CN107109384B - 乳糖酶溶液及使用其的乳制品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种热稳定性优异的乳糖酶溶液。乳糖酶溶液中，基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量约120kDa的乳糖酶级分的比例为20％以上。

Description

乳糖酶溶液及使用其的乳制品
技术领域
本发明涉及乳糖酶溶液及使用其的乳、乳制品等。
背景技术
乳糖(lactose)不耐受症是指：由于先天性地无法顺利分解乳糖，因此会因乳制品等食品中的乳糖而呈现腹痛、腹泻等诸多症状的状态。乳糖为由半乳糖及葡萄糖构成的二糖。为了应对乳糖不耐受症，在食品制造业中进行的是：利用酶乳糖酶使牛奶等中所含的乳糖预先分解为半乳糖和葡萄糖。
为了将牛奶等的乳糖分解而使用的乳糖酶溶液一直以来通过以下方式来制造，即，培养乳糖酶产生微生物，从细胞内提取乳糖酶，除去源自培养物的夹杂物而进行纯化，然后添加稳定剂，进行过滤灭菌。
专利文献1(日本特公昭60-18394号公报)中公开了由Kluyveromyces lactis的某菌株的培养物制造乳糖酶的制造法的发明。根据该方法，在使酵母菌体自消化后，将所得的粗酶溶液通入DEAE纤维素柱，并利用食盐浓度梯度进行溶出时，得到2个活性种类(乳糖酶A及乳糖酶B)。并且，公开了这两个活性种类除了pH稳定性略有不同以外，包括温度稳定性在内的各种性质几乎没有差异，酶制剂可由它们的混合物构成。
另外，根据Kluyveromyces lactis的乳糖酶的基因解析，推断出该乳糖酶为包含1025氨基酸的多肽、且分子量为117，618(非专利文献1)。
进而，专利文献1记载的乳糖酶的最佳温度为40～50℃，并且记载了在pH7.0下在50℃、10分钟时失活45％，在55℃、10分钟时失活100％。但是，并未记载使用该酶使实际上乳中所含的乳糖分解的情况。因此，对于在原料乳中添加乳糖酶时的活性降低、尤其是在乳中施加40℃以上的热负荷时的酶失活的问题并无任何记载。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特公昭60-18394号公报
专利文献2：日本特表2004-534527号公报
专利文献3：日本特表2009-517061号公报
非专利文献
非专利文献1：Poch et al.，Gene 1992Sep 1；118(1)：55-63
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于提供热稳定性优异的乳糖酶溶液。
用于解决课题的手段
本发明人等发现在乳糖酶中通过提高在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中形成约120kDa的条带的级分的比例，从而使乳糖酶具有高热稳定性，从而完成了本发明。
因此，根据本发明，提供以下技术方案。
[1]一种乳糖酶溶液，其特征在于，基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量约120kDa的乳糖酶级分的比例为20％以上；
[2]根据[1]所述的乳糖酶溶液，其特征在于，上述120kDa的乳糖酶级分的比例与基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量约80kDa的乳糖酶级分的比例之和为30％以上；
[3]根据[1]所述的乳糖酶溶液，其特征在于，基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量约50kDa的乳糖酶级分的比例为70％以下；
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的乳糖酶溶液，其特征在于，上述约120kDa的乳糖酶级分的比例与上述约80kDa的乳糖酶级分的比例之和除以基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量约50kDa的乳糖酶级分的比例所得的值为0.5以上；
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的乳糖酶溶液，其特征在于，其用于制造乳制品；
[6]一种乳制品，其含有[1]～[5]中任一项所述的乳糖酶溶液；
[7]一种原料乳的处理方法，其特征在于，将[1]～[5]中任一项所述的乳糖酶溶液添加到原料乳中，并使该原料乳中所含的乳糖在1～60℃下分解；
[8]一种乳糖酶溶液的制造方法，其特征在于，包括：
培养工序，对微生物进行培养；
回收工序，从利用上述培养工序得到的培养物中回收乳糖酶；以及
纯化工序，对利用上述回收工序所回收的乳糖酶进行纯化，
其中，上述纯化工序包括1次或多次进行盐析处理及脱盐处理的工序；
[9]根据[8]所述的乳糖酶溶液的制造方法，其特征在于，上述盐析处理包括：
饱和工序，使盐析剂在上述回收的乳糖酶中10～90％饱和；
放置工序，在上述饱和工序后将乳糖酶在4～40℃放置1～80小时；
[10]根据[8]或[9]所述的乳糖酶溶液的制造方法，其特征在于，上述盐析处理在pH4～9下进行。
发明效果
根据本发明，可提供即使在添加到原料乳中并施加40℃以上的热负荷的情况下乳糖分解活性也不易降低的乳糖酶溶液。
附图说明
图1为表示各种乳糖酶溶液的SDS-PAGE的结果的图。泳道1＝实施例1-1、泳道2＝实施例1-2、泳道3＝比较例1-1、泳道4＝比较例1-2、泳道5＝比较例2、泳道6＝比较例3、泳道M＝分子量标准品。予以说明，泳道1及2、泳道3及4表示基于不同的Lot的结果。
图2为表示在原料乳中添加乳糖酶溶液而在43℃、2小时的乳糖分解反应后的SDS-PAGE(面板A)及Western印迹(面板B)的结果的图。在各面板中，泳道1＝实施例1-1、泳道2＝实施例1-2、泳道3＝比较例1-1、泳道4＝比较例1-2、泳道5＝比较例2、泳道6＝比较例3、泳道M＝分子量标准品。
图3A为表示在原料乳中添加乳糖酶溶液而使其在37、40、43、46及49℃反应时的乳糖量的经时变化的图。关于图中的图标，□表示实施例1的结果，○表示比较例1的结果，▲表示比较例2的结果，△表示比较例3的结果。
图3B为表示在原料乳中添加乳糖酶溶液而使其在37、40、43、46及49℃反应时的乳糖分解率的经时变化的图。关于图中的图标，□表示实施例1的结果，○表示比较例1的结果，▲表示比较例2的结果，△表示比较例3的结果。
图4为表示120kDa级分的比例不同的乳糖酶溶液的SDS-PAGE的结果的图。泳道1＝实施例1、泳道2＝实施例2、泳道3＝实施例3、泳道4＝实施例4、泳道5＝实施例5、泳道6＝比较例1、泳道M＝分子量标记物。
图5为表示在原料乳中添加120kDa级分的比例不同的乳糖酶溶液而使其在49℃反应时的乳糖量(面板A)及乳糖分解率(面板B)的经时变化的图。关于图中的图标，□表示实施例1的结果，◇表示实施例2的结果，▲表示实施例3的结果，×表示实施例4的结果，*表示实施例5的结果，○表示比较例1的结果。
具体实施方式
本发明中所使用的乳糖酶为源自酵母(Kluyveromyces属)的乳糖酶。这些乳糖酶的绝大部分是最佳pH为pH＝6～pH＝8的所谓中性乳糖酶。作为Kluyveromyces属的乳糖酶产生酵母，可列举例如Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragillis、Kluyveromycesmarxianus等。
本发明的乳糖酶溶液理想地具有10～100,000NLU/g的乳糖酶活性。“NLU”为Neutral Lactase Unit。活性的测定方法如以下所示。利用使基质邻硝基苯基-β-吡喃半乳糖苷(ONPG)成为邻硝基苯酚及半乳糖的水解来测定。反应通过碳酸钠的添加而结束。所形成的邻硝基苯酚在碱性介质中成为黄色，吸光度的变化被用于测定酶活性(以NLU/g表示)。该步骤被公示于“美国食品化学物质规格集(FCC；Food Chemicals Codex)第4版、1996年7月1日、第801～802页/乳糖酶(中性)(β-半乳糖苷酶)活性中。
本发明所使用的乳糖酶溶液可以为按照以下的方法从微生物中回收并纯化后的乳糖酶溶液。
本发明的乳糖酶溶液的制造方法经过以下的4个工序。即，
(1)微生物的培养工序、
(2)从微生物中的乳糖酶回收工序、
(3)乳糖酶的纯化工序、及
(4)乳糖酶活性的调整工序。
以下，对上述4个工序的详细情况进行说明。
(1)关于微生物的培养工序，只要使用公知的培养基并且使用公知的菌株即可。培养条件也公知，可以根据需要进行适当选择。
(2)关于从微生物中的乳糖酶回收工序，在为细胞内酶时，需要包含提取乳糖酶的工序。该提取工序只要是使乳糖酶转移至细胞外的方法，则并无特别限定，可以使用公知的提取方法。另一方面，若为通过基因引入、变异等而将乳糖酶分泌至细胞外的酶，则使该培养液包含乳糖酶，因此不需要本提取工序。
(3)为了得到本发明的乳糖酶溶液，乳糖酶的纯化工序较为重要。专利文献1、专利文献2及专利文献3的共同点在于均利用色谱法纯化乳糖酶溶液。通过进行该色谱法，从而进行乳糖酶的纯化，可以使乳糖酶活性提高。但是，若如后述那样使用色谱法(分配色谱法或分子筛色谱法、吸附色谱法或离子交换色谱法等)纯化乳糖酶，则判明原本120kDa的乳糖酶会分别分解为80kDa及50kDa的乳糖酶。任一分子量的乳糖酶均具有乳糖酶活性，但是在乳糖酶被分解，尤其是50kDa的级分的比例增加时，乳糖酶的热稳定性降低，结果产生在较高温度下乳糖不易进行分解的问题。
本发明的乳糖酶可以通过在纯化工序中使用盐析和脱盐处理来得到。即，利用盐析使乳糖酶沉淀后，将该沉淀物回收、再溶解，将沉淀物中所含的盐进行脱盐，由此得到本发明的乳糖酶。盐析、沉淀物的回收、再溶解及脱盐可以连续进行。另外，只要得到本发明的乳糖酶，则也可以并用其他纯化手段(包括色谱法、活性炭处理)。
120kDa的乳糖酶通过盐析而不被分解的理由可推测为：通过盐析而使乳糖酶以高分子形式析出且不溶化，因此导致反应性变低。
作为进行盐析的盐析剂，可列举硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、硫酸镁、柠檬酸钠、氯化钠、氯化钾，可以使用其中的1种或2种以上。
当在包含乳糖酶的溶液中添加作为盐析剂的硫酸铵时，优选达到10～90％饱和，更优选达到30～70％饱和。在使用其他盐析剂时，只要使用与该硫酸铵的添加量相当的量即可。
通过添加硫酸铵等盐析剂，从而可以从包含乳糖酶的溶液中使乳糖酶沉淀。从盐析剂的添加至使乳糖酶沉淀的条件优选在1～40℃下放置1～80小时。此时的pH条件优选为4～9。更优选4～25℃(室温)、1～48小时、pH5～8。予以说明，关于温度条件的下限值，只要为不使包含乳糖酶的溶液凝固的温度即可。利用过滤将包含乳糖酶的液体与包含乳糖酶的沉淀物进行固液分离后，使固体状的乳糖酶再度溶解于水或缓冲液等中，利用透析或超浓缩进行脱盐处理。
(4)乳糖酶活性的调整工序只要能够调整乳糖酶的活性，则并无限制。例如为水、包含盐类的水溶液的添加、稳定剂的添加等。
本发明的乳糖酶溶液也可以在基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量级分的比例满足规定比例的范围内将市售的乳糖酶溶液和利用上述的方法得到的乳糖酶溶液混合来得到。
乳糖酶溶液中的乳糖酶的分子量可以利用使用10％聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE进行估算。例如，将乳糖酶溶液根据需要用纯化水进行稀释，并与SDS-PAGE用SampleBuffer按照1∶1混合，利用95度、5分钟的加热处理来制备泳动用样品。对10％丙烯酰胺凝胶供给标准品及泳动用样品，进行泳动。标准品使用BIO-RAD#161-0313(经过预染)等。泳动后的凝胶利用CBB染色液(APRO SP-4010)进行蛋白染色。
本发明的乳糖酶溶液在SDS-PAGE及CBB染色后使用TEFCO聚丙烯酰胺凝胶干燥试剂盒(商品名Clear Dry Solution)使其干燥。干燥后的凝胶利用EPSON公司制扫描仪GT-X820以灰色标度的图像的形式取入，利用ImageJ软件(NIH，Bethesda，MD)测定各条带的浓度(蛋白量)。
本发明的乳糖酶溶液的特征在于利用上述的方法测定的分子量约120kDa的级分的比例高。在本发明中，“基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量约120kDa的乳糖酶级分”是指：在利用上述的方法进行电泳后，与分子量标准品的迁移率相比，在相当于约120kDa的位置(约100kDa～约150kDa之间)形成条带的分子的级分。
本发明的乳糖酶溶液在SDS-PAGE及CBB染色后利用ImageJ软件(NIH，Bethesda，MD)测得的约120kDa的级分的比例为20％以上、优选为50％以上、更优选为80％以上、最优选为90％以上。上限值并无特别限定，例如为100％。该比例利用下述的方法来计算。
在SDS-PAGE及CBB染色后，使用ImageJ软件(NIH，Bethesda，MD)对各条带的浓度进行定量，计算将包含相当于约120kDa(100～150kDa)、约80kDa(80～100kDa)、约50kDa(49～54kDa)及约30kDa(28～32kDa)的条带的主要条带的全体设为100％时的约120kDa的条带的比例。关于本申请的技术方案中的记载，只要没有特别记载，则记载的是将上述4个条带的整体设为100％时的值。
本发明的乳糖酶溶液利用与上述同样的方法计算出的约80kDa的级分的比例与上述120kDa的级分的比例之和优选为30％以上、更优选为60％以上、进一步优选为90％以上。上限值并无特别限定，例如为100％。
若约120kDa的乳糖酶(以下有时称作乳糖酶I)分解，则成为约80kDa的乳糖酶(以下有时称作乳糖酶II)，若乳糖酶I或乳糖酶II分解，则成为约50kDa的乳糖酶(以下有时称作乳糖酶III)。
乳糖酶溶液中的乳糖酶I及乳糖酶II均具有乳糖酶活性及耐热性。乳糖酶III具有乳糖酶活性，但是耐热性不充分。即使对于任一级分，乳糖酶活性也是同等的。
乳糖酶II为乳糖酶I的分解物，因此从耐热性的观点出发，优选使乳糖酶溶液中的乳糖酶I的比例多于乳糖酶II。
乳糖酶溶液中的乳糖酶III的比例优选为70％以下，更优选为40％以下，进一步优选为10％以下。下限值并无特别限定，例如为0％。
乳糖酶I的比例与乳糖酶II的比例之和除以乳糖酶III的比例所得的值优选设为0.5以上、更优选为1.0以上、进一步优选为5.0以上。若不足0.5，则存在耐热性不足的倾向。最优选使乳糖酶溶液中完全不包含乳糖酶III、即、乳糖酶III为零，因此上限值并无限定。
原料乳是添加乳糖酶溶液的对象。本发明中，只要使用公知的原料乳即可。原料乳包括杀菌前的原料乳和杀菌后的原料乳。原料乳只要是使用乳的原料乳即可。作为构成原料乳的材料，可列举水、生乳、杀菌处理后的乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、酪乳、黄油、奶油、乳清蛋白浓缩物(WPC)、乳清蛋白分离物(WPI)、α-La、β-Lg等。
通过将本发明的乳糖酶溶液添加到原料乳中，从而可以使该原料乳中所含的乳糖分解。分解温度为1～60℃，分解时间为10分钟～24小时。
作为乳糖酶溶液的具体利用形态，例如被用于制造发酵乳。经乳糖分解的发酵乳的制造方法包括：1.在杀菌前的乳中添加乳糖酶而进行乳糖的分解后，在乳的加热杀菌的同时使乳糖酶失活，之后使乳发酵的方法(日本特开平5-501197号公报)；2.在杀菌乳中添加乳糖酶进行乳糖的分解后，利用加热处理使乳糖酶失活，之后使乳发酵的方法；3.利用固定化的乳糖酶将乳中的乳糖分解后，使乳发酵的方法(日本特开昭46-105593号公报、日本特开昭59-162833号公报)；4.将预先经过乳糖分解或乳糖除去后的原材料用于杀菌乳而使其发酵的方法等。
本发明的乳糖酶溶液特别适合用于制造乳制品。在此，乳制品是指：冰激凌、长保质期的牛奶等牛奶类、酸奶、鲜奶油、酸奶油、乳酪等。本发明的乳糖酶溶液尤其可优选用于施加40℃以上的热负荷的情况。作为此种用途，包括例如酸奶。
实施例
1.乳糖酶溶液的制造
(实施例1)
将含有玉米浆7％、乳糖2％的液体培养基加压杀菌后(杀菌后的pH5.5)，接种Kluyveromyces lactis No.013-2(ATCC 8585株)，在30℃且12000L/min的通气下培养24小时。培养结束后，边冷却边放置4小时后，从罐上部除去上清液，在罐底部得到凝聚沉降了的菌体1500kg。接着，将在此得到的菌体中的1500g用自来水清洗后，加入甲苯80ml进行混合后，加入1500ml的0.05M磷酸缓冲液(pH7.0)，进行搅拌使其均匀，盖严，在30℃放置15小时，使其自消化。
将该消化液离心分离，在所得的上清2500ml中加入等容的冷丙酮，放置一夜。将产生的沉淀通过离心分离进行收集，溶入600ml的自来水中，得到浓缩前酶溶液。
边将该浓缩前酶溶液600ml冷却至4℃，边用60分钟一点点地添加硫酸铵粉末，得到50％饱和水溶液。将该水溶液在4℃放置(静置)80小时，使乳糖酶沉淀后，利用过滤进行固液分离，回收固体状的乳糖酶。使该乳糖酶再度溶解于600ml的自来水后，进行超浓缩。在脱盐后的乳糖酶中添加自来水，按照使终浓度达到50％的方式添加甘油，得到实施例1的乳糖酶溶液(5,000NLU/g)。
(实施例2)
将实施例1的乳糖酶溶液和下述比较例1按照重量比达到80∶20的方式进行混合，得到实施例2的乳糖酶溶液(5,000NLU/g)。
(实施例3)
将实施例1的乳糖酶溶液和下述比较例1按照重量比达到60∶40的方式进行混合，得到实施例3的乳糖酶溶液(5,000NLU/g)。
(实施例4)
将实施例1的乳糖酶溶液和下述比较例1按照重量比达到40∶60的方式进行混合，得到实施例4的乳糖酶溶液(5,000NLU/g)。
(实施例5)
将实施例1的乳糖酶溶液和下述比较例1按照重量比达到20∶80的方式进行混合，得到实施例5的乳糖酶溶液(5,000NLU/g)。
(比较例1)
将市售的乳糖酶制剂即商品名“GODO-YNL2SS”(合同酒精公司制、5000NLU/g)作为比较例1的乳糖酶溶液。
(比较例2)
将市售的乳糖酶制剂即商品名“MAXILACT LG5000”(DSM公司制、5000NLU/g)作为比较例2的乳糖酶溶液。
(比较例3)
将市售的乳糖酶制剂即商品名“MAXILACT LGX5000”(DSM公司制、5000NLU/g)作为比较例3的乳糖酶溶液。
2.乳糖酶溶液的电泳
将乳糖酶溶液用Milli Q水稀释成10NLU/g，与SDS-PAGE用Sample Buffer(0.125MTris-HCl pH6.8、0.0125％溴百里酚蓝、20％甘油、2.5％SDS、2.5％2-巯基乙醇)以1∶1进行混合，利用95℃、5分钟的加热处理制备泳动用样品。对10％丙烯酰胺凝胶(4％积层凝胶、凝胶厚1mm、泳动距离50mm)供给分子量标准品及泳动用样品，利用Marisol产业泳动漕，以堆积(ス夕ッキング)10mA恒定电流、分离(セパレ一ティンゲ)20mA泳动至泳动前线到达凝胶下端附近。分子量标准品(泳道M)使用BIO-RAD#161-0313(经过预染)。泳动后的凝胶利用CBB染色液(APRO SP-4010)进行1小时的蛋白染色。
结果如图1所示。实施例1的乳糖酶溶液(泳道1及2)仅观察到分子量约120kDa的主条带，与此相对，比较例1(泳道3及4)中，分子量约120kDa的条带大部分消失，检测到分子量约80kDa、约50kDa、约30kDa的3条主条带。比较例2(泳道5)、比较例3(泳道6)均未观察到分子量约120kDa的条带以及分子量约80kDa的条带，主条带为约50kDa、约30kDa这两条。
具有乳糖酶活性的是约120kDa、约80kDa及约50kDa的条带，约30kDa的条带并不具有乳糖酶活性。
3.各条带的定量及结果1
利用上述的方法，对泳动后的凝胶通过条带的定量计算出比例。结果如表1所示。表1记载了包含全部条带的值。进而，在表2中示出计算出仅以主要的4个条带为全体的各个条带的比例的结果。表1～表4中，即使将各实施例、比较例等的值进行合计也不为100的原因在于，将所得的测定结果的小数点第2位进行了四舍五入。
虽然未示于表1、2中，但是与上述实施例1等同样地对通过追加试验专利文献1的实施例1所得的A种类及B种类进行了电泳，结果显示出与比较例2、3同样的倾向。
表1
表1
实施例1-1 实施例1-2 比较例1-1 比较例1-2 比较例2 比较例3
约12万 78.8 76.6 13.0 8.7 3.9 3.5
约8万 23.9 14.1 5.3 3.5
约5万 25.7 32.6 36.7 37.9
约3万 37.5 43.0 53.7 55.1
其他 21.2 23.5 1.6 0.4
表2
表2
实施例1-1 实施例1-2 比较例1-1 比较例1-2 比较例2 比较例3
约12万 100.0 100.0 13.0 8.9 3.9 3.5
约8万 23.9 14.3 5.3 3.5
约5万 25.7 33.1 36.9 37.9
约3万 37.5 43.7 53.9 55.1
4.乳糖分解反应后的电泳及Western印迹
在UHT杀菌(130℃、2秒)牛奶(商品名“明治美味牛奶”、株式会社明治制)中分别按照终浓度达到0.05％(W/V)的方式添加实施例1的乳糖酶溶液(泳道1及泳道2)、比较例1(泳道3及泳道4)、比较例2(泳道5)或比较例3(泳道6)，在43℃下进行2小时乳糖分解反应。将反应后的溶液用纯化水稀释成20倍(W/V)，与上述同样地与SDS-PAGE用Sample Buffer以1∶1进行混合，利用95℃、5分钟的加热处理制备出泳动用样品。对2片10％丙烯酰胺凝胶供给分子量标准品及泳动用样品，同时进行泳动。分子量标准品(泳道M)使用BIO-RAD # 161-0313(经过预染)。
泳动后的凝胶中的1片与上述同样地利用CBB染色液进行蛋白染色，另1片供于Western印迹。Western印迹的转印膜使用硝基纤维素膜片(BIO-RAD#162-0114)，利用湿法方式进行转印。转印后的膜片利用Block Ace溶液(雪印乳业Block Ace粉末4g/纯化水100mL)进行封闭(blocking)操作后，用Tween-PBS进行清洗。
作为一次抗体，使用按照以下方式自家制备的抗乳糖酶多克隆抗体。进行实施例1所得的乳糖酶溶液的SDS-PAGE，利用凝胶将120kDa的条带切细碎后，与Difco公司制弗氏完全佐剂(Adjuvant Complete Freund)混合，进行乳化。将其在Balb-C小鼠的尾部根部皮下注射共计3次，确认到血清中抗体效价的上升后，将所采集的全血的离心分离上清作为抗乳糖酶多克隆抗体。利用该抗体可以检测乳糖酶的120、80、50kDa的条带。
使上述的抗乳糖酶抗体在用Block Ace稀释液(将Block Ace溶液用纯化水稀释10倍)稀释成1,000倍的液体中于室温反应2小时。用Tween-PBS清洗4次后，使2次抗体(Gorta-mouse IgG(H+L)-HRP；Southern Biotech 1034-05)在用Block Ace稀释液稀释成5,000倍的液体中于室温反应2小时。用Tween-PBS清洗后，利用3，3’-二氨基联苯胺(DAB)进行染色。DAB基质使用DAB buffer tablets(MERCK 1.02924.0001)。
结果如图2所示。在CBB染色像(面板A)中，无论乳糖酶溶液为何，均观察到大致同样的结果。与此相对，在Western印迹的结果(面板B)中，与反应前的乳糖酶溶液同样地观察到由乳糖酶溶液带来的不同。即，实施例1仅观察到分子量约120kDa的主条带，与此相对，比较例1中，分子量约120kDa的条带大部分消失，检测到分子量约80kDa、约50kDa这2条主条带。比较例2或比较例3均未观察到分子量约120kDa的条带以及分子量约80kDa的条带，主条带为约50kDa。
由以上可知：在分解反应的前后各乳糖酶溶液中所含的乳糖酶的分子量及各分子量级分的比例均未观察到变化。
5.乳糖分解试验1
在UHT杀菌牛奶(130℃、2秒)中分别按照终浓度达到0.05％(w/v)(2.5NLU/100mL牛奶)的方式添加实施例1的乳糖酶溶液、比较例1、比较例2及比较例3，在49℃、46℃、43℃、40℃及37℃下进行乳糖分解反应。经时性地以HPLC(Transgenomic CARBOSep CHO620柱)测定乳糖分解反应前的乳糖含量和反应中的乳糖含量(Waters Alliance HPLC***、柱温：85℃、溶剂：H2O、流速：0.5mL/min、检测器：Waters2414RI检测器)。乳糖分解率按照以下方式来计算。乳糖分解率(％)＝100-(使用各实施例或各比较例的乳糖酶溶液的乳糖分解反应后的牛奶中所含的乳糖含量/使用各实施例或各比较例的乳糖酶溶液的乳糖分解反应前的牛奶中所含的乳糖含量)×100)
结果如图3所示。图3A示出乳糖量，图3B示出乳糖分解率的经时变化的结果。通过2小时的反应，而在37℃下在实施例1、比较例1、比较例2或比较例3中未观察到分解率的差异，但是，确认到以下倾向：随着反应温度的上升，实施例1的分解率最高，比较例1次高，分解率最低的是比较例2或比较例3。如上述所示，可知：本发明的乳糖酶溶液即使在提高反应温度的情况下乳糖酶也不失活，热稳定性高。实施例1的乳糖酶溶液通过提高温度而也可以以较短的反应时间更有效地分解乳糖。予以说明，即使在不同Lot的乳糖酶溶液中也确认到该结果的再现性。
各乳糖酶溶液中的主要的乳糖酶级分的分子量在反应前后未发生变化，因此可认为分解率的降低是由反应中乳糖酶的活性降低而产生的。另外，120kDa级分的含量越高，则在40℃以上的反应中的分解率越高。
6.混合乳糖酶溶液的研究
将实施例1的乳糖酶溶液和比较例1的乳糖酶溶液以上述比例进行混合，并对所得的乳糖酶溶液、实施例2～5进行以下研究。
6-1.各条带的定量及结果2
对于实施例2～5，利用上述的方法进行电泳后，进行各条带的定量。电泳的结果如图4所示，定量的结果如表3所示。表3记载了包含全部条带的值。进而，在表4中示出计算出仅以主要的4个条带为全体的各条带的比例的结果。予以说明，为了比较而示出对实施例1及比较例1也同时进行泳动及定量的结果。
表3
表3
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 比较例1
约12万 82.8 77.8 66.5 44.3 23.8 5.5
约8万 1.9 2.2 6.3 7.7 12.9
约5万 11.7 16.3 26.3 32.7 38.8
约3万 4.9 13.8 21.9 32.5 40.8
其他 17.2 3.7 1.2 1.1 3.4 2.0
表4
表4
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 比较例1
约12万 100.0 80.8 67.3 44.8 24.6 5.7
约8万 2.0 2.2 6.4 7.9 13.1
约5万 12.1 16.5 26.6 33.8 39.6
约3万 5.1 14.0 22.2 33.6 41.7
乳糖分解试验2
使用实施例1～5及比较例1的乳糖酶溶液，利用上述的乳糖分解试验的方法在49℃进行乳糖分解反应。所得的结果示于图5。
面板A示出乳糖量，面板B示出乳糖分解率的经时变化的结果。确认到：随着约120kDa的条带增加，乳糖分解加剧。
因此，基于上述的结果可以说：在SDS-PAGE中约120kDa的主带为20％以上的乳糖酶溶液与在SDS-PAGE中具有分子量约80kDa、约50kDa及约30kDa的主带的乳糖酶溶液相比耐热性较高。

Claims (7)

1.一种乳糖酶溶液，其特征在于，基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量约120kDa的乳糖酶级分的比例为20％以上，
所述约120kDa的乳糖酶级分的比例与基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量约80kDa的乳糖酶级分的比例之和为100％，
所述乳糖酶溶液还含有稳定剂。
2.根据权利要求1所述的乳糖酶溶液，其特征在于，其用于制造乳制品。
3.一种乳制品，其含有权利要求1或2所述的乳糖酶溶液。
4.一种原料乳的处理方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的乳糖酶溶液添加到原料乳中，并使该原料乳中所含的乳糖在1℃～60℃下分解。
5.一种乳糖酶溶液的制造方法，其特征在于，包括：
培养工序，对微生物进行培养；
回收工序，从利用所述培养工序而得到的培养物中回收乳糖酶；
纯化工序，对利用所述回收工序所回收的乳糖酶进行纯化；以及
调整工序，对乳糖酶溶液的乳糖酶的活性进行调整，
其中，所述纯化工序包括1次或多次进行盐析处理及脱盐处理的工序，
所述调整工序包括稳定剂的添加，
所制造的乳糖酶溶液中，基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量约120kDa的乳糖酶级分的比例为20％以上，
基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量约120kDa的乳糖酶级分的比例与基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量约80kDa的乳糖酶级分的比例之和为100％。
6.根据权利要求5所述的乳糖酶溶液的制造方法，其特征在于，所述盐析处理包括：
饱和工序，使盐析剂在所述回收的乳糖酶中10％～90％饱和；以及
放置工序，在所述饱和工序后将乳糖酶在4℃～40℃放置1小时～80小时。
7.根据权利要求5或6所述的乳糖酶溶液的制造方法，其特征在于，所述盐析处理在pH4～9下进行。
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