CN107098964A

CN107098964A - 一种肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途

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Publication number: CN107098964A
Application number: CN201710362102.1A
Authority: CN
Inventors: 何向锋; 施文
Original assignee: Individual
Current assignee: New Key (nanjing) Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-05-19
Filing date: 2017-05-19
Publication date: 2017-08-29

Abstract

本发明公开了一种肿瘤特异性重组水蛭素，所述重组水蛭素的N末端含有可被基质金属蛋白酶9(MMP9)识别并裂解的寡肽序列PLGI，用于重组的水蛭素为水蛭素异构体、水蛭素突变体、截短的水蛭肽、基因修饰的水蛭素或水蛭素融合蛋白。相应地，本发明还提供了肿瘤特异性重组水蛭素的制备方法及其在制备防治肿瘤的药物中的应用，还提供了表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞的制备方法和用途。本发明的重组水蛭素，使水蛭素抗凝活性进行肿瘤靶向性释放，营造不易形成血栓的微环境，甚至溶解已形成的微小栓子以达到抗凝、溶栓、防止肿瘤细胞转移的功能，这就克服了野生型水蛭素全身用药引起***性出血的风险。

Description

一种肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物治疗与生物医药领域，特别涉及一种肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途。

背景技术

水蛭素是迄今发现的活性最强的天然凝血酶特异性抑制剂，最初从医用水蛭唾液腺中分离得到，由65～66个氨基酸组成，可直接与凝血酶以l：l(摩尔比)的方式结合形成非共价复合物，从而使凝血酶失去裂解纤维蛋白原的能力，抑制血栓的形成。天然水蛭素存在十种以上变体，主要有简称为HV1、HV2、HV3三种同源性很高的异构体(Hirudin Variant)。

目前，国外已有两个重组水蛭素产品被批准上市：1.Desirudin(商品名：Revasc，瑞士Novartis产品)，2.Lepirudin(商品名：Refludan，英国Pharmion及美国BerlexLaboratories产品)。两者结构上仅在N-端存在微小差异，Desirudin为Val1-Val2，而Lepirudin为Leu1-Tyr2。Desirudin用于手术时深度静脉血栓(DVT)的预防与治疗，Lepirudin用于肝素诱导的血小板减少性疾病患者的抗凝治疗。此外，水蛭素在防治不稳定性心绞痛、弥散性血管内凝血、脑血栓、血栓静脉炎及冠状动脉血栓等方面都具有巨大的潜在临床应用价值。

在多种恶性肿瘤患者中存在着血液高凝状态，如肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等。恶性肿瘤患者血液中的高凝状态，不仅能促进体内血栓形成，而且与肿瘤生长、侵袭以及转移明显相关。凝血功能变化可引起肿瘤细胞表型和活性改变，促进肿瘤细胞与血小板、内皮细胞、纤维结合蛋白(Fibrinectin)以及Von Willebrand factor(vWF)的黏附，从而使肿瘤细胞在局部增殖、浸润甚至向其他部位转移。血栓性疾病是恶性肿瘤患者第二大致死因素，仅次于肿瘤转移。对血栓形成高危肿瘤患者及早进行药物性干预，对于延长患者生存期、降低死亡率有重要意义。研究表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。重组水蛭素通过其抗凝作用，抑制纤维蛋白的形成，能防止肿瘤细胞与血纤维蛋白或血小板凝集，使NK细胞或其他细胞毒效应细胞的活性得以发挥。已证明水蛭素治疗可发挥疗效的肿瘤有纤维肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化疗和放疗，通过促进肿瘤中的血流、改善乏氧状态而增强疗效。

动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，半致死剂量远大于治疗所需剂量，机体易接受，免疫性弱，不影响血小板、纤维蛋白原水平和血红蛋白含量，不易通过血脑脊液屏障。无论急性、亚急性的毒性试验，水蛭素对呼吸、血压、心率均不影响。水蛭素在体内无降解，以活性成分经肾脏***。

水蛭素作为一种高效、直接、特异的凝血酶抑制剂，具有很强的抗凝、抗血栓以及抗炎等多种药理活性。与肝素等传统的抗凝药物相比，其治疗剂量小、疗效高、不会引起过敏反应。水蛭素有抗原性，但其抗体没有害，反而延长消除半衰期，是一种少见的正效果抗体。因此水蛭素的应用将会不断得到开拓和推广，重组水蛭素将会成为新一代的抗凝、抗栓和抗肿瘤新药。但是，水蛭素又可导致凝血相关参数，如活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和凝血酶原时间(PT)等明显升高，从而可能引起全身或***性出血风险。临床上，作为一个理想的抗凝药物，在全身用药条件下，应当具有明确的抗凝、抗栓效果，但又不引起出血副作用，尤其是在以***为目的的临床应用时，其理想的工作状态为靶向性的在肿瘤局部发挥抗凝、抗栓、抗肿瘤作用，从而使临床用药安全性提高。在肿瘤治疗领域，如何进一步减少水蛭素的副作用，增加其肿瘤治疗靶向性是值得探讨的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种肿瘤特异性重组水蛭素及表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞，至少能够解决上述问题之一。

本发明思想的指导原则的关键是构建水蛭素衍生物，使水蛭素抗凝活性进行肿瘤靶向性释放，即在正常条件下，该水蛭素衍生物无抗凝活性，而当位于肿瘤位置时，该水蛭素衍生物的抗凝活性才在肿瘤局部释放，营造不易形成血栓的微环境，甚至溶解已形成的微小栓子以达到抗凝、溶栓、防止肿瘤细胞转移的功能。这就克服了野生型水蛭素全身用药引起***性出血的风险。

基质金属蛋白酶(MMPs)是一类以无活性酶原形式分泌的Zn²⁺依赖性肽链内切酶家族，是构成胞外基质降解最重要的蛋白水解***。MMP9即基质金属蛋白酶9，是其家族的重要成员。能够降解肿瘤微环境中的多种蛋白胶原，促进肿瘤侵袭。大量的实验研究表明，MMP9在癌细胞的快速增殖、侵袭及转移的过程中起到很重要的作用。MMP9通过以下方式促进肿瘤浸润及转移：降解ECM的分子物质；调节细胞的黏附性；配合其他酶类降解血管基底膜和血管周围基质。这是血管树生长的重要条件，只有通过降解过程，内皮细胞才能迁移入周围组织，并逐渐形成血管树，促进肿瘤细胞的转移和侵袭。MMP9酶与底物作用后可使明胶中Gly-Ile之间的肽键断裂。

水蛭素是由65～66个氨基酸组成的单链多肽，其N末端可以与凝血酶催化活性位点结合，具有抗凝活性，C末端与凝血酶的底物识别位点结合，对凝血酶有很强的特异性亲和作用。本发明设计了一个封闭水蛭素N末端的措施，以达到降低该水蛭素衍生物的抗凝活性的目的，同时还具有肿瘤靶向寻的功能。当该水蛭素衍生物位于肿瘤微环境使时，利用肿瘤微环境中富含MMP9酶特点，使该水蛭素衍生物N末端被封闭的水蛭素重新回复为水蛭素原形，在肿瘤局部发挥特异性靶向抗凝作用，从而成为一类新型、安全、有效的肿瘤靶向性抗凝、抗癌剂。

为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种肿瘤特异性重组水蛭素，重组水蛭素的N末端含有可被MMP9识别并裂解的寡肽序列，用于重组的水蛭素为水蛭素异构体、水蛭素突变体、截短的水蛭肽、基因修饰的水蛭素或水蛭素融合蛋白。

进一步的，寡肽序列为可被MMP9识别并裂解的短肽，其结构特征为XnGI，Xn代表任意数量的任意氨基酸。

重组水蛭素是在水蛭素异构体HV2或HV3的N末端修饰有寡肽PLG，与水蛭素异构体HV2或HV3的N末端序列I共同组成MMP9识别并酶切的底物肽序列PLGI，重组水蛭素PLG-HV2氨基酸序列为：SEQ ID NO.1，基因序列为：SEQ ID NO.2，重组水蛭素PLG-HV3氨基酸序列为：SEQ ID NO.3，基因序列为：SEQ ID NO.4；

或者，所述重组水蛭素，是人白蛋白与N末端氨基酸是I的水蛭素异构体HV2或HV3通过寡肽PLG连接而成的融合蛋白HPH2，或HPH3，HPH2氨基酸序列为：SEQ ID NO.17，基因序列为：SEQ ID NO.18，HPH3氨基酸序列为：SEQ ID NO.19，基因序列为：SEQ ID NO.20；

或者，所述重组水蛭素，是人嵌合免疫球蛋白Fc段与N末端氨基酸是I的水蛭素异构体HV2或HV3通过寡肽PLG连接而成的融合蛋白FPH2，或FPH3，人嵌合免疫球蛋白Fc段包含人IgG4铰链区、Fc段序列和IgM尾片序列，FPH2氨基酸序列为：SEQ ID NO.21，基因序列为：SEQ ID NO.22，FPH3氨基酸序列为：SEQ ID NO.23，基因序列为：SEQ ID NO.24。

肿瘤细胞能够营造肿瘤微环境，通过分析肿瘤微环境的特点，可以找到肿瘤靶向性的靶标。研究表明αvβ3在多种肿瘤细胞如肺癌、乳腺癌、***癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤及浸润性黑色素瘤等表面高表达。在肿瘤组织新生血管内皮细胞中强烈表达，在成熟的血管内皮细胞和绝大多数正常组织中αvβ3的表达水平很低。在肿瘤组织中，肿瘤细胞分泌的生长因子使上皮细胞活化，其中整合素αvβ3的表达水平很高，这使得αvβ3成为肿瘤靶向治疗的一个理想位点。与正常组织血管***相比，肿瘤组织大量表达αvβ3，αvβ3在肿瘤组织新生毛细血管***中的表达水平比正常组织高出很多。整合素αvβ3能识别细胞外基质蛋白，与其特异性结合，介导肿瘤细胞的粘附与迁移，在肿瘤的生长、浸润、转移尤其是血管生成中发挥重要作用。αvβ3能够与多种含有RGD序列的蛋白结合，例如玻璃体结合蛋白、纤维结合蛋白、纤维蛋白素原、凝血酶敏感素及一些模拟RGD序列的内源性蛋白。一些设计的抗体或小分子量的αvβ3拮抗剂，在体内模型中能抑制血管内皮细胞与玻璃体结合蛋白之间的粘附，肿瘤的血管发生明显减少。

在以往研究中，RGD序列常被作为靶向药物的载体，将药物靶向到表达整合素αvβ3的肿瘤血管***去。RGD序列是作为纤维结合蛋白与细胞的结合位点被发现的，其基本识别位点由Arg-Gly-Asp三个氨基酸组成。在RGD衍生物中，c(RGDfK)常被作为药物的载体，因为赖氨酸残基K是最理想的能够同其他化学物质发生偶联反应的基团。人们运用噬菌体技术发现了另外一种能和αvβ3特异性结合的RGD配体：含两个二硫键的RGD序列(ACDCRGDCFCG)，人们称其为RGD4C。其结合能力是含一个二硫键RGD序列的20倍，是通常线性RGD序列的200倍。RGD4C的缺点是能够形成不同的环状结构，如果形成了附加的单环和二环结构，则其结合能力降低10倍。二者相比，c(RGDfK)稳定性较好而且容易与其他化学基团发生偶联，更适合作为化学偶联的载体。而RGD4C则适合作为运用重组技术设计的靶向药物载体。

进一步的，重组水蛭素，是靶向整合素αvβ3的多肽RGD4C与N末端氨基酸是I的水蛭素异构体HV2或HV3通过Linker和寡肽PLG连接而成的融合蛋白RPH2，或RPH3，RPH2氨基酸序列为：SEQ ID NO.13，基因序列为：SEQ ID NO.14，RPH3氨基酸序列为：SEQ ID NO.15，基因序列为：SEQ ID NO.16。

目前已经了解，水蛭素分子的N末端是其核心部分，含三对二硫键(Cys6-Cys14，Cys16-Cys28，Cys32-Cys39)，使N末端肽链绕迭成密集形核心环肽结构，与凝血酶的催化活性位点结合；而C末端为一无规则伸展的链状结构，其中Gln49～Gly54有空间和疏水作用，而Asp55～Pro60富含酸性氨基酸，带有负电荷，易与凝血酶碱性的底物识别位点结合。HV1/HV2的Ser32-Asp33-Gly34-Glu35(SDGE)或HV3的Ser32-Asn33-Gly34-Lys35(SNGK)为一突出于β-折叠间的Loop结构，构象自由，对活性无明显作用。根据水蛭素的以上特性，将野生型水蛭素(HV2/HV3)肽链的Ser32-Asn33-Gly34-Glu35替换为Arg32-Gly33-Asp34-Met35(RGDM)。RGD序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成，存在于多种细胞外基质中，可与整合素αvβ3特异性结合。经过RGDS或RGDM修饰的重组水蛭素可以更好的靶向肿瘤微环境的整合素αvβ3，通过MMP9蛋白酶将水蛭素释放出来，发挥抗凝、抗栓和抗肿瘤作用。

进一步的，所述重组水蛭素，是将野生型水蛭素HV2或HV3肽链的Ser32-Asn33-Gly34-Glu35替换为Arg32-Gly33-Asp34-Ser35，再在其N末端修饰PLG寡肽，所述重组水蛭素PLG-HV2-RGDS氨基酸序列为：SEQ ID NO.5，基因序列为：SEQ ID NO.6，重组水蛭素PLG-HV3-RGDS氨基酸序列为：SEQ ID NO.7，基因序列为：SEQ ID NO.8；

或者，所述重组水蛭素，是将野生型水蛭素HV2或HV3肽链的Ser32-Asn33-Gly34-Glu35替换为Arg32-Gly33-Asp34-Met35，再在其N末端修饰PLGL寡肽，所述重组水蛭素PLG-HV2-RGDM氨基酸序列为：SEQ ID NO.9，基因序列为：SEQ ID NO.10，重组水蛭素PLG-HV3-RGDM氨基酸序列为：SEQ ID NO.11，基因序列为：SEQ ID NO.12。

相应地，本发明还提供了上述肿瘤特异性重组水蛭素的制备方法，包括以下步骤：化学合成上述肿瘤特异性重组水蛭素基因片段，在其N末端连接信号肽序列，并在重组编码基因的两端添加限制性酶切位点，将重组编码基因***基因载体中制备重组载体，用该重组载体转化或转染宿主细胞，培养宿主细胞，并从中回收和纯化该肿瘤特异性重组水蛭素，宿主细胞为大肠杆菌、乳酸菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

相应地，本发明还提供了上述的肿瘤特异性重组水蛭素在制备抗凝、抗血栓、防治肿瘤的药物中的应用，尤其是防治肿瘤伴发高凝状态和血栓性病变的药物、保健品和功能性食品中的应用。

相应地，本发明还提供了表达上述肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞制备方法，体外培养人源免疫细胞，将人源分泌型信号肽编码基因与上述的肿瘤特异性重组水蛭素的编码基因相连，并在重组编码基因的两端添加限制性酶切位点，将编码基因***载体中制备成重组基因载体，转染免疫细胞，获得表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞。

进一步的，人源分泌型信号肽为人酰胺化酶信号肽，氨基酸序列为：SEQ IDNO.25，基因序列为：SEQ ID NO.26。

进一步的，免疫细胞为αβT、γδT、NKT、NK、DC、CIK、CAR-T、CAR-NK、TCR-T中的一种或多种，所述免疫细胞为人源免疫细胞。

进一步的，过继免疫细胞的膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面。

进一步的，靶标分子为CD19的全长或其截短片段，或CD20的全长或其截短片段。

进一步的，靶标分子及跨膜段的结构为：GM-CSFR信号肽-ΔCD20-Linker2-CD28跨膜段，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.27，基因序列为SEQ ID NO.28。

以过继免疫细胞为载体，在肿瘤患者体内持续稳定表达肿瘤特异性重组水蛭素，发挥“微型细胞药厂”的作用，既将细胞过继免疫治疗技术与肿瘤靶向性重组水蛭素的防栓抗癌功能整合，更好的发挥抗肿瘤作用，又可通过在体内长期稳定表达肿瘤特异性重组水蛭素，避免反复注射肿瘤特异性重组水蛭素引起潜在的过敏反应。

相应地，本发明还提供了上述表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞的应用，用于抗凝、抗血栓、防治肿瘤的生物治疗，尤其是防治伴有高凝状态和/或血栓的肿瘤患者的生物治疗。

本发明的有益效果为：本发明的肿瘤特异性重组水蛭素的N末端含有可被MMP9识别并酶切的短肽，可以封闭水蛭素N末端的凝血酶催化活性位点，以达到降低该水蛭素衍生物的抗凝活性、减少出血副作用的目的，同时还具有肿瘤靶向寻的功能。当该水蛭素衍生物位于肿瘤微环境使时，利用肿瘤微环境中的富含MMP9酶特点，特异性切除该水蛭素衍生物N末端的封闭肽，使被封闭的水蛭素重新回复为水蛭素原形，在肿瘤局部发挥特异性抗凝作用，从而成为一类新型、安全、有效的肿瘤靶向性抗凝、抗栓和抗癌剂。本发明更进一步的提供了表达肿瘤特异性重组水蛭素的免疫细胞，通过以过继免疫细胞为载体，在体内持续表达肿瘤特异性重组水蛭素，可解决水蛭素半衰期短的弊端，无需短时间内反复给药，可避免反复给药引起过敏或诱导抗体产生，更加适合需要长期抗凝、抗栓的肿瘤患者。表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞可靶向肿瘤局部表达，改善肿瘤患者高凝状态，溶解微血栓，防止肿瘤转移，促进免疫细胞进入肿瘤内部发挥杀伤功能，可单独应用或临床配合化/放疗使用。

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明。

本发明的肿瘤特异性重组水蛭素的的N末端含有可被MMP9识别并裂解的寡肽序列，，用于重组的水蛭素为水蛭素异构体、水蛭素突变体、截短的水蛭肽或水蛭素融合蛋白。寡肽序列为可被MMP9识别并酶切的短肽，其结构特征为XnGI，Xn代表任意数量的任意氨基酸。

天然水蛭素有多种异构体，其中三种主要异构体分别为Hirudin variant 1(HV1)、Hirudin variant 2(HV2)、Hirudin variant 3(HV3)。

HV2和HV3的N末端氨基酸为I，MMP9的生理底物序列为GI，酶切后断裂点位为G↓I。在HV2或HV3的N末端连接上PLG短肽，或其它XXXG型具有同等功效的短肽，与HV2或HV3的N末端的I共同组成MMP9的底物序列，当被MMP9自G和I之间裂解后，可完整释放水蛭素的抗凝活性。

进一步的，重组水蛭素的末端还连接有用于靶向整合素αvβ3的多肽，该多肽包含RGD序列。则可使上述水蛭素衍生物更好的靶向肿瘤微环境的整合素αvβ3。具体的RGD序列为RGD4C序列。当RGD4C导向载体与肿瘤细胞表面αvβ3结合后，通过MMP9将水蛭素原形释放出来，发挥抗凝、抗栓和抗肿瘤作用。

相应地，本发明还提供了上述肿瘤特异性重组水蛭素的制备方法，包括以下步骤：化学合成上述肿瘤特异性重组水蛭素基因片段，在其N末端连接信号肽，并在重组编码基因的两端添加限制性酶切位点，将重组编码基因***基因载体中制备重组载体，，用该重组载体转化或转染宿主细胞，培养宿主细胞，并从中回收和纯化该肿瘤特异性重组水蛭素，宿主细胞为大肠杆菌、乳酸菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

用于重组的载体优选的为真核表达载体，优选的为pPIC9K。宿主细胞优选的为甲醇营养型酵母菌株GS115。

相应地，本发明还提供了表达上述肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞制备方法，将人源分泌型信号肽编码基因与上述的肿瘤特异性重组水蛭素的编码基因相连，制备成重组基因载体，转染免疫细胞，获得表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞。

该过继免疫细胞的膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面，肿瘤特异性重组水蛭素直接表达或通过偶联诱导表达***进行诱导表达。靶标分子为CD19的全长或其截短片段，或CD20的全长或其截短片段。

本发明表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞，肿瘤特异性重组水蛭素可以组成性表达，也可以偶联诱导表达***进行诱导表达。偶联诱导表达***可以是四环素诱导表达***、蜕皮激素(ecdysone)诱导表达***、他克莫司(tacrolimus，FK506)/雷帕霉素(rapamycin)诱导***或RU486诱导***。免疫细胞可以是αβT、γδT、NKT、NK、DC、CIK、CAR-T、CAR-NK、TCR-T中的一种或多种，免疫细胞为人源免疫细胞。

表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞还表达***基因/前药***。***基因/前药***为单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊环鸟苷(HSV-tk/GCV)***、带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶/阿糖甲氧基嘌呤(VZV-tk/Ara-M)***、胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5FC)***、细胞色素P450微粒体酶CYP2B1/环磷酰胺(CYP2B1/CPA)***；细胞色素P450CYP4B1/氨基蒽(CYP4B1/2AA)***、脱氧胞苷激酶/阿糖胞苷(dCK/Ara-C)***、乌苷-黄嘌呤磷酸核糖基转移酶/6-硫黄嘌呤(gpt/6TX)***、硝基还原酶/CB1954(NTR/CB1954)***、嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脱氧核苷(PNP/6-MeP-dR)***、胸腺嘧啶磷酸化酶/5’-脱氧-5-氟尿嘧啶(TP/5’-DFUR)***、羧基肽酶G2/CMDA***(CPG2/CMDA)、羧酸酯酶/CPT-11(CE/CPT-11)***中的一种。

上述的表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞的制备方法，包括以下步骤：制备编码肿瘤特异性重组水蛭素和膜型分子靶标的基因载体，基因载体中包括(信号肽序列-肿瘤特异性重组水蛭素序列)和(信号肽序列-靶标分子序列-Linker-跨膜段序列)两段基因序列；将上述编码肿瘤特异性重组水蛭素和靶标分子的基因载体通过基因工程技术转染免疫细胞。

基因工程技术为公知技术，所用基因转染***包括慢病毒转染***、逆转录病毒转染***、腺病毒转染***、腺相关病毒转染***、睡美人转座子转染***、质粒电转染***。优选的，采用睡美人转座子转染***或电转染***。以瞬时表达载体，将肿瘤特异性重组水蛭素基因导入过继免疫细胞，可使其外源基因表达量可控，避免过量表达的风险。

编码肿瘤特异性重组水蛭素和膜型分子靶标的基因载体的结构为：信号肽-肿瘤特异性重组水蛭素-IRES-信号肽-靶标分子-Linker-跨膜段，或者，信号肽-靶标分子-Linker-跨膜段-P2A-信号肽-肿瘤特异性重组水蛭素。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例中重组水蛭素是在水蛭素异构体HV2的N末端修饰有寡肽PLG，与水蛭素异构体HV2的N末端序列I共同组成MMP9识别并裂解的底物肽序列PLGI，肿瘤特异性重组水蛭素PLG-HV2，氨基酸序列为：SEQ ID NO.1，基因序列为：SEQ ID NO.2。

其中，PLGI可被其它MMP9识别并酶切底物肽序列替换，其共同特点为包含有GI序列，以保证经MMP9识别并酶切后，释放的水蛭素N末端的氨基酸为I。

该肿瘤特异性重组水蛭素在制备防治肿瘤的药物中的应用，尤其是防治肿瘤伴发高凝状态和血栓性病变的药物中的应用。

实施例2

本实施例中重组水蛭素是在水蛭素异构体HV3的N末端修饰有寡肽PLG，与水蛭素异构体HV3的N末端序列I共同组成MMP9识别并酶切的底物肽序列PLGI，重组水蛭素PLG-HV3，氨基酸序列为：SEQ ID NO.3，基因序列为：SEQ ID NO.4。

其中，PLGI可被其它MMP9识别并酶切底物肽序列替换，其共同特点为包含有GI序列，以保证经MMP9酶切后，释放的水蛭素N末端的氨基酸为I。

实施例3

本实施例中重组水蛭素，是将野生型水蛭素HV2肽链的Ser32-Asn33-Gly34-Glu35替换为Arg32-Gly33-Asp34-Ser35，再在其N末端修饰PLG寡肽，重组水蛭素PLG-HV2-RGDS氨基酸序列为：SEQ ID NO.5，基因序列为：SEQ ID NO.6。

实施例4

本实施例中用于重组的水蛭素为水蛭素突变体，是将野生型水蛭素HV3肽链的Ser32-Asn33-Gly34-Lys35替换为Arg32-Gly33-Asp34-Ser35，再在其N末端修饰PLG寡肽，重组水蛭素的结构为：PLG-HV3-RGDS，氨基酸序列为：SEQ ID NO.7，基因序列为：SEQ IDNO.8。

实施例5

本实施例中重组水蛭素，是将野生型水蛭素HV2肽链的Ser32-Asn33-Gly34-Glu35替换为Arg32-Gly33-Asp34-Met35，再在其N末端修饰PLGL寡肽，重组水蛭素PLG-HV2-RGDM氨基酸序列为：SEQ ID NO.9，基因序列为：SEQ ID NO.10。

实施例6

本实施例中用于重组的水蛭素为水蛭素突变体，是将野生型水蛭素HV3肽链的Ser32-Asn33-Gly34-Lys35替换为Arg32-Gly33-Asp34-Met35(RGDM)，重组水蛭素PLG-HV3-RGDM，氨基酸序列为：SEQ ID NO.11，基因序列为：SEQ ID NO.12。

实施例7

本实施例的重组水蛭素，是靶向整合素αvβ3的多肽RGD4C与N末端氨基酸是I的水蛭素异构体HV2通过Linker和寡肽PLG连接而成的融合蛋白RPH2(RGD4C-PLG-HV2)，重组水蛭素的结构为：RGD4C-Linker1-MMP9酶切位点-HV2，氨基酸序列为：SEQ ID NO.13基因序列为：SEQ ID NO.14。

其中，RGD4C可被其它包含RGD序列的可靶向结合αvβ3的短肽序列替换。PLGI可被其它MMP9识别并酶切底物肽序列替换，其共同特点为包含有GI序列，以保证经MMP9酶切后，释放的水蛭素N末端的氨基酸为I；Linker1的长度为2～15个氨基酸。

实施例8

本实施例的重组水蛭素，是靶向整合素αvβ3的多肽RGD4C与N末端氨基酸是I的水蛭素异构体HV3通过Linker和寡肽PLG连接而成的融合蛋白RPH3(RGD4C-PLG-HV3)，重组水蛭素的结构为：RGD4C-Linker1-MMP9酶切位点-HV3，氨基酸序列为：SEQ ID NO.15，基因序列为：SEQ ID NO.16。

其中，RGD4C可被其它包含RGD序列的可靶向结合αvβ3的短肽序列替换。PLGI可被其它MMP9识别并酶切底物肽序列替换，其共同特点为包含有GI序列，以保证经MMP9酶切后，释放的水蛭素N末端的氨基酸为I。Linker1的长度为2～15个氨基酸。

实施例9

本实施方式的重组水蛭素是人白蛋白与N末端氨基酸是I的水蛭素异构体HV2通过寡肽PLG连接而成的融合蛋白HPH2(HSA-PLG-HV2)，HPH2氨基酸序列为：SEQ ID NO.17，基因序列为：SEQ ID NO.18

实施例10

本实施方式的重组水蛭素是人白蛋白与N末端氨基酸是I的水蛭素异构体HV3通过寡肽PLG连接而成的融合蛋白HPH3(HSA-PLG-HV3)，HPH3氨基酸序列为：SEQ ID NO.19，基因序列为：SEQ ID NO.20。

实施例11

本实施方式的重组水蛭素，是人嵌合免疫球蛋白Fc段与N末端氨基酸是I的水蛭素异构体HV2通过寡肽PLG连接而成的融合蛋白FPH2(Fc-PLG-HV2)，人嵌合免疫球蛋白Fc段包含人IgG4铰链区、Fc段序列和IgM尾片序列，FPH2氨基酸序列为：SEQ ID NO.21，基因序列为：SEQ ID NO.22。

实施例12

本实施方式的重组水蛭素，是人嵌合免疫球蛋白Fc段与N末端氨基酸是I的水蛭素异构体HV3通过寡肽PLG连接而成的融合蛋白FPH3(Fc-PLG-HV3)，人嵌合免疫球蛋白Fc段包含人IgG4铰链区、Fc段序列和IgM尾片序列，FPH3氨基酸序列为：SEQ ID NO.23，基因序列为：SEQ ID NO.24。

实施例13

本实施例的肿瘤特异性重组水蛭素的制备方法，包括以下步骤：化学合成上述实施例1～12任一的肿瘤特异性重组水蛭素基因片段，并将其连接成编码基因，将编码基因***载体中制备重组载体，用该重组载体转化或转染宿主细胞，宿主细胞为大肠杆菌、乳酸菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞，培养宿主细胞，之后离心收集上清液，经超滤浓缩、凝胶过滤、离子交换三步法纯化获得肿瘤特异性重组水蛭素。

本实施例用于重组的载体优选的为真核表达载体，采用pPIC9K。宿主细胞为甲醇营养型酵母菌株GS115。

宿主细胞GS115的发酵方法为：用低盐培养基扩增工程菌，诱导前用含微量元素的甘油溶液进行补料，培养增殖后，用含微量元素的甲醇溶液进行诱导表达，发酵参数为：温度30℃、氧容量控制在35±5％、pH＝5、搅拌速度与DO连动。

实施例14

表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞制备方法是将人源分泌型信号肽编码基因与上述实施例1～12任一的肿瘤特异性重组水蛭素的编码基因相连，制备成重组基因载体，转染免疫细胞，获得表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞。

过继免疫细胞的膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面。该过继免疫细胞的膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面。靶标分子为CD19的全长或其截短片段，或CD20的全长或其截短片段。

本实施例的表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞制备方法包括步骤S1～S3，具体如下。

S1、体外培养人源CIK细胞，包括步骤A的外周血单个核细胞(PBMC)采集和步骤B的CIK细胞培养。

A、外周血单个核细胞的采集具有以下步骤：

A1、自患者体内抽取外周血50-100ml；

A2、淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化PBMC；

A3、无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90％以上的PBMC。

B、CIK细胞的培养：

B1、将PBMC按1～2×10⁶/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000U/ml的重组人IFN-γ，37℃，5％CO₂培养箱中培养；

B2、24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300U/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖；

注：此时也可同时加入100U/ml的重组人IL-1α。

B3、每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300U/ml；

B4、在培养的第14d，收获CIK细胞。

其中，细胞培养基中还可添加5％～20％的自体血清。

S2、制备重组基因载体.

本实施列采用肿瘤特异性重组水蛭素RPH2(RGD4C-PGR-HV2)基因序列，融合蛋白RPH2的氨基酸序列为：SEQ ID NO.13，基因序列为：SEQ ID NO.14。依照肿瘤特异性重组水蛭素RPH2的基因序列，在其N末端添加人酰胺化酶信号肽序列，其氨基酸序列为：SEQ IDNO.25，基因序列为SEQ ID NO.26。化学合成基因片段，将其连接成重组编码基因，N端添加NheⅠ限制性酶切位点，C端添加EcoRⅠ限制性酶切位点。

本实施列采用靶标分子结构为：GM-CSFR信号肽-ΔCD20-Linker2-CD28跨膜段，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.27，基因序列为SEQ ID NO.28。化学合成基因片段，N端添加BamHⅠ限制性酶切位点，C端添加NotⅠ限制性酶切位点。

应用基因工程技术制备编码肿瘤特异性重组水蛭素和膜型分子靶标的基因载体，将信号肽序列-肿瘤特异性重组水蛭素序列和信号肽序列-靶标分子序列-Linker-跨膜段序列两段基因分别克隆入pIRES质粒的两个克隆位点。所用基因工程技术为公知技术，简述如下：

按照已有的方法建立标准的限制性内切酶消化体系，然后利用NheⅠ和EcoRⅠ处理pIRES质粒，回收大片段；利用相同的限制性内切酶NheⅠ和EcoRⅠ处理并回收重组肿瘤特异性水蛭素RPH基因片段，然后与上述酶切好的载体pIRES大片段相连，构建出重组肿瘤特异性水蛭素表达质粒pIRES-RPH；转化大肠杆菌DH5α后，筛选出阳性克隆并扩增。

纯化pIRES-RPH2质粒，然后利用BamHⅠ和NotⅠ处理pIRES-RPH2质粒，回收大片段；利用相同的限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ处理并回收重组GM-CSFR信号肽-ΔCD20-Linker2-CD28跨膜段基因片段，然后与上述酶切好的pIRES-RPH2载体大片段相连，构建出同时表达重组肿瘤特异性水蛭素和膜型分子靶标CD20的双表达质粒pIRES-RPH2/CD20。转化大肠杆菌DH5α后，筛选出阳性克隆并扩增，纯化pIRES-RPH2/CD20质粒。

S3、纯化经步骤S2得到的pIRES-RPH2/CD20重组质粒，用该重组载体以质粒电转染方法转染步骤S1得到的CIK细胞，之后进行细胞培养36h以上，得到表达重组水蛭素的CIK细胞，经流式细胞仪检测获得转染率，根据临床需要计算所需阳性细胞数量，回输肿瘤患者。

该表达肿瘤特异性重组水蛭素的CIK细胞，用于抗凝、抗血栓、防治肿瘤的生物治疗，尤其是防治伴有高凝状态和/或血栓的肿瘤患者的生物治疗。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110>何向锋

<120>一种肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途

<160>28

<210>1

<211>68

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Pro Leu Gly Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn

5 10 15

Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys

20 25 30

Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Glu Glu Asn Gln Cys Val Thr Gly

35 40 45

Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu

50 55 60

Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln

65

<210>2

<211>207

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cccttaggta ttacttacac tgattgtaca gaatcgggtc aaaatttgtg cctctgcgag 60

ggaagcaatg tttgcggtaa aggcaataag tgcatattgg gttctaatgg agaggaaaac 120

caatgtgtca ctggcgaagg tacaccgaag cctcaaagcc ataataacgg cgatttcgaa 180

gaaattccag aagaatattt acaatga 207

<210>3

<211>70

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Pro Leu Gly Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Ile Glu Ser Gly Gln Asn

5 10 15

Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys

20 25 30

Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Asp Asn Gln Cys Val Thr Gly

35 40 45

Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe Glu

50 55 60

Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Glu Lys

65 70

<210>4

<211>213

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cccttaggta ttacttacac tgattgtata gaatcgggtc aaaatttgtg cctctgcgag 60

ggaagcaatg tttgtggtaa aggcaataag tgcatattgg gttctaatgg aaaggacaac 120

caatgtgtca ctggcgaagg tacaccgaag cctcaaagcc ataatcaagg cgatttcgaa 180

ccaattccag aagacgctta tgatgaaaaa tga 213

<210>5

<211>68

<212> PRT

<213>人工序列

<400>5

Pro Leu Gly Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn

5 10 15

Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys

20 25 30

Cys Ile Leu Gly Arg Gly Asp Ser Glu Asn Gln Cys Val Thr Gly

35 40 45

Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu

50 55 60

Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln

65

<210>6

<211>207

<212> DNA

<213>人工序列

<400>6

cccttaggta ttacttacac tgattgtaca gaatcgggtc aaaatttgtg cctctgcgag 60

ggaagcaatg tttgcggtaa aggcaataag tgcatattgg gtcgcggaga ttctgaaaac 120

caatgtgtca ctggcgaagg tacaccgaag cctcaaagcc ataataacgg cgatttcgaa 180

gaaattccag aagaatattt acaatga 207

<210>7

<211>70

<212> PRT

<213>人工序列

<400>7

Pro Leu Gly Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Ile Glu Ser Gly Gln Asn

5 10 15

Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys

20 25 30

Cys Ile Leu GlyArg Gly Asp Ser Asp Asn Gln Cys Val Thr Gly

35 40 45

Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe Glu

50 55 60

Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Glu Lys

65 70

<210>8

<211>213

<212> DNA

<213>人工序列

<400>8

cccttaggta ttacttacac tgattgtata gaatcgggtc aaaatttgtg cctctgcgag 60

ggaagcaatg tttgtggtaa aggcaataag tgcatattgg gtcgcggaga ttctgacaac 120

caatgtgtca ctggcgaagg tacaccgaag cctcaaagcc ataatcaagg cgatttcgaa 180

ccaattccag aagacgctta tgatgaaaaa tga 213

<210>9

<211>68

<212> PRT

<213>人工序列

<400>9

Pro Leu Gly Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn

5 10 15

Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys

20 25 30

Cys Ile Leu Gly Arg Gly Asp Met Glu Asn Gln Cys Val Thr Gly

35 40 45

Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu

50 55 60

Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln

65

<210>10

<211>207

<212> DNA

<213>人工序列

<400>10

cccttaggta ttacttacac tgattgtaca gaatcgggtc aaaatttgtg cctctgcgag 60

ggaagcaatg tttgcggtaa aggcaataag tgcatattgg gtcgcggaga tatggaaaac 120

caatgtgtca ctggcgaagg tacaccgaag cctcaaagcc ataataacgg cgatttcgaa 180

gaaattccag aagaatattt acaatga 207

<210>11

<211>70

<212> PRT

<213>人工序列

<400>11

Pro Leu Gly Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Ile Glu Ser Gly Gln Asn

5 10 15

Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys

20 25 30

Cys Ile Leu Gly Arg Gly Asp Met Asp Asn Gln Cys Val Thr Gly

35 40 45

Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe Glu

50 55 60

Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Glu Lys

65 70

<210>12

<211>213

<212> DNA

<213>人工序列

<400>12

cccttaggta ttacttacac tgattgtata gaatcgggtc aaaatttgtg cctctgcgag 60

ggaagcaatg tttgtggtaa aggcaataag tgcatattgg gtcgcggaga tatggacaac 120

caatgtgtca ctggcgaagg tacaccgaag cctcaaagcc ataatcaagg cgatttcgaa 180

ccaattccag aagacgctta tgatgaaaaa tga 213

<210>13

<211>109

<212> PRT

<213>人工序列

<400>13

Met Glu Phe Trp Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys

5 10 15

Gly Val Gln Cys Ala Cys Asp CysArg Gly Asp Cys Phe Cys Gly

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Ile

35 40 45

Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys

50 55 60

Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly

65 70 75

Ser Asn Gly Glu Glu Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro

80 85 90

Lys Pro Gln Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu

95 100 105

Glu Tyr Leu Gln

<210>14

<211>330

<212> DNA

<213>人工序列

<400>14

atggagtttt ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt taaaaggtgt ccagtgtgca 60

tgtgattgta ggggagattg tttttgtggt agcggtggcg gtggctctgg tggtggtggc 120

agccccttag gtattactta cactgattgt acagaatcgg gtcaaaattt gtgcctctgc 180

gagggaagca atgtttgcgg taaaggcaat aagtgcatat tgggttctaa tggagaggaa 240

aaccaatgtg tcactggcga aggtacaccg aagcctcaaa gccataataa cggcgatttc 300

gaagaaattc cagaagaata tttacaatga 330

<210>15

<211>111

<212> PRT

<213>人工序列

<400>15

Met Glu Phe Trp Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys

5 10 15

Gly Val Gln Cys Ala Cys Asp CysArg Gly Asp Cys Phe Cys Gly

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Ile

35 40 45

Thr Tyr Thr Asp Cys Ile Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys

50 55 60

Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly

65 70 75

Ser Asn Gly Lys Asp Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro

80 85 90

Lys Pro Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu

95 100 105

Asp Ala Tyr Asp Glu Lys

110

<210>16

<211>336

<212> DNA

<213>人工序列

<400>16

atggagtttt ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt taaaaggtgt ccagtgtgca 60

tgtgattgta ggggagattg tttttgtggt agcggtggcg gtggctctgg tggtggtggc 120

agccccttag gtattactta cactgattgt atagaatcgg gtcaaaattt gtgcctctgc 180

gagggaagca atgtttgtgg taaaggcaat aagtgcatat tgggttctaa tggaaaggac 240

aaccaatgtg tcactggcga aggtacaccg aagcctcaaa gccataatca aggcgatttc 300

gaaccaatc cagaagacgc ttatgatgaa aaatga 336

<210>17

<211>653

<212> PRT

<213>人工序列

<400>17

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly

5 10 15

Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr

20 25 30

Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu

35 40 45

Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu

50 55 60

Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys

65 70 75

Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys

80 85 90

Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His

95 100 105

Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

110 115 120

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu

125 130 135

Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr

140 145 150

Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe

155 160 175

Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro

180 185 190

Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys

195 200 205

Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala

210 215 220

Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys

225 230 235

Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

240 245 250

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp

255 260 265

Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser

270 275 280

Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu

285 290 295

Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala

300 305 310

Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val

315 320 325

Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe

330 335 340

Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu

345 350 355

Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

360 365 370

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp

375 380 385

Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln

390 395 400

Asn Cys Glu Leu Phe Lys Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn

405 410 415

Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr

420 425 430

Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser

435 440 445

Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu

450 455 450

Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu

455 460 465

Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu

485 490 495

Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His

500 505 510

Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys

515 520 525

Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr

530 535 540

Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val

545 550 555

Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu

560 565 570

Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

575 580 585

Pro Leu Gly Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn

590 595 600

Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys

605 610 615

Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Glu Glu Asn Gln Cys Val Thr Gly

620 625 630

Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu

635 640 645

Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln

650

<210>18

<211>336

<212> DNA

<213>人工序列

<400>18

gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60

gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120

aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg tagctgatga gtcagctgaa 180

aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240

cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300

tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360

gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420

gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480

tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540

aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaaatgt 600

gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtggc tcgcctgagc 660

cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720

gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780

gccaagtata tctgtgaaaa tcaggattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840

aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900

gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960

gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020

tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactcta gagaagtgc 1080

tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140

gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aactgtgagc tttttaagca gcttggagag 1200

tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260

ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320

cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380

tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca caaaatgctg cacagagtcc 1440

ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500

gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatatg cacactttct gagaaggag 1560

agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagcttgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620

aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680

gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740

gctgccttag gcttaccctt aggtattact tacactgatt gtacagaatc gggtcaaaat 1800

ttgtgcctctg cgagggaa gcaatgtttgc ggtaaaggca ataagtgcat attgggttct 1860

aatggagagg aaaaccaatg tgtcactggc gaaggtacac cgaagcctcaa agccataat 1920

aacggcgatt tcgaagaaat tccagaagaa tatttacaat ga 1962

<210>19

<211>655

<212> PRT

<213>人工序列

<400>19

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly

5 10 15

Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr

20 25 30

Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu

35 40 45

Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu

50 55 60

Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys

65 70 75

Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys

80 85 90

Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His

95 100 105

Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

110 115 120

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu

125 130 135

Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr

140 145 150

Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe

155 160 165

Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro

170 175 180

Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys

185 190 195

Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala

200 205 210

Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys

215 220 225

Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp

245 250 255

Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser

260 265 270

Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu

275 280 285

Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala

290 295 300

Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val

305 310 315

Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe

320 325 330

Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu

335 340 345

Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

350 355 360

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp

365 370 375

Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln

380 385 390

Asn Cys Glu Leu Phe Lys Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn

405 410 415

Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr

420 425 430

Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser

435 440 445

Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu

450 455 450

Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu

455 460 465

Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu

485 490 495

Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His

500 505 510

Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys

515 520 525

Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr

530 535 540

Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val

545 550 555

Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu

560 565 570

Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

575 580 585

Pro Leu Gly Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Ile Glu Ser Gly Gln Asn

590 595 600

Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys

605 610 615

Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Asp Asn Gln Cys Val Thr Gly

620 625 630

Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe Glu

635 640 645

Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Glu Lys

650

<210>20

<211>336

<212> DNA

<213>人工序列

<400>20

gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60

gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120

aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg tagctgatga gtcagctgaa 180

aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240

cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300

tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360

gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420

gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480

tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540

aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaaatgt 600

gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtggc tcgcctgagc 660

cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720

gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780

gccaagtata tctgtgaaaa tcaggattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840

aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900

gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960

gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020

tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactcta gagaagtgc 1080

tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140

gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aactgtgagc tttttaagca gcttggagag 1200

tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260

ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320

cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380

tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca caaaatgctg cacagagtcc 1440

ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500

gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatatg cacactttct gagaaggag 1560

agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagcttgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620

aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680

gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740

gctgccttag gcttaccctt aggtattact tacactgatt gtatagaatc gggtcaaaat 1800

ttgtgcctct gcgagggaag caatgtttgt ggtaaaggca ataagtgcat attgggttct 1860

aatggaaagg acaaccaatg tgtcactggc gaaggtacac cgaagcctca aagccataat 1920

caaggcgatt tcgaaccaat tccagaagac gcttatgatg aaaaatga 1968

<210>21

<211>313

<212> PRT

<213>人工序列

<400>21

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

5 10 15

Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

50 55 60

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

65 70 75

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

80 85 90

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

95 100 105

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

110 115 120

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

125 130 135

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

140 145 150

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

155 160 165

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

170 175 180

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

185 190 195

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

200 205 200

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

215 220 225

Ser Leu Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser

230 235 240

Asp Thr Ala Gly Thr Pro Leu Gly Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr

245 250 255

Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys

260 265 270

Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Glu Glu Asn

275 280 285

Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn

290 295 300

Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln

300 310

<210>22

<211>942

<212> DNA

<213>人工序列

<400>22

gaatctaagt acggccctcc ctgcccaccc tgtcctgctc cagagtttct gggcggaccc 60

tccgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa 120

gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccag gaagatcccg aggtccagtt caattggtac 180

gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gttcaactcc 240

acctaccggg tggtgtctgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagag 300

tacaagtgca aggtctccaa caagggcctg ccctccagca tcgaaaagac catctccaag 360

gccaagggcc agccccgcga gcctcaggtg tacacactgc cccctagcca agaagagatg 420

accaagaacc aggtgtccct gacatgcctg gtgaagggct tctacccctc cgatatcgcc 480

gtggaatggg agtccaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540

gactccgacg gctccttctt cctgtactct cggctgaccg tggacaagtc ccggtggcag 600

gaaggcaacg tcttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660

aagtctctga gcctgtccct gggcaagccc accctgtaca acgtgtccct ggtcatgtcc 720

gacacagctg gcaccccctt aggtattact tacactgatt gtacagaatc gggtcaaaat 780

ttgtgcctct gcgagggaag caatgtttgc ggtaaaggca ataagtgcat attgggttct 840

aatggagagg aaaaccaatg tgtcactggc gaaggtacac cgaagcctca aagccataat 900

aacggcgatt tcgaagaaat tccagaaga atatttacaat ga 942

<210>23

<211>315

<212> PRT

<213>人工序列

<400>23

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

5 10 15

Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

50 55 60

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

65 70 75

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

80 85 90

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

95 100 105

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

110 115 120

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

125 130 135

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

140 145 150

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

155 160 165

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

170 175 180

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

185 190 195

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

200 205 200

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

215 220 225

Ser Leu Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser

230 235 240

Asp Thr Ala Gly Thr Pro Leu Gly Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Ile

245 250 255

Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys

260 265 270

Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Asp Asn

275 280 285

Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn

290 295 300

Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Glu Lys

305 310 315

<210>24

<211>948

<212> DNA

<213>人工序列

<400>24

gaatctaagt acggccctcc ctgcccaccc tgtcctgctc cagagtttct gggcggaccc 60

tccgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa 120

gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccag gaagatcccg aggtccagtt caattggtac 180

gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gttcaactcc 240

acctaccggg tggtgtctgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagag 300

tacaagtgca aggtctccaa caagggcctg ccctccagca tcgaaaagac catctccaag 360

gccaagggcc agccccgcga gcctcaggtg tacacactgc cccctagcca agaagagatg 420

accaagaacc aggtgtccct gacatgcctg gtgaagggct tctacccctc cgatatcgcc 480

gtggaatggg agtccaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540

gactccgacg gctccttctt cctgtactct cggctgaccg tggacaagtc ccggtggcag 600

gaaggcaacg tcttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660

aagtctctga gcctgtccct gggcaagccc accctgtaca acgtgtccct ggtcatgtcc 720

gacacagctg gcaccccctt aggtattact tacactgatt gtatagaatc gggtcaaaat 780

ttgtgcctct gcgagggaag caatgtttgt ggtaaaggca ataagtgcat attgggttct 840

aatggaaagg acaaccaatg tgtcactggc gaaggtacac cgaagcctca aagccataat 900

caaggcgatt tcgaaccaat tccagaagac gcttatgatg aaaaatga 948

<210>25

<211>20

<212> PRT

<213>人工序列

<400>25

Met Ala Gly Arg Val Pro Ser Leu Leu Val Leu Leu Val Phe Pro

5 10 15

Ser Ser Cys Leu Ala

20

<210>26

<211>60

<212> DNA

<213>人工序列

<400>26

atggctggcc gcgtccctag cctgctagtt ctccttgttt ttccaagcag ctgtttggct 60

<210>27

<211>83

<212> PRT

<213>人工序列

<400>27

Met Val Leu Ala Gln Gly Leu Leu Ser Met Ala Leu Leu Ala Leu

5 10 15

Cys Trp Glu Arg Ser Leu Ala Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala

20 25 30

Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser

35 40 45

Ile Gln Ser Gly Gly Ser Gly Gly Pro Phe Trp Val Leu Val Val

50 55 60

Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala

65 70 75

Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser

80

<210>28

<211>252

<212> DNA

<213>人工序列

<400>28

atggtgctgg cccaggggct gctctccatg gccctgctgg ccctgtgctg ggagcgcagc 60

ctggcaaaca tatacaactg tgaaccagct aatccctctg agaaaaactc cccatctacc 120

caatactgtt acagcataca atctggcgga agcggaggcc ccttttgggt gctggtggtg 180

gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg 240

gtgaggagtt aa 252

Claims

1.一种肿瘤特异性重组水蛭素，其特征在于，所述重组水蛭素的N末端含有可被MMP9识别并裂解的寡肽序列，用于重组的水蛭素为水蛭素异构体、水蛭素突变体、水蛭素嵌合体、截短的水蛭肽、基因修饰的水蛭素或水蛭素融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的肿瘤特异性重组水蛭素，其特征在于，所述寡肽序列为可被MMP9识别并裂解的短肽，其结构特征为XnGI，Xn代表任意数量的任意氨基酸。

3.根据权利要求1所述的肿瘤特异性重组水蛭素，其特征在于，所述重组水蛭素是在水蛭素异构体HV2或HV3的N末端修饰有寡肽PLG，与水蛭素异构体HV2或HV3的N末端的异亮氨酸共同组成MMP9识别并酶切的底物肽序列PLGI，重组水蛭素PLG-HV2氨基酸序列为：SEQ IDNO.1，基因序列为：SEQ ID NO.2，重组水蛭素PLG-HV3氨基酸序列为：SEQ ID NO.3，基因序列为：SEQ ID NO.4；

或者，所述重组水蛭素，是将野生型水蛭素HV2或HV3肽链的Ser32-Asn33-Gly34-Glu35替换为Arg32-Gly33-Asp34-Ser35，再在其N末端修饰PLG寡肽，所述重组水蛭素PLG-HV2-RGDS氨基酸序列为：SEQ ID NO.5，基因序列为：SEQ ID NO.6，重组水蛭素PLG-HV3-RGDS氨基酸序列为：SEQ ID NO.7，基因序列为：SEQ ID NO.8；

或者，所述重组水蛭素，是将野生型水蛭素HV2或HV3肽链的Ser32-Asn33-Gly34-Glu35替换为Arg32-Gly33-Asp34-Met35，再在其N末端修饰PLG寡肽，所述重组水蛭素PLG-HV2-RGDM氨基酸序列为：SEQ ID NO.9，基因序列为：SEQ ID NO.10，重组水蛭素PLG-HV3-RGDM氨基酸序列为：SEQ ID NO.11，基因序列为：SEQ ID NO.12；

或者，所述重组水蛭素，是靶向整合素αvβ3的多肽RGD4C与N末端氨基酸是I的水蛭素异构体HV2或HV3通过Linker和寡肽PLG连接而成的融合蛋白RPH2，或RPH3，RPH2氨基酸序列为：SEQ ID NO.13，基因序列为：SEQ ID NO.14，RPH3氨基酸序列为：SEQ ID NO.15，基因序列为：SEQ ID NO.16；

或者，所述重组水蛭素，是人嵌合免疫球蛋白Fc段与N末端氨基酸是I的水蛭素异构体HV2或HV3通过寡肽PLG连接而成的融合蛋白FPH2，或FPH3，人嵌合免疫球蛋白Fc段包含人IgG4铰链区、Fc段序列和IgM尾片序列，FPH2氨基酸序列为：SEQ ID NO.21，基因序列为：SEQID NO.22，FPH3氨基酸序列为：SEQ ID NO.23，基因序列为：SEQ ID NO.24。

4.肿瘤特异性重组水蛭素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：化学合成权利要求1～3任一项的肿瘤特异性重组水蛭素基因片段，在其N末端连接信号肽序列，并在重组编码基因的两端添加限制性酶切位点，将编码基因***载体中制备重组载体，用该重组载体转化或转染宿主细胞，培养宿主细胞，并从中回收和纯化该肿瘤特异性重组水蛭素，宿主细胞为大肠杆菌、乳酸菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

5.权利要求1～3任一项所述的肿瘤特异性重组水蛭素在制备抗凝、抗血栓、防治肿瘤的药物中的应用，尤其是防治肿瘤伴发高凝状态和血栓性病变的药物、保健品和功能性食品中的应用。

6.表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞制备方法，其特征在于，体外培养人源免疫细胞，将人源分泌型信号肽编码基因与权利要求1～3任一项的肿瘤特异性重组水蛭素的编码基因相连，并在重组编码基因的两端添加限制性酶切位点，将编码基因***载体中制备成重组基因载体，转染免疫细胞，获得表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞。

7.根据权利要求6所述的表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞制备方法，其特征在于，所述人源分泌型信号肽为人酰胺化酶信号肽，氨基酸序列为：SEQ ID NO.25，基因序列为：SEQ ID NO.26。

8.根据权利要求6所述的表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞制备方法，其特征在于，所述免疫细胞为αβT、γδT、NKT、NK、DC、CIK、CAR-T、CAR-NK、TCR-T中的一种或多种，所述免疫细胞为人源免疫细胞。

9.根据权利要求6所述的表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞制备方法，其特征在于，所述过继免疫细胞的膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面。

10.根据权利要求9所述的表达水蛭素的过继免疫细胞，其特征在于，所述靶标分子为CD19的全长或其截短片段，或CD20的全长或其截短片段。

11.根据权利要求10所述的表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞制备方法，其特征在于，所述靶标分子及跨膜段的结构为：GM-CSFR信号肽-ΔCD20-Linker2-CD28跨膜段，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.27，基因序列为SEQ ID NO.28。

12.权利要求6所述的表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞，用于抗凝、抗血栓、防治肿瘤的生物治疗，尤其是防治伴有高凝状态和/或血栓的肿瘤患者的生物治疗。