CN107082814A - 一种长效干扰素及其制备方法 - Google Patents

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孙永越
夏文龙
张鑫宇
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Abstract

本发明属于生物技术研究领域，具体涉及一种长效干扰素及其制备方法。所述的长效干扰素由干扰素与链球菌G蛋白C2结构域组成，其制备方法包括融合表达载体构建、融合干扰素表达与纯化、纯化标签切除和融合干扰素回收。与现有的重组干扰素相比，本发明的长效干扰素具有制备工艺简单、成本低和半衰期长等优点，可以用于人和动物长效干扰素的制备。

Description

一种长效干扰素及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术研究领域，具体涉及一种长效干扰素及其制备方法。
背景技术
干扰素是病毒病的有效治疗药物和肿瘤的辅助治疗药物。现有重组干扰素多为大肠杆菌表达的组氨酸标签融合蛋白，需要用亲和柱纯化。亲和柱不仅价格较贵，而且难以规模化制备。类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide,ELP)是根据弹性蛋白重复序列合成的聚合分子，具有温度敏感的可逆相变特性，在低于相变温度溶液中呈可溶状态，在高于相变温度溶液中呈凝聚状态。因此，ELP融合蛋白不仅可在特定温度下用简单的离心法进行分离纯化，而且纯化效率与亲和层析法相当。
由于分子量较小(15kDa左右)和易被体内清除，干扰素的半衰期较短，治疗慢性疾病时需要反复注射。延长干扰素半衰期的策略主要有聚乙二醇化和与血清白蛋白等融合。其中，聚乙二醇化工艺相对简单，但反应程度较难控制，不仅影响干扰素活性，而且有一定的副作用；血清白蛋白融合干扰素的活性稳定，但纯化程序较复杂、成本较高。链球菌G蛋白(SPG)是免疫球蛋白IgG结合蛋白，其IgG结合区含C1、C2和C3结构域，其中C2结构域足以与人和多种动物的IgG结合。因此，SPG C2结构域融合干扰素可通过与IgG结合而增大分子量、延长半衰期。
多数重组蛋白均需切除融合标签后才有生物活性，常用的策略是先向目的蛋白引入蛋白酶切位点，在纯化获得重组蛋白后，再用烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVP)等切除融合标签。这种策略不仅需要价格昂贵的蛋白酶，还需用额外的亲和层析等步骤去除蛋白酶。
本发明将干扰素与ELP、肝片吸虫Fh8蛋白和SPG C2结构域进行融合表达，用TEVP活性包涵体切割ELP-Fh8融合标签，获得的IFN-C2融合干扰素能通过与IgG结合而延长半衰期。尽管这种策略在理论上是可以想得到的，但在设计时面临以下具体问题：此融合蛋白能否在大肠杆菌中高效表达？其分离纯化和标签切除的最佳条件是什么？IFN-C2融合干扰素能否与IgG结合？其生物活性及半衰期如何？
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种长效干扰素制备方法。
本发明的长效干扰素由干扰素与SPG C2结构域组成，经体外结合证明能与人和多种动物IgG结合，经血浆稳定性试验证明半衰期显著延长。
本发明所述的长效干扰素，用下列方法制备：
(1)将肝片吸虫Fh8蛋白编码序列优化成大肠杆菌密码子序列，将合成序列***类弹性蛋白多肽(ELP)融合表达载体，获得pELP-Fh8载体；
(2)将SPG C2结构域编码序列优化成大肠杆菌密码子序列，将合成序列***pELP-Fh8载体，获得pELP-Fh8-C2载体；
(3)将干扰素成熟肽编码序列优化成大肠杆菌密码子序列，5'端引入烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVP)识别位点，将合成序列***pELP-Fh8-C2载体，获得重组载体pELP-Fh8-IFN-C2；
(4)将重组载体转化大肠杆菌，在低温用IPTG诱导融合蛋白表达；
(5)在优化条件下，用温度敏感的相变循环纯化融合蛋白；
(6)用TEVP活性包涵体消化ELP-Fh8-IFN-C2融合蛋白，用离心法去除TEVP活性包涵体；
(7)用相变循环去除ELP-Fh8标签，用低浓度尿素溶解IFN-C2融合干扰素。
优选地，步骤(1)中Fh8编码序列为大肠杆菌密码子优化序列如SEQ ID No.1所示；步骤(2)中SPG C2编码序列为大肠杆菌密码子优化序列如SEQ ID No.4所示；步骤(3)中干扰素肽编码序列为大肠杆菌密码子优化序列如SEQ ID No.7所示；步骤(5)中所述优化条件是裂解重组菌蛋白浓度为10mg/mL，相变温度为28℃，孵育时间为10min，初次相变循环氯化钠浓度为3M，再次相变循环氯化钠浓度为2.5M，12000g室温5min。
用免疫印迹法检测本发明制得的IFN-C2融合干扰素与免疫球蛋白结合，用病变抑制法测定融合干扰素的抗病毒活性，用血浆稳定性试验测定融合干扰素的半衰期。实验表明IFN-C2融合干扰素能与人和动物IgG结合，半衰期显著延长。
与其他方法相比，本发明的长效干扰素制备方法具有简单、经济等优点，适合人和动物长效干扰素的制备。
附图说明
图1.长效干扰素表达载体的结构示意图。PT7代表T7启动子；ELP、Fh8、IFNa和SPGC2分别代表类弹性蛋白多肽、Fh8蛋白、干扰素和SPG C2结构域编码序列。
图2.融合蛋白的纯化及电泳分析。M代表蛋白分子量标准；1为未纯化重组菌裂解液；2为初次相变循环纯化产物；3为再次相变循环纯化产物。
图3.融合干扰素的标签切除与回收。M为蛋白分子量标准；1为TEVP酶切产物；2为离心上清；3为回收的PoIFNα-C2融合干扰素。
图4.融合干扰素的免疫球蛋白亲和性检测。M为蛋白分子量标准；1-7分别为猪、牛、鼠、羊、兔、人、鸭的IgG。
具体实施方式
生物材料：
1.pET-ELP载体：本实验室构建(文献：Wen-Jun Liu,Qian Wu,Bi Xu,Xin-YuZhang,Xiao-Li Xia,Huai-Chang Sun.Single-step purification of recombinantproteins using elastin-like peptide-mediated inverse transition cycling andself-processing module from Neisseria meningitides FrpC.Protein Expressionand Purification,2014,98:18-24)。
2.DH5α大肠杆菌：从美国BD Biosciences Clontech公司引进，本实验室保存。
3.BL21(DE3)大肠杆菌：从美国Novagen公司引进，本实验室保存。
4.MDBK细胞：从美国ATCC引进，本实验室保存。
5.水泡性口炎病毒(VSV)：由本实验室保存(文献：徐耀先，周晓峰，刘立德.分子病毒学.武汉：湖北科学技术出版社，2000.300-302)。
6、pUC57载体：购于金斯瑞生物科技(南京)有限公司。
具体实施步骤如下：
1.表达载体构建
(1)用JAVA Codon Adaption Tool(文献：Grote A,Hiller K,Scheer M,MünchRB,Hempel DC,Jahn D.JCat:a novel tool to adapt codon usage of a target geneto its potential expression host.Nucleic Acids Research,2005，1:33)，将肝片吸虫Fh8蛋白编码序列(GenBankAF213970)优化为大肠杆菌(K12株)密码子序列(SEQ ID No.1)，序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，***pUC57载体。
5-CATATGCCGTCTGTTCAGGAAGTTGAAAAACTGCTGCACGTTCTGGACCGTAACGGTGACGGTAAAGTTTCTGCTGAAGAACTGAAAGCTTTCGCTGACGACTCTAAATGCCCGCTGGACTCTAACAAAATCAAAGCTTTCATCAAAGAACACGACAAAAACAAAGACGGTAAACTGGACCTGAAAGAACTGGTTTCTATCCTGTCTTCTGCAGATCT-3(SEQ ID No.1)
(2)根据Fh8编码序列设计一对引物，正向引物引入SacI酶切位点，反向引物引入SalI酶切位点。
正向引物：5-GAGCTCACCGTCTGTTCAGGAAGTTG-3(SEQ ID No.2)；
反向引物：5-GTCGACGCAGAAGACAGGATAGAAAC-3(SEQ ID No.3)。
(3)以含Fh8编码序列pUC57为模板，按照rTaq DNA Polymerase(TaKaRa公司)说明书进行PCR扩增，反应程序为：94℃/4min；94℃/45s，65℃/30s，72℃/1min，30次循环；72℃/10min；扩增产物经限制酶SacI和SalI消化后，***pET-ELP载体，获得pELP-Fh8载体。
(4)用JAVA Codon Adaption Tool将SPG C2编码序列(GenBank：X06173)优化为大肠杆菌(K12株)密码子序列(SEQ ID No.4)，序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，***pUC57载体。
5-ACCTACAAACTGGTTATCAACGGTAAAACCCTGAAAGGTGAAACCACCACCGAAGCTGTTGACGCTGCTACCGCTGAAAAAGTTTTCAAACAGTACGCTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACCTACGACGACGCTACCAAAACCTTCACCGTTACCGAATAA-3(SEQ ID No.4)。
(5)根据SPG C2编码序列设计1对引物，上游引物引入NotI酶切位点，下游引物引入TAA终止码和XhoI酶切位点。
正向引物：5-GCGGCCGCGGATCCACCTACAAACTGGTTATCAAC-3(SEQ ID No.5)；
反向引物：5-CTCGAGTTATTCGGTAACG-3(SEQ ID No.6)。
(6)以含SPG C2编码序列pUC57为模板，用rTaq DNA Polymerase进行PCR扩增，反应程序同前；扩增产物经限制酶NotI和XhoI消化后，***pELP-Fh8载体，获得pELP-Fh8-C2载体。
(7)用JAVA Codon Adaption Tool将猪α干扰素(PoIFN-α)编码序列(GenBankAY345969)优化为大肠杆菌(K12株)密码子序列(SEQ ID No.7)，序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆在pUC57载体中。
5-TGCGACCTGCCGCAGACCCACTCTCTGGCTCACACCCGTGCTCTGCGTCTGCTGGCTCAGATGCGTCGTATCTCTCCGTTCTCTTGCCTGGACCACCGTCGTGACTTCGGTTCTCCGCACGAAGCTTTCGGTGGTAACCAGGTTCAGAAAGCTCAGGCTATGGCTCTGGTTCACGAAATGCTGCAGCAGACCTTCCAGCTGTTCTCTACCGAAGGTTCTGCTGCTGCTTGGGACGAATCTCTGCTGCACCAGTTCTGCACCGGTCTGGACCAGCAGCTGCGTGACCTGGAAGCTTGCGTTATGCAGGAAGCTGGTCTGGAAGGTACCCCGCTGCTGGAAGAAGACTCTATCCTGGCTGTTCGTAAATACTTCCACCGTCTGACCCTGTACCTGCAGGAAAAATCTTACTCTCCGTGCGCTTGGGAAATCGTTCGTGCTGAAGTTATGCGTTCTTTCTCTTCTTCTCGTAACCTGCAGGACCGTCTGCGTAAAAAAGAAGGCGCGCCGGGATCC-3(SEQ ID No.7)。
(8)根据PoIFN-α编码序列设计一对引物，上游引物引入SalI酶切位点和TEVP识别位点，下游引物引入BamHI酶切位点。
正向引物：5-GTCGACAGAAAACCTGTACTTCCAGGGTTGCGACCTGCCGCAGAC-3(SEQ IDNo.8)；
反向引物：5-GGATCCCGGCGCGCCTTC-3(SEQ ID No.9)。
(9)以含PoIFN-α编码序列pUC57为模板，用rTaq DNA Polymerase进行PCR扩增，反应程序同前；扩增产物经限制酶SalI和BamHI消化后，***pELP-Fh8-C2载体，获得重组载体pELP-Fh8-PoIFNα-C2，如图1所示。
2.融合蛋白表达与纯化
(1)将pELP-Fh8-PoIFNα-C2转化BL21(DE3)大肠杆菌，挑取单菌落接种卡那霉素(50μg/ml)LB培养基，37℃、220rpm培养过夜；按1:100接种卡那霉素2×YT培养液(Tryptone16g，Yeast Extract 10g，NaCl 5g，pH7.2)，37℃、220rpm培养至OD600＝0.6，加入0.2mMIPTG，分别在20、24、28、37℃诱导表达6h。电泳分析结果显示：37℃诱导的表达产物约50％为可溶性蛋白，20℃诱导的表达产物＞90％为可溶性蛋白。
(2)将重组菌在20℃、0.2mM IPTG诱导24h，4℃、5000g离心10min，沉淀菌体用裂解液(50mM Tris-HCl，50mM NaCl，5％glycerol，pH7.2)悬浮，超声波充***解(40W，10s，停20s，5min)，4℃、12000g离心10min；离心上清用PBS调蛋白浓度为10mg/mL，加入3M氯化钠，28℃孵育10min，室温12000g离心5min。SDS-PAGE分析显示：第一轮相变循环纯化的ELP-Fh8-PoIFNα-C2融合蛋白的纯度约为80％。用PBS溶解初次纯化产物，加入2.5M氯化钠，28℃孵育10min，室温12000g离心5min；沉淀用预冷PBS溶解，冰浴30min，4℃、12000g离心5min。SDS-PAGE分析显示：再次相变循环纯化的ELP-Fh8-PoIFNα-C2融合蛋白的纯度为95％(图2)。
3.纯化标签切除与融合干扰素获得
(1)按Li等方法(文献:Li GY,Xiao ZZ,Lu HP,Li YY,Zhou XH,Tan X,Zhang XY,Xia XL,Sun HC.A simple method for recombinant protein purification usingself-assembling peptide-tagged tobacco etch virus protease.Protein Expressionand Purification,2016,128:86-92)制备TEVP活性包涵体。将pP16P-TEVP重组菌接种100毫升卡那霉素2×YT培养基，37℃振荡培养至OD600＝0.8，加入0.2mM IPTG，20℃、180rpm诱导表达18h；离心收集菌体，超声波裂解，4℃、6000g离心10min；沉淀的活性包涵体用0.5％Triton X-100菌体裂解液离心洗涤2次，用TEVP反应液离心洗涤1次。
(2)将50μl纯化ELP-Fh8-PoIFNα-C2融合蛋白与15μl TEVP活性包涵体(1mg/ml)混合，30℃孵育6h；4℃、12000g离心10min，弃沉淀(TEVP活性包涵体)。
(3)离心上清液加1M氯化钠，12000g离心5min，弃上清(含ELP-Fh8标签)；沉淀用3M尿素溶解，依次针对2M尿素和PBS透析4h，4℃、12000g离心5min，吸取上清液。电泳分析结果显示：PoIFNα-C2融合干扰素的纯度约为80％(图3)。
4.融合干扰素结合IgG检测
将PoIFNα-C2融合干扰素进行SDS-PAGE电泳分离，用转印仪将分离蛋白转移(80V1h)到硝酸纤维素膜，用5％脱脂乳粉PBST(含0.01％Tween 20的PBS)37℃封闭1h，PBST洗膜3次；分别加入1：1000稀释IgG或辣根过氧化物酶(HRP)标记IgG(上海生工生物工程有限公司)，37℃孵育1h，PBST洗涤3次；HRP标记IgG反应组经化学发光染色后直接进行信号扫描，未标记IgG反应组加入1：5000稀释HRP标记SPA(上海生工生物工程有限公司)，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，然后进行信号扫描。结果显示：PoIFNα-C2融合干扰素能与猪、牛、鼠、羊、兔和人IgG结合(图4)。
5.融合干扰素活性检测
PoIFNα-C2融合干扰素活性按文献测定(文献：LaFleur DW,Nardelli B,TsarevaT,Mather D,Feng P,Semenuk M,Taylor K,Buergin M,Chincilla D,Roschke V,etal.Interferon-κ,a novel type I IFN expressed in human keratinocytes.J BiolChem，2001，276:39765–39772)。在96孔板分别培养MDBK细胞、PK-15细胞和Marc-145细胞，104个/孔，37℃、5％CO2培养至细胞单层；用2％胎牛血清(FBS)DMEM培养液稀释PoIFNα-C2融合干扰素，加入培养板各孔，100μL/孔，每稀释度设3孔重复，37℃、5％CO2培养过夜；每孔加100μL(100TCID50)水泡性口炎病毒(VSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)或猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，设不加干扰素、不加病毒阴性对照，不加干扰素、加病毒阳性对照和加干扰素、不加病毒空白对照，37℃、5％CO2培养，每天观察细胞病变；在阳性对照孔90％以上细胞出现病变时，每孔加100μL 0.5％结晶紫(溶于20％乙醇)染色液，用1％醋酸抽提后，用酶标仪读取各孔的OD570nm值，将抑制半数细胞病变的干扰素最高稀释度定为1个活性单位(U)。结果显示：PoIFNα-C2融合干扰素在MDBK和PK-15细胞上抗VSV活性分别为2.3×104U/mg和9.1×104U/mg蛋白，在PK-15细胞上抗PRV活性为2.8×105U/mg蛋白，在Marc-145细胞上抗PRRSV活性为2.1×105U/mg蛋白。
6.融合干扰素血浆稳定性检测
干扰素血浆稳定性检测参考进行(文献：Shuo Tian,Qinshan Li,Wenbin Yao,Chen Xu.Construction and characterization of a potent,long-lastingrecombinant human serum albumin-interferon a1fusion protein expressed inPichia pastoris.Protein Expression and Purification，2013,90:124-128)。从健康猪采集枸橼酸钠抗凝血，高速离心5min取血浆；用PBS稀释成50％血浆，分别加入PoIFNα-C2融合干扰素(10μg/mL)和商品化白细胞干扰素(四川世红生物科技有限公司)，37℃孵育24h，分别在0、0.5、1.0、3.0、6.0、12和24h，各取100μL进行干扰素活性检测，方法同前。结果显示：白细胞干扰素活性下降50％的时间为12h，PoIFNα-C2融合干扰素活性下降50％的时间＞24h。
SEQUENCE LISTING
<110> 扬州大学
<120> 一种长效干扰素及其制备方法
<130>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
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tctaacaaaa tcaaagcttt catcaaagaa cacgacaaaa acaaagacgg taaactggac 180
ctgaaagaac tggtttctat cctgtcttct gcagatct 218
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<212> DNA
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Claims (3)

1.一种的长效干扰素，其特征在于：由干扰素与链球菌G蛋白(SPG)C2结构域组成。
2.一种权利要求1所述的长效干扰素的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)将肝片吸虫Fh8蛋白编码序列优化成大肠杆菌密码子序列，将合成序列***类弹性蛋白多肽(ELP)融合表达载体，获得pELP-Fh8载体；
(2)将SPG C2结构域编码序列优化成大肠杆菌密码子序列，将合成序列***pELP-Fh8载体，获得pELP-Fh8-C2载体；
(3)将干扰素成熟肽编码序列优化成大肠杆菌密码子序列，5'端引入烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVP)识别位点，将合成序列***pELP-Fh8-C2载体，获得重组载体pELP-Fh8-IFN-C2；
(4)将重组载体转化大肠杆菌，在低温用IPTG诱导融合蛋白表达；
(5)在优化条件下，用温度敏感的相变循环纯化融合蛋白；
(6)用TEVP活性包涵体消化ELP-Fh8-IFN-C2融合蛋白，用离心法去除TEVP活性包涵体；
(7)用相变循环去除ELP-Fh8标签，用低浓度尿素溶解IFN-C2融合干扰素。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中Fh8编码序列为大肠杆菌密码子优化序列，如SEQ ID No.1所示；步骤(2)中SPG C2编码序列为大肠杆菌密码子优化序列，如SEQ ID No.4所示；步骤(3)中干扰素肽编码序列为大肠杆菌密码子优化序列，如SEQID No.7所示。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112029000A (zh) * 2020-08-25 2020-12-04 江苏农牧科技职业学院 鸭干扰素α融合蛋白在制备抗鸭1型肝炎病毒的药物中的用途
CN113292647A (zh) * 2021-07-28 2021-08-24 南京谷浦生物科技有限公司 一种igf-1的低成本制备方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103232545A (zh) * 2013-05-16 2013-08-07 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种重组猪干扰素α1-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法
CN104725515A (zh) * 2015-03-20 2015-06-24 扬州大学 一种类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白及其制备方法和应用
CN105886489A (zh) * 2016-05-09 2016-08-24 扬州大学 一种烟草蚀纹病毒蛋白酶活性包涵体及其制备方法与应用
CN106282216A (zh) * 2016-08-29 2017-01-04 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 一种重组长效鸡干扰素α的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103232545A (zh) * 2013-05-16 2013-08-07 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种重组猪干扰素α1-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法
CN104725515A (zh) * 2015-03-20 2015-06-24 扬州大学 一种类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白及其制备方法和应用
CN105886489A (zh) * 2016-05-09 2016-08-24 扬州大学 一种烟草蚀纹病毒蛋白酶活性包涵体及其制备方法与应用
CN106282216A (zh) * 2016-08-29 2017-01-04 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 一种重组长效鸡干扰素α的制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FELIX UNVERDORBEN: ""A Fab-Selective Immunoglobulin-Binding"", 《PLOS ONE》 *
HUTT M 等: ""Plasma Half-life Extension of Small Recombinant Antibodies by Fusion to Immunoglobulin-binding Domains"", 《J BIOL CHEM》 *
SAUER-ERIKSSON AE: ""Crystal structure of the C2 fragment of streptococcal protein G in complex with the Fc domain of human IgG"", 《STRUCTURE》 *
张敏 等: ""类弹性蛋白多肽融合犬β干扰素的表达纯化和抗病毒活性及体外半衰期的研究"", 《中国兽医科学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112029000A (zh) * 2020-08-25 2020-12-04 江苏农牧科技职业学院 鸭干扰素α融合蛋白在制备抗鸭1型肝炎病毒的药物中的用途
CN113292647A (zh) * 2021-07-28 2021-08-24 南京谷浦生物科技有限公司 一种igf-1的低成本制备方法及其应用

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