CN107096019A - 一种基于抗原蛋白多聚体的结核分枝杆菌亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents
一种基于抗原蛋白多聚体的结核分枝杆菌亚单位疫苗及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明用八臂聚乙二醇(8arm‑PEG‑NHS)修饰结核分枝杆菌的CFP10‑TB10.4融合抗原蛋白,使抗原蛋白多聚体化,然后分别与铝佐剂/洛索立宾(loxoribine)混合物和聚肌苷酸胞苷酸(poly(I:C))物理混合,形成一种新型的结核分枝杆菌亚单位疫苗。该亚单位疫苗能诱导产生高水平的体液免疫应答和细胞免疫应答。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体地,本发明涉及一种基于八臂聚乙二醇修饰结核分枝杆菌抗原蛋白,形成抗原蛋白多聚体,从而作为一种结核分枝杆菌亚单位疫苗。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染引起的一种慢性传染病,是当今严重危害人类健康的公共卫生问题之一。据2014年世界卫生组织报告,估计全球有960万新的活动性结核病例和150万死亡病例,约三分之一的世界人口感染了结核分枝杆菌。中国一直是世界上结核病疫情较严重的国家,同时也是全球20多个结核病高负担国家之一。
卡介苗(BCG)是全球控制结核病疫情最常用的疫苗。通常在婴儿出生后不久给予接种卡介苗。卡介苗能有效地控制粟粒性结核病在婴幼儿中的发展,但对成年人的活动性肺结核不起作用,并且卡介苗无法控制潜伏性肺结核的再活化作用。此外,卡介苗在近几年的临床应用中效果不甚理想,总体的有效防控率不超过50%,而且在不同国家和不同地区的接种效果也不尽相同。目前,越来越多的国家面临多重耐药菌株的感染、HIV合并感染等诸多问题,这使得结核病的防控更加棘手,迫切需要开发更加安全有效的疫苗。蛋白质亚单位疫苗是一种新型、安全、经济的疫苗,但其存在免疫原性弱的缺点。因此,需要通过提高抗原蛋白的免疫原性来提高蛋白质亚单位疫苗的免疫保护效果,同时免疫佐剂递送***也可提高抗原蛋白诱导产生保护性免疫应答的能力。
目前,已经有多种基于结核分枝杆菌抗原蛋白的亚单位疫苗进入临床试验阶段。TB10.4和CFP10属于结核分枝杆菌早期分泌的抗原蛋白,是结核分枝杆菌重要的抗原蛋白。本发明所用的CFP10-TB10.4融合蛋白(CT)是将TB10.4和CFP10融合表达得到,其分子量为25kDa。CT仍属于低分子量的抗原蛋白,具有较低的免疫原性。通常认为在抗原蛋白多聚体化与其免疫原性增强之间存在潜在的联系。有一种解释是抗原蛋白多聚体化使得其抗原决定簇的重复结构增多,增强了免疫***吞噬、摄取、识别、提呈和加工的能力。
铝盐佐剂在20世纪20年代被首次用作免疫佐剂使用,并且是至今应用最为广泛的一类疫苗佐剂。铝盐佐剂可通过激活Th2型细胞分泌IL-4,诱发以体液免疫为主的免疫应答,尤其是IgG1和IgE抗体应答,并可以与其它佐剂或疫苗递送***相容。洛索立宾(loxoribine,7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guanosine)是一种人工合成的鸟苷类似物,可以作为免疫调节剂使用。此外,洛索立宾作为TLR7激动剂,可以与TLR7结合,进而激活MyD88依赖性的TLR/IL-1R信号通路,促进CD4+T细胞的增殖和细胞因子的分泌。聚肌胞苷酸(polyinsinicpolycytidylic acid,poly(I:C))是一种人工合成的双链RNA,可作为病原体相关的分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)与机体的TLR3结合,产生类似病毒感染的免疫反应,是一种高效的干扰素诱生剂。研究表明,poly(I:C)作为免疫佐剂,可提高蛋白类疫苗的体液免疫应答和细胞免疫应答。Poly(I:C)还可以增强局部引流***中树突状细胞的比例,诱导树突状细胞的稳定与成熟,增加活化的抗原特异性CD4+T细胞增殖和存活,并增强抗原特异性CD8+T细胞的数量及其在体内的存活。
发明内容
1.本发明通过化学修饰的方法,将八臂聚乙二醇与CFP10-TB10.4融合蛋白(CT)偶联形成CT抗原蛋白多聚体(CT-PEG),并加入免疫佐剂制备出了一种新型结核分枝杆菌亚单位疫苗,能够诱导机体产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答。八臂聚乙二醇有八个分枝末端,每个末端带有一个琥珀酰亚胺酯基团。
2.本发明涉及多聚体蛋白的制备工艺,包括以下步骤:
(1)将八臂聚乙二醇溶于20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中,加入溶于20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的CT,于4℃下反应12小时。
(2)CT-PEG的纯化方法采用半制备型凝胶过滤柱Superdex 200凝胶过滤柱(2.6厘米×60厘米),洗脱液为含有0.15M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH 7.4),流速为3毫升/分钟。收集CT-PEG对应的洗脱峰。
3.本发明涉及一种结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备工艺,包括以下步骤:
(1)将铝佐剂溶于20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4),洛索立宾溶于N,N’-二甲基甲酰胺中,将两者混合。将混合物再分别与CT和CT-PEG混合。
(2)将poly(I:C)溶于20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4),并分别与CT和CT-PEG混合。
本发明公开了一种基于八臂聚乙二醇修饰形成抗原蛋白多聚体的结核分枝杆菌亚单位疫苗及其制备方法,其技术优势体现在以下几方面:
(1)本发明将八臂聚乙二醇与CT融合蛋白偶联,使CT融合蛋白实现了多聚体化。抗原蛋白多聚体所诱导的免疫应答要显著高于单体CT融合蛋白。
(2)本发明在抗原蛋白多聚体的基础上,分别加入铝佐剂-洛索立宾混合物和poly(I:C),进一步提高了抗原蛋白多聚体的免疫原性。
(3)本发明所涉及的结核分枝杆菌亚单位疫苗,其中抗原蛋白多聚体的结构特征与单体蛋白相比,未发生显著改变。
(4)本发明所涉及的结核分枝杆菌亚单位疫苗,在37℃下具有较高的热稳定性,且显著优于单体CT融合蛋白。
附图说明
图1凝胶过滤法纯化CT-PEG。用半制备型凝胶过滤柱Superdex 200(2.6厘米×60厘米)纯化CT-PEG。流动相为PBS缓冲液(pH 7.4),流速3.0毫升/分钟,检测波长为280纳米。
图2凝胶过滤分析CT-PEG。用分析型凝胶过滤柱Superdex 200(1厘米×30厘米)检测CT和CT-PEG。分析条件:流动相为PBS缓冲液(pH 7.4),流速0.5毫升/分钟,检测波长为280纳米。
图3内源荧光光谱分析CT-PEG的三级结构。蛋白浓度为0.1毫克/毫升,激发波长为280纳米,发射波长的扫描范围为300纳米-400纳米,缓冲体系为20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)。
图4CT-PEG在37℃下的热稳定性。将CT和CT-PEG溶液分别放入水浴锅中,于37℃水浴。于不同水浴时间取出样品,立即放入4℃冰箱中。用内源荧光光谱检测CT和CT-PEG的三级结构,计算剩余荧光强度的百分比。
图5结核分枝杆菌亚单位疫苗诱导产生的CT特异性抗体。CT特异性抗体滴度由ELISA方法测定。
图6结核分枝杆菌亚单位疫苗诱导产生的细胞因子。图a为测定TNF-α的浓度;图b为测定IFN-γ的浓度;图c为测定IL-5的浓度;图d为测定IL-10的浓度;图e为测定IL-2的浓度;图f为测定IL-4的浓度。
具体实施方式
实施例1:抗原蛋白多聚体的制备
八臂聚乙二醇(2毫升,10mM)与CT(2毫升,1mM)于20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中混合,于4℃下反应过夜。将反应混合物加载到Superdex 200凝胶过滤柱(2.6厘米×60厘米)上,从反应混合物中纯化出CT-PEG。凝胶过滤柱由PBS缓冲液(pH 7.4)进行平衡和洗脱,流速为3.0毫升/分钟。如图1所示,将反应混合物加载到凝胶过滤柱后,出现了两个分开的洗脱峰,分别对应于CT-PEG和八臂聚乙二醇。收集CT-PEG对应的洗脱峰。
实施例2:疫苗的结构表征
CT-PEG由分析型Superdex 200凝胶过滤柱(1.0厘米×30厘米)进行鉴定,洗脱液为PBS缓冲液(pH 7.4),流速为0.5毫升/分钟。如图2所示,与融合蛋白CT相比,CT-PEG出峰时间明显提前,表明其分子量显著增加。
用内源荧光光谱检测CT-PEG的三级结构。在280纳米的波长下激发样品。融合蛋白CT在300-400纳米的荧光发光基团主要来源于色氨酸。如图3所示,CT与CT-PEG的最大发射波长相同,说明经过八臂聚乙二醇修饰后,CT的三级结构没有发生明显的变化。
将CT和CT-PEG溶液分别放入水浴锅中,于37℃水浴。于不同水浴时间取出样品,立即放入4℃冰箱中。用内源荧光光谱检测CT和CT-PEG的三级结构,在280纳米的波长下激发样品。测定CT与CT-PEG的最大荧光强度,并与未水浴处理的样品进行比较,测定剩余荧光强度的百分比,用于评价样品在37℃热处理条件下的稳定性。如图4所示,CT的剩余荧光强度下降较快,在37℃热处理24小时后仅保留52.6%的剩余荧光强度。相比之下,CT-PEG的剩余荧光强度下降地非常缓慢,在37℃热处理24小时后还保留92.8%的剩余荧光强度。这表明CT-PEG具有较高的热稳定性,且其热稳定性显著高于CT。
实施例3:测定疫苗诱导的抗体水平
选取48只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠,随机分为8组,即PBS组、PEG组、CT组、CT-PEG组、CT/A-L组、CT-PEG/A-L组、CT/P组和CT-PEG/P组,每组6只小鼠。以腹腔注射的方式,注射剂量为每只小鼠每次含有20微克蛋白。CT/A-L组与CT-PEG/A-L组每针剂含有200微克铝佐剂和40微克洛索立宾;CT/P组和CT-PEG/P组含有50微克poly(I:C);分别于第0、第7和14天注射样品,共注射三次。第二、三次注射前(即第7和14天)和第三次注射后(即第21天)分别从眼眶取血。离心收集血清,于-80℃保存备用。用ELISA法检测小鼠血清中CT特异性的IgG滴度。
如图5所示,在第21天,CT组产生的CT特异性IgG滴度较低,而CT-PEG组产生的CT特异性IgG滴度是CT组的10.0倍。这表明CT多聚体化可以增加亚单位疫苗的CT特异性IgG滴度。CT/A-L组和CT/P组产生的CT特异性IgG滴度要显著高于CT组。CT-PEG/A-L组和CT-PEG/P组产生的CT特异性IgG滴度要显著高于CT-PEG组,分别是CT-PEG组的2.3倍和4.3倍。这表明铝佐剂-洛索立宾和poly(I:C)能进一步提高了CT-PEG的免疫原性。此外,CT-PEG组产生的CT特异性IgG滴度要高于CT/A-L组和CT/P组,这表明CT多聚体化比免疫佐剂能更为有效地提高CT的免疫原性。
实施例4:测定疫苗诱导的细胞免疫水平
于第21天取出BALB/c小鼠的新鲜脾脏,研磨分离出脾脏细胞,进行细胞培养。在细胞数目达到5×106以后,用20微克/毫升的抗原蛋白CT刺激细胞72个小时,离心收集细胞培养液上清。使用TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-10细胞因子ELISA检测试剂盒,测定脾脏细胞培养液上清中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-10的水平。
如图6所示,PEG组、PBS组和CT组的TNF-α、IFN-γ、IL-5、IL-10、IL-2和IL-4水平较低。CT-PEG组的TNF-α、IFN-γ、IL-5、IL-10、IL-2和IL-4水平分别是CT组的3.0、2.5、7.5、2.6、2.6和2.8倍。这表明CT多聚体化可以增加亚单位疫苗的细胞免疫应答和体液免疫应答。CT/A-L组和CT/P组产生的细胞因子水平要显著高于CT组。相比之下,CT-PEG组产生的TNF-α水平高于CT/A-L组,与CT/P组的TNF-α水平相当。CT-PEG组产生的IFN-γ水平要低于CT/A-L组和CT/P组,但IL-2、IL-4、IL-5和IL-10水平均高于CT/A-L组和CT/P组。这表明CT多聚体化比免疫佐剂能更为有效地提高CT的免疫原性。
CT-PEG/A-L组和CT-PEG/P组产生的细胞因子水平要显著高于CT-PEG组。这表明铝佐剂-洛索立宾和poly(I:C)能进一步提高了CT-PEG的免疫原性。CT-PEG/A-L组的TNF-α、IFN-γ、IL-5、IL-10、IL-2和IL-4水平分别是CT-PEG组的1.8、1.5、5.8、2.3、1.4和1.8倍。CT-PEG/P组的TNF-α、IFN-γ、IL-5、IL-10、IL-2和IL-4水平分别是CT-PEG组的2.8、2.2、1.9、1.4、2.0和1.2倍。需要指出的是,CT-PEG/A-L组产生的Th1型细胞因子(IFN-γ,TNF-α和IL-2)要低于CT-PEG/P组,而Th2型细胞因子(IL-4,IL-5和IL-10)要高于CT-PEG/P组。这表明铝佐剂-洛索立宾倾向于刺激CT-PEG诱导产生Th2型免疫应答,而poly(I:C)倾向于刺激CT-PEG诱导产生Th1型免疫应答。
Claims (6)
1.一种结核分枝杆菌亚单位疫苗,其特征在于,该疫苗是基于八臂聚乙二醇聚合的结核分枝杆菌CFP10-TB10.4融合抗原蛋白多聚体。
2.如权利要求1所述的结核分枝杆菌亚单位疫苗,其特征在于,结核分枝杆菌CFP10-TB10.4融合抗原蛋白多聚体加入了铝佐剂-洛索立宾混合物或者聚肌胞苷酸(poly(I:C))。
3.如权利要求1所述的八臂聚乙二醇,其特征在于,八臂聚乙二醇有八个分枝末端,每个末端带有一个琥珀酰亚胺酯基团,可与CFP10-TB10.4融合抗原蛋白上的氨基发生聚合反应。
4.如权利要求1所述的八臂聚乙二醇,其特征在于,八臂聚乙二醇的分子量为10kDa。
5.权利要求1所述的结核分枝杆菌亚单位疫苗,其特征在于,八臂聚乙二醇与CFP10-TB10.4融合抗原蛋白反应时的摩尔比为(1-10):1,反应体系的pH值为6.0-8.0,反应时的温度为4-25℃,反应时间为0.5-24小时。
6.权利要求1所述的结核分枝杆菌亚单位疫苗,其特征在于,八臂聚乙二醇与CFP10-TB10.4融合抗原蛋白反应后,抗原蛋白聚集体由Superdex 200凝胶过滤柱进行分离纯化,除去未反应的八臂聚乙二醇和CFP10-TB10.4融合抗原蛋白。
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