CN107076744A - 用于诊断潜伏性感染的结核分枝杆菌的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含至少三个衍生自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原Rv2626c的肽的组合物，其用于诊断潜伏性感染的结核分枝杆菌(LTBI)受试者的用途，相应的使用方法和试剂盒。

Description

用于诊断潜伏性感染的结核分枝杆菌的组合物
技术领域
本发明涉及包含至少三个衍生自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原Rv2626c的肽的组合物，其在诊断潜伏性感染的结核分枝杆菌(LTBI)受试者中的用途，相应的使用方法和试剂盒。
背景技术
尽管在过去五十年间抗结核治疗有效，由结核分枝杆菌引起的疾病仍然是全世界最流行的传染病之一。因此，2011年报道了接近9百万新的结核病(TB)病例和140万死亡。此外，世界卫生组织估计，全世界人口的三分之一将感染潜伏性的结核分枝杆菌(LTBI)，即其中个体被胞内菌感染但不表现活动性疾病，但具有再激活的高风险的病症。初级感染在少于10％的感染个体中导致活动性结核病，而大多数情况下，免疫***能够包含(但不消除)感染，从而导致LTBI。潜伏可以持续一生，但宿主免疫反应的衰弱可能导致再激活。
潜伏性结核病在免疫抑制的情况下可能导致活动性疾病，所述免疫抑制可能由治疗性治疗(对于自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎或对于器官移植)、营养不良或老年引起。结核分枝杆菌-HIV共感染的高比例使情况恶化，因为AIDS引起免疫抑制，从而引起结核病激活。
如此巨大的病原体储库(几乎20亿人口)的存在急切需要结核病感染的灵敏且早期的诊断以控制活动性疾病。知道个体是否是潜伏性感染能够改变治疗决策，如在需要免疫抑制治疗的器官移植的情况下。
干扰素γ释放分析(IGRA)代表最新的结核病感染诊断分析，尽管它具有限制性，但在多数发达国家中已经被很好地接受。尽管结核分枝杆菌抗原CFP-10和ESAT-6目前用于此类诊断，它们不能区分活动性和潜伏性感染。
因此，缺少诊断LTBI的金标准仍然是一个主要的障碍。实际上，通过灵敏且快速的诊断测试鉴定这些受试者是根除结核病的一个关键目的，而目前可用的测试不够灵敏，不能够区分潜伏性和活动性感染个体。
因此，本发明的目的是鉴定新抗原，所述抗原允许将潜伏性感染个体与健康对照和患有活动性结核病的患者特异性区分开来，而这是目前可用的测试不能做到的。
进一步的目的是允许区分三组受试者(LTBI、TB患者和健康患者)的单个测试。这种测试不需要放射性和临床数据来区分活动性和潜伏性感染个体。
发明内容
本发明涉及衍生自结核分枝杆菌抗原Rv2626c的肽的混合物，与目前商业化的测试不同，所述混合物将LTBI个体与患有结核病活动性疾病的患者和健康个体区分开来。
此外，本发明还涉及这些肽与抗原CFP-10和ESAT-6(其仅区分结核分枝杆菌感染，潜伏性或活动性)的组合，该组合能够在一个测试中区分以下三组个体：健康受试者、患有潜伏性感染的个体和患有活动性疾病的患者。
因此，本发明涉及包含至少两个肽的组合物，其中所述至少两个肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：1(MTTARDIMNAGVTCVGEHETLTAAAQYMREHDIGALPICGDDDRLHGMLTDRDIVIKGLAAGLDPNTATAGELARDSIYYVDANASIQEMLNVMEEHQVRRVPVISEHRLVGIVTEADIARHLPEHAIVQFVKAICSPMALAS)的结核分枝杆菌抗原Rv2626c的氨基酸序列的3-30个连续氨基酸的不同片段组成。
更具体地，本发明涉及包含至少三个肽的组合物，其中所述至少三个肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：1的结核分枝杆菌抗原Rv2626c的氨基酸序列的5-30个连续氨基酸的不同片段组成，不包括SEQ ID NO：40(LTAAAQYMREHDIGALPICG)、SEQ ID NO：41(GELARDSIYYVDANASIQEM)和SEQ ID NO：42(RHLPEHAIVQFVKAICSPMA)的氨基酸序列的肽。
在本发明的范围内，术语“组合物”和术语“组合产物”可交替使用，术语“组合产物”包括肽池，即如本发明所述的至少三个肽的肽混合物。
在本发明的范围内，以上提及的SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42的肽不是本文所述的组合物的一部分。
结核分枝杆菌抗原Rv2626c是休眠诱导的分枝杆菌(Mycobacterium)蛋白，相关信息可在http：//tuberculist.epfl.ch/index.html找到。
具体地，根据本发明的组合物包含2-10个肽，更具体的3-10个肽，例如3、4、5、6、7、8、9或10个肽，甚至更具体地6个肽。
具体地，所述至少两个或三个肽，优选所述至少三个肽由SEQ ID NO：1的结核分枝杆菌抗原Rv2626c的氨基酸序列的5-20个连续氨基酸，或10-30个连续氨基酸，更具体地12-20个连续氨基酸，甚至更具体地13-17或13-15个连续氨基酸，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个，优选13、14、15、16或17个连续氨基酸的不同片段组成。所述至少两个或三个肽，优选所述至少三个肽的序列长度可以相同或不同。具体地，所述肽的序列可以重叠至少3个氨基酸、更具体的至少10个氨基酸、例如11个氨基酸。
因此，在一个实施方案中，所述至少三个肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：1的结核分枝杆菌抗原Rv2626c的氨基酸序列的10-30个连续氨基酸，优选12-20个连续氨基酸的不同片段组成。
在一个实施方案中，所述至少两个或三个肽，优选所述至少三个肽的氨基酸序列不包含C-末端氨基酸G、P、E、D、Q、N、T或S，和/或N-末端氨基酸Q。所述至少两个或三个肽，优选所述至少三个肽可以例如选自以下：
-SEQ ID NO：2的肽6(etltaaaqymrehdi)；
-SEQ ID NO：3的肽12(ddrlhgmltdrdivi)；
-SEQ ID NO：4的肽18(dpntatagelardsi)；
-SEQ ID NO：5的肽24(nasiqemlnvmeeh)；
-SEQ ID NO：6的肽30(ehrlvgivteadiar)；
-SEQ ID NO：7的肽36(vqfvkaicspmalas)；
-SEQ ID NO：8的肽7(aaaqymrehdigal)；
-SEQ ID NO：9的肽8(aqymrehdigalpi)；
-SEQ ID NO：10的肽9(mrehdigalpicgdddr)；
-SEQ ID NO：11的肽10(galpicgdddrlhgm)；
-SEQ ID NO：12的肽11(icgdddrlhgmltdr)；
-SEQ ID NO：13的肽19(atagelardsiyyv)；
-SEQ ID NO：14的肽20(gelardsiyyvdana)；
-SEQ ID NO：15的肽21(rdsiyyvdanasi)；
-SEQ ID NO：16的肽22(siyyvdanasiqeml)；
-SEQ ID NO：17的肽23(vdanasiqemlnvm)；
-SEQ ID NO：18的肽31(vgivteadiarhl)；
-SEQ ID NO：19的肽32(ivteadiarhlpeha)；
-SEQ ID NO：20的肽33(adiarhlpehaivqf)；
-SEQ ID NO：21的肽34(rhlpehaivqfvkai)；
-SEQ ID NO：22的肽35(ehaivqfvkaicspm)；
-SEQ ID NO：25的肽1(mttardimnagvtcv)；
-SEQ ID NO：26的肽2(rdimnagvtcvgeh)；
-SEQ ID NO：27的肽3(mnagvtcvgehetl)；
-SEQ ID NO：28的肽4(gvtcvgehetltaaa)；
-SEQ ID NO：29的肽5(vgehetltaaaqymr)；
-SEQ ID NO：30的肽13(hgmltdrdivikgla)；
-SEQ ID NO：31的肽14(tdrdivikglaagl)；
-SEQ ID NO：32的肽15(divikglaagldpnta)；
-SEQ ID NO：33的肽16(glaagldpntata)；
-SEQ ID NO：34的肽17(aagldpntatagela)；
-SEQ ID NO：35的肽25(iqemlnvmeehqvrr)；
-SEQ ID NO：36的肽26(lnvmeehqvrrvpvi)；
-SEQ ID NO：37的肽27(eehqvrrvpvisehr)；
-SEQ ID NO：38的肽28(vrrvpvisehrlvgi)；和
-SEQ ID NO：39的肽29(pvisehrlvgivtea)。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物不包含超过两个选自以下肽的肽：1、2、3、4、5、6、25、26、27、28、29和30。
所述至少两个或三个肽，优选所述至少三个肽也可以选自以上提及的肽6、12、18、24、30、36、7、8、9、10、11、19、20、21、22、23、31、32、33、34、35、1、2、3、4、5、13、14、15、16、17、25、26、27、28和29的不同片段，特别是其至少3个氨基酸的片段，更具体地其4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的片段。
所述至少两个或三个肽，优选所述至少三个肽也可以选自氨基酸序列与以上提及的肽6、12、18、24、30、36、7、8、9、10、11、19、20、21、22、23、31、32、33、34、35、1、2、3、4、5、13、14、15、16、17、25、26、27、28和29的氨基酸序列具有超过70％同一性、至少80％或至少90％，更具体地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的肽。
这种变体包括等位基因变体和在肽序列内单个氨基酸或一组氨基酸的缺失、修饰或添加，只要所述肽保留诊断LTBI受试者的能力并且只要其长度为3-30个氨基酸，优选5-30个氨基酸。
本发明组合物的至少两个或三个肽，优选本发明组合物的至少三个肽可以是化学修饰的，例如翻译后修饰。例如，它们可以被糖基化或包含修饰的氨基酸残基。它们也可以通过添加组氨酸残基来修饰以帮助其纯化。
因此，在一个实施方案中，所述至少三个肽选自：
-SEQ ID NO：2的肽6或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：3的肽12或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：4的肽18或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：5的肽24或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：6的肽30或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：7的肽36或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ TD NO：8的肽7或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：9的肽8或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：10的肽9或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：11的肽10或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：12的肽11或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：13的肽19或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：14的肽20或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：15的肽21或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：16的肽22或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：17的肽23或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：18的肽31或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：19的肽32或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：20的肽33或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：21的肽34或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：22的肽35或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：25的肽1或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：26的肽2或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：27的肽3或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：28的肽4或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：29的肽5或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：30的肽13或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：31的肽14或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：32的肽15或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：33的肽16或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：34的肽17或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：35的肽25或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：36的肽26或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：37的肽27或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：38的肽28或其至少3个氨基酸的片段；和
-SEQ ID NO：39的肽29或其至少3个氨基酸的片段。
在另一个实施方案中，所述至少三个肽选自：
-肽6、12和18，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽6、12和24，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽6、12和30，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽6、12和36，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽6、18和24，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽6、18和30，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽6、18和36，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽6、24和30，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽6、24和36，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽6、30和36，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽7、8和9，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽7、8和1O，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽7、8和11，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽7、8和12，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽7、9和10，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽7、9和11，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽7、8和12，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽7、10和11，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽7、10和12，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽7、11和12，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽13、14和15，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽13、14和16，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽13、14和17，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽13、14和18，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽13、15和16，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽13、15和17，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽13、15和18，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽13、16和17，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽13、16和18，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽13、17和18，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽19、20和21，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽19、20和22，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽19、20和23，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽19、20和24，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽19、21和22，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽19、21和23，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽19、21和24，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽19、22和23，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽19、22和24，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽19、23和24，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽31、32和33，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽31、32和34，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽31、32和35，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽31、32和36，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽32、33和34，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽32、33和35，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽32、33和36，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽32、34和35，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽32、34和36，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽32、35和36，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽1、7和13，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽1、7和19，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽1、7和25，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽1、7和31，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽1、13和19，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽1、13和25，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽1、13和31，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽1、19和25，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽1、19和31，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽1、25和31，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽2、8和14，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽2、8和20，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽2、8和26，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽2、8和32，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽2、14和20，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽2、14和26，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽2、14和32，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽2、20和26，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽2、20和32，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽2、26和32，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽3、9和15，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽3、9和21，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽3、9和27，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽3、9和33，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽3、15和21，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽3、15和27，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽3、15和33，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽3、21和27，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽3、21和33，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽3、27和33，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽4、10和16，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽4、10和22，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽4、10和28，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽4、10和34，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽4、16和22，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽4、16和28，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽4、16和34，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽4、22和28，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽4、22和34，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽4、28和34，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽5、11和17，或其至少3个氨基酸的片段；和
-肽5、11和23，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽5、11和29，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽5、11和35，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽5、17和23，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽5、17和29，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽5、17和35，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽5、23和29，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽5、23和35，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽5、29和35，或其至少3个氨基酸的片段。
在进一步的实施方案中，根据本发明的组合物包含六个肽，其中所述六个肽的氨基酸序列由12-20个连续氨基酸的不同片段组成。
在进一步的实施方案中，组合物包含：
-肽6、12、18、24、30和36，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽7、8、9、10、11和12，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽19、20、21、22、23和24，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽31、32、33、34、35和36，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽1、7、13、19、25和31，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽2、8、14、20、26和32，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽3、9、15、21、27和33，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽4、10、16、22、28和34，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽5、11、17、23、29和35，或其至少3个氨基酸的片段；或
-肽13、14、15、16、17和18，或其至少3个氨基酸的片段。
在上述实施方案中，当肽6、12、18、24、30、36、7、8、9、10、11、19、20、21、22、23、31、32、33、34、35、1、2、3、4、5、13、14、15、16、17、25、26、27、28和29的至少3个氨基酸的片段是根据本发明的组合物的一部分时，这些片段的每一个具有不同的氨基酸序列。这意味着，例如，当组合物包含肽19、20、21、22、23和24的至少三个氨基酸的片段时，这些六个片段的每一个具有不同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物不包含：
-肽1、2、3、4、5和6，或
-肽25、26、27、28、29和30。
本发明还涉及进一步包含CFP-10和/或ESAT-6抗原的上述组合物。
CFP-10抗原也称为ESAT-6样抗原esxB或分泌的抗原性蛋白MTSA-10或10kDa培养滤液抗原CFP-10或Rv3874，是由esxB基因编码的蛋白。与该蛋白SEQ ID NO：23(MAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAAVVRFQEAANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGF)相关的信息可以在http：//tuberculist.epfl.ch/ index.html找到。
ESAT-6抗原也称为结核分枝杆菌的6kDa早期分泌抗原靶标或Rv3875，是分泌蛋白和有效的T细胞抗原。与该蛋白SEQ ID NO：24
(MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA)相关的信息可以在http：//tuberculist.epfl.ch/index.html找到。该蛋白和CFP-1O和TB7.7一起用于通过全血干扰素γ测试QuantiFERON-TB Gold的结核病诊断。
本发明组合物的至少两个或三个肽，尤其是至少三个肽和/或以上提及的CFP-10和ESAT-6抗原可以与不会干扰肽和抗原的意欲目的的载体或稀释剂混合。组合物一般将包含至少50％，例如超过80％、90％、95％或99％重量的至少两个或三个肽，尤其是至少三个肽。
可以利用常规方法合成本发明组合物的肽和抗原。这种方法是本领域技术人员熟知的，包括如fmoc合成的技术(等，Automated solid-phase peptide synthesis toobtain therapeutic peptides Beilstein J Org Chem.2014；10：1197-1212)。CFP-10和ESAT-6抗原可商购。
本发明还涉及上述组合物用于诊断LTBI受试者。
本发明还涉及上述组合物在诊断LTBI受试者中的用途。
“LTBI”是指潜伏性结核病感染或潜伏性感染的结核分枝杆菌，即其中个体被胞内菌感染但不表现活动性疾病，但具有再激活的高风险的病症。初级感染在少于10％的感染个体中导致活动性结核病，而大多数情况下，免疫***能够包含(但不消除)感染，从而导致LTBI。潜伏可以持续一生，但宿主免疫反应的衰弱(例如HIV感染或任何免疫抑制治疗)可能导致再激活。
“受试者”是指男性或女性的人，其患有本文所述的一种或多种疾病和病症，或具有患本文所述的一种或多种疾病和病症的可能性。
本发明还涉及包含CFP-10和/或ESAT-6抗原的如上所述的组合物用于区分健康受试者、患有活动性结核病的受试者和LTBI受试者。
本发明还涉及包含CFP-10和/或ESAT-6抗原的如上所述的组合物在区分健康受试者、患有活动性结核病的受试者和LTBI受试者中的用途。
“活动性结核病”是指其中疾病是活动性的病症，即一般由结核分枝杆菌引起的传染病。结核病通常攻击肺，但也可以影响身体的其他部位。
“健康受试者”是指不具有潜伏性结核病感染且不具有活动性结核病的受试者。
具体地，用于上述的组合物和/或上述组合物的用途是干扰素γ释放分析(IGRA)。
在本文上下文中，“干扰素γ释放分析”或“IGRA”是指在结核病诊断中所用的医疗测试。干扰素γ释放分析依赖以下事实：当暴露于特定抗原时，T淋巴细胞将释放干扰素γ。
具体地，用于上述的组合物和/或上述组合物的用途是诱导IFN-γ表达。
“IFN-γ”是指干扰素γ或IFNγ，其是作为II型干扰素类的唯一成员的二聚化可溶性细胞因子，也称为免疫干扰素。
本发明进一步涉及诊断LTBI受试者的方法，所述方法包括使用上述组合物。
本发明进一步涉及诊断LTBI受试者的方法，所述方法包括通过以下使用上述组合物：
(i)在来自受试者的分离的外周血单核细胞(PBMC)或血样中测量IFN-γ的表达水平；和
(ii)由此推断该受试者是否患有LTBI。
本发明还涉及区分健康受试者、患有活动性结核病的受试者和LTBI受试者的方法，包括使用包含CFP-10和/或ESAT-6抗原的如上所述的组合物。
本发明还涉及区分健康受试者、患有活动性结核病的受试者和LTBI受试者的方法，包括通过以下使用包含CFP-10和/或ESAT-6抗原的如上所述的组合物：
(i)在来自受试者的分离的外周血单核细胞(PBMC)或血样中测量IFN-γ的表达水平；和
(ii)由此推断该受试者是否患有LTBI。
具体地，上述方法包括：
(i)将来自受试者的分离的外周血单核细胞(PBMC)或血样与上述组合物一起培养；
(ii)测量所述分离的外周血单核细胞(PBMC)或所述血样的IFN-γ的表达水平；和
(iii)由此推断该受试者是否患有LTBI。
具体地，上述方法是离体方法。
本领域技术人员完全能够理解术语“培养”的含义。具体地，“培养”是指用根据本发明的组合物处理或孵育来自受试者的血样或PBMC。例如，将PBMC或血样与根据本发明的组合物于37℃孵育24h或5天，然后回收那些培养样品的血浆或上清液以测定其中的IFN-γ水平。
“血样”是指包括全血、血浆、血清、循环表皮细胞、成分或血的任何衍生物的样品。
IFN-γ表达水平的测量可以通过免疫分析或免疫印迹或分析方法进行，例如毛细管电泳-质谱(CE-MS)、与质谱偶联的液相色谱(LC-MS、LC-MS/MS)、具有同位素标记的定量方法(细胞培养中通过氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)、同位素编码亲和标签(ICAT)、同位素标记相对和绝对定量(ITRAQ)……)、不含标记的方法，例如选择性反应监控(SRM)或多反应监控(MRM)分析，或包含具有校准和不具有校准(例如不含校准的浓度分析)的方法的生物分子相互作用分析/表面等离子体共振(BIA/SPR)技术。
根据本发明所用的术语“免疫分析”包括竞争、直接反应或夹层型分析。这些分析包括但不限于：凝集试验、酶标记和介导的免疫分析例如ELISA、生物素/抗生物素蛋白型分析、放射性免疫分析、免疫电泳和免疫沉淀。
这些方法是本领域技术人员熟知的。
本发明还涉及用于诊断LTBI受试者和/或用于区分健康受试者、患有活动性结核病的受试者和LTBI受试者的试剂盒，包含：
(i)根据本发明的组合物；和
(ii)用于诊断LTBI受试者和/或用于区分健康受试者、患有活动性结核病的受试者和LTBI受试者的说明书。
用于使用根据本发明的试剂盒的说明书可以包括用于处理从受试者获得的生物样品和/或用于进行测试的说明书，或用于解释结果的说明书。试剂盒还可以包括由管理医药或生物产品的制造、使用或销售的政府部门签发形式的布告。
根据本发明的试剂盒可以进一步包含用于测量IFN-γ表达水平的手段。
根据一个实施方案，所述手段可以是针对IFN-γ的特异性抗体。
这种手段可以用可检测化合物例如荧光或放射性化合物标记。例如，可以用可检测化合物标记与所述蛋白特异性结合的抗体。或者，当试剂盒包含抗体时，该试剂盒可以进一步包含用可检测化合物标记的第二抗体，其结合与所述蛋白特异性结合的末标记抗体。
此外，本发明的试剂盒还可以包含至少一种试剂，所述试剂用于检测试剂盒中用于测量包含的所述蛋白表达的表达水平的手段和所述蛋白之间的络合物。
根据程序，试剂盒可以进一步包含一种多多种：提取缓冲液和/或试剂、western印迹缓冲液和/或试剂和检测手段。
本发明的试剂盒可以任选地包含用于每一个单独缓冲液和/或试剂和/或肽和/或抗原的不同容器(例如小瓶、安瓿、试管、烧瓶或瓶子)。每个成分一般将适于分装于各自的容器或以浓缩形式提供。也可以提供适于进行公开方法的某些步骤的其他容器。试剂盒的单独容器优选在用于商业销售的严格限制下保存。
本发明将进一步通过以下附图和实施例说明。
附图说明
图1示出了通过ELISA测量的以下样品上的IFN-γ表达水平：A)来自健康供体(HD)、患有结核病的患者(TB)和潜伏性结核分枝杆菌感染的个体(LTBI)的外周血单核细胞(PBMC)与根据本发明的组合物培养5天；和B)来自健康供体(HD)、患有结核病的患者(TB)和潜伏性结核分枝杆菌感染的个体(LTBI)的全血与根据本发明的组合物培养24H。条块表示平均值±SEM。对非配对样品的Mann-Whitney测试*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图2：将来自健康供体(HD)、患有结核病的患者(TB)和潜伏性结核分枝杆菌感染的个体(LTBI)的外周血单核细胞与根据本发明的组合物培养。5天后，通过ELISA评估不含细胞的上清液中IFN-γ的产量。条块表示平均值±SEM。对非配对样品的Mann-Whitney测试*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
具体实施方式
实施例1
实验方案
受试者
没有结核病史且在出生时接受卡介苗(BCG)疫苗接种的健康成人参加了本次研究。在该组中，根据制造商的说明，使用QuantiFERON TB In-tube试验CellestisInc.)建立潜伏性结核病(LTBI受试者)的诊断。该试验用于在健康人群中区分LTBI受试者。实际上，如已经提及的，由于该试验不允许区分活动性TB受试者和LTBI受试者，确定分析不可能患有活动性TB的健康人群以总结QuantiFERON阳性个体是LTBI受试者。
在阿根廷布宜诺斯艾利斯的Dr.F.医院评估患有活动性结核病的未感染HIV的患者(TB受试者)。基于以下诊断疾病：临床和放射性数据，以及痰中抗酸杆菌(AFB)的鉴定。此次研究中包含的患者已经接受少于1周的抗结核病治疗。
对照组(HD受试者)包括与TB患者和LTBI个体在性别、年龄和种族上相匹配的个体。
所有参与者为外周血样的收集和后续分析提供了书面的知情同意书。
本工作中进行的实验方法通过了医院的伦理委员会和国际评审委员会Fundación Huésped的批准。
由于历史上阿根廷从欧洲国家，以及在过去十年从其他拉丁美洲国家接受的密集移民，阿根廷人群包括非常多样的遗传背景。
此外，由于BCG疫苗接种在该国是强制性的，也可以测试当用根据本发明的组合物刺激时，BCG疫苗接种是否造成假阳性。
肽
Biomatik Corp使用Fmoc化学合成了跨越SEQ ID NO：1的结核分枝杆菌抗原Rv2626c的序列的13-17个氨基酸的合成肽。
将冻干的肽溶解于二甲基亚砜(DMSO)，分装并储存于-70℃。
通过HPLC分析，肽的纯度超过80％，它们的组合物通过质谱验证。
根据Addo等(J Virol.2003Feb；77(3)：2081-92)之前所述的方法，对于体外刺激，制备了6个肽的4个池(表1)，每个肽的最终浓度为2mg/ml。
表1：结核分枝杆菌抗原Rv2626c肽池
细胞制备和试剂
在Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)上通过离心分离外周血单核细胞(PBMC)，并将其与不同的肽池(5μg/ml)和补充有L-谷氨酰胺、盘里西林/链霉素和10％人血清(Sigma-Aldrich)的RPMI 1640(Gibco)一起培养。5天后，收集不含细胞的上清液以通过ELISA(BioLegend)测定IFN-γ表达。
结果
首先设计其中每个池由6个不同肽组成的池矩阵，然后测试针对这些池的IFN-γ产量。
示于图1的结果表明，池6、8、10和12通过在LTBI个体中诱导比在活动性TB患者和健康供体中明显更高水平的IFN-γ从而能够显著地将LTBI个体与患有结核病的患者和健康对照区分开来。
这些结果表明根据本发明的组合物可以用于诊断试验以在TB、LTBI和HD受试者中区分LTBI受试者。
如之前提及的，潜伏性结核病感染是主要的结核分枝杆菌储库，使得它的有效检测在针对活动性疾病的努力中至关重要。
目前，尽管存在缺点，用于诊断潜伏性结核病感染的最常用的分析是结核菌素皮肤试验(TST)和两个商业分析：来自Cellestis GmbH公司的QuantiFERON TB Gold In Tube和来自Oxford Immunotec公司的T-Spot TB。两个商业试剂盒均是干扰素γ释放分析(IGRA)，其使用特异性结核分枝杆菌肽(主要是CFP-10和ESAT-6)在感染病原体的个体中诱导该细胞因子的分泌。
因此，与根据本发明的组合物不同，尽管这些分析区分感染性个体和健康个体，它们不能够区分潜伏性和活动性感染。
在欠发达国家最常用的TST显示高变异度，并且依赖于观察者和施用方式两者。它不标准也不客观，此外，可能显示假阳性，尤其是具有BCG疫苗接种。T-Spot TB和QuantiFERON TB Gold In Tube的特异性均比TST高得多，然而，它们不能区分潜伏性感染的个体和患有活动性疾病的个体。
表2说明了使用不同的现有诊断试验和本发明的组合物的预期结果。
表2
实施例2
实验方案
受试者
招募没有TB病史的BCG疫苗接种的健康成人(家庭接触和医护人员)。在该组个体中，使用QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT；Qiagen，USA；根据制造商的指示)和结核菌素皮肤试验(TST)测试建立LTBI的诊断。具有阳性QFT-GIT/TST且没有临床或放射性证据表明活动性TB的任何受试者诊断为LTBI。在QFT-GIT/TST结果不一致的情况下，基于QFT-GIT结果将个体分成相应的组。健康供体(HD)组由不患有TB疾病(通过胸腔X射线测试并分析痰中的抗酸杆菌)且具有阴性QFT-GIT/TST的成年个体组成。
在Dr.F.或Dr.E.Tornú医院评估患有活动性TB的未感染HIV的患者(布宜诺斯艾利斯，阿根廷)。基于以下诊断TB疾病：临床和放射性数据和培养确认，以及痰中抗酸杆菌(AFB)的鉴定。此次研究中包含的患者已经接受少于1周的抗TB治疗。
在招募时获得关于人口数据和之前TB暴露的信息。所有参与者为样品收集和后续分析提供了书面的知情同意书。进行的实验方案通过了Dr.F.和Dr.E.Tornú医院的伦理委员会和国际评审委员会Fundación Huésped的批准。
由于历史上阿根廷从欧洲国家，以及在过去十年从其他拉丁美洲国家接受的密集移民，阿根廷人群包括非常多样的遗传背景。
此外，由于BCG疫苗接种在该国是强制性的，也可以测试当用根据本发明的组合物刺激时，BCG疫苗接种是否造成假阳性。
参与本研究的个体的研究纳入和排除标准
纳入标准：a)患有活动性肺TB的成年(超过18岁)男性和女性；和b)高水平暴露至结核分枝杆菌的健康志愿者(TB患者的家庭接触和国家转诊医院TB的医护人员)。所有招募的受试者均接种了疫苗BCG。使用QFT-GIT和TST分析以确定在不具有活动性TB的临床或微生物诊断的个体中存在LTBI。本研究中包括的所有TB患者的结核分枝杆菌培养均为阳性。
排除标准：a)HIV阳性或对其他病毒或细菌感染为血清学阳性；b)患有糖尿病、癌症、自身免疫性疾病或可能影响个体的免疫***的其他病症的患者；c)怀孕妇女和d)儿童。在活动性TB患者人群中排除以下：a)患有耐多药结核病(MDR-TB)感染的患者；b)超过连续7天抗TB治疗的患者。具有不确定QFT-GIT结果的个体也从本研究中排除。
肽
Biomatik Corp使用Fmoc化学合成了跨越SEQ ID NO：1的Rv2626c序列的重叠合成肽(13-17个氨基酸，重叠11个氨基酸(aa))。通过HPLC分析，肽的纯度超过80％，它们的组合物通过质谱验证。将冻干的肽溶解于二甲基亚砜(DMSO)，分装并储存于-70℃。表3显示所用的肽池。对于体外刺激，以每个池6个肽布置肽(如表3所示)，其中每个肽的最终浓度为2mg/ml。
表3：结核分枝杆菌抗原Rv2626c肽池
细胞制备和试剂
在Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)上通过离心分离外周血单核细胞(PBMC)，并将其与不同的肽池(5μg/ml)和补充有L-谷氨酰胺、盘里西林/链霉素和10％人血清(Sigma-Aldrich)的RPMI 1640(Gibco)一起培养。5天后，收集不含细胞的上清液以通过ELISA(BioLegend)测定IFN-γ表达。
结果
首先设计其中每个池由6个不同肽组成的池矩阵，然后测试针对这些池的IFN-γ产量。
从图2可以看出，池1、2、3、4、5、6、8、9、10和12诱导高IFN-γ水平，这显著地将LTBI个体与结核病患者和健康对照区分开来。
总之，这些数据表明，根据本发明的组合物能够用于诊断试验以在TB、LTBI和HD受试者中区分LTBI受试者，并且是可用于区分LTBI受试者、TB患者和HD的诊断试验的非常好的候选物。
序列表
<110> INSERM TRANSFERT
CONICET
CNRS PARIS
UNIVERSITE AIX MARSEILLE
Institut Jean Paoli et Irene Calmettes
<120> 用于诊断潜伏性感染的结核分枝杆菌的组合物
<130> BEX15L0361
<150> EP14306329.5
<151> 2014-08-29
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 143
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 1
Met Thr Thr Ala Arg Asp Ile Met Asn Ala Gly Val Thr Cys Val Gly
1 5 10 15
Glu His Glu Thr Leu Thr Ala Ala Ala Gln Tyr Met Arg Glu His Asp
20 25 30
Ile Gly Ala Leu Pro Ile Cys Gly Asp Asp Asp Arg Leu His Gly Met
35 40 45
Leu Thr Asp Arg Asp Ile Val Ile Lys Gly Leu Ala Ala Gly Leu Asp
50 55 60
Pro Asn Thr Ala Thr Ala Gly Glu Leu Ala Arg Asp Ser Ile Tyr Tyr
65 70 75 80
Val Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gln Glu Met Leu Asn Val Met Glu Glu
85 90 95
His Gln Val Arg Arg Val Pro Val Ile Ser Glu His Arg Leu Val Gly
100 105 110
Ile Val Thr Glu Ala Asp Ile Ala Arg His Leu Pro Glu His Ala Ile
115 120 125
Val Gln Phe Val Lys Ala Ile Cys Ser Pro Met Ala Leu Ala Ser
130 135 140
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 2
Glu Thr Leu Thr Ala Ala Ala Gln Tyr Met Arg Glu His Asp Ile
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 3
Asp Asp Arg Leu His Gly Met Leu Thr Asp Arg Asp Ile Val Ile
1 5 10 15
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 4
Asp Pro Asn Thr Ala Thr Ala Gly Glu Leu Ala Arg Asp Ser Ile
1 5 10 15
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 5
Asn Ala Ser Ile Gln Glu Met Leu Asn Val Met Glu Glu His
1 5 10
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 6
Glu His Arg Leu Val Gly Ile Val Thr Glu Ala Asp Ile Ala Arg
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 7
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<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 8
Ala Ala Ala Gln Tyr Met Arg Glu His Asp Ile Gly Ala Leu
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<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 9
Ala Gln Tyr Met Arg Glu His Asp Ile Gly Ala Leu Pro Ile
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<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 10
Met Arg Glu His Asp Ile Gly Ala Leu Pro Ile Cys Gly Asp Asp Asp
1 5 10 15
Arg
<210> 11
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<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 11
Gly Ala Leu Pro Ile Cys Gly Asp Asp Asp Arg Leu His Gly Met
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<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
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Ile Cys Gly Asp Asp Asp Arg Leu His Gly Met Leu Thr Asp Arg
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<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 13
Ala Thr Ala Gly Glu Leu Ala Arg Asp Ser Ile Tyr Tyr Val
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<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
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Gly Glu Leu Ala Arg Asp Ser Ile Tyr Tyr Val Asp Ala Asn Ala
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<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
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Arg Asp Ser Ile Tyr Tyr Val Asp Ala Asn Ala Ser Ile
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 16
Ser Ile Tyr Tyr Val Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gln Glu Met Leu
1 5 10 15
<210> 17
<211> 14
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 17
Val Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gln Glu Met Leu Asn Val Met
1 5 10
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 18
Val Gly Ile Val Thr Glu Ala Asp Ile Ala Arg His Leu
1 5 10
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 19
Ile Val Thr Glu Ala Asp Ile Ala Arg His Leu Pro Glu His Ala
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 20
Ala Asp Ile Ala Arg His Leu Pro Glu His Ala Ile Val Gln Phe
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 21
Arg His Leu Pro Glu His Ala Ile Val Gln Phe Val Lys Ala Ile
1 5 10 15
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 22
Glu His Ala Ile Val Gln Phe Val Lys Ala Ile Cys Ser Pro Met
1 5 10 15
<210> 23
<211> 100
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 23
Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val
20 25 30
Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly
35 40 45
Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys
50 55 60
Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly
65 70 75 80
Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser
85 90 95
Gln Met Gly Phe
100
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<211> 95
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 24
Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly
20 25 30
Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu
50 55 60
Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly
65 70 75 80
Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala
85 90 95
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌
<400> 25
Met Thr Thr Ala Arg Asp Ile Met Asn Ala Gly Val Thr Cys Val
1 5 10 15
<210> 26
<211> 14
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<213> 结核分枝杆菌
<400> 26
Arg Asp Ile Met Asn Ala Gly Val Thr Cys Val Gly Glu His
1 5 10
<210> 27
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<213> 结核分枝杆菌
<400> 27
Met Asn Ala Gly Val Thr Cys Val Gly Glu His Glu Thr Leu
1 5 10
<210> 28
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<213> 结核分枝杆菌
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Gly Val Thr Cys Val Gly Glu His Glu Thr Leu Thr Ala Ala Ala
1 5 10 15
<210> 29
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<213> 结核分枝杆菌
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Val Gly Glu His Glu Thr Leu Thr Ala Ala Ala Gln Tyr Met Arg
1 5 10 15
<210> 30
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<400> 30
His Gly Met Leu Thr Asp Arg Asp Ile Val Ile Lys Gly Leu Ala
1 5 10 15
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<213> 结核分枝杆菌
<400> 31
Thr Asp Arg Asp Ile Val Ile Lys Gly Leu Ala Ala Gly Leu
1 5 10
<210> 32
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<213> 结核分枝杆菌
<400> 32
Asp Ile Val Ile Lys Gly Leu Ala Ala Gly Leu Asp Pro Asn Thr Ala
1 5 10 15
<210> 33
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Gly Leu Ala Ala Gly Leu Asp Pro Asn Thr Ala Thr Ala
1 5 10
<210> 34
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<213> 结核分枝杆菌
<400> 34
Ala Ala Gly Leu Asp Pro Asn Thr Ala Thr Ala Gly Glu Leu Ala
1 5 10 15
<210> 35
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<213> 结核分枝杆菌
<400> 35
Ile Gln Glu Met Leu Asn Val Met Glu Glu His Gln Val Arg Arg
1 5 10 15
<210> 36
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<213> 结核分枝杆菌
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Leu Asn Val Met Glu Glu His Gln Val Arg Arg Val Pro Val Ile
1 5 10 15
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<213> 结核分枝杆菌
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Glu Glu His Gln Val Arg Arg Val Pro Val Ile Ser Glu His Arg
1 5 10 15
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<213> 结核分枝杆菌
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Val Arg Arg Val Pro Val Ile Ser Glu His Arg Leu Val Gly Ile
1 5 10 15
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<213> 结核分枝杆菌
<400> 39
Pro Val Ile Ser Glu His Arg Leu Val Gly Ile Val Thr Glu Ala
1 5 10 15
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<213> 结核分枝杆菌
<400> 40
Leu Thr Ala Ala Ala Gln Tyr Met Arg Glu His Asp Ile Gly Ala Leu
1 5 10 15
Pro Ile Cys Gly
20
<210> 41
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<213> 结核分枝杆菌
<400> 41
Gly Glu Leu Ala Arg Asp Ser Ile Tyr Tyr Val Asp Ala Asn Ala Ser
1 5 10 15
Ile Gln Glu Met
20
<210> 42
<211> 20
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<213> 结核分枝杆菌
<400> 42
Arg His Leu Pro Glu His Ala Ile Val Gln Phe Val Lys Ala Ile Cys
1 5 10 15
Ser Pro Met Ala
20

Claims (15)

1.包含至少三个肽的组合物，其中所述至少三个肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：1的结核分枝杆菌抗原Rv2626c的氨基酸序列的5-30个连续氨基酸的不同片段组成，并且不包括SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42的氨基酸序列的肽。
2.权利要求1所述的肽，包含3-10个肽。
3.权利要求1或2所述的肽，其中所述至少三个肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1的结核分枝杆菌抗原Rv2626c的氨基酸序列的10-30个连续氨基酸，优选12-20个连续氨基酸的不同片段。
4.权利要求1或2所述的肽，其中所述至少三个肽选自：
-SEQ ID NO：2的肽6或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：3的肽12或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：4的肽18或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：5的肽24或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：6的肽30或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：7的肽36或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：8的肽7或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：9的肽8或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：10的肽9或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：11的肽10或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：12的肽11或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：13的肽19或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：14的肽20或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：15的肽21或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：16的肽22或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：17的肽23或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：18的肽31或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：19的肽32或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：20的肽33或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：21的肽34或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：22的肽35或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：25的肽1或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：26的肽2或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：27的肽3或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：28的肽4或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：29的肽5或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：30的肽13或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：31的肽14或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：32的肽15或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：33的肽16或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：34的肽17或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：35的肽25或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：36的肽26或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：37的肽27或其至少3个氨基酸的片段；
-SEQ ID NO：38的肽28或其至少3个氨基酸的片段；和
-SEQ ID NO：39的肽29或其至少3个氨基酸的片段。
5.前述权利要求任一项所述的组合物，包含6个肽，其中所述六个肽的氨基酸序列由12-20个连续氨基酸的不同片段组成。
6.权利要求1、2和4-5任一项所述的组合物，包含：
-肽6、12、18、24、30和36，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽7、8、9、10、11和12，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽19、20、21、22、23和24，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽31、32、33、34、35和36，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽1、7、13、19、25和31，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽2、8、14、20、26和32，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽3、9、15、21、27和33，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽4、10、16、22、28和34，或其至少3个氨基酸的片段；
-肽5、11、17、23、29和35，或其至少3个氨基酸的片段；或
-肽13、14、15、16、17和18，或其至少3个氨基酸的片段。
7.权利要求1-6任一项所述的组合物，进一步包含CFP-10和/或ESAT-6抗原。
8.权利要求1-7任一项所述的组合物在诊断潜伏性感染结核分枝杆菌(LTBI)受试者中的用途。
9.权利要求1-7任一项所述的组合物在区分健康受试者、患有活动性结核病的受试者和LTBI受试者中的用途。
10.在干扰素γ释放分析(IGRA)中的权利要求8或9任一项所述的用途。
11.权利要求8-10任一项所述的用途用来诱导IFN-γ表达。
12.诊断LTBI受试者的方法，所述方法包括通过以下使用权利要求1-7任一项所述的组合物：
(i)在来自受试者的分离的外周血单核细胞(PBMC)或血样中测量IFN-γ的表达水平；和
(ii)由此推断该受试者是否患有LTBI。
13.区分健康受试者、患有活动性结核病的受试者和LTBI受试者的方法，包括通过以下使用权利要求7所述的组合物：
(i)在来自受试者的分离的外周血单核细胞(PBMC)或血样中测量IFN-γ的表达水平；和
(ii)由此推断该受试者是否患有LTBI。
14.权利要求12或13所述的方法，包括：
(i)将来自受试者的分离的外周血单核细胞(PBMC)或血样与所述组合物一起培养；
(ii)测量所述分离的外周血单核细胞(PBMC)或所述血样的IFN-γ的表达水平；和
(iii)由此推断该受试者是否患有LTBI。
15.用于诊断LTBI受试者和/或用于区分健康受试者、患有活动性结核病的受试者和LTBI受试者的试剂盒，包含：
(i)权利要求1-7任一项所述的组合物；和
(ii)用于诊断ITBI受试者和/或用于区分健康受试者、患有活动性结核病的受试者和LTBI受试者的说明书。
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