4、本发明制备出的复合凝胶具有较强的力学性能和良好吸水稳定性、保湿性，优于其他方法制备出的丝素蛋白复合凝胶。本发明制备的复合凝胶可用于医药卫生、组织工程、环境保护等领域，拓展了丝素蛋白的应用途径，也为制备高强度的复合凝胶提供了新思路和新方法。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1
本实施例中丝素/羧甲基壳聚糖复合凝胶的制备方法依次包括如下步骤。
(1)称取10g剪碎的茧层于质量分数为0.5％的Na2CO3沸水溶液中脱胶两次，每次30min，得到的丝素纤维用去离子水冲洗后拧干，并在烘箱中烘干；
(2)将步骤(1)中得到的丝素纤维置于9M LiBr溶液中，在60℃条件下溶解处理4h，得到的液体经过滤后装入透析袋(分子量8000～14000)于去离子水(3)将适量羧甲基壳聚糖(脱乙酰度90％，取代度90％)溶于水中，制得浓度为4％w/v的羧甲基壳聚糖溶液。
(4)将步骤(2)中得到的浓度为0.5％w/v的丝素溶液和步骤(3)中得到的浓度为4％w/v的羧甲基壳聚糖溶液按体积比1：1混合均匀，得到混合溶液。
(5)在步骤(4)中得到的混合溶液中加入一定量的交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)，加入方式分两种：一种为固体粉末直接加入体系，一种为先将固体粉末溶于少量水中再加入体系。交联剂加入量为体系的0.3～0.75％w/v，优选为0.45～0.6％w/v，最佳为0.6％w/v。交联剂的最佳加入方式为第二种。
(6)在磁力搅拌器不断搅拌下，将EDC·HCL加入丝素/羧甲基壳聚糖复合溶液，20s后，将溶液倒入模具，静置6～12h，最佳为12h。
(7)将其浸入60～90％v/v的乙醇水溶液中12h，乙醇最佳浓度为75％v/v，最终得到丝素/羧甲基壳聚糖复合凝胶。
(8)本实施例采用力学万能试验机(岛津，AGS-J系列)进行单轴压缩(压缩速率：1mm/min)来测定凝胶的力学性能。采用质量称重法测试凝胶的溶胀性能：首先将复合凝胶材料在去离子水或磷酸盐缓冲液中浸泡24h使其达到溶胀平衡,然后用滤纸吸去表面水分，称其质量为M1(g)，然后将复合凝胶置于60℃烘箱中烘干，测其质量为M2(g)。计算公式如下：溶胀率＝(M1-M2)/M2×100％。
该复合凝胶的弹性模量达到(29.46±16.70)kPa，压缩回复率达到100％。凝胶在去离子水中吸水溶胀率达到(103.63±4.91)×100％，在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中体积相对稳定，溶胀率为(20.79±2.64)×100％。
实施例2
本实施例中丝素/羧甲基壳聚糖复合凝胶的制备方法依次包括如下步骤。
(1)称取10g剪碎的茧层于质量分数为0.5％的Na2CO3沸水溶液中脱胶两次，每次30min，得到的丝素纤维用去离子水冲洗后拧干，并在烘箱中烘干；
(2)将步骤(1)中得到的丝素纤维置于9M LiBr溶液中，在60℃条件下溶解处理4h，得到的液体经过滤后装入透析袋(分子量8000～14000)于去离子水中透析4d，期间不断换水，最后得到的丝素溶液浓度为1.0％w/v。
(3)将适量羧甲基壳聚糖(脱乙酰度90％，取代度90％)溶于水中，制得浓度为4％w/v的羧甲基壳聚糖溶液。
(4)将步骤(2)中得到的浓度为1.0％w/v的丝素溶液和步骤(3)中得到的浓度为4％w/v的羧甲基壳聚糖溶液按体积比1：1混合均匀，得到混合溶液。
(5)在步骤(4)中得到的混合溶液中加入一定量的交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)，加入方式为先将固体粉末溶于少量水中再加入体系。交联剂加入量为体系的0.6％w/v。
(6)在磁力搅拌器不断搅拌下，将EDC·HCL加入丝素/羧甲基壳聚糖复合溶液，20s后，将溶液倒入模具，静置12h。
(7)将其浸入75％v/v的乙醇水溶液中12h，最终得到丝素/羧甲基壳聚糖复合凝胶。
(8)通过与实施例1相同方式进行测试，获得该复合凝胶的弹性模量达到(78.89±5.67)kPa，压缩回复率达到100％，凝胶在去离子水中吸水溶胀率达到(56.95±6.34)×100％，在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中体积相对稳定，溶胀率为(19.17±4.30)×100％。
实施例3
本实施例中丝素/羧甲基壳聚糖复合凝胶的制备方法依次包括如下步骤。
(1)称取10g剪碎的茧层于质量分数为0.5％的Na2CO3沸水溶液中脱胶两次，每次30min，得到的丝素纤维用去离子水冲洗后拧干，并在烘箱中烘干；
(2)将步骤(1)中得到的丝素纤维置于9M LiBr溶液中，在60℃条件下溶解处理4h，得到的液体经过滤后装入透析袋(分子量8000～14000)于去离子水中透析4d，期间不断换水，最后得到的丝素溶液浓度为1.5％w/v。
(3)将适量羧甲基壳聚糖(脱乙酰度90％，取代度90％)溶于水中，制得浓度为4％w/v的羧甲基壳聚糖溶液。
(4)将步骤(2)中得到的浓度为1.5％w/v的丝素溶液和步骤(3)中得到的浓度为4％w/v的羧甲基壳聚糖溶液按体积比1：1混合均匀，得到混合溶液。
(5)在步骤(4)中得到的混合溶液中加入一定量的交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)，加入方式为先将固体粉末溶于少量水中再加入体系。交联剂加入量为体系的0.6％w/v。
(6)在磁力搅拌器不断搅拌下，将EDC·HCL加入丝素/羧甲基壳聚糖复合溶液，20s后，将溶液倒入模具，静置12h。
(7)将其浸入75％v/v的乙醇水溶液中12h，最终得到丝素/羧甲基壳聚糖复合凝胶。
(8)通过与实施例1相同方式进行测试，获得该复合凝胶的弹性模量达到(99.03±9.72)KPa，压缩回复率达到100％，凝胶在去离子水中吸水溶胀率达到(51.74±10.03)×100％，在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中体积相对稳定，溶胀率为(16.60±2.11)×100％。
实施例4
本实施例中丝素/羧甲基壳聚糖复合凝胶的制备方法依次包括如下步骤。
(1)称取10g剪碎的茧层于质量分数为0.5％的Na2CO3沸水溶液中脱胶两次，每次30min，得到的丝素纤维用去离子水冲洗后拧干，并在烘箱中烘干；
(2)将步骤(1)中得到的丝素纤维置于9M LiBr溶液中，在60℃条件下溶解处理4h，得到的液体经过滤后装入透析袋(分子量8000～14000)于去离子水中透析4d，期间不断换水，最后得到的丝素溶液浓度为2.0％w/v。
(3)将适量羧甲基壳聚糖(脱乙酰度90％，取代度90％)溶于水中，制得浓度为4％w/v的羧甲基壳聚糖溶液。
(4)将步骤(2)中得到的浓度为2.0％w/v的丝素溶液和步骤(3)中得到的浓度为4％w/v的羧甲基壳聚糖溶液按体积比1：1混合均匀，得到混合溶液。
(5)在步骤(4)中得到的混合溶液中加入一定量的交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)，加入方式先将固体粉末溶于少量水中再加入体系。交联剂加入量为体系的0.6％w/v。
(6)在磁力搅拌器不断搅拌下，将EDC·HCL加入丝素/羧甲基壳聚糖复合溶液，20s后，将溶液倒入模具，静置12h。
(7)将其浸入75％v/v的乙醇水溶液中12h，最终得到丝素/羧甲基壳聚糖复合凝胶。
(8)通过与实施例1相同方式进行测试，获得该复合凝胶的弹性模量达到(248.60±34.47)kPa，压缩回复率达到100％，凝胶在去离子水中吸水溶胀率达到(35.78±10.75)×100％，在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中体积相对稳定，溶胀率为(13.18±0.53)×100％。
实施例5
本实施例中丝素/羧甲基壳聚糖复合凝胶的制备方法依次包括如下步骤。
(1)称取10g剪碎的茧层于质量分数为4.0％的Na2CO3沸水溶液中脱胶两次，每次30min，得到的丝素纤维用去离子水冲洗后拧干，并在烘箱中烘干；
(2)将步骤(1)中得到的丝素纤维置于9M LiBr溶液中，在60℃条件下溶解处理4h，得到的液体经过滤后装入透析袋(分子量8000～14000)于去离子水中透析4d，期间不断换水，最后得到的丝素溶液浓度为0.5％w/v。
(3)将适量羧甲基壳聚糖(脱乙酰度90％，取代度90％)溶于水中，制得浓度为4％w/v的羧甲基壳聚糖溶液。
(4)将步骤(2)中得到的浓度为4.0％w/v的丝素溶液和步骤(3)中得到的浓度为4％w/v的羧甲基壳聚糖溶液按体积比1：1混合均匀，得到混合溶液。
(5)在步骤(4)中得到的混合溶液中加入一定量的交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)，加入方式为先将固体粉末溶于少量水中再加入体系。交联剂加入量为体系的0.6％w/v。
(6)在磁力搅拌器不断搅拌下，将EDC·HCL加入丝素/羧甲基壳聚糖复合溶液，20s后，将溶液倒入模具，静置12h。
(7)将其浸入75％v/v的乙醇水溶液中12h，最终得到丝素/羧甲基壳聚糖复合凝胶。
(8)通过与实施例1相同方式进行测试，获得该复合凝胶的弹性模量达到(363.99±45.57)kPa，压缩回复率达到100％，凝胶在去离子水中吸水溶胀率达到(20.79±3.14)×100％，在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中体积相对稳定，溶胀率为(9.32±0.09)×100％。
由此可见，本发明提供的新的一种制备丝素复合凝胶的方法，制备工艺简单、条件温和、凝胶时间短，且得到的复合凝胶具有较好的力学性能和吸水稳定性：弹性模量达到(363.94±45.57)kPa，压缩回复率达到100％，即当在其上施加一定压力时，复合凝胶的承受能力很强，并未被压碎，且当压力消去时，凝胶又恢复原状；在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中体积相对稳定，溶胀率为(9.32±0.09)×100％，且烘干的样品置于水中可快速吸收大量水而膨胀，但仍然保持较好形态，并未松散破碎。
以上列举的仅是本发明的部分具体实施例，显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶的制备方法，其特征在于：
将脱胶得到的丝素纤维在LiBr溶液中进行溶解处理，并通过透析制得再生丝素溶液，再将其与羧甲基壳聚糖溶液混合，然后加入交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，最终在乙醇的作用下制备成丝素/羧甲基壳聚糖复合水凝胶；
所述方法具体过程如下：
(1)用茧层处理获得丝素纤维，然后制备获得丝素溶液；
(2)将羧甲基壳聚糖溶于水中，制得羧甲基壳聚糖溶液；步骤(1)中丝素溶液的浓度为0.5～4％w/v，步骤(2)中羧甲基壳聚糖溶液的浓度为4％w/v；
(3)将步骤(1)中得到的丝素溶液和步骤(2)中得到的羧甲基壳聚糖溶液混合均匀得到混合溶液；
(4)在步骤(3)中得到的混合溶液中加入一定量的交联剂，再将溶液在磁力搅拌器上搅拌短时间后立即倒入模具中静置；交联剂采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)的固体粉末，交联剂的加入量为体系的0.3～0.75％w/v；
(5)再浸入乙醇水溶液中，最终得到丝素/羧甲基壳聚糖复合凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为：
(1)将茧层置于质量分数为0.5％的Na2CO3沸水溶液中脱胶两次，每次30min，得到的丝素纤维用去离子水冲洗后拧干，并在烘箱中烘干；
(2)将步骤(1)中得到的丝素纤维置于9M LiBr溶液中，在60℃条件下溶解处理4h，得到的液体经过滤后装入透析袋于去离子水中透析4d，期间不断换水，最后得到的丝素溶液。
3.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中丝素溶液和羧甲基壳聚糖溶液的混合体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶的制备方法，其特征在于：所述羧甲基壳聚糖的脱乙酰度为55％～99％，取代度为60％～99％。
5.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，搅拌时间为20s，静置时间为6-12h；所述步骤(5)中，乙醇水溶液中的乙醇浓度是60～90％v/v，浸入乙醇水溶液的时间为12h。
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