CN107074951B - 拮抗性抗-ox40l抗体及其使用方法 - Google Patents

拮抗性抗-ox40l抗体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明描述了用于治疗自身免疫和炎性病症而不非特异性抑制宿主免疫***的方法和组合物。具体地，本发明描述的抗‑OX40L抗体的独特之处在于其不仅抑制炎性T细胞的分化，而且还通过诱导IL‑10和抑制TNF‑α以及通过降低异常Th2细胞应答来促进调节性T细胞的产生和功能。此外，本发明描述的方法和组合物消除或降低可能促成自身免疫疾病的致病性的异常T滤泡性辅助细胞‑(Tfh)应答。

Description

拮抗性抗-OX40L抗体及其使用方法
发明背景
本申请要求2014年8月4日提交的第62/032,959号美国临时专利申请的优先权的权益，通过引用将其整体并入本文。
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的批准号为AI057234、AI082715和AI089987的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
1.发明领域
总地来说，本发明涉及医药领域。更具体地，其涉及用于治疗自身免疫和炎性障碍以及调节免疫应答的药物组合物。
2.相关技术描述
自身免疫疾病和一些炎性障碍由身体对正常存在于体内的物质和组织的异常免疫应答引起(自身免疫性或自身炎性)。这可能限于某些器官(例如，在自身免疫性甲状腺炎中)或涉及不同部位的特定组织(例如，古德帕斯彻病(Goodpasture's disease)，其可以影响肺和肾的基底膜)。自身免疫疾病仅在美国就影响高达5千万人，并且自身免疫的原因仍然未知。此外，有许多炎性疾病，其与自身免疫无关并且可以是特发性的，或与慢性或急性障碍有关。
自身免疫和炎性疾病的治疗通常采用降低免疫应答和/或炎症反应的免疫抑制或抗炎药物。使用免疫抑制剂，如环孢菌素、他克莫司(tacroliums)、氨甲蝶呤或抗TNFa/IL-6的常规免疫疗法非特异性抑制宿主中的T细胞的功能，包括非致病性T细胞的功能。因此，使用这些免疫抑制剂的治疗通常导致严重感染的发展，并且有时导致致命的后果。本领域中存在对治疗自身免疫应答和/或炎症反应而没有全面免疫抑制的治疗剂的需求。
发明概述
本文描述了用于治疗自身免疫和炎性病症而不非特异性抑制宿主免疫***的方法和组合物。具体地，本文所述的抗-OX40L抗体的独特之处在于其不仅抑制炎性T细胞的分化，而且还通过诱导IL-10和抑制TNF-α以及通过降低异常Th2细胞应答来促进调节性T细胞的产生和功能。此外，本文描述的方法和组合物消除或降低可能促成自身免疫疾病的致病性的异常T滤泡性辅助细胞-(Tfh)应答。
本发明公开了药物组合物，其包含分离的抗-OX40L抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗-OX40L抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含三个互补决定区(CDR)氨基酸序列，其中CDR中的一个或多个包含选自SEQ ID NO:5-7、19-21或33-35的氨基酸序列或其等价序列。在一些实施方案中，抗原结合片段的抗体包含三个来自可变结构域的CDR。在一些实施方案中，三个重链可变结构域CDR包含SEQ ID NO:5-7的氨基酸序列或其等价序列中的每一种。在其他实施方案中，三个重链可变结构域CDR各自包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列或其等价序列。在其他实施方案中，三个重链可变结构域CDR各自包含SEQ ID NO:33-35的氨基酸序列或其等价序列。在另外的实施方案中，抗-OX40L抗体或其抗原结合片段还包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含三个互补决定区(CDR)氨基酸序列，其中CDR中的一个或多个包含选自SEQ ID NO:12-14、26-28、40-42的氨基酸序列或其等价序列。在一些实施方案中，有三个轻链可变结构域CDR，其各自包含SEQ ID NO:12-14的氨基酸序列或其等价序列。在其他实施方案中，有三个轻链可变结构域CDR，其各自包含SEQ ID NO:26-28的氨基酸序列或其等价序列。在另外的实施方案中，有三个轻链可变结构域CDR，其各自包含SEQ ID NO:40-42的氨基酸序列或其等价序列。
在本文所述的某些实施方案中，抗-OX40L抗体或其抗原结合片段结合于人OX40L或其等价物。在具体的实施方案中，OX40L抗体是破坏、阻止或阻碍OX40L蛋白的功能或相互作用(例如，OX40-OX40L相互作用)的中和抗体。在特定实施方案中，抗-OX40L抗体包括5C6、19A3或44F3单克隆抗体。
在其他实施方案中，抗体是人抗体、人源化抗体、重组抗体、嵌合抗体、抗体衍生物、镶嵌抗体(veneered antibody)、双价抗体(diabody)、工程化抗体、多特异性抗体、DARPin(设计的锚蛋白重复蛋白)、单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。
在另外的实施方案中，OX40L抗体包含修饰。在某些实施方案中，修饰是VH和/或VLCDR 1、CDR 2和/或CDR 3区域内的保守氨基酸突变；具有Fc铰链区中的保守氨基酸突变；聚乙二醇化；与血清蛋白缀合；与人血清白蛋白缀合；与可检测标记缀合；与诊断试剂缀合；与酶缀合；与荧光、发光或生物发光材料缀合；与放射性材料缀合；或与治疗剂缀合。
某些实施方案涉及药物组合物，其包含分离的人源化IgG抗-OX40L抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化IgG抗-OX40L抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的互补决定区(CDR)氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQID NO:14的互补决定区(CDR)氨基酸序列。
其他实施方案涉及药物组合物，其包含分离的人源化IgG抗-OX40L抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化IgG抗-OX40L抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的互补决定区(CDR)氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的互补决定区(CDR)氨基酸序列。
另外的实施方案涉及药物组合物，其包含分离的人源化IgG抗-OX40L抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化IgG抗-OX40L抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35的互补决定区(CDR)氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42的互补决定区(CDR)氨基酸序列。
本发明的另外的方面涉及分离的多核苷酸，其包含编码抗-OX40L抗体或其抗原结合片段的多肽链的核酸序列，所述抗-OX40L抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含三个互补决定区(CDR)氨基酸序列，其中CDR中的一个或多个包含选自SEQ ID NO:5-7、19-21、33-35的氨基酸序列或其等价序列。另一个方面涉及分离的多核苷酸，其包含编码抗-OX40L抗体或其抗原结合片段的多肽链的核酸序列，所述抗-OX40L抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含三个互补决定区(CDR)氨基酸序列，其中CDR中的一个或多个包含选自SEQ ID NO:12-14、26-28、40-42的氨基酸序列或其等价序列。本发明还公开了包含本文所述的多核苷酸的表达载体，和包含可操作地连接到调节序列的本文所述的多核苷酸的宿主细胞。
本发明提供了其中抗-OX40L抗体或其抗原结合片段包含一个或多个来自特异性结合于OX40L的抗体的CDR结构域的实施方案。在特定实施方案中，抗-OX40L抗体或其抗原结合片段包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个来自19A3、5C6和44F3单克隆抗体的VH或VL结构域的CDR结构域。在某些方面，抗-OX40L抗体或其抗原结合片段包含六个来自19A3、5C6和44F3单克隆抗体的VH或VL结构域的CDR结构域。在一些实施方案中，抗-OX40L抗体或其抗原结合片段包含与19A3、5C6和44F3单克隆抗体的VH或VL结构域至少或至多70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％(或其中可推导的任何范围)相同的序列。本发明提供了其中抗-OX40L抗体或其抗原结合片段包含来自19A3、5C6或44F3单克隆抗体的VH结构域和/或来自19A3、5C6或44F3单克隆抗体的VL结构域的实施方案。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是重组的。在某些方面，重组多肽包含一个或多个来自19A3、5C6和44F3单克隆抗体的VH或VL结构域的CDR结构域的至少90％、95％或99％。在一些实施方案中，重组多肽包含两个、三个、四个、五个、六个或更多个来自19A3、5C6和44F3单克隆抗体的VH或VL结构域的CDR结构域。
在一些实施方案中，重组多肽包含i)来自19A3的可变轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3(SEQ ID NO:12-14)；和/或ii)来自19A3的可变重链的CDR1、CDR2和/或CDR3(SEQ ID NO:5-7)。在一些实施方案中，重组多肽包含i)来自5C6的可变轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3(SEQID NO:26-28)；和/或ii)来自5C6的可变重链的CDR1、CDR2和/或CDR3(SEQ ID NO:19-21)。在一些实施方案中，重组多肽包含i)来自44F3的可变轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3(SEQ IDNO:40-42)；和/或ii)来自44F3的可变重链的CDR1、CDR2和/或CDR3(SEQ ID NO:33-35)。这些CDR的序列可以在随后的公开内容中找到。
在一些实施方案中，有包含一个或多个抗-OX40L抗体CDR结构域的纯化多肽。如上所述，多肽可以包含1、2、3、4、5或6个来自抗-OX40L抗体的轻和/或重链可变区的CDR。在某些实施方案中，多肽包含来自特定抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3。本发明考虑的是，虽然在一些实施方案中，多肽具有来自轻链的可变区和/或重链的可变区的CDR1、CDR2和CDR3，但所述CDR1、CDR2和CDR3不需要来自相同抗体。虽然一些多肽具有来自相同抗体或基于相同抗体的CDR1、CDR2和CDR3，但本发明考虑的是，来自一种抗体的CDR1可以被来自或基于另一种抗体的CDR取代。例如，多肽可以包含来自或基于19A3的轻链可变区的CDR1、来自或基于19A3的轻链可变区的CDR2，但具有来自或基于5C6的可变轻链区的CDR3。然而，本发明通常考虑的是当单一的一组CDR1、CDR2和CDR3一起使用时，它们均来自轻链可变区或来自重链可变区，而不是来自两者的混合。
供选择地，多肽可以包含CDR1序列，其与SEQ ID NO:12、26和40所示的整条序列至多或至少70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％(或其中可推导的任何范围)相同，所述SEQ ID NO:12、26和40所示的整条序列是来自抗-OX40L抗体的轻链可变区的CDR1序列。供选择地或另外地，多肽可以包含CDR2序列，其与SEQ ID NO:13、27和41所示的整条序列至多或至少70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％(或其中可推导的任何范围)相同，所述SEQID NO:13、27和41所示的整条序列是来自抗-OX40L抗体的轻链可变区的CDR2序列。供选择地或另外地，多肽可以包含CDR3序列，其与SEQ ID NO:14、28和42所示的整条序列至多或至少70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％(或其中可推导的任何范围)相同，所述SEQ IDNO:14、28和42所示的整条序列为来自抗-OX40L抗体的轻链可变区的CDR3序列。供选择地或另外地，多肽可以包含CDR1序列，其与SEQ ID NO:5、19和33所示的整条序列至多或至少70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％(或其中可推导的任何范围)相同，所述SEQ ID NO:5、19和33所示的整条序列为来自抗-OX40L抗体的重链可变区的CDR1序列。供选择地或另外地，多肽可以包含CDR2序列，其与SEQ ID NO:6、20和34所示的整条序列至多或至少70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％(或其中可推导的任何范围)相同，所述SEQ ID NO:6、20和34所示的整条序列为来自抗-OX40L抗体的重链可变区的CDR2序列。供选择地或另外地，多肽可以包含CDR3序列，其与SEQ ID NO:7、21和35所示的整条序列至多或至少70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％(或其中可推导的任何范围)相同，所述SEQ ID NO:7、21和35所示的整条序列为来自抗-OX40L抗体的重链可变区的CDR3序列。
本发明的方法方面涉及用于治疗或预防有其需要的受试者的炎症的方法，包括给予受试者治疗有效量的OX40L抑制剂。
另外的方面涉及用于治疗或预防有其需要的受试者的自身免疫疾病的方法，包括给予受试者治疗有效量的OX40L抑制剂。
在某些方面，所述方法用于预防有其需要的受试者的与自身免疫疾病相关的炎症，包括给予受试者治疗有效量的OX40L抑制剂。
其他方面涉及在有其需要的受试者中降低炎性Th2细胞应答、增加IL-10产生和/或减少TNF-α产生的方法，包括给予受试者治疗有效量的OX40L抑制剂。在一些实施方案中，炎性Th2细胞应答包括产生低IL-10/高TNF-α的炎性Th2细胞。
其他方面涉及用于降低有其需要的受试者的致病性Tfh细胞应答的方法，包括给予治疗有效量的OX40L抑制剂。
在一些实施方案中，所治疗的受试者是患有自身免疫疾病的受试者。在某些方面，受试者的自身免疫障碍通过给予OX40L抑制剂治疗，所述OX40L抑制剂降低受试者的致病性Tfh细胞应答。
在另外的实施方案中，受试者具有炎症。受试者的炎症可以通过给予OX40L抑制剂来减少或消除，所述OX40L抑制剂增加受试者的IL-10产生并减少受试者的TNF-α产生。OX40L抑制剂还可以通过降低受试者的炎性Th2细胞应答来减少炎症。
在一些实施方案中，所治疗的受试者患有自身免疫障碍或具有由自身免疫障碍引起的炎症。在一些实施方案中，自身免疫疾病选自：过敏性疾病哮喘、特应性皮炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎、炎性肠病、接触性超敏反应、哮喘性气道高反应、自身免疫性糖尿病、动脉粥样硬化、***性红斑狼疮、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、I型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化、溃疡性结肠炎、多肌炎、混合性***病、***性硬化、重症肌无力、甲状腺炎、自身免疫性溶血性贫血、免疫性血小板减少性紫癜、皮肌炎、抗中性粒细胞胞浆自身抗体介导的疾病、IgA-介导的血管炎和Ig4-相关障碍。在一些实施方案中，自身免疫疾病是***性红斑狼疮。
在另外的实施方案中，炎症可以是特发性的。在又另外的实施方案中，炎症可以是非自身免疫相关的疾病或病症，例如受伤的结果。
另外的方面涉及用于治疗或预防有其需要的受试者的移植物抗宿主病或移植排斥的方法，包括给予受试者治疗有效量的OX40L抑制剂。
移植物抗宿主病(GVHD)是在同种异体的组织移植之后常见的并发症。其通常与干细胞或骨髓移植相关，但该术语也适用于其他形式的组织移植。组织(移植物)中的免疫细胞(白血细胞)将受者(宿主)识别为“外来的”。然后，移植的免疫细胞攻击宿主的体细胞。如果使用的血液制品未经辐照，则在输血后也会发生GVHD。
当移植的组织被受者的免疫***排斥时，发生移植排斥，其破坏移植的组织。移植排斥(graft rejection)也可以称为移植排斥(transplant rejection)或宿主抗移植物病。
在以上公开的方法中任一种的一些实施方案中，受试者是将接受或已经接受移植的组织的受试者。在相关的实施方案中，移植的组织是同种异体移植物。同种异体移植物(也称为同种异体移植术、同种异体移植或同种移植物)是将细胞、组织或器官从相同物种的遗传上不相同的供者移植到受者。在相关的实施方案中，受试者是具有源自移植的组织的并发症的受试者，其中所述并发症是移植排斥或GVHD。
术语“受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，并且是指脊椎动物，例如灵长类动物、哺乳动物或优选为人。哺乳动物包括但不限于，马、犬、牛、羊、鼠、大鼠、猿、人、饲养动物、运动动物和宠物。在本文所述的方法的一个实施方案中，受试者为人受试者。
OX40L抑制剂可以是siRNA、dsRNA、miRNA、核酶、分子抑制剂、小分子、抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，OX40L抑制剂是OX40L抗体或其抗原结合片段。在另外的实施方案中，OX40L抑制剂包括如本文所述的组合物。在又另外的实施方案中，OX40L抑制剂包括本文所述的多肽、多核苷酸、抗体、宿主细胞或表达载体。
如本文在说明书中所使用的，“一(a)”或“一(an)”可以表示一个或多个。如本文在权利要求(多个权利要求)中所使用的，当与词语“包含(comprising)”一起使用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以表示一个或多于一个。
在权利要求中使用术语“或”是用来表示“和/或”，除非明确指明仅指代供选择的方案，或供选择的方案互相排斥，但是本发明支持仅指代供选择的方案和“和/或”的定义。如本文所使用的，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。
贯穿本申请，术语“约”用于表示包括用于确定数值的装置、方法固有的误差变化或在研究受试者中存在的变化的数值。
本发明的其他目的、特征和优点将由以下详述变得显而易见。然而，应理解的是，虽然详细描述和具体实施例显示本发明的优选实施方案，但是其仅以举例说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改基于该详细描述将变得对本领域技术人员显而易见。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。结合本文提供的具体实施方案的详述，参照这些附图中的一个或多个，可以更好地理解本发明。
图1描绘了其中根据实施例1所述的方法，在5C6(AB104_105.5C6.3F9)抗-OX40LmAb、ik-5抗-OX40L mAb或对照抗体(IgG2a)的存在下共培养树突细胞和T细胞的分析的结果。IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-α和IFN-γ的产生通过ELISA测定。
图2描绘了其中根据实施例1所述的方法，在19A3(AB104_105.19A3.2C4)抗-OX40LmAb、ik-5抗-OX40L mAb或对照抗体(IgG2a和IgG2b)的存在下共培养树突细胞和T细胞的分析的结果。IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-α和IFN-γ的产生通过ELISA测定。
图3描绘了其中根据实施例1所述的方法，在5C6(AB104_105.5C6.3F9)抗-OX40LmAb、44F3(AB104_105.44F3.2F7)抗-OX40L mAb、19A3(AB104_105.19A3.2C4)抗-OX40LmAb、ik-5抗-OX40L mAb或对照抗体(IgG2a和IgG2b)的存在下共培养树突细胞和T细胞的分析的结果。IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-α和IFN-γ的产生通过ELISA测定。
图4描绘了其中根据实施例1所述的方法，在5C6(AB104_105.5C6.3F9)抗-OX40LmAb、ik-5抗-OX40L mAb或对照抗体(IgG2a)的存在下共培养树突细胞和T细胞的分析的结果。收获细胞并确定细胞的增殖和活力。
图5描绘了其中根据实施例1所述的方法，在19A3(AB104_105.19A3.2C4)抗-OX40LmAb、ik-5抗-OX40L mAb或对照抗体(IgG2a和IgG2b)的存在下共培养树突细胞和T细胞的分析的结果。收获细胞并确定细胞的增殖和活力。
图6描绘了其中根据实施例1所述的方法，在5C6(AB104_105.5C6.3F9)抗-OX40LmAb、44F3(AB104_105.44F3.2F7)抗-OX40L mAb、19A3(AB104_105.19A3.2C4)抗-OX40LmAb、ik-5抗-OX40L mAb或对照抗体(IgG2a和IgG2b)的存在下共培养树突细胞和T细胞的分析的结果。收获细胞并确定细胞的增殖和活力。
图7描绘了其中根据实施例1所述的方法，在19A3(AB104_105.19A3.2C4)或对照抗体(小鼠IgG2b)的存在下共培养树突细胞和T细胞的分析的结果。IL-10和TNF-α的产生通过ELISA测定。
图8显示重复图7所述的实验。
图9A-9C显示在炎症扁桃体中髓样APC的OX40L表达升高。(A)OX40L、ICOSL、4-1BBL和GITRL在来自儿童扁桃体的髓样CD11c+HLA-DR+APC上的表达。出自9次独立实验的代表性结果。(B)在扁桃体髓样APC内的OX40L+、ICOSL+、GITRL+和4-1BBL+细胞的频率。平均±s.d.，n＝9。单因素方差分析(one way ANOVA)。***p<0.001。(C)炎症扁桃体中的OX40L+CD11c+APC。GC：生发中心；MZ：外套层；Epi：上皮层。上图和下图的比例尺分别显示为100μm和10μm。
图10A-10E显示来自SLE患者的髓样APC的OX40L表达。(A)来自成年SLE患者和没有自身免疫疾病的受试者的皮肤和肾活检中的OX40L+髓样APC。来自SLE患者的5例皮肤和3例肾活检样品和来自对照的5例皮肤和2例肾活检样品的代表性结果。比例尺＝100μm。(B)来自以下三个组的血液髓样CD11c+HLA-DR+APC的OX40L表达的代表性流式数据：健康供者(HD)、非活动性(iSLE)和活动性(aSLE)SLE患者。(C)在成人和儿科同期群组中的三个组中的血液髓样APC内的OX40L+细胞的频率。上：成人同期群组；16例HD、38例iSLE和31例aSLE样品。下：儿童同期群组；14例HD、20例iSLE和14例aSLE样品。单因素方差分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。(D)在CD11c+HLA-DR+髓样APC内的OX40L+细胞的百分比(成人：n＝69和儿童：n＝38)和由SLEDAI评估的疾病活动性之间的相关性。使用Spearman检验进行统计分析。(E)在成人(n＝28)和儿科(n＝34)SLE患者中的不同亚组的血液OX40L+髓样APC的组成(CD14+CD16-、CD14+CD16+、CD14-CD16-、CD14-CD16+)。平均±s.d.
图11A-11C显示OX40信号诱导Tfh基因的上调。(A)在sOX40L存在或不存在的情况下使用抗-CD3和抗-CD28激活48h的初始和记忆Th细胞(来自三个供者)的Tfh基因表达。在归一化后显示培养的Th细胞中的转录物计数。平均±s.d，n＝3。配对t检验。*p<0.05，**p<0.01。(B)在所述试剂的存在下使用抗-CD3和抗-CD28激活48h的初始和记忆Th细胞的Tfh基因表达谱。在所述试剂的存在下培养的Th细胞的转录物计数相对于在每个供者的对照Th细胞中的转录物计数进行归一化。(C)在所述试剂的存在下使用抗-CD3和抗-CD28激活的记忆Th细胞中的转录物计数。每个条形图中的条从左到右表示“无”、“OX40L”、“IL-2”、“IL-2+OX40L”和“IFN-γ”。平均±s.d.，n＝3。单因素方差分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图12A-12C显示OX40L刺激促进初始和记忆T细胞分化成Tfh样细胞。(A)在sOX40L和/或IL-12存在或不存在的情况下使用抗-CD3和抗-CD28激活4天的初始和记忆Th细胞的CXCR5、IL-21和CD40L表达。门控到(gated to)FSChiSSChi激活的细胞。显示了出自3次独立实验的代表性结果。(B)在sOX40L和/或IL-12存在或不存在的情况下使用抗-CD3和抗-CD28激活后的初始或记忆Th细胞中形成的CXCR5+IL-21+和CXCR5+CD40L+细胞的频率。单因素方差分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n＝3。(C)在sOX40L和/或IL-12的存在下使用抗-CD3和抗-CD28激活初始或记忆Th细胞4天，然后与自体记忆B细胞一起培养。显示了每孔的上清液中的IgG浓度。显示了出自2次独立实验的代表性结果。
图13A-13F显示人SLE中的血液CD14+APC通过OX40L促进Tfh样细胞的产生。(A)使用来自非活动性(iSLE，n＝5)和活动性(aSLE，n＝5)SLE患者的同种异体CD14+APC培养7天后，在初始Th细胞中形成的CXCR5+IL-21+细胞(在FSChiSSChi激活的细胞中)的频率。Mann-Whitney U检验。**p<0.01。(B)在OX40L中和mAb或对照IgG的存在下，使用同种异体SLECD14+APC培养的初始Th细胞的CXCR5和IL-21的表达。显示了出自5次实验的代表性结果。(C)抗-OX40L降低CXCR5+IL-21+细胞(在FSChiSSChi激活的细胞中)的产生。显示了来自活动性SLE患者的APC的结果。配对t检验。**p<0.01。(D)CD14+APC内的OX40L+细胞的频率和在培养物中产生的CXCR5+IL-21+Th细胞的频率之间的相关性。Spearman相关性检验，n＝10。(E)三个组中血液Tfh细胞上的ICOS的表达；aSLE、iSLE和HD。显示了代表性流动结果。(F)血液髓样APC内的OX40L+细胞的频率和SLE患者中的血液Tfh细胞内的ICOS+细胞的频率之间的相关性。Spearman相关性检验，n＝19。
图14A-14E显示RNP/抗-RNP IC以TLR7-依赖性方式促进髓样APC的OX40L表达。(A)暴露于对照血清(n＝7)或SLE血清(n＝21)的纯化的正常单核细胞的OX40L(MFI)的表达。Mann-Whitney U检验。**p<0.01。左图显示了代表性染色。(B)纯化的正常单核细胞被TLR3、TLR7或TLR9激动剂刺激时的OX40L表达。显示了出自4次不同实验的代表性染色。(C)在TLR7抑制剂存在或不存在的情况下，暴露于SLE血清(n＝7)的正常单核细胞中的OX40L表达(MFI)。配对t检验。**p<0.01。左图显示了代表性染色。(D)暴露于抗-RNP阴性SLE血清(n＝5)或抗-RNP阳性SLE血清(n＝16)中的正常单核细胞中的OX40L表达(MFI)。Mann-Whitney U检验。**p<0.01。(E)暴露于抗-RNP阴性SLE血清(上图)、补充含抗-RNP的IgG的血清(中间图)、在TLR7抑制剂存在下加标有抗-RNP的IgG的血清(下图)的纯化的正常单核细胞的OX40L表达。显示了出自三次独立实验的代表性染色。
图15显示在SLE中的髓样APC的OX40L表达。15名健康供者(HD)、37名SLE、13名***性硬化(SSc)和11名类风湿性关节炎(RA)患者的血液CD11c+HLA-DR+细胞的OX40L表达的分析。单因素方差分析。***P<0.001。
图16A-16B显示活动性SLE患者的血液髓样APC不表达ICOSL、4-1BBL或GITRL。8名活动性SLE患者的血液髓样APC的OX40L、GITRL、ICOSL、4-1BBL表达的分析。在图a、b中显示了代表性流式结果。单因素方差分析。**P<0.01，*P<0.05。
图17显示大多数血液OX40L+髓样APC表达CD14。分析成年和儿科SLE患者的血液OX40L+髓样APC上的CD14和CD16表达。显示了来自11名成年SLE和12名儿科SLE患者样品的代表性的流式结果。
图18显示血液髓样APC上的OX40L表达在治疗后在成年SLE患者中降低。在治疗(Tx)之前和之后，分析11名突发的(flaring)先前未治疗的成年SLE患者的血液髓样APC上的OX40L表达。显示了治疗之前和之后的血液髓样APC内的OX40L+细胞的百分比。配对t检验，n＝11。
图19显示OX40信号诱导初始Th细胞表达Tfh基因。在所述试剂的存在下使用抗-CD3和抗-CD28激活48h的初始Th细胞的Tfh基因表达谱。每个条形图中的条从左到右表示“无”、“OX40L”、“IL-2”、“IL-2+OX40L”和“IFN-γ”。平均±s.d.，n＝3。单因素方差分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图20显示OX40L刺激促进初始和记忆Th细胞获得Tfh细胞的表型。在IL-12和/或可溶性OX40L存在或不存在的情况下使用抗-CD3和CD28培养初始和记忆Th细胞。通过流式细胞术在第5天分析激活的(FSChiSSChi)细胞的表型。在上图显示了代表性的流式结果。在不同条件下在激活的细胞内的CXCR5+ICOS+和CXCR5+CCR7-细胞的百分比显示在下图中。单因素方差分析。***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。
图21显示OX40L刺激诱导初始和记忆Th细胞表达IL-21、IL-2和TNF-α。在sOX40L存在或不存在的情况下使用抗-CD3和抗-CD28激活的初始和记忆Th细胞的CXCR5、IL-21和CD40L表达。在布雷菲德菌素A和莫能菌素的存在下使用PMA和离子霉素再刺激培养的Th细胞6h，以分析胞质内细胞因子。配对t检验。***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。
图22显示血液髓样APC内的OX40L+细胞的百分比与SLE患者的血液Tfh细胞的频率相关。分析了19名SLE患者的血液髓样APC内的OX40L+细胞的频率和血液Tfh细胞的频率之间的相关性。使用Spearman检验进行统计分析。
图23显示血液髓样APC内的OX40L+细胞的百分比与SLE患者的血液Th1、Th2和Th17细胞的频率不相关。在上图中显示了(记忆CXCR5-Th细胞内的)血液Th1、Th2和Th17细胞的分析的门控策略。分析了19名SLE患者的血液髓样APC内的OX40L+细胞的频率和血液Th1、Th2和Th17细胞的频率之间的相关性。使用Spearman检验进行统计分析。
图24显示SLE血清的OX40L表达依赖于RNA。在RNA酶(0.1mg/ml，Qiagen)存在或不存在的情况下暴露于SLE血清的纯化的正常单核细胞的OX40L表达。来自5名SLE患者的血清样品的结果。配对t检验，***P<0.001。
图25显示动物在移植组织移植后的存活百分比。
图26A-B显示抗-OX40L抗体不干扰人嵌合性。显示了IgG2b(图26A)处理的小鼠和抗-OX40L(图26B)处理的小鼠的FACS图。
说明性实施方案的描述
使用免疫抑制剂例如环孢菌素、他克莫司、氨甲蝶呤或抗-TNFα/IL-6的常规免疫疗法非特异性抑制T细胞功能，包括宿主中的非致病性T细胞。因此，使用这些免疫抑制剂的治疗通常导致严重感染的发展，并且有时导致致命的后果。本文所述的方法和组合物涉及OX40-OX40L相互作用的有意阻断和炎性T细胞的新近活化的特异性抑制。反过来，炎性T细胞的分化通过诱导IL-10和抑制TNF-α产生而转化为调节性T细胞，而没有全面免疫抑制。重要的是，OX40L的靶向可以仅调节抗原特异性T细胞库(repertoire)，而不破坏其他T细胞库的功能，导致较少的免疫抑制副作用。
使用独特的筛选方法，申请人已经制备了抗人OX40L中和MAb，其1)识别人OX40L上的独特表位；2)抑制由TSLP-mDC引发的产生低IL-10/高TNFα的炎性Th2的分化；和3)抑制TNF-α的增殖和产生，并且通过用OX40L转染的细胞系培养的CD4 T细胞促进IL-10。这些OX40L阻断性单克隆抗体是强力的免疫调节剂，并且为炎性疾病，如移植物抗宿主病、***性红斑狼疮、心血管疾病(例如，动脉粥样硬化)和如本文所述的那些的炎性疾病提供有希望的治疗剂。
I.OX40L抑制剂
A.抗体
本发明的方法和组合物涉及OX40L抑制剂。术语“OX40L”是指已经被发现参与T细胞抗原呈递细胞(APC)相互作用的蛋白。OX40L还可以被称为TNFSF4、GP34、CD252、OX40L、TXGP1和CD134L。该蛋白是OX40的配体(也被称为CD134、TNFRSF4、ACT35、IMD16和TXGP1L)。OX40L的人蛋白序列由Genbank登录号：NP_003317.1、P23510.1、BAB18304.1和P43489.1表示。与这些登录号相关的序列特意地通过引用并入本文。
在某些实施方案中，OX40L抑制剂是抗体或其抗原结合片段。如本文所使用，“抗体”包括全抗体和任何抗原结合片段或其单链。因此，术语“抗体”包括包含免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白或含肽分子。这样的实例包括但不限于，重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(FR)区或其任何部分或结合蛋白的至少一部分。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异性结合人OX40L。
抗体可以是本文描述的各种抗体中的任一种，其非限定性实例包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、镶嵌抗体(veneered antibody)、双价抗体、人源化抗体、抗体衍生物、重组抗体、重组人源化抗体、工程化抗体、多特异性抗体、DARPin、或其各自的衍生物或片段。
可以使用本领域已知的常规技术产生抗体，并且抗体在文献中有详细描述。存在几种用于产生多克隆抗体的方法。例如，通常通过免疫适合的哺乳动物，例如但不限于鸡、山羊、豚鼠、仓鼠、马、小鼠、大鼠和兔产生多克隆抗体。将抗原注射到哺乳动物中，诱导B-淋巴细胞产生对抗原具有特异性的免疫球蛋白。免疫球蛋白可以从哺乳动物的血清纯化。为了最佳的产生和动物的人道处理，该方法的常见变化包括佐剂、给予途径和位点、每个位点的注射体积和每只动物的位点数量的改变。例如，佐剂通常用于提高或增强对抗原的免疫应答。大多数佐剂向注射位点提供抗原储库，其使抗原缓慢释放到引流***中。其他佐剂包括促进在大表面积上的蛋白抗原分子和免疫刺激分子的集中的表面活性剂。用于多克隆抗体产生的佐剂的非限定性实例包括弗氏佐剂、Ribi佐剂***和Titermax。可以使用本领域已知的方法产生多克隆抗体，其中一些描述在第7,279,559号、第7,119,179号、第7,060,800号、第6,709,659号、第6,656,746号、第6,322,788号、第5,686,073号和第5,670,153号美国专利中。
除非另有规定，抗体可以是多克隆或单克隆的，并且可以从任何适合的生物来源，例如鼠、大鼠、兔、山羊、骆驼、绵羊或犬分离。
如本文所使用，“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体。因为每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇，因此单克隆抗体是高度特异性的。可以例如使用放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等可检测地标记抗体。抗体还可以缀合于其他部分，如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-亲和素特异性结合对的成员)等。抗体还可以结合于固体载体，包括但不限于，聚苯乙烯板或珠等。在一些情况下，间接标记抗体。间接标记可以涉及与抗体结合的蛋白质，例如第二抗体的标记。
可以使用本领域已知的且在文献中详细描述的常规杂交瘤技术产生单克隆抗体。例如，通过使适合的永生细胞系(例如，骨髓瘤细胞系，例如但不限于Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、P3X63Ag8,653、Sp2 SA3、Sp2 MAI、Sp2 SS1、Sp2 SA5、U397、MIA144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 313、HL-60、MLA144、NAMAIWA、NEURO 2A、CHO、PerC.6、YB2/O等)或类似的，或异源骨髓瘤、其融合产物，或源自其的任何细胞或融合细胞，或如本领域已知的任何其他适合的细胞系，与产生抗体的细胞融合来产生杂交瘤，所述产生抗体的细胞例如但不限于分离或克隆的脾、外周血、淋巴、扁桃体或其他免疫细胞或含B细胞的细胞，或任何其他表达重链或轻链恒定或可变或框架或CDR序列的细胞，所述重链或轻链恒定或可变或框架或CDR序列为内源性或异源性核酸，为重组的或内源性的病毒，细菌，藻类，原核生物，两栖动物，昆虫，爬行动物，鱼，哺乳动物，啮齿动物，马，羊，山羊，绵羊，灵长类动物，真核生物的基因组DNA，cDNA，rDNA，线粒体DNA或RNA，叶绿体DNA或RNA，hnRNA，mRNA，tRNA，单、双或三链的，杂交的等或其任意组合。产生抗体的细胞还可以获自已经使用目标抗原免疫的人或其他适合的动物的外周血，或优选为脾或***。任何其他适合的宿主细胞也可以用于表达编码本发明的抗体、其指定片段或变体的异源或内源核酸。可以使用选择性培养条件或其他适合的已知方法分离融合细胞(杂交瘤)或重组细胞，并且通过有限稀释或细胞分选或其他已知方法克隆。
可以使用产生或分离具有必要的特异性的抗体的其他适合的方法，包括但不限于使用本领域已知的方法从以下选择重组抗体的方法：肽或蛋白文库(例如但不限于噬菌体、核糖体、寡核苷酸、cDNA等)；展示文库，例如可得自各种供应商，如MorphoSys(Martinsreid/Planegg,Del.)、BioInvent(Lund,Sweden)、Affitech(Oslo,Norway)。本领域已知的方法描述于专利文献中，其中一些包括第4,704,692号、第5,723,323号、第5,763,192号、第5,814,476号、第5,817,483号、第5,824,514号、第5,976,862号美国专利。供选择的方法依赖于能够产生人抗体库的转基因动物(例如，SCID小鼠)的免疫(Nguyen等人，1977；Sandhu等人，1996；Eren等人，1998)，如本领域已知和/或如本文所述。这样的技术包括但不限于核糖体展示(Wanes等人，1997；Hanes等人，1998)；单细胞抗体产生技术(例如，选择的淋巴细胞抗体方法(“SLAM”)(第5,627,052号美国专利，Wen等人，1987；Babcook等人，1996)；凝胶微滴和流式细胞仪(Powell等人，1990；Gray等人，1995；Kenny等人，1995)；B细胞选择(Steenbakkers等人，1994)。
如本文使用的术语“多克隆抗体”或“多克隆抗体组合物”是指源自不同的B-细胞系的抗体的制剂。其为针对特异性抗原分泌的免疫球蛋白分子的混合物，各自识别不同的表位。
如本文所使用的术语“小鼠抗体”旨在包括具有源自小鼠种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。
如本文所使用，嵌合抗体是其轻链和重链基因通常通过基因工程由属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因构建的抗体。
在一个实施方案中，抗-OX40L抗体或其抗原结合片段是中和抗体或其抗原结合片段。在OX40L中和抗体的上下文中，术语“中和”是指可以进行以下一种或多种的抗体：干扰OX40/OX40L相互作用；降低受试者或细胞中OX40/OX40L相互作用物质的浓度；防止受试者或细胞中的OX40/OX40L相互作用；和/或降低OX40L的生物学功能，其可以包括以下一种或多种：抑制TNF-α的增殖和产生，促进CD4+T细胞产生IL-10，抑制炎性T细胞的激活和/或改变炎性T细胞向调节性T细胞的分化。
在另外的实施方案中，抗体包括修饰并且是“抗体衍生物”。术语“抗体衍生物”包括对抗体或片段的线性多肽序列的翻译后修饰。例如，第6,602,684B1号美国专利描述了用于生成抗体的修饰的二醇形式的方法以及如此产生的糖蛋白，所述抗体包括包含等同于免疫球蛋白的Fc区的区域的全抗体分子、抗体片段或融合蛋白，具有增强的Fe-介导的细胞毒性。
本发明的抗体还包括通过将任何类型的分子共价连接到抗体以使共价连接不阻止抗体产生抗独特型应答而修饰的衍生物。抗体衍生物包括但不限于已经通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化，通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白质水解切割、连接到细胞配体或其他蛋白等修饰的抗体。另外，该衍生物可以包含一个或多个非经典氨基酸。
还可以通过将编码本发明的抗体的多核苷酸递送至适合的宿主以提供在其乳汁中产生这样的抗体的转基因动物或哺乳动物，如山羊、牛、马、绵羊等来制备本发明的抗体衍生物。这些方法在本领域中是已知的，并且描述于例如第5,827,690号、第5,849,992号、第4,873,316号、第5,849,992号、第5,994,616号、第5,565,362号和第5,304,489号美国专利中。
还可以通过递送本发明的多核苷酸以提供在植物部分或在由其培养的细胞中产生这样的抗体、特定部分或变体的转基因植物和培养的植物细胞(例如但不限于烟草、玉米和浮萍)来制备抗体衍生物。已经由包含抗体片段，如单链抗体(scFv)的转基因植物种子，包括烟草种子和马铃薯块茎大量生产了抗体衍生物。参见例如，Conrad等人，1998及其中引用的参考文献。因此，还可以根据已知的方法使用转基因植物生产抗体。
还可以例如通过添加外源序列以改变免疫原性，或降低、提高或改变结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期，或任何其他适合的特征来产生抗体衍生物。通常保持部分或所有非人或人CDR序列，同时使用人或其他氨基酸替代可变区和恒定区的非人序列。
术语“可变区”是指赋予抗体其结合抗原的特异性的抗体的部分。可变区通常位于重链和轻链的末端。β-链的可变环，在轻链(VL)和重链(VH)上各有三个，负责结合于抗原。这些环被称为“互补决定区”(CDR)。
一般而言，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合。抗体的人源化或工程化可以使用任何已知的方法进行，例如但不限于第5,723,323号、第5,976,862号、第5,824,514号、第5,817,483号、第5,814,476号、第5,763,192号、第5,723,323号、第5,766,886号、第5,714,352号、第6,204,023号、第6,180,370号、第5,693,762号、第5,530,101号、第5,585,089号、第5,225,539号和第4,816,567号美国专利中描述的那些。
术语“恒定区”是指在所有相同同种型的抗体中相同的抗体的部分。恒定区在不同同种型的抗体中不同。
如本文所使用，术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”是指包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的人/非人嵌合抗体。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的可变区的残基被具有希望的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供者抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的可变区的残基替代。人源化抗体可以包含未在受者抗体或供者抗体中发现的残基。人源化抗体可以任选地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，在框架区、恒定区或CDR中包含一个或多个已被来自人抗体的相应定位的氨基酸置换的氨基酸的非人抗体的至少一部分。一般地，与相同抗体的非人源化形式相比，预期人源化抗体在人宿主中产生的免疫应答降低。人源化抗体可以具有保守的氨基酸替换，其对抗原结合或其他抗体功能基本上没有影响。保守的替换组包括：甘氨酸-丙氨酸、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、丝氨酸-苏氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
本发明的嵌合的、人源化的或灵长类化的抗体可以基于使用标准分子生物技术制备的参照单克隆抗体的序列制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目标杂交瘤获得，并且使用标准分子生物技术工程化以包含非参照(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠可变区连接到人恒定区(第4,816,567号美国专利)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区***人框架(第5,225,539号美国专利和第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号和第6,180,370号美国专利)。类似地，为了产生灵长类化的抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区***灵长类动物框架中(WO93/02108和WO99/55369)。
用于制备部分至完全的人抗体的技术是本领域已知的，并且可以使用任何这样的技术。根据一个实施方案，在已经工程化以表达人重链和轻链抗体基因的转基因小鼠中制备完全的人抗体序列。已经制备了多个这样的转基因小鼠品种，其可以产生不同种类的抗体。来自产生希望的抗体的转基因小鼠的B细胞可以融合以制备用于连续产生希望的抗体的杂交瘤细胞系。(参见例如，Russel等人，2000；Gallo等人，2000；Green，1999；Yang等人，1999A；Yang，1999B；Jakobovits，1998；Green和Jakobovits，1998；Jakobovits，1998；Tsuda等人，1997；Sherman-Gold，1997；Mendez等人，1997；Jakobovits，1996；Jakobovits，1995；Mendez等人，1995；Jakobovits，1994；Arbones等人，1994；Jakobovits，1993；Jakobovits等人，1993；第6,075,181号美国专利)。
本发明的抗体也可以被修饰以产生嵌合抗体。嵌合抗体是其中抗体的重链和轻链的各结构域由来自多于一种的物种的DNA编码的抗体。参见例如第4,816,567号美国专利。
供选择地，本发明的抗体还可以被修饰以产生镶嵌抗体。镶嵌抗体是其中一种物种的抗体的外部氨基酸残基被第二物种的抗体的外部氨基酸残基合理地替代或“镶嵌”，以使第一物种的抗体在第二物种中没有免疫原性，从而降低抗体的免疫原性的抗体。由于蛋白的抗原性主要取决于其表面性质，因此可以通过替代与在另一个哺乳动物物种抗体中通常发现的暴露的残基不同的暴露的残基来降低抗体的免疫原性。该外部残基的合理替代应对内部结构域或对结构域间接触有极小影响或没有影响。因此，由于改变限于可变区框架残基，因此配体结合特性应不受影响。该过程被称为“镶嵌”，由于仅有抗体的外表面或外皮改变，支持性残基保持不受干扰。
“镶嵌”过程利用可得的Kabat等人(1987)Sequences of Proteins ofImmunological interest,4th ed.,Bethesda,Md.,National Institutes of Health汇编的人抗体可变结构域的序列数据、此数据库的更新以及其他可访问的美国和外国数据库(核酸和蛋白)。用于产生镶嵌抗体的方法的非限定性实例包括EP519596；第6,797,492号美国专利；并描述于Padlan等人，1991。
术语“抗体衍生物”还包括“双价抗体”，其为具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中片段包含连接到相同的多肽链中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。(参见例如，EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等人，1993)。通过使用太短而不能使相同链上的两个结构域配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。(还参见Chen等人的第6,632,926号美国专利，其公开了抗体变体，所述抗体变体具有一个或多个***到亲本抗体的高可变区的氨基酸，并且其对靶抗原的结合亲和力比亲本抗体对抗原的结合亲和力强至少约两倍)。
术语“抗体衍生物”还包括工程化的抗体分子、片段和单一结构域，如scFv、dAb、纳米抗体、微抗体、单价体(Unibody)和亲和体(Affibody)(Holliger&Hudson，2005；美国公开专利US2006/0211088；PCT公开申请WO2007/059782；第5,831,012号美国专利)。
术语“抗体衍生物”还包括“线性抗体”。用于制备线性抗体的过程是本领域已知的，并且描述于Zapata等人，1995。简言之，这些抗体包含一对形成一对抗原结合区的串联Ed节段(V.sub.H-C.sub.H 1-VH-C.sub.H1)。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
可以通过已知方法从重组细胞培养物回收和纯化本发明的抗体，所述方法包括但不限于蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉降、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。高效液相色谱(“HPLC”)也可以用于纯化。
在某些实施方案中，本发明的抗体是重组抗体。重组抗体与内源产生的抗体不同。例如，重组抗体在其糖基化状态方面不同(参见例如，Jefferis,R.“Glycolsylation ofRecombinant Antibody Therapeutics”Biotechnol.Prog.2005,21:11-16，通过引用将其并入本文)。
在一些实施方案中，抗体是工程化抗体。例如，Fc区可以被工程化以增加与效应细胞的Fcγ受体的结合。这会涉及改变抗体糖基化模式或使Fc区中的氨基酸突变。糖工程化可以通过本领域已知的方法进行，如POTELLIGENT和Glycart。氨基酸工程化的方法也是已知的，并用于本领域(例如，Xencor的Xmab方法)。Fc区的氨基酸变化可以通过改善与效应细胞的结合来改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性，但是还可以实现延长的半衰期。另外的实例参见Evans和Syed,Nature Reviews,2014,13:413-414。
本发明的抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性的。双特异性和多特异性抗体是识别两个或多个抗原靶点的抗体。有一些在商业上使用的多特异性抗体平台，其包括“BiTE”(双特异性T细胞接合器(engager))平台和DART平台。
多特异性抗体、工程化抗体和各种其他平台描述于Evans和Syed，“Next-generation antibodies,”Nature Reviews,2014,13:413-414，通过引用将其整体并入本文。
如果被测试的抗体与蛋白或多肽结合，则被测试的抗体和由本发明提供的抗体是等价物。在一个实施方案中，等价物是结合OX40L并提供相同中和活性和/或细胞应答的等价物(即，抑制由TSLP-mDC引发的产生低IL-10/高TNF-α的炎性Th2的分化和/或抑制TNF-1的增殖和产生和通过CD4+T细胞促进IL-10)。
还能够在没有过度实验的情况下通过确定被测试的抗体是否阻止本发明的抗体结合该抗体通常与其反应的蛋白或多肽，来确定抗体是否与本发明的抗体具有相同的特异性。如果被测试的抗体与本发明的抗体竞争，如通过本发明的单克隆抗体的结合的减少所示，则两种抗体可能结合于相同的或密切相关的表位。供选择地，本发明的抗体可以与本发明的抗体通常反应的蛋白一起预孵育，并确定被测试的抗体的结合抗原的能力是否被抑制。如果被测试的抗体被抑制，则很可能的是，其与用于本发明的抗体具有相同的或密切相关的表位特异性。
除非另有说明，术语“抗体”还旨在包括所有免疫球蛋白同种型和亚类的抗体。同种型是指抗体的重链和轻链的恒定区中的遗传变异或差异。在人中，有五种重链同种型：IgA、IgD、IgG、IgE和IgM以及两种轻链同种型：κ和λ。IgG类分为四种同种型：人中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，和小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。它们在Fc区的氨基酸序列中共享超过95％的同源性，但是在铰链区的氨基酸组成和结构方面显示主要的差异。单克隆抗体的特定同种型可以通过从初始融合体选择来直接制备，或通过使用sib选择技术以使用Steplewski等人，1985；Spira等人，1984所述的方法分离类别转换变体而由分泌不同同种型的单克隆抗体的亲本杂交瘤二次制备。供选择地，可以使用重组DNA技术。
具有本文描述的单克隆抗体的特异性的其他单克隆抗体的分离还可以通过产生抗独特型抗体由本领域普通技术人员实现(Herlyn等人，1986)。抗独特型抗体是识别存在于目标单克隆抗体上的独特的决定簇的抗体。
在本发明的一些方面，可检测地或治疗性地标记抗体是有用的。用于使抗体与这些试剂缀合的方法是本领域已知的。仅出于举例说明的目的，抗体可以用可检测的部分如放射性原子、发色团、荧光团等标记。这样的标记的抗体可以用于体内或对分离的测试样品的诊断技术。
如本文所使用的，术语“标记”意指可直接或间接地检测的化合物或组合物，其直接或间接地缀合于被检测的组合物，例如多核苷酸或蛋白，如抗体，从而产生“标记的”组合物。术语还包括当***的序列表达时，例如绿色荧光蛋白(GFP)等，将提供信号的缀合于多核苷酸的序列。所述标记可以是自身可检测的(如放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。所述标记可以适合小规模检测或更适合高通量筛选。因此，适合的标记包括但不限于放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和蛋白质，包括酶。可以简单检测所述标记或者可以定量所述标记。简单检测的响应通常包括仅确认其存在的响应，而定量的响应通常包括具有可定量(如数值上可报告的)的值，例如强度、极化和/或其他性能的响应。在发光或荧光分析中，可检测的响应可以使用与在结合中实际涉及的分析组分相关的发光团或荧光团直接产生，或使用与另一(如报告分子或指示剂)组分相关的发光团或荧光团间接产生。
产生信号的发光标记的实例包括但不限于生物发光和化学发光。可检测的发光响应一般包括发光信号的改变或出现。用于发光标记分析组分的适合的方法和发光团是本领域已知的，并且描述于例如Haugland,Richard P.(1996)Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals(6.sup.th ed.)。发光探针的实例包括但不限于发光蛋白和荧光素酶。
适合的荧光标记的实例包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、茋、荧光黄、瀑布蓝(Cascade Blue.TM.)和德克萨斯红(Texas Red)。其他合适的光学染料描述于Haugland,Richard P.(1996)Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals(6.sup.th ed.)。
在另一个方面，荧光标记被官能化以有利于共价连接到存在于细胞或组织中或细胞或组织表面上的细胞组分，例如细胞表面标志物。适合的官能团包括但不限于异硫氰酸酯基基团、氨基基团、卤代乙酰基基团、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺酯和磺酰卤化物，所有这些可以用于将荧光标记连接到第二分子。荧光标记的官能团的选择将取决于连接到接头、试剂、标志物或第二标记试剂的位点。
荧光标记可以直接连接到细胞组分或化合物，或供选择地可以通过接头连接到细胞组分或化合物。用于将荧光标记间接地连接到中间体的适合的结合对包括但不限于抗原/抗体，如罗丹明/抗-罗丹明、生物素/亲和素和生物素/链霉亲和素。
将抗体偶联到低分子量半抗原能够在分析中增加抗体的敏感性。然后可以借助第二反应特异性检测所述半抗原。例如，通常使用半抗原，如与亲和素反应的生物素，或可以与特异性抗半抗原抗体反应的二硝基酚、吡哆醛和荧光素。参见上述Harlow和Lane(1988)。
可以通过使VH和/或VL CDR 1、CDR 2和/或CDR 3区域内的氨基酸残基突变来修饰本发明的抗体的可变区，以改进抗体的一种或多种结合性能(例如亲和力)。突变可以通过定点诱变或PCR介导的诱变引入，并且对抗体结合或其他目标功能特性的影响可以在合适的体外或体内分析中评价。优选引入保守修饰，并且通常在CDR区域内改变不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。突变可以是氨基酸替换、添加或删除。
可以例如，通过将一个或多个框架残基“回复突变”至相应的种系序列对抗体进行框架修饰，以降低免疫原性。
此外，可以将本发明的抗体工程化，以在Fc区域内包含修饰，从而改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。这样的修饰包括但不限于促进轻链和重链的组装或增加或降低抗体的稳定性的铰链区中半胱氨酸残基的数目的改变(第5,677,425号美国专利)，和降低抗体的生物半衰期的Fc铰链区中的氨基酸突变(第6,165,745号美国专利)。
此外，可以化学修饰本发明的抗体。可以例如通过修饰抗体序列内的一个或多个糖基化位点改变抗体的糖基化，以增加抗体对抗原的亲和力(第5,714,350号和第6,350,861号美国专利)。供选择地，为了增加抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性，可以通过在具有改变的糖基化机制的宿主细胞亚群(host cell.sub.)中表达抗体，获得具有数量减少的岩藻糖残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的平分型GlcNac结构的抗体(Shields等人，2002；Umana等人，1999)。
在其中一个或多个PEG基团连接到抗体或抗体片段的条件下，可以通过使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)或PEG的活性酯或醛衍生物反应来使本发明的抗体聚乙二醇化以增加生物半衰期。抗体聚乙二醇化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在包括已经用于衍生其它蛋白的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。待聚乙二醇化的抗体可以是非糖基化的抗体。使蛋白聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可以应用于本发明的抗体(EP0154316和EP0401384)。
另外，可以通过将抗体的抗原结合区缀合或融合于血清蛋白例如人血清白蛋白对抗体进行化学修饰，从而增加得到的分子的半衰期。这种方法例如描述于EP0322094和EP0486525中。
本发明的抗体或其片段可以缀合于诊断试剂并在诊断上使用，例如，监测疾病的发展或进展，并确定给定的治疗方案的疗效。诊断试剂的实例包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料，使用各种正电子发射断层摄影的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。可检测的物质可以使用本领域已知的技术，直接地偶联或缀合于抗体或其片段，或通过接头间接地偶联或缀合于抗体或其片段。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。适合的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素。适合的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。发光材料的实例包括鲁米诺。生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和发光蛋白。适合的放射性材料的实例包括.sup.125I、.sup.131I、铟-111、镥-171、铋-212、铋-213、砹-211、铜-62、铜-64、铜-67、钇-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、钪-47、银-111、镓-67、镨-142、钐-153、铽-161、镝-166、钬-166、铼-186、钌-188、铼-189、铅-212、镭-223、锕-225、铁-59、硒-75、砷-77、锶-89、钼-99、铑-1105、钯-109，镨-143、钷-149、铒-169、铱-194、金-198、金-199和铅-211。单克隆抗体可以通过使用与抗体共价连接的双功能螯合剂与放射性金属离子间接地缀合。螯合剂可以通过胺(amities)(Meares等人，1984)；氨基酸残基的巯基(Koyama 1994)和碳水化合物基团(Rodwell等人，1986；Quadri等人，1993)连接。
另外适合的缀合分子包括核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I，反义核酸、抑制性RNA分子如siRNA分子、免疫刺激性核酸、适体、核糖酶、三链体形成分子(triplex formingmolecule)和外部引导序列。适体是长度为15-50个碱基的小核酸，其折叠为限定的二级和三级结构，例如茎-环或G-四联体(quartet)，并且可以结合小分子，例如ATP(第5,631,146号美国专利)和茶碱(theophilline)(第5,580,737号美国专利)，以及大分子，例如逆转录酶(第5,786,462号美国专利)和凝血酶(第5,543,293号美国专利)。核酶是能够催化分子内或分子间化学反应的核酸分子。核酶通常通过识别并结合靶底物以及随后的切割来切割核酸底物。形成三链体的功能核酸分子可以通过形成三链体与双链或单链核酸相互作用，其中DNA的三条链形成依赖于沃森-克里克(Watson-Crick)和胡斯坦(Hoogsteen)碱基配对的复合物。三链体分子可以以高亲和力和特异性结合靶区域。
功能性核酸分子可以充当靶分子所具有的特异性活性的效应分子、抑制剂、调节剂和刺激剂，或者功能性核酸分子可以具有独立于任何其它分子的全新(de novo)活性。
可以使用大量可用方法中的任一种将缀合剂直接或间接地连接到抗体。例如，可以通过使用交联剂例如3-(2-吡啶基二巯基)丙酸-N-琥珀酰酯(SPDP)形成二硫键，或通过在抗体的Fc区域的碳水化合物部分将试剂连接到还原的抗体组分的铰链区(Yu等人，1994；Upeslacis等人，1995；Price，1995)。
用于将抗原缀合于抗体的技术是本领域熟知的(Amon等人，1985；Hellstrom等人，1987；Thorpe，1985；Baldwin等人，1985；Thorpe等人，1982)。
本发明的抗体或其抗原结合区域可以连接到另一个功能性分子，例如另一个抗体或受体的配体，以产生结合到至少两个或更多个不同的结合位点或靶分子的双特异性或多特异性分子。可以通过例如化学偶联、基因融合或非共价缔合进行抗体与一种或多种其他结合分子，例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物的连接。除了第一和第二靶表位外，多特异性分子还可以包括第三结合特异性。
双特异性和多特异性分子可以使用本领域已知的方法制备。例如，可以分别产生双特异性分子的每个结合单元，然后将其彼此缀合。当结合分子是蛋白质或肽时，可将多种偶联剂或交联剂用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(Karpovsky等人，1984；Liu等人，1985)。当结合分子是抗体时，可以通过两条重链的C-末端铰链区的巯基键合将它们缀合。
可以将本发明的抗体或其片段连接到对抗体所结合的细胞有毒性的部分，以形成“消耗”抗体。这些抗体在其中期望消耗NK细胞的应用中特别有用。
本发明的抗体还可以连接到固体支持物，其对于靶抗原的免疫分析或纯化特别有用。这样的固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
抗体还可以结合于许多不同的载体。因此，本发明还提供了含有抗体和另一种活性或惰性物质的组合物。众所周知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性的纤维素、聚丙烯酰胺，琼脂糖和磁石。出于本发明的目的，载体的性质可以是可溶的或不可溶的。本领域技术人员将知道用于结合单克隆抗体的其他适合的载体，或者将能够使用常规实验来确定。
B.其他OX40L抑制剂
OX40L抑制剂包括降低OX40L基因和/或蛋白的生物活性的多核苷酸，并且可以是例如，针对OX40L DNA或mRNA的miRNA、siRNA、shRNA、dsRNA或反义RNA，或编码该miRNA、siRNA、shRNA、dsRNA或反义RNA的多核苷酸，或包含该多核苷酸的载体。
“短干扰RNA”(siRNA)是指长度通常为约10至约30个核苷酸的双链RNA分子(dsRNA)，其能够介导RNA干扰(RNAi)。“RNA干扰”(RNAi)是指由短干扰RNA(siRNA)介导的基因表达(蛋白质合成)的序列特异性或基因特异性抑制。如本文所使用的，术语siRNA包括短发夹RNA(shRNA)。针对基因或基因的mRNA的siRNA可以是这样的siRNA，其识别基因的mRNA，并将RNA诱导的沉默复合物(RISC)引导到mRNA，导致mRNA的降解。针对基因或基因的mRNA的siRNA还可以是这样的siRNA，其识别mRNA并抑制该mRNA的翻译。siRNA可以经化学修饰以增加其稳定性和安全性。参见例如Dykxhoorn&Lieberman，2006和第2008/0249055号美国公开专利申请。
“双链RNA”(dsRNA)是指可以具有任何长度并且可以在细胞内剪切成更小的RNA分子，如siRNA的双链RNA分子。在具有强的干扰素反应的细胞中，更长的dsRNA，如长度长于约30个碱基对的那些，可以触发干扰素反应。在不具有强的干扰素反应的其他细胞中，dsRNA可以用于触发特异性RNAi。
“微RNA”(miRNA)是指长度为21-23个核苷酸的单链RNA分子，其调节基因表达。miRNA由以下基因编码，miRNA由所述基因的DNA转录，但miRNA不翻译成蛋白(非编码RNA)；而是将每种初级转录物(pri-miRNA)加工成称为前-miRNA的短茎-环结构，最后加工成功能性miRNA。成熟的miRNA分子与一个或多个信使RNA(mRNA)分子部分互补，并且其主要功能是下调基因表达。
可以按照本领域已知的程序设计抑制基因表达的siRNA、dsRNA和miRNA。参见例如，Dykxhoorn&Lieberman，2006；Dykxhoorn等人，2006；Aagaard&Rossi，2007；deFougerolles等人，2007；Krueger等人，2007；第2008/0188430号美国公开专利申请；和第2008/0249055号美国公开专利申请。
siRNA、dsRNA或miRNA向细胞的递送可以使用本领域已知的方法进行。参见例如Dykxhoorn&Lieberman，2006；Dykxhoorn等人，2006；Aagaard&Rossi，2007；de Fougerolles等人，2007；Krueger等人，2007；第2008/0188430号美国公开专利申请；和第2008/0249055号美国公开专利申请。“反义”寡核苷酸具有与蛋白编码序列或“有义”序列互补的核苷酸序列。反义RNA序列通过杂交于互补mRNA序列并且阻止翻译而作为基因表达的调节子起作用(Mizuno等人，1984；Heywood等人，1986)。包含靶转录物的整条序列或其任何部分的反义多核苷酸可以使用本领域已知的方法合成。参见例如Ferretti等人，1986。反义多核苷酸可以置于载体构建体中并有效地引入细胞以抑制基因表达(Izant等人，1984)。通常，为了确保特异性杂交，反义序列与靶序列基本上互补。在某些实施方案中，反义序列与靶序列完全互补。然而，反义多核苷酸还可以包括核苷酸置换、添加、缺失、转变(transition)、转座(transposition)或修饰，或其他核酸序列或非核酸部分，只要保留与对应于基因的相关靶序列的特异性结合作为多核苷酸的功能性质。
可以使用任何适合的产生核酸的方法制备反义核酸(DNA、RNA、修饰的、类似物等)，如本文公开的和本领域技术人员已知的化学合成和重组方法。在一个实施方案中，例如，本发明的反义RNA分子可以通过从头化学合成或通过克隆来制备。例如，可以通过***(连接)可操作地连接到载体(例如，质粒)中的启动子的在相反方向上的基因序列来制备反义RNA。只要启动子和优选为终止和聚腺苷酸化信号被正确定位，则对应于非编码链的***序列的链将被转录并充当本发明的反义寡核苷酸。
应当理解，寡核苷酸可以使用非标准碱基(例如，除了腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷)或非标准骨架结构来制备，以提供期望的性质(例如增加的核酸酶抗性、更紧密的结合、稳定性或期望的T.sub.m)。赋予寡核苷酸核酸酶抗性的技术包括描述于PCT公开申请WO94/12633中的那些。可以制备多种有用的修饰的寡核苷酸，包括具有肽-核酸(PNA)骨架(Nielsen等人，1991)的寡核苷酸或掺入2'-O-甲基核糖核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸、膦酸甲酯核苷酸、磷酸三酯核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸、氨基磷酸酯(phosphoramidate)。修饰的另一个实例是使用增加对核酸酶消化的抗性的硫原子代替非桥接磷酰基氧原子。提高反义多核苷酸稳定性还可以使用具有2-甲氧基乙基取代的骨架的分子实现。参见例如第6,451,991号和第6,900,187号美国专利。
在另一个实施方案中，可以使用核酶(参见例如，Cech，1995；和Edgington，1992；Hu等人，PCT公开申请WO94/03596)。核糖核酸酶(“核酶”、“RNA酶”或“催化RNA”)是催化化学反应的RNA分子。许多天然核酶催化它们自己的磷酸二酯键之一的水解或其他RNA中的键的水解，但是也已经发现它们催化核糖体的氨基转移酶活性。制备和使用核酶的方法可以见于例如第2006/0178326号美国公开专利申请。
“三链体(triplex)核酶”构型实现了相对于常规表达的核酶增加的靶剪切。三链体核酶的实例包括发夹核酶和锤头核酶。制备和使用三链体核酶的方法见于例如Aguino-Jarguin等人，2008和第2005/0260163号美国公开专利申请。
已经描述了具有使期望的核酸跨细胞膜易位的能力的蛋白质。通常，这样的蛋白质具有两亲性或疏水性子序列，所述子序列具有充当膜易位载体的能力。例如，同源结构域蛋白具有跨细胞膜易位的能力。发现同源结构域蛋白的最短可内化肽Antennapedia是蛋白的第43到58位氨基酸的第三个螺旋(参见例如，Prochiantz，1996)。发现另一条子序列，信号肽的h(疏水性)结构域具有相似的细胞膜易位特性(参见例如Lin等人，1995)。这样的子序列可以用于使寡核苷酸跨细胞膜易位。寡核苷酸可以便利地使用这样的序列衍生化。例如，接头可以用于连接寡核苷酸和易位序列。可以使用任何适合的接头，例如肽接头或任何其他适合的化学接头。
本发明特征在于用于降低细胞中OX40L的生物活性的方法和组合物。可以使用表达载体、病毒载体和本领域已知的用于将遗传物质转移至患者的细胞并对患者产生治疗益处的其它技术在细胞中表达本文所述的OX40L抑制剂。在一些实施方案中，可以将本文所述的多肽或编码所述多肽的多核苷酸(例如抗体和抗体片段)递送至人或宿主细胞。
在一些实施方案中，将编码目标OX40L抑制剂多核苷酸的表达载体直接给予患者。载体被靶细胞(例如神经元或多能干细胞)摄取，并且表达多核苷酸。讨论用于基因治疗的方法和组合物的最近综述包括Eck等人，Goodman&Gilman's The Pharmacological Basisof Therapeutics，1996；Wilson，1997；Wivel等人，1998；Romano等人，2000。第6,080,728号美国专利也提供了对多种基因递送方法和组合物的讨论。
腺病毒能够转染多种细胞类型，包括非***细胞。已知在本领域中有超过50种腺病毒的血清型，但是最常用的用于基因治疗的血清型是2型和5型。通常，这些病毒是复制缺陷的；并且经基因修饰以防止病毒的意外扩散。这通常通过El区的缺失、E1区的缺失以及任一E2或E4区的缺失、或除了顺式作用的反向末端重复序列和包装信号以外的整条腺病毒基因组的缺失来实现(Gardlik等人，2005)。
逆转录病毒也可以用作载体，并且通常(除慢病毒外)不能转染非***细胞。因此，可以使用本领域已知的任何适当类型的逆转录病毒，包括但不限于HIV、SIV、FIV、EIAV和莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)。通常，治疗上有用的逆转录病毒包括gag、pol或env基因的缺失。
在另一方面，本发明的特征在于使用在患者中表达OX40L抑制性多核苷酸的慢病毒载体抑制OX40L的方法。慢病毒是一类具有感染增殖和静止细胞的能力的逆转录病毒。用于基因治疗的示例性慢病毒载体是HIV-1慢病毒。先前构建的慢病毒的基因修饰包括除那些gag、pol和rev基因以外的所有蛋白质编码基因的缺失(Moreau-Gaudry等人，2001)。
用于递送核酸的示例性非病毒载体包括裸DNA；与单独的或与阳离子聚合物组合的、与阳离子脂质复合的DNA；阴离子和阳离子脂质体；包含与阳离子聚合物缩合的DNA的DNA-蛋白复合物和颗粒，所述阳离子聚合物如异质聚赖氨酸、确定长度的寡肽和聚乙烯亚胺，在一些情况下包含在脂质体中；和使用包含病毒和聚赖氨酸-DNA的三元复合物。已经广泛研究了体内DNA介导的进入多种不同的靶位点的基因转移。裸DNA可以使用注射、基因枪或电穿孔给予。裸DNA可以在肌肉中提供长期表达。参见Wolff等人，1992；Wolff等人，1990。DNA介导的基因转移也已在肝、心、肺、脑和内皮细胞中表征。参见Zhu等人，1993；Nabel等人，1989。用于基因转移的DNA也可以与各种阳离子脂质、聚阳离子和其它缀合物质结合使用。参见Przybylska等人，2004；Svahn等人，2004。
使用阳离子脂质体递送核酸的方法在本领域也是熟知的。用于本发明的示例性的阳离子脂质体为DOTMA、DOPE、DOSPA、DOTAP、DC-Chol、脂质GL-67.TM.和EDMPC。这些脂质体可以体内或离体使用，以包封用于递送到靶细胞中的载体(例如，神经元或多能干细胞)。
通常，根据本发明的原理制备的载体将包含将导致编码序列组成性表达的调节元件。希望地，使用神经元特异性调节元件如神经元特异性启动子以便在载体被引入靶区域外的细胞中的情况下限制或消除异位基因表达。几种引导神经元特异性基因表达的调节元件在本领域中是熟知的，包括例如，神经元特异性烯醇酶(NSE)和突触蛋白-1启动子(Morelli等人，1999)。
还提供了编码与本发明的多肽和多肽复合物基本上同源和生物学上等价的多肽的多核苷酸。基本上同源和生物学上等价是指具有不同程度的同源性的那些，如至少80％或供选择地至少85％或供选择地至少90％或供选择地至少95％或供选择地至少98％如以上所定义的同源的，以及编码具有如本文所述的生物活性的多肽的那些。应理解，尽管不总是明确地说明，但基本上同源的多肽和多核苷酸的实施方案旨在用于本发明的每个方面，例如多肽、多核苷酸和抗体。
本发明的多核苷酸可以使用常规重组技术复制。供选择地，可以使用PCR技术复制多核苷酸。PCR是第4,683,195号、第4,800,159号、第4,754,065号和第4,683,202号美国专利的主题，并描述于PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人编，BirkhauserPress，Boston(1994))和其中引用的参考文献中。而且此外，本领域技术人员可以使用本文提供的序列和商业DNA合成仪来复制DNA。因此，本发明还提供了用于通过以下获得本发明的多核苷酸的方法：提供多核苷酸的线性序列、适当的引物分子、诸如酶的化学物质以及用于它们的复制和以正确取向化学复制或连接核苷酸以获得多核苷酸的说明书。在一个单独的实施方案中，进一步分离这些多核苷酸。而且此外，本领域技术人员可以将多核苷酸可操作地连接到调节序列，用于它们在宿主细胞中表达，如下所述。将多核苷酸和调节序列***宿主细胞(原核的或真核的)中用于复制和扩增。如此扩增的DNA可以通过本领域技术人员熟知的方法从细胞分离。本文进一步提供了通过该方法获得多核苷酸的方法以及如此获得的多核苷酸。
还提供了包含本发明的多肽或多核苷酸中的一种或多种的宿主细胞。本发明的又一个方面提供了表达本发明的分离的多肽、抗体或抗体的生物活性片段的分离的转化的宿主细胞。分离的宿主细胞可以是原核或真核细胞。在一个方面，多肽被表达并且可以从宿主细胞分离。在另一个方面，多肽被表达和分泌。在又一个方面，多肽被表达并出现在细胞表面上(细胞外)。包含本发明多肽的适合的细胞包括原核细胞和真核细胞，其包括但不限于细菌细胞、藻类细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、鼠细胞、大鼠细胞、绵羊细胞、猿猴细胞和人细胞。藻类细胞的非限制性实例是红藻凋毛藻属(Griffithsia sp)，从其分离出Griffithsin(Toshiyuki等人，2005)。植物细胞的非限制性实例是本氏烟叶细胞，由其可以大规模产生Griffithsin(O'Keefe，2009)。细菌细胞的实例包括大肠杆菌(Escherichia coli)(Giomarelli等人(2006)，同上)、肠道沙门氏菌(Salmonella enteric)、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)和乳杆菌(lactobacillus)(Liu等人，2007；Rao等人，2005；Chang等人，2003；Liu等人，2006)。细胞可以从商业供应商例如美国模式培养物保藏所(ATCC，Rockville Md.，USA)购买，或使用本领域已知的方法由分离物培养。适合的真核细胞的实例包括但不限于293T HEK细胞，以及仓鼠细胞系CHO、BHK-21；命名为NIH3T3、NS0、C127的鼠细胞系，猿猴细胞系COS、Vero；和人细胞系HeLa、PER.C6(可商购自Crucell)U-937和Hep G2。昆虫细胞的非限定性实例包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)。用于表达的酵母的实例包括但不限于酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、念珠菌属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、耶氏酵母属(Yarrowia)或毕赤酵母属(Pichia)。参见例如，第4,812,405号、第4,818,700号、第4,929,555号、第5,736,383号、第5,955,349号、第5,888,768号和第6,258,559号美国专利。
OX40L抑制剂也可以是分子抑制剂。用于筛选调节蛋白活性的各种试剂的方法是本领域已知的并且在本文中描述。出于本发明的目的，“分子抑制剂”旨在包括但不限于生物或化学化合物，例如简单或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质(例如抗体)、多核苷酸(例如反义)或核酶。可以合成大量化合物，例如聚合物，如多肽和多核苷酸，以及基于各种核心结构的合成有机化合物，并且这些也包括在术语“分子抑制剂”中。此外，各种天然来源可以提供用于筛选的化合物，例如植物或动物提取物等。尽管不总是明确地说明，但应当理解，分子抑制剂单独使用或与另一种药剂组合使用，所述另一种药剂具有与本发明筛选确定的药剂相同或不同的生物活性。
在一些实施方案中，OX40L抑制剂是能够与OX40L蛋白相互作用的小分子。出于本发明的目的，“小分子”是具有低分子量(MW)的分子，在一个实施方案中，其能够结合目标蛋白质，从而改变该蛋白质的功能。优选地，小分子的MW不超过1,000。用于筛选能够改变蛋白质功能的小分子的方法是本领域已知的。例如，You等人，1997讨论了用于检测细胞中小分子-蛋白质相互作用的小型化阵列分析。
为了在体外筛选小分子抑制剂，首先提供用待处理的微生物感染的适合的细胞培养物或组织。将细胞在一定条件(温度、生长或培养基和气体(CO2))下培养适当的时间以达到指数增殖，而没有密度依赖性限制。还希望保持未感染的另外的分开的细胞培养物作为对照。
对本领域技术人员显而易见的是，可以在微滴定板中培养合适的细胞，并且可以通过留意基因型改变、表型改变或微生物滴度的降低同时分析几种小分子抑制剂。小分子抑制剂可以直接加到细胞培养物或加到培养基中用于添加。对于本领域技术人员显而易见的是，必须添加可以凭经验确定的“有效”量。
II.药物组合物
本发明包括用于抑制有其需要的受试者的OX40L的方法和组合物。组合物的给予通常将通过任何常见的途径。其包括但不限于肠胃外、原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、鼻内或静脉内注射。在某些实施方案中，疫苗组合物可以被吸入(例如，第6,651,655号美国专利，其通过引用特意地并入)。适合用于其他给药方式的另外的制剂包括口服制剂。口服制剂包括通常使用的赋形剂，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物呈现溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或散剂的形式，并含有约10％至约95％的活性成分，优选含有约25％至约70％的活性成分。
通常，本发明的组合物以与剂型制剂相容的方式，并且以治疗有效和免疫改变的量给予。待给予的量取决于待治疗的受试者。需要给予的活性成分的精确的量取决于从业人员的判断。
应用方式可以差别很大。给予抗体的任何常规方法都是适用的。认为这些包括在固态生理上可接受的基质上或在生理上可接受的分散体中的口服应用，经胃肠道外，通过注射等。药物组合物的剂量将取决于给予途径并根据受试者的尺寸和健康状况变化。
在许多情况下，期望有至多约或至少约3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次的多次给药。给药可以间隔2天至12周，更通常间隔1至2周。给药过程之后可以进行同种异体反应性免疫应答和T细胞活性的分析。
短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当给予动物或人时不产生不利的、过敏性或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所使用的，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。用于药物活性物质的这样的介质和试剂的用途在本领域中是熟知的。除了任何常规介质或试剂与活性成分不相容的情况以外，考虑其在免疫原性和治疗组合物中的用途。
本发明的药物组合物可以配制成用于肠胃外给予，例如配制成用于经静脉内、肌内、皮下或甚至腹膜内途径注射。根据本发明，包含OX40L抗体或抑制剂的含水组合物的制备将是本领域技术人员已知的。通常，这样的组合物可以制备为作为液体溶液或混悬剂的注射剂；也可以制备为适用于在注射之前添加液体时制备溶液或混悬剂的固体形式；并且，所述制剂也可以被乳化。
适用于可注射应用的药物形式包括无菌水溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或含水丙二醇的制剂；和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须是流动的，到其可以容易地注射的程度。其在制造和储存条件下其还应当是稳定的，并且必须针对微生物如细菌和真菌的污染作用进行防腐。
组合物可以配制成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐，包括(由蛋白的游离氨基形成的)酸加成盐和与以下形成的酸加成盐：无机酸，例如盐酸或磷酸；或有机酸，如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。由游离羧基形成的盐也可以源自：无机碱，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；和有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
载体还可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质包含例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和植物油。对微生物的作用的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现，例如，尼泊金、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选包括等张剂，例如，糖或氯化钠。可注射的组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延长吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌注射液的制备如下：根据需要在具有以上列举的各种其他成分的适合的溶剂中以所需量加入活性成分，接着是过滤灭菌。一般地，分散体的制备如下：将各种灭菌的活性成分加入无菌溶媒中，所述无菌溶媒含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末，加上来自其之前的无菌过滤溶液的任何另外希望的成分。
基于预期目标确定治疗或预防组合物的有效量。术语“单位剂量”或“剂量”是指适合在受试者中使用的物理上离散的单位，每个单位包含预定量的组合物，所述预定量的组合物经计算以产生与其给予，即适合的途径和方案相关的以上讨论的期望的应答。根据治疗次数和单位剂量两者，待给予的量取决于期望的结果和/或保护。组合物的精确量还取决于从业人员的判断，并且对于每个个体是独特的。影响剂量的因素包括受试者的身体和临床状态，给予途径，预期的治疗目标(症状减轻还是治愈)以及特定组合物的效价、稳定性和毒性。在配制时，溶液将以与剂量制剂相容的方式且以治疗或预防有效的量给予。制剂容易地以多种剂型，如上述的可注射的溶液的类型容易地给予。
III.疾病的治疗
本发明的方法包括治疗或预防炎症和自身免疫。可以通过给予OX40L抑制剂治疗炎症，所述OX40L抑制剂抑制炎性T细胞的分化，通过诱导IL-10和抑制TNF-α来促进调节性T细胞的产生和功能，并减少异常Th2细胞应答。炎症可以是自身免疫疾病的组分或由非自身免疫相关的功能障碍(例如癌症、受伤等)引起的炎症。在另外的情况下，炎症可以是特发性的或原因未知的。
本发明的方法还包括通过给予消除或减少可能促成自身免疫疾病的致病性的异常T滤泡性辅助细胞-(Tfh)应答的OX40L抑制剂来治疗或预防自身免疫。本发明的组合物已显示具有用于治疗GVHD和移植排斥的体内效用。
本发明的实施方案可以用于治疗或改善多种免疫介导的炎性或自身免疫疾病，例如，糖尿病、移植排斥等。这样的疾病或障碍的实例包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎，如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风或痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、II型胶原蛋白诱导的关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、斯蒂尔病、脊椎关节炎和幼年发病型风湿性关节炎(juvenile-onset rheumatoid arthritis)、骨关节炎、慢性渐进性关节炎(arthritischronica progrediente)、变形性关节炎、原发性慢性多发性关节炎(polyarthritischronica primaria)、反应性关节炎和强直性脊椎炎)，炎症性高增殖皮肤病，银屑病，如斑块型银屑病、滴状银屑病(gutatte psoriasis)、脓疱型银屑病和指甲银屑病，特应症(atopy)，包括特应性疾病，例如枯草热和乔布氏综合征，皮炎，包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、过敏性皮炎、过敏接触性皮炎、疱疹样皮炎、钱币状皮炎、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发刺激性接触性皮炎和特应性皮炎，X连锁高IgM综合征，过敏性眼内炎性疾病，荨麻疹，如慢性过敏性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹，肌炎，多肌炎/皮肌炎，幼年型皮肌炎，中毒性表皮坏死松解，硬皮病(包括全身性硬皮病)，硬化症，例如***性硬化症、多发性硬化症(MS)，例如脊髓-眼多发性硬化症(spino-opticalMS)、原发进展型MS(PPMS)和复发缓解型MS(RRMS)、进行性***性硬化症、动脉粥样硬化症、动脉硬化症、播散性硬化症、共济失调性硬化症，视神经脊髓炎(NMO)，炎性肠病(IBD)(例如克罗恩病，自身免疫介导的胃肠疾病，结肠炎，如溃疡性结肠炎、结肠炎溃疡(colitisulcerosa)、显微镜性结肠炎、胶原性结肠炎、结肠炎息肉、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎，以及自身免疫性炎症性肠病)，肠炎症(bowel inflammation)，坏疽性脓皮病，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，呼吸窘迫综合征，包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，全部或部分葡萄膜炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫性血液病，类风湿性脊椎炎，类风湿性滑膜炎，遗传性血管性水肿，脑膜炎中的颅神经损伤，妊娠疱疹，妊娠性类天疱疮，阴囊瘙痒，自身免疫性卵巢早衰，由于自身免疫病症导致的突发性听觉丧失，IgE介导的疾病，例如过敏性反应(anaphylaxis)以及过敏性及特应性鼻炎，脑炎，如拉斯马森脑炎(Rasmussen's encephalitis)和边缘和/或脑干脑炎，葡萄膜炎，如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和不具有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)，如慢性或急性肾小球肾炎，如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病，膜性或膜性增生性GN(MPGN)，包括I型和II型的膜性或膜性增生性GN(MPGN)，以及快速进行性GN，增生性肾炎，自身免疫性多腺内分泌衰竭，***炎，包括浆细胞性局限性***炎、******炎，离心性环形红斑，持久性色素异常性红斑，多形性红斑，环形肉芽肿，光泽苔藓，硬化性萎缩性苔癣，慢性单纯性苔藓，小棘苔藓，扁平苔藓，板层状鱼鳞病，表皮松解性角化过度症，癌前角化症，坏疽性脓皮病，过敏性病症和应答，过敏反应，湿疹，包括过敏性或特应性湿疹、皮脂缺乏性湿渗、出汗不良性湿疹和囊泡型掌跖湿疹，哮喘，如哮喘性支气管炎、支气管哮喘和自身免疫性哮喘，涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的病症，针对外源抗原如怀孕期间的胎儿A-B-O血型的免疫反应，慢性肺炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，狼疮，包括狼疮性肾炎、狼疮性脑炎、小儿狼疮、非肾源性狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、脱发性狼疮、***性红斑(SLE)，例如皮肤SLE或亚急性皮肤SLE、新生儿狼疮综合征(NLE)和散播型红斑狼疮，幼年发病型(I型)糖尿病，包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)以及成年发病型糖尿病(II型糖尿病)和自身免疫性糖尿病。还考虑了与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫应答，结节病，肉芽肿，包括淋巴瘤样肉芽肿、韦格纳肉芽肿(Wegener's granulomatosis)，粒细胞缺乏症，血管炎病，包括血管炎、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(Takayashu's)动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎/结节性外周动脉炎)、微小多动脉炎、免疫性血管炎、CNS血管炎、皮肤血管炎、超敏血管炎、坏死性血管炎，例如全身坏死性血管炎和ANCA相关性血管炎，如变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss vasculitis)和变应性肉芽肿性综合征(Churg-Strauss syndrome，CSS)和ANCA相关性小血管血管炎，颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，Coombs阳性贫血，Diamond Blackfan贫血，溶血性贫血或免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，艾迪生氏病，自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少症，与白细胞渗出有关的疾病，CNS炎性障碍，阿尔茨海默病，帕金森病，多器官损伤综合征，例如继发于败血症、创伤或出血的那些，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，过敏性神经炎，***/综合征(Behcet's disease/syndrome)，Castleman综合征，古德帕斯彻综合征(Goodpasture'ssyndrome)，雷诺氏综合征(Reynaud's syndrome)，干燥综合征(Sjogren's syndrome)，史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)，类天疱疮，如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮，天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮(pemphigusmucus-membrane pemphigoid)和红斑型天疱疮)，自身免疫性多内分泌疾病，莱特尔病或综合征(Reiter's disease or syndrome)，热损伤，子痫前期，免疫复合物疾病，例如免疫复合物性肾炎，抗体介导性肾炎，多发性神经病，慢性神经病，例如IgM多发性神经病或IgM介导的神经病，自身免疫性或免疫介导的血小板减少，例如特发性血小板减少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP，巩膜炎，例如特发性角膜-巩膜炎，巩膜外层炎，睾丸和卵巢的自身免疫病，包括自身免疫性***和***，原发性甲状腺功能减退，甲状旁腺功能减退，自身免疫性内分泌病，包括甲状腺炎，如自身免疫性甲状腺炎、桥本病(Hashimoto's disease)、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)或者亚急性甲状腺炎，自身免疫性甲状腺病，特发性甲状腺机能减退，格雷夫斯病(Grave's disease)，多腺体综合征，例如自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)，副肿瘤综合征，包括神经副肿瘤综合征，例如Lambert-Eaton肌无力综合征或Eaton-Lambert综合征，僵人综合征(stiff-man syndrome)或僵人综合征(stiff-person syndrome)，脑脊髓炎，例如过敏性脑脊髓炎或脑脊髓炎过敏症和实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)，实验性自身免疫性脑脊髓炎，重症肌无力，例如胸腺瘤相关的重症肌无力，小脑变性，神经性肌强直，眼阵挛或眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)和感觉神经病，多病灶运动神经病，席汉综合征(Sheehan's syndrome)，自身免疫性肝炎，慢性肝炎，类狼疮性肝炎，巨细胞肝炎，慢性活跃性肝炎或自身免疫性慢性活跃性肝炎，淋巴细胞性间质性肺炎(LIP)，闭塞性细支气管炎(非移植)相对于NSIP，格林-巴利综合征(Guillain-Barresyndrome)，伯格氏病(IgA肾病)，特发性IgA肾病，线性IgA皮肤病，急性发热性嗜中性粒细胞皮肤病，角层下脓疱性皮肤病，暂时性棘层松解性皮肤病，肝硬化，如原发性胆汁性肝硬化和肺硬变，自身免疫性肠病综合征，腹腔病(celiac disease)或腹腔病(coeliacdisease)，口炎性腹泻(麸质肠病)，难治性口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷沉球蛋白血症，肌萎缩性侧索硬化(ALS；路格瑞氏症(Lou Gehrig's disease))，冠状动脉疾病，自身免疫性耳病，例如自身免疫性内耳病(AIED)，自身免疫性听觉丧失，多软骨炎，例如难治性或复发的或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉积症，柯根氏综合征(Cogan'ssyndrome)/非梅毒性间质性角膜炎，面神经麻痹(Bell's palsy)，斯威特病/综合征(Sweet's disease/syndrome)，自身免疫性酒糟鼻，带状疱疹相关疼痛，淀粉样变性病，非癌症淋巴细胞增多，原发性淋巴细胞增多，其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如良性单克隆丙种球蛋白病和意义不明的单克隆丙种球蛋白病，MGUS)，外周神经病，副肿瘤综合征，通道病，例如癫痫、偏头痛、心律失常、肌肉障碍、耳聋、失明、周期性麻痹和CNS的离子通道病，孤独症，炎性肌病，局灶性或节段性或局灶节段性肾小球硬化(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝病，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特氏综合征(Schmidt'ssyndrome)，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘疾病，例如自身免疫性脱髓鞘疾病和慢性炎性脱髓鞘多神经病，德雷斯勒氏综合征(Dressler's syndrome)，严重脱发(alopeciagreata)，完全脱发(alopecia totalis)，CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象(Raynaud'sphenomenon)、食道运动功能障碍、指端硬化和毛细血管扩张)，男性和女性自身免疫性不育，例如由于抗***抗体所导致的，混合型***病，查格斯病(Chagas'disease)，风湿热，习惯性流产，农民肺，多形性红斑，心切开术后综合征(post-cardiotomy syndrome)，库辛综合征(Cushing's syndrome)，养鸟人肺(bird fancier's lung)，过敏性肉芽肿性血管炎，良性淋巴脉管炎，阿尔波特综合征(Alport's syndrome)，肺泡炎，例如过敏性肺泡炎和纤维性肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风病，疟疾，寄生虫病，如利什曼病、椎虫病、血吸虫病、蛔虫病，曲霉菌病，萨姆普特氏综合征(Sampter's syndrome)，卡布兰综合征(Caplan's syndrome)，登革热，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性间质性肺纤维化，间质性肺纤维化(interstitial lung fibrosis)，肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久性***性红斑，胎儿成红细胞增多症，嗜酸性筋膜炎，舒尔曼综合征(Shulman's syndrome)，费尔蒂氏综合征(Felty's syndrome)，丝虫病，睫状体炎，如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)或富克斯睫状体炎(Fuch's cyclitis)，过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，SCID，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，埃可病毒感染，败血症，内毒素血症，胰腺炎，甲状腺毒症，细小病毒感染，风疹病毒感染，接种后综合征，先天性风疹病毒感染，EB病毒(Epstein-Barr virus)感染，流行性腮腺炎，埃文斯综合征(Evan's syndrome)，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)，链球菌感染后肾炎，血栓闭塞性脉管炎，甲状腺毒症，脊髓痨，脉络膜炎，巨细胞多肌痛，慢性过敏性肺炎，干燥性角结膜炎，流行性角结膜炎，特发性肾病综合征，微小病变肾病，良性家族性和缺血再灌注损伤，移植器官再灌注，视网膜自身免疫性疾病，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道/肺病，矽肺，口疮，口疮性口炎，动脉硬化障碍，无***产生症(asperniogenese)，自身免疫性溶血，结节病(Boeck's disease)，冷沉球蛋白血症，迪皮特朗擎缩(Dupuytren's contracture)，晶状体过敏性眼内炎，过敏性肠炎，麻风结节性红斑，特发性面神经麻痹，慢性疲劳综合征，风湿热，哈-里综合征(Hamman-Rich'sdisease)，感觉神经性听觉丧失，血红蛋白尿症，性腺机能减退，局限性回肠炎，白细胞减少症，感染性单核细胞增多，横贯性脊髓炎，原发性特发性粘液水肿，肾病，交感性眼炎(ophthalmia symphatica)，肉芽肿性***(orchitis granulomatosa)，胰腺炎，急性多神经根炎，坏疽性脓皮症，奎尔万氏甲状腺炎(Quervain's thyreoiditis)，获得性脾萎缩，非恶性胸腺瘤，白癜风，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的病症，白细胞粘附缺陷，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性相关的免疫应答，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，过敏性神经炎，自身免疫性多内分泌病，***，原发性粘液水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，交感性眼炎，风湿病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌衰竭，自身免疫性多腺性综合征I型，成人发作的特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)，心肌病，诸如扩张型心肌病，获得性大疱性表皮松解(EBA)，血色素沉着，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非化脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛窦炎，额窦炎，上颌窦炎或蝶窦炎，嗜酸性粒细胞相关的障碍，诸如嗜酸性粒细胞增多症、肺嗜酸性粒细胞浸润、嗜酸性粒细胞增多-肌痛综合征、勒夫勒综合征(Loffler's syndrome)、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多，支气管肺曲霉病，曲霉肿或含有嗜酸性粒细胞的肉芽肿，过敏反应，血清阴性脊椎关节病，多内分泌自身免疫病，硬化性胆管炎，巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤念珠菌病，布鲁顿综合征，婴儿期暂时性低丙种球蛋白血症，维-奥综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)，共济失调性毛细管扩张综合征，血管扩张，与胶原病有关的自身免疫性障碍，风湿病，神经***疾病，***炎，血压应答降低，血管功能障碍、组织损伤，心血管缺血，痛觉过敏，肾缺血，脑缺血和伴随血管化的疾病，过敏性超敏感性障碍，肾小球肾炎病，再灌注损伤，缺血再灌注障碍，心肌或其它组织的再灌注损伤，淋巴瘤气管支气管炎，炎性皮肤病，具有急性炎性组分的皮肤病，多器官衰竭，大疱病，肾皮质坏死，急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经***炎性障碍，眼和眶炎性障碍，粒细胞输血相关综合征，细胞因子诱发的中毒，发作性睡病，急性重度炎症，慢性顽固性炎症，肾盂炎，动脉内增生，消化性溃疡，心瓣炎，移植物抗宿主病，接触性超敏反应，哮喘性气道高反应，重症肌无力，免疫性血小板减少性紫癜，抗中性粒细胞胞浆自身抗体介导的疾病，IgA-介导的血管炎，Ig4-相关障碍和子宫内膜异位症。
IV.体外或离体给予
如本文所使用的，术语体外给予是指对从受试者移出的细胞进行的操作或在受试者外部对细胞进行的操作，包括但不限于培养物中的细胞。术语离体给予是指已经在体外操作并且随后给予受试者的细胞。术语体内给予包括在受试者中进行的所有操作，包括给予。
在本发明的某些方面，组合物可以体外、离体或体内给予。在某些体外实施方案中，将自体T细胞与本发明的组合物一起孵育。然后可以将细胞用于体外分析，或供选择地用于离体给予。
V.联合治疗
本发明的组合物和相关方法，特别是OX40L抗体或抗原结合片段的给予还可以与传统疗法的给予联合使用。这些包括但不限于给予免疫抑制或免疫调节疗法或治疗。
在一个方面，预期OX40L抗体或抗原结合片段与另外的疗法联合使用。供选择地，抗体给予可以在其它治疗之前或之后，间隔数分钟至数周。在其他药剂分开给药的实施方案中，通常将确保有效期在每次递送的时间之间不会到期，使得药剂和抗体仍然能够对受试者发挥有利的联合作用。在这种情况下，考虑两种模式可以彼此在约12-24小时内，更优选彼此在约6-12小时内给予。然而，在一些情况中，期望的是显著地延长给药的时间段，其中在各自的给药之间间隔几天(2、3、4、5、6或7天)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
将本发明的OX40L抗体或抗原结合片段给予患者/受试者将遵循给予这样的化合物的一般方案，如果有的话，考虑毒性。期望根据需要重复治疗周期。还考虑各种标准疗法，例如水合作用，可以与上述疗法联合应用。
VI.序列表
SEQ ID NO:1–小鼠抗-hOX40L_19A3(9295)-抗体重链mIgGH2b
Figure GDA0003044410120000411
SEQ ID NO:2-小鼠抗-hOX40L_19A3(9295)-抗体重链mIgGH2b。经典的TTXP特征加下划线
Figure GDA0003044410120000412
SEQ ID NO:3-小鼠抗-hOX40L_19A3(9295)-抗体重链mIgGH2b的VH区的前导肽
MEWSWIFLFLLSGTAGVHS(SEQ ID NO:3)
SEQ ID NO:4小鼠抗-hOX40L_19A3(9295)-抗体重链mIgGH2b的可变区
Figure GDA0003044410120000421
SEQ ID NO:5-小鼠抗-hOX40L_19A3(9295)-抗体重链mIgGH2b的VH区的CDR1
GYSFTGYSMH(SEQ ID NO:5)
SEQ ID NO:6-小鼠抗-hOX40L_19A3(9295)-抗体重链mIgGH2b的VH区的CDR2
KIDPYNGVTTYNQRFTG(SEQ ID NO:6)
SEQ ID NO:7-小鼠抗-hOX40L_19A3(9295)-抗体重链mIgGH2b的VH区的CDR3
EGFAY(SEQ ID NO:7)
SEQ ID NO:8–小鼠抗-hOX40L_19A3(9295)-抗体κ轻链mIgK
Figure GDA0003044410120000422
SEQ ID NO:9-小鼠抗-hOX40L_19A3(9295)-抗体κ轻链mIgK。LE经典特征加下划线
Figure GDA0003044410120000423
SEQ ID NO:10-小鼠抗-hOX40L_19A3(9295)-抗体κ轻链mIgK的VL区的前导肽：
MHFQVQIFSFLLISASVIMSRG(SEQ ID NO:10)
SEQ ID NO:11小鼠抗-hOX40L_19A3(9295)-抗体κ轻链mIgK的可变区
Figure GDA0003044410120000431
SEQ ID NO:12-小鼠抗-hOX40L_19A3(9295)-抗体κ轻链mIgK的VL区的CDR1
SASSSVRYIH(SEQ ID NO:12)
SEQ ID NO:13-小鼠抗-hOX40L_19A3(9295)-抗体κ轻链mIgK的VL区的CDR2
STSDLAS(SEQ ID NO:13)
SEQ ID NO:14-小鼠抗-hOX40L_19A3(9295)-抗体κ轻链mIgK的VL区的CDR3
QQRTGYPLT(SEQ ID NO:14)
SEQ ID NO:15–克隆5C6(8703)杂交瘤OX40L抗体重链的DNA序列；在hIgG4上嵌合
Figure GDA0003044410120000432
SEQ ID NO:16–克隆5C6(8703)杂交瘤OX40L抗体重链的氨基酸序列；经典的TXXP特征加下划线
Figure GDA0003044410120000441
SEQ ID NO:17–克隆5C6(8703)杂交瘤OX40L抗体重链的信号序列
MKCSWVIFFLMAVVTGVNS(SEQ ID NO:17)
SEQ ID NO:18–克隆5C6(8703)杂交瘤OX40L抗体重链的可变区
Figure GDA0003044410120000442
SEQ ID NO:19–克隆5C6(8703)杂交瘤OX40L抗体重链的CDR1
GFNIKDTYMH(SEQ ID NO:19)
SEQ ID NO:20–克隆5C6(8703)杂交瘤OX40L抗体重链的CDR2
RIDPRNDNTKFDPKFRG(SEQ ID NO:20)
SEQ ID NO:21–克隆5C6(8703)杂交瘤OX40L抗体重链的CDR3
VPTRSWYFDV(SEQ ID NO:21)
SEQ ID NO:22–克隆5C6(8703)杂交瘤OX40L抗体轻链的DNA序列；在hIgGK-C骨架上嵌合
Figure GDA0003044410120000443
SEQ ID NO:23–克隆5C6(8703)杂交瘤OX40L抗体轻链的氨基酸序列；LE经典特征加下划线。在hIgGK-C骨架上嵌合
Figure GDA0003044410120000451
SEQ ID NO:24–克隆5C6(8703)杂交瘤OX40L抗体轻链的信号序列
METHSQVFVYMLLWLSGVEG(SEQ ID NO:24)
SEQ ID NO:25–克隆5C6(8703)杂交瘤OX40L抗体轻链的可变区
Figure GDA0003044410120000452
SEQ ID NO:26–克隆5C6(8703)杂交瘤OX40L抗体轻链的CDR1
KASQDVGKSVV(SEQ ID NO:26)
SEQ ID NO:27–克隆5C6(8703)杂交瘤OX40L抗体轻链的CDR2
WASTRHT(SEQ ID NO:27)
SEQ ID NO:28–克隆5C6(8703)杂交瘤OX40L抗体轻链的CDR3
QQYTSYPYMYT(SEQ ID NO:28)
SEQ ID NO:29–在hIgG4上嵌合的克隆44F3(8704)杂交瘤OX40L抗体重链的DNA序列
Figure GDA0003044410120000461
SEQ ID NO:30–在hIgG4上嵌合的克隆44F3(8704)杂交瘤OX40L抗体重链的氨基酸序列；经典的TXXP特征加下划线
Figure GDA0003044410120000462
SEQ ID NO:31–克隆44F3(8704)杂交瘤OX40L抗体重链的信号序列
MERHWILLLLLSVTAGVHS(SEQ ID NO:31)
SEQ ID NO:32–克隆44F3(8704)杂交瘤OX40L抗体重链的可变区
Figure GDA0003044410120000463
SEQ ID NO:33–克隆44F3(8704)杂交瘤OX40L抗体重链的CDR1
GYTLASYTLH(SEQ ID NO:33)
SEQ ID NO:34–克隆44F3(8704)杂交瘤OX40L抗体重链的CDR2
YINPNSGYTNYIQKFKD(SEQ ID NO:34)
SEQ ID NO:35–克隆44F3(8704)杂交瘤OX40L抗体重链的CDR3
GGGDRYCTDCAMDY(SEQ ID NO:35)
SEQ ID NO:36–克隆44F3(8704)杂交瘤OX40L抗体轻链的DNA序列；在hIgGK-C骨架上嵌合
Figure GDA0003044410120000471
SEQ ID NO:37–在hIgGK-C上嵌合的克隆44F3(8704)杂交瘤OX40L抗体轻链的氨基酸序列；LE经典特征加下划线
Figure GDA0003044410120000472
SEQ ID NO:38–克隆44F3(8704)杂交瘤OX40L抗体轻链的信号序列
MHSLALLLSLLLLCVSDSRA(SEQ ID NO:38)
SEQ ID NO:39–克隆44F3(8704)杂交瘤OX40L抗体轻链的可变区
Figure GDA0003044410120000473
SEQ ID NO:40–克隆44F3(8704)杂交瘤OX40L抗体轻链的CDR1
MTSIDIDDDMN(SEQ ID NO:40)
SEQ ID NO:41–克隆44F3(8704)杂交瘤OX40L抗体轻链的CDR2
EGKTLRP(SEQ ID NO:41)
SEQ ID NO:42–克隆44F3(8704)杂交瘤OX40L抗体轻链的CDR3
LQSDNLPFT(SEQ ID NO:42)
VII.实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员将理解遵照本发明人发现的代表性技术的在实施例中公开的技术在本发明的实施中很好地发挥作用，因此可以视为构成用于其实施的优选方式。然而。本领域技术人员根据本发明应理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，在公开的具体实施方案中可以作出许多变化，并且仍然获得相同或相似的结果。
实施例1：OX40L抗体的表征
使用以下分析测试了OX40L抗体5C6(也标记为AB104_105.5C6.3F9)、19A3(也标记为AB104_105.19A3.2C4)和44F3(也标记为AB104_105.44F3.2F7)促进与mDC共培养的初始T细胞的细胞因子产生的能力。还使用本实施例中所述的分析测试OX40L抗体对mDC培养物的增殖和活力的影响。
发现OX40L抗体克隆5C6、19A3和44F3 1)识别人OX40L上的独特表位，2)抑制由TSLP-mDC引发的产生低IL-10/高TNFα的炎性Th2的分化，3)抑制TNF-α的增殖和产生，并且促进用OX40L-转染的细胞系培养的CD4 T细胞的IL-10。这些结果显示在图1-8中。
TSLP-mDC和初始CD4 T细胞共培养-血液髓样DC(mDC)的分离和培养。从获得自成年健康志愿者的血沉棕黄层或成分分离的血液(apheresis blood)样品分离PBMC。根据本领域已知的方法，通过使用人泛-DC预富集试剂盒(STEMCELL#19251)或人髓样DC富集试剂盒(STEMCELL#19061)从PBMC富集mDC(谱系-，CD4+，CD11c+)。使用FITC-CD3(#349201)、CD14(#347493)、CD16(#555406)、CD19(#555412)、CD20(#555622)、CD56(#3032769)、APC-CD11c(#340544)和V450-CD4(#2342693)(所有抗体均来自BD)对富集的mDC进行染色，然后通过FACS Aria2(BD Biosciences)将谱系-CD11c+CD4+群分选为髓样DC。在RPMI+GlutaMAX(gibco)、10mM HEPES(gibco)、青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(gibco)、1mM丙酮酸钠(SIGMA)和包含10％人AB血清(GemCell#100-512)的MEM非必需氨基酸溶液(Hyclone)中培养mDC。在20ng/ml重组人TSLP存在下，以1～2x105/200ul培养基的密度将细胞接种在平底96孔板中。已经如前所述使用腺病毒载体***内部制备重组人TSLP(Soumelis等人，2002)。在孵育20～24小时后，收获mDC并使用培养基洗涤。
初始T细胞的分离。从获得自成年健康志愿者的血沉棕黄层或成分分离的血液样品分离PBMC。使用人CD4+T细胞富集组合(Enrichment Cocktail)(STEMCELL#15062)和人初始CD4+T细胞富集试剂盒(STEMCELL#19155)从PBMC富集CD4+初始T细胞。使用FITC-CD8(#340692)、CD14(#347493)、CD16(#555406)、CD19(#555412)、CD20(#555622)、CD25(#340694)、CD56(#3032769)、BDCA-2(130-090-510；Miltenyi Biotech)、CD11c(#3011791)、TCRγδ(#347903)、PE-CCR7(#353204；BioLegend)、PE-Cy7-CD45RO(#337168)、APC-CD45RA(#304112；BioLegend)和V450-CD4(#2342693)(除BDCA-2、CCR7和CD45RA以外的所有抗体均来自BD)对富集的CD4+初始T细胞进行染色。谱系-CD4+CD45RA+CD45RO-CCR7+群通过FACSAria2分选为初始CD4+T细胞。
DC和T细胞共培养。在50ug/ml抗-OX40L mAb(ik-5，由Dr.Toshiyuki Hori提供)、内部抗-OX40L mAb(5C6、19A3和44F3)存在下在圆底96孔培养板中将新纯化的同种异体初始CD4+T细胞(每孔2.5x104个细胞)与TSLP DC(每孔5x103个细胞)以1:5的DC/T细胞比共培养。小鼠IgG2a(16-4724-85；eBioscience)和IgG2b(MAB004；R&D systems)用作对照。在6-8天培养后，收获初始T细胞并以105个细胞/100ul的浓度在平底96孔板中使用固定化的抗-CD3(OKT3:1ug/ml)加上抗-CD28(1ug/ml)再刺激20～24小时。通过ELISA(所有试剂盒来自R&D Systems)或Luminex(Milliopore)测量IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-α和IFN-γ的产生。
大量CD4+T细胞的分离。通过使用人CD4+T细胞富集组合(STEMCELL#15062)从来自健康成年志愿者的血液的血沉棕黄层分离大量CD4+T细胞，接着使用FITC-CD8(#340692)、CD14(#347493)、CD16(#555406)、CD19(#555412)、CD20(#555622)、CD25(#340694)、CD56(#3032769)、BDCA-2(130-090-510；Miltenyi Biotech)、CD11c(#3011791)、TCRγδ(#347903)和APC-Cy7 CD4(#)(除BDCA-2以外的所有抗体均来自BD)将细胞分选为CD4+谱系-部分。分选后，根据生产说明用CSFE标记CD4+T细胞。
L细胞和T细胞共培养。在与T细胞共培养之前，将0.2ug/ml的抗-CD3抗体(OKT3)放入预接种的L细胞中并孵育1～2小时。然后添加CSFE-标记的CD4+T细胞并在1ug/ml抗-CD28抗体(CD28.2，BD pharmingen)的存在下在L细胞上培养6天。使用固定化的抗-CD3(OKT3:1ug/ml)加上抗-CD28(1ug/ml)在平底96孔板中以105个细胞/100ul的浓度再刺激激活的CD4+T细胞24小时。通过ELISA(所有试剂盒来自R&D Systems)或Luminex(Milliopore)测量IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-α和IFN-γ的产生。
实施例2：OX40配体通过促进T滤泡性辅助细胞应答促成人狼疮发病机制
***性红斑狼疮(SLE)是慢性全身性炎性自身免疫疾病，其特征在于对核抗原的耐受性的破坏(Tsokos，2011)。SLE在临床表现和疾病过程中显示出相当大的异质性。对SLE发病机理的更全面的了解已期待已久；在过去50年中，只有一种新药被批准用于SLE治疗(Murphy等人，2013；Stohl等人，2012)。全基因组关联研究(GWAS)已经确定了SLE的许多易感基因座，证实SLE患者显示易感的遗传因素(Cunninghame Graham等人，2008；Delgado-Vega等人，2009；Gateva等人，2009；Han等人，2009；国际***性红斑狼疮研究协作组(International Consortium for Systemic Lupus Erythematosus)等，2008)。免疫***与易感因素与环境因素的相互作用引起SLE中抗原呈递细胞(APC)和淋巴细胞功能的改变。包括树突状细胞(DC)的APC在SLE患者中异常激活，并且促进自身反应性T和B细胞的激活(Blanco等人，2001；Blanco等人，2008)。发展的自身反应性浆细胞产生针对核组分的致病性自身抗体并引起组织损伤。
使用鼠模型的许多研究已经证明T滤泡性辅助细胞(Tfh)(Craft，2012；Linterman等人，2009；Vinuesa等人，2005)在狼疮中发挥主要致病性作用，所述T滤泡性辅助细胞(Tfh)是经特化以向B细胞提供辅助的CD4+辅助T(Th)细胞亚组(Crotty，2011)。例如，在Roquin基因中显示单一隐性缺陷的sanroque小鼠通过产生过多的Tfh细胞应答而患上狼疮样自身免疫疾病(Linterman等人，2009；Vinuesa等人，2005)。Tfh细胞对于生发中心(GC)的形成是必需的，所述生发中心(GC)是用于选择高亲和力B细胞和用于形成B细胞记忆的位点(MacLennan，1994；Vinuesa和Cyster，2011)。Tfh细胞具有B细胞辅助所需的多个特征(Crotty，2011；King等人，2008)。Tfh细胞及其前体分泌的IL-21(Bentebibel等人，2011；Bryant等人，2007；Chtanova等人，2004)强力地促进B细胞的生长、分化和类别转换(Spolski和Leonard，2008)。可诱导的共刺激物(ICOS)由GC Tfh细胞高表达，并且介导与B细胞的相互作用(Crotty，2011；King等人，2008；Xu等人，2013)。由Tfh细胞表达的CD40配体(CD40L)通过CD40向B细胞提供其分化和类别转换的信号(Banchereau等人，1994)。在狼疮小鼠模型中观察到的CD40L(Boumpas等人，2003；Kalled等人，1998)、ICOS(Odegard等人，2008)、IL-21和/或IL-21受体(Bubier等人，2009；Herber等人，2007)的功能的抑制延迟疾病过程并改善临床症状突显了这些Tfh分子在狼疮发病机制中的重要性。此外，通过删除SAP分子抑制狼疮易感的sanroque小鼠模型中的Tfh细胞的产生通过抑制消除了肾脏病理的发展(Linterman等人，2009)。这些研究提供了抑制Tfh细胞的产生和/或活性用于预防来自具有易感基因座的受试者的狼疮疾病和/或用于治疗狼疮患者的强有力的理论基础。
在人狼疮中，大多数IgG类自身抗体产生性B细胞是体细胞突变的(Tiller等人，2007)，表明它们通过与Tfh细胞的相互作用而源自GC。多项研究表明，在活动性SLE患者中，具有活动性表型的血液Tfh细胞的频率增加(He等人，2013；Simpson等人，2000)。此外，还在患有狼疮肾炎患者的肾脏中的T细胞和B细胞聚集体和异位生发中心中发现Tfh细胞(Chang等人，2011；Liarski等人，2014)。这些观察支持Tfh细胞在人狼疮中的致病作用。然而，涉及SLE患者中的Tfh应答增强的机制仍然未知。
此处显示由髓样APC表达的OX40配体(OX40L)有助于SLE中的异常Tfh应答。OX40L由髓样APC在血液中以及在成人和儿科活跃性SLE患者的发炎组织中表达。OX40L刺激诱导人CD4+T细胞表达Tfh相关分子，并且足以诱导它们成为功能性B细胞辅助细胞。最后，此处显示存在于狼疮血清中的含有核糖核蛋白(RNP)的免疫复合物(IC)通过TLR7的激活诱导髓样APC的OX40L表达。因此，该研究显示RNP IC-OX40L轴可能提供SLE中自身抗体产生的扩增环。
材料和方法
患者样品–招募符合美国风湿病学会(American College of Rheumatology)修订的SLE标准(Hochberg，1997)的成年SLE患者(总共61名：53名女性和8名男性)和儿科SLE患者(总共38名：34名女性和4名男性)。患者的所有临床和生物相关信息显示在下表1-2中。使用SLE疾病活动性指数(SLEDAI)评估临床疾病活动性。活动性患者定义为SLEDAI评分≥6。对于成年人SLE样品，在获得知情同意后使用来自常规实验室分析的血液样品。对于儿科SLE样品，该研究由贝勒研究院的机构审查委员会批准，并从所有参与者或其父母获得知情同意。对照PBMC获自来自成年志愿者的血沉棕黄层、抽血或成分分离血液样品。
表1：研究中纳入的成年SLE患者的临床和实验室参数。
Figure GDA0003044410120000531
表1续
Figure GDA0003044410120000541
表2：研究中纳入的儿科SLE患者的临床和实验室参数。
Figure GDA0003044410120000551
缩写：F：女性，M：男性，A：关节的，C：皮肤的，D：消化道的，H：血液的，M：心肌的(mycardic)，N：神经的，PP：胸膜-心包的，R：肾的，V：血管的，APS：抗磷脂综合征，HCQ：羟基氯喹，AZA：硫唑嘌呤，CYC：环磷酰胺，MMF：吗替麦考酚酯，MPA：麦考酚酸，MTX：氨甲蝶呤，RTX：利妥昔单抗。
针对来自成年SLE群体的患者特征，随机选择皮肤和肾脏活检(IV类狼疮肾炎)。从接受整形手术的患者获得对照皮肤样品。对照肾脏样品获自经历肾切除术的癌症患者。
通过流式细胞术分析血液免疫细胞表型–为了分析OX40L表达，用抗-CD14-PC5、CD16-FITC、CD11c-APC、HLA-DR-PC7和OX40L-PE mAb对全血样品染色，并且用Versalyse(Beckman Coulter)裂解红血细胞。对于血液Tfh细胞的分析，用抗-CXCR5-AF488、CCR6-PE、CXCR3-PC5、CCR4-PC7、CD3-AF700、CD8-APCH7、CD4-太平洋蓝(Pacific Blue)(所有均来自Becton Dickinson)、CD45RA-ECD(Beckman Coulter)、ICOS-APC(Biolegend)和CD45-太平洋橙(Pacific Orange)(Invitrogen)对全血样品染色。使用BD LSR II仪器(BDBiosciences)收集数据并用Flowjo软件(Tree Star Inc.)分析。
皮肤和肾活检分析-使用免疫荧光显微镜分析来自SLE患者和没有自身免疫疾病的受试者的皮肤和肾活检中的OX40L和CD11c表达。简言之，将来自皮肤和肾的***固定的、石蜡包埋的组织的5μm厚的切片脱蜡并进行热诱导的表位恢复步骤。将载玻片在冷的流动水中冲洗，并在pH 7.4的Tris-缓冲盐水中洗涤，然后与第一抗CD11c(Novocsatra，克隆5D11)和抗OX40L(R&D Systems，克隆159403)或同种型匹配的对照抗体孵育过夜。然后将载玻片洗涤三次，并用合适的第二抗体：AF488-缀合的抗小鼠或大鼠或AF568-缀合的抗小鼠(Invitrogen)孵育。在与Cytovision***(Applied Imaging)偶联的Olympus BX51/52***显微镜上分析免疫荧光图像。
扁桃体样品的表型分析-从经历扁桃体切除术的健康受试者获得扁桃体样品，并通过机械破碎收集单细胞。对于表面染色，在LIVE/DEAD FIXABLE Aqua(Invitrogen)的存在下，使细胞与荧光染料缀合的抗体CD11c-PC7(B-ly6)、HLA-DR-PerCP(L243)、CD19-FITC(HIB19)、来自BD Biosciences的CD19-APC(HIB19)和41BBL-PE(C65-485)、来自AncellCorporation的OX40L-PE(ANC10G1)、CD14-APC-AF750(TuK4)、来自Invitrogen的CD16-APC(3G8)和CD3-PB(UCHT1)、来自Miltenyi的ICOSL-FITC(MIH12)、来自R&D的GITRL-PE(109101)孵育15分钟，接着在BD LSRII上分析。使用FlowJo软件(Tree Star Inc.)进一步分析数据。
Th细胞的培养–通过如前所述的流式细胞术(Schmitt等人，2009)分选初始(CD45RA+CCR7+)和记忆(CD45RA-)Th细胞。用CD3/CD28Dynabeads(Invitrogen)在补充有10％FCS的RPMI完全培养基中刺激Th细胞过夜。然后在重组IL-12(100pg/ml)和/或可溶性OX40L(100ng/ml(R&D systems)存在或不存在的情况下将细胞转移到用补充有可溶性CD28mAb(1μg/ml，CD28.2)的CD3mAb(5μg/ml，OKT3)包被的平底96孔板中。在一些实验中，将分选的初始Th细胞与通过从活动性SLE患者PBMC分选而分离的同种异体单核细胞(CD14+细胞)一起培养(T：单核细胞比＝1:1)。在第4天(对于CD3/CD28刺激的T细胞)或在第7天(对于单核细胞-T共培养)收获T细胞用于使用抗-CXCR5-AF647、抗-CD40L APC-eFluor780和抗-ICOS生物素/链霉亲和素-PerCP进行表型分型；以及用于与B细胞共培养。为了评估IL-21表达(使用抗-IL21-PE)，将培养的细胞用25ng/ml PMA、1μg/ml离子霉素再刺激6小时，后4小时在布雷菲德菌素(eBioscience)和莫能菌素的存在下再刺激。
Th和B细胞的共培养-在内毒素减少的SEB(0.25ng/ml；Toxin technology,Inc.)的存在下，在96孔圆底板中的Yssel培养基/10％FBS中将活化的Th细胞与自体同源的初始或记忆B细胞(每孔5x103个T细胞，40x103个记忆B细胞)共培养。在第14天通过ELISA分析培养物中产生的IgG。
单核细胞的培养–通过阴性选择(Schmitt等人，2009)从健康供者的血液样品中纯化CD14+单核细胞，然后在6孔板中暴露于SLE血清(10％)或对照血清3天。使用抗-CD14-PC5、抗-HLA-DR-PC7和抗-OX40L-PE通过FACS分析表型。TLR3(聚-IC，10μg/ml)、TLR7(R837，5μg/ml)、TLR9(ODN2216，10μg/ml)激动剂购自InvivoGen。将TLR7抑制剂IRS-661(1μM)(Barrat等人，2005)与单核细胞孵育10分钟，然后添加SLE血清或抗-RNP IgG(50μg/ml)。
抗RNP纯化–使用可商购的酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒(Corgenix)测定抗RNP滴度水平。将样品与制造商提供的阳性对照进行比较。阳性抗RNP样品具有大于22U/ml的活性。使用HiTrap Protein G HP柱(GE Healthcare)从抗-RNP+SLE患者的血清样品纯化IgG。将纯化的IgG脱盐，然后定量。
Nanostring–在RLT缓冲液中裂解用IL-12和/或sOX40L培养48小时的Th细胞。使用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen)纯化总RNA。根据制造商的说明书进行NanoString反应。将数据针对包含在代码集中的管家基因归一化。
统计分析–评估变量分布的正态性，并且当分布的正态性被否定时，视情况通过非参数配对的Wilcoxon检验或未配对的Mann-Whitney U检验进行分析。必要时，用KruskallWallis检验，然后用Dunn事后检验分析比较。为了比较三个以上的参数，使用具有多个比较检验的单因素方差分析(one-way ANOVA)。通过使用Spearman检验确定变量之间的相关性。所有统计分析使用StatView 5.0软件(SAS Institute)进行。
结果
OX40L在发炎的扁桃体中大量表达–申请人先前证明了真皮CD14+DC优先在体外诱导Tfh样细胞的产生(Klechevsky等人，2008)。包括真皮CD14+DC的皮肤DC亚群迁移到引流***中(Segura等人，2012)，并在T细胞区与T细胞相互作用。***中的CD206+DC是迁移的真皮CD14+DC的提议的对应物，其促进初始Th细胞产生CXCL13(Segura等人，2012)，所述CXCL13是Tfh细胞大量表达的趋化因子(Bentebibel等人，2011；Kim等人，2004)。这些观察表明真皮CD14+DC参与Tfh细胞的产生和在皮肤的引流***中的抗体应答。然而，与炎症淋巴器官例如扁桃体中的Tfh应答相关的APC的表型尚未确定。
小鼠模型中的先前研究显示由DC表达的ICOS配体(ICOSL)对Tfh细胞分化的重要性(Choi等人，2011)。申请人分析了髓样APC(CD11c+HLA-DR+)是否在儿童扁桃体中表达ICOSL，其使用成熟Tfh细胞以及GC富集(Bentebibel等人，2011)。申请人发现发炎的扁桃体中的髓样APC几乎不表达ICOSL(图9A，9B)。相反，髓样APC，特别是CD14+细胞，表达共刺激分子OX40L(9.3±7.1％的CD11c+HLA-DR+细胞，平均±s.d.，n＝9。图9A)。其他TNF配体家族分子例如GITRL和4-1BBL是不可检测的或仅以低水平表达(图9A，B)。然而，髓样APC的OX40L表达在脾脏中几乎不存在(0.3±0.5％的CD11c+HLA-DR+细胞，平均值±sd，n＝4)，其中Tfh和GC应答比在儿童扁桃体中更不明显(Bentebibel等人，2013)。因此，OX40L+髓样APC不存在于所有次级淋巴器官中，并且似乎限于具有炎症的那些。
为了确定它们的定位，用抗-OX40L和抗-CD11c对扁桃体组织染色并通过免疫荧光显微镜分析。申请人发现OX40L在扁桃体，特别是上皮下区域、T细胞区和外套层中大量表达；但在GC中较少(图9C)。OX40L+CD11c+髓样APC主要在T细胞区中发现(图9C)。值得注意的是，OX40L也由CD11c-细胞表达。这与以下事实一致：OX40L可以由包括B细胞、血管内皮细胞、肥大细胞、激活的NK细胞和激活的Th细胞的广泛的免疫细胞表达(Croft，2010)。这些观察表明扁桃体中的炎性环境通过未知的机制诱导不同类型的细胞上OX40L表达的上调。
来自活动性成人和儿科SLE患者的髓样APC表达OX40L–鉴于OX40L在炎症扁桃体中的显著表达，申请人想知道OX40L是否也在来自SLE患者的炎症组织中表达。申请人发现，来自患有肾炎的活动性成年SLE患者的炎性肾组织中的细胞，包括CD11c+髓样APC，大量表达OX40L，但在没有自身免疫性疾病的受试者的组织中缺乏(图10A)。OX40L+髓样APC也在来自SLE患者而不是来自对照的皮肤活检样品中发现(图10A)。与扁桃体相似，OX40L+CD11c-细胞也存在于来自SLE患者的两种组织中。
申请人接下来分析了患有SLE的患者的外周髓样APC是否也表达OX40L。与健康受试者、非活动性SLE患者和其他自身免疫性疾病患者相比，来自患有活动性SLE的成年和儿科患者的血液髓样APC的表面上的OX40L表达显著增加(图12B和图15)。与扁桃体髓样APC(图9A，9B)类似，未观察到血液髓样APC上的ICOSL、GITRL或4-1BBL的表达(图16)。在成人和儿科SLE中，活动性患者(由SLE疾病活动性指数(SLEDAI)评估)中的OX40L+细胞在血液中的百分比显著高于非活动性患者(图10C)。此外，在成人和儿科SLE中，髓样APC内的OX40L+细胞的频率与通过SLEDAI评估的疾病活动性相关(图10D)。OX40L主要由CD14+CD16+和CD14+CD16-单核细胞表达(图10E和图17)。在11个突发和之前未治疗的成年SLE患者的纵向随访中，OX40L+髓样APC的百分比在治疗后随着疾病活动性的降低而大幅度降低(图18，P<0.01，n＝11)。
总之，这些结果显示OX40L在活动性SLE患者的血液和组织浸润髓样APC上表达。
OX40信号促进Tfh基因在初始和记忆T细胞中的表达–在血液和发炎组织中存在OX40L+髓样APC表明OX40L表达在活动性SLE患者中的髓样APC上全面增加。特别地，SLE患者中的发炎组织似乎产生富含OX40L的环境，其中Th细胞接收OX40信号以及T细胞受体信号(图10A)。在提供对T细胞增殖和存活重要的信号的同时，OX40信号还与来自APC、微环境和Th细胞自身的其它因素联合调节Th分化(Croft，2010)。申请人假设OX40信号可能显示出促进人Th细胞向Tfh谱系分化的固有性质。为了解决这一假设，申请人应用无APC***以避免来自APC和微环境的因素的贡献，并且在激动性可溶性OX40L(sOX40L)的存在下用抗-CD3和抗-CD28培养初始和记忆Th细胞。为了最小化T细胞内在因素的影响，申请人通过NanoString分析了培养物在48h时的基因表达谱。为了评估OX40信号对基因表达模式的影响，将在sOX40L的存在下刺激的Th细胞中的转录物丰度归一化为在sOX40L不存在的情况下刺激的Th细胞的值。申请人发现在初始和记忆Th细胞二者中OX40信号传导上调多种Tfh基因，包括CXCR5、BCL6、IL21、CXCL13和PDCD1(编码PD-1)(图11A)。此外，OX40L刺激下调PRDM1(编码Blimp-1)的表达，所述PRDM1为抑制Tfh产生的转录阻遏物(Crotty，2011)。
以前，申请人和其他人显示IL-12诱导激活的人初始Th细胞以比其它细胞因子更高的水平表达多种Tfh分子，包括IL-21、ICOS、CXCR5和Bcl-6(Ma等人，2009；Schmitt等人，2013；Schmitt等人，2009)。缺乏IL-12受体β1(IL-12Rβ1)链的受试者显示降低的Tfh和GC应答(特别是儿童)，提供以下体内证据：通过IL-12受体的信号对于人中的Tfh细胞分化的产生是必要的(Schmitt等人，2013)。因此，申请人比较了Tfh基因在OX40-和IL-12-刺激的Th细胞之间的表达。令人惊讶的是，OX40信号以与IL-12信号相当的水平诱导初始Th细胞表达Tfh基因(图19)。此外，Tfh基因的总体表达模式在OX40-和IL-12-刺激的初始Th细胞之间很大程度上相似(图11B，左)。虽然小鼠研究表明IFN-γ对Tfh细胞产生的积极作用(Lee等人，2012)，但是这些细胞中Tfh分子的上调不是由于培养物中分泌的IFN-γ，因为IFN-γ刺激的初始Th细胞不显示相似的基因模式(图19，左)。两种信号的组合进一步增加IL21的表达，但不增加其它Tfh分子的表达。
与对初始Th细胞的观察相反，OX40信号在诱导记忆Th细胞调节全局Tfh基因的表达(图11B，右)和促进Tfh基因(BCL6、CXCR5、IL-21、CXCL13和PDCD1)的上调和PRDM1基因的下调(图11C)方面比IL-12信号更有效。注意到OX40信号对MAF和BATF的表达的调节在初始和记忆Th之间有差异，所述MAF和BATF是与Tfh发育和功能相关的基因(Crotty，2011)。OX40信号诱导初始Th细胞中两种基因的上调，但是诱导记忆Th细胞中的下调(图11B)。尽管如此，IL-12信号与OX40信号协作以通过记忆Th细胞增加IL21的表达(图11C)。
OX40信号促进功能性辅助细胞的产生–为了从蛋白质水平分析Tfh分子的表达，在sOX40L存在或不存在的情况下，通过抗-CD3和抗-CD28激活初始和记忆Th细胞三天，并且通过流式细胞术分析表型。与转录数据(图11A，11B)一致，OX40信号促进初始和记忆Th细胞二者表达包括CXCR5、CD40L和IL-21的Tfh分子，并且增加共表达IL-21、CD40L和ICOS的CXCR5+细胞的产生(图12A和12B；图20)。值得注意的是，除了IL-21之外，OX40信号诱导IL-2和TNF-α的表达，而不诱导IFN-γ或IL-4的表达(图21)。此外，OX40L刺激诱导初始Th细胞下调CCR7在CXCR5+细胞上的表达(图20)，并且增加CXCR5+CCR7-细胞的产生，这是归巢到B细胞滤泡所需的趋化因子受体表达谱(Haynes等人，2007)。引人注目的是，OX40信号比IL-12信号更有效地诱导记忆Th细胞表达包括CXCR5、CD40L和IL-21的Tfh分子(图12B)。申请人注意到，与对照培养物相比，OX40信号降低了记忆Th细胞上ICOS的表达(图20)，这与转录数据一致(图11B)。然而，ICOS表达保持高水平，并且多于80％的用OX40信号刺激的CXCR5+细胞表达ICOS。
申请人想知道OX40信号是否足以诱导Th细胞成为功能性辅助细胞。为此，将刺激的Th细胞与自体B细胞共培养，并在第14天测量产生的IgG。OX40信号足以诱导初始和记忆Th细胞二者成为B细胞辅助细胞(图12C)。值得注意的是，OX40信号比IL-12信号更有效地诱导记忆Th细胞成为辅助细胞(图12C)。这些结果表明OX40L刺激促进初始和记忆Th细胞分化成Tfh样细胞。
总之，这些结果显示OX40信号显示诱导人初始和记忆Th细胞表达多种Tfh分子和成为功能性B细胞辅助细胞的固有性质。
来自SLE患者的髓样APC以OX40L依赖性方式促进IL-21+Th细胞的产生–这些数据表明OX40信号有助于SLE中异常Tfh应答的产生。因此，申请人检查了来自活动性SLE患者的血液OX40L+髓样APC是否诱导Th细胞表达Tfh分子。申请人使用总CD14+单核细胞用于实验，因为分离OX40L+单核细胞是不可行的。从活动性和非活动性成年SLE患者分离CD14+单核细胞，并与同种异体的初始Th细胞一起培养。申请人发现，来自活动性患者的CD14+单核细胞比来自非活动性SLE患者的CD14+单核细胞更有效地诱导初始Th细胞变成CXCR5+IL-21+T细胞(图13A)。CXCR5+IL-21+细胞的产生主要依赖于OX40L，因为使用OX40L-中和mAb阻断OX40-OX40L相互作用对其有强抑制(图13B和13C)。此外，所产生的CXCR5+IL-21+细胞的数量与培养物中OX40L+单核细胞的频率正相关(图13D)。
先前的研究显示活动性SLE患者显示具有活性表型(ICOS+CXCR5+)的血液Tfh细胞的频率增加(He等人，2013；Simpson等人，2010)。申请人能够在同生群中证实该观察(图13E)。申请人进一步发现，血液Tfh细胞内的ICOS+细胞的频率与血液髓样APC内的OX40L+细胞的频率正相关(图13F)。OX40L+APC的频率也与血液Tfh细胞(总Th细胞中的CXCR5+)的频率正相关(图22)，但显示与血液CXCR5-Th1(CXCR3+CCR6-)、Th2(CXCR3-CCR6-)、Th17(CXCR3-CCR6+)细胞的频率不相关(Morita等人，2011)(图23)。总之，这些结果表明来自SLE患者的表达OX40L的髓样APC促进Tfh细胞的发育和/或活化。
RNP/抗RNP IC通过TLR7激活促进OX40L表达。申请人想知道在活动性SLE患者中髓样APC的OX40L表达中涉及哪种机制。申请人之前证明了SLE血清诱导单核细胞获得DC的特性(Blanco等人，2001)。因此，申请人假设SLE血清可能含有诱导髓样APC表达OX40L的组分。因此，申请人发现SLE血清而不是对照血清在可变水平诱导正常单核细胞上的OX40L表达(图14A)。申请人怀疑涉及含有自身核酸的免疫复合物(IC)的参与，因为APC通过内体核酸传感器的激活在SLE发病机理中起关键作用(Barrat和Coffman，2008)。实际上，用TLR7的激动剂而非TLR9和3的激动剂刺激诱导正常单核细胞表达OX40L(图14B)。为了测试TLR7是否与SLE血清的OX40L上调直接相关，申请人在特异性TLR7抑制剂IRS-661(Barrat等人，2005)或RNA酶的存在下使正常单核细胞暴露于SLE血清。TLR7抑制剂和RNA酶二者显著降低了SLE血清诱导OX40L表达的能力(图14C；图24)，表明含有RNA的IC的主要作用。与该假设一致，申请人观察到SLE血清中抗核糖核蛋白(RNP)抗体而不是抗DNA抗体的存在与促进正常单核细胞上OX40L表达的能力的提高相关(图14D)。
为了验证RNP/抗-RNP IC是否直接参与OX40L表达，用抗-RNP阴性SLE血清培养单核细胞，并将含有RNP/抗-RNP IC的纯化的IgG掺入(spiked into)培养物中。申请人发现，补充RNP/抗-RNP IC使抗-RNP阴性SLE血清能够促进OX40L表达(图14E)。该效应依赖于TLR7，因为TLR7特异性抑制剂的添加消除了OX40L的上调(图14E)。
这些数据显示，RNP/抗-RNP IC通过活动性SLE中髓样APC中的TLR7活化来促进OX40L表达。
自身反应性抗体产生是多种自身免疫性疾病(包括SLE)的标志。该研究提供了髓样APC表达的OX40L通过促进Tfh细胞的产生促成狼疮发病机制的证据。
髓样APC的OX40L的表达在活动性SLE患者的血液以及炎症组织中增加。活动性SLE患者血液中的OX40L+髓样APC主要限于CD14+CD16-和CD14+CD16+单核细胞群。儿童扁桃体中的OX40L+髓样APC也大部分限于CD14+群。在败血症患者(Karulf等人，2010)和慢性丙型肝炎患者(Zhang等，2013)中也报道了血液单核细胞群上的OX40L表达增加。有趣的是，已知两种疾病病症常常与高丙种球蛋白血症相关。这些观察结果表明单核细胞和巨噬细胞在炎症环境中上调OX40L，并且有助于抗体应答。
包含自身核酸的IC在SLE中的致病作用被很好地确立。IC通过TLR9和TLR7激活浆细胞样DC，并诱导它们产生大量的I型干扰素(Lovgren等人，2006)。I型IFN刺激诱导嗜中性粒细胞上调TLR7，并使其能够对RNP/抗-RNP IC应答。然后嗜中性粒细胞产生激活pDC的包含DNA的组分(Garcia-Romo等人，2011；Lande等人，2011)。RNP/抗-RNP IC还靶向CD16+CD14dim单核细胞群，并诱导这些细胞产生损伤内皮的细胞因子，包括TNF-α、IL-1和CCL3(Cros等人，2010)。虽然这些机制激活先天免疫***并引起炎症，但该研究显示，RNP/抗-RNP IC也激活适应性免疫***。本发明人发现，RNP/抗-RNP IC有助于单核细胞/巨噬细胞通过TLR7表达OX40L。通过RNP/抗-RNP IC-OX40L轴增强的Tfh应答进一步加速自身抗体的产生，包括针对自身核酸的那些。因此，RNP/抗-RNP IC-OX40L轴似乎提供了在SLE中产生自身抗体的扩增环。
本发明人显示OX40信号与TCR和CD28信号一起促进初始和记忆Th细胞表达多种Tfh分子，包括CXCR5、IL-21和Bcl-6，同时抑制Blimp-1的表达。本发明人还发现，OX40信号和IL-12信号在诱导人初始Th细胞表达Tfh分子方面几乎同等有效。此外，这两种信号在Th细胞的IL-21表达的上调中共同起作用。值得注意的是，OX40信号比IL-12信号更有效地诱导记忆Th细胞表达Tfh分子，并且足以使它们成为有效的B细胞辅助细胞。这些结果显示OX40信号显示驱动Th向Tfh谱系分化的固有性质。据推测，在SLE中，与炎性组织中表达OX40L的APC的相互作用使记忆T细胞分化成Tfh细胞，从而潜在地原位保持B细胞自身免疫应答。尽管如此，在缺乏ICOS、CD40L(Bossaller等人，2006)、IL-12Rβ1链(Schmitt等人，2013)和STAT3(Ma等人，2012)的受试者中降低的Tfh和GC应答表明OX40信号本身不足以补偿这些信号的缺乏。此外，尽管血液记忆B细胞更少，但是缺乏OX40的受试者在体内显示完整的抗体应答(Byun等，2013)，表明OX40信号对于产生抗体应答可以是非必要的。因此，本发明人推测过量的OX40信号在人体中引起异常Tfh应答和自身免疫。在活动性SLE患者中的ICOS+血液Tfh细胞的频率和OX40L+髓样APC的频率之间的正相关支持这一假设。
早期小鼠研究显示OX40L刺激促进小鼠初始Th细胞表达CXCR5(Flynn等人，1998)，并且它们迁移到B细胞滤泡中(Brocker等人，1999；Fillatreau和Gray，2003)。此外，OX40L转基因小鼠模型(T细胞特异性过表达)显示出以间质性肺炎、结肠炎和高水平的抗核抗体为特征的自身免疫样疾病的发展(Murata等人，2002)。最近的研究显示，Roquin基因在sanroque小鼠中的突变导致OX40在Th细胞上的上调，表明OX40信号对Tfh细胞的产生的积极作用(Pratama等，2013；Vogel等，2013)。另一方面，至少两个研究得出结论，OX40信号的缺乏不影响Th细胞的CXCR5表达、Tfh分化、GC发育或抗体产生(Akiba等人，2005；Kopf等人，1999)。此外，在急性病毒感染模型中(Boettler等人，2013)和李斯特菌感染模型中(Marriott等人，2014)，用激动性OX40 mAb的体内治疗抑制小鼠中的Tfh细胞产生。Boettler等人显示激动性抗-OX40 mAb诱导的特异性Th细胞的Blimp-1表达增强，同时抑制体内Bcl-6的表达(Boettler等人，2013)，这与本发明人在体外用人Th细胞的观察相反。鉴于OX40信号与源自APC、微环境和Th细胞本身的其他因子协作调节Th分化(Croft，2010)，OX40信号可能根据Th细胞与APC相互作用的微环境促进或抑制Tfh细胞分化。另一种可能性是OX40信号对Tfh分子的诱导在人和小鼠Th细胞之间有差异。
本发明人的结论也得到自身免疫性疾病中的GWAS中的发现的支持。已经发现TNFSF4(编码OX40L)多态性赋予SLE(Cunninghame Graham等人，2008；Delgado-Vega等人，2009)和其他自身免疫疾病，如干燥综合征和类风湿性关节炎(Kim等人，2014；Nordmark等人，2011)易感性。TNFSF4风险等位基因也与高加索SLE患者的肾脏障碍有关(Sanchez等，2011)。此外，在TLR7基因座的拷贝数变化和/或多态性已经显示与SLE易感性相关(Shen等人，2010)。该研究提供了一个基本原理，即靶向含RNP的IC-OX40L-OX40轴和TLR7的治疗方式可以影响自身抗体的形成，因此对人SLE是有益的。
实施例3：抗-OX40L在GVHD抑制中的体内功效
没有副作用的同种异体移植存活是移植中的最终目标。在过去数十年中，已经开发了大量免疫抑制剂并且用于经历移植手术的患者。然而，这样的免疫抑制药物不保证接受器官、组织和造血干细胞(HPSC)移植的患者随时间推移避免同种异体反应。因此，患者死于移植物抗宿主病(GVHD)以及由于终生免疫抑制引起的严重副作用。
因此，开发预防GVHD而不降低对微生物病原体的宿主免疫的新的治疗策略是特别重要的。抗OX40L抗体不干扰人嵌合性。
抗OX40L抗体不干扰人嵌合性(图26A-B)。然后测试抗OX40L抗体(克隆19A3，IgG2b)处理是否可导致动物模型中GVHD的抑制。在异种GVHD小鼠模型中，用人DC激活的人T细胞是疾病的主要原因。在人PBMC(一千万个细胞，静脉内)移植前一天，γ-辐照15只NOG小鼠。将动物分成三组(5-6只小鼠/组)，然后每周三次用200μg同种型对照、2μg抗-OX40L(克隆19A3)或200μg抗-OX40L(克隆19A3)处理。图25显示用200μg抗-OX40L处理的所有动物在第112天仍然存活，而用同种型对照处理的所有动物在第42天死亡(或由于不利的健康原因必须被处死)。用2μg抗-OX40L处理的动物的三分之二在第112天死亡，三分之一仍然存活。这些数据表明抗-OX40L可以在体内抑制GVHD。
本文公开并要求保护的所有方法可以依照本发明在不需过度的实验的情况下形成和实施。尽管本发明的组合物和方法已经以优选的实施方案进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不背离本发明的构思、精神和范围的情况下，对本文描述的方法和在所述方法的步骤中或者步骤的顺序中进行变化。更具体地，将显而易见的是，某些化学和生理上均相关的试剂可以代替本文所述的试剂，同时将实现相同或相似的结果。所有这样的对于本领域技术人员而言显而易见的类似替代和修改被视为在由所附权利要求所限定的本发明的精神、范围及构思之内。
参考文献
以下参考文献通过引用特意地并入本文，达到它们提供补充本文所阐述的内容的示例性程序或其它细节的程度。
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序列表
<110> Y-J·刘
S·祖拉夫斯基
吴相坤
S·哈纳布奇
H·藤田
上野英树
P·布兰科
H·郑
<120> 拮抗性抗-OX40L抗体及其使用方法
<130> BHCS.P0408WO
<140> 未知
<141> 2015-08-03
<150> 62/032,959
<151> 2014-08-03
<160> 42
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1420
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 1
atggaatgga gctggatctt tctcttcctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt acactctgag 60
gtccagcttc agcagtctgg gcctgagctg gggcagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120
tgcaaggctt ctggttactc attcactggt tacagcatgc actgggtgaa gcagagccat 180
aggaaaagcc ctgagtggat tggaaaaatt gatccttaca atggtgtgac tacctataat 240
cagaggttca cgggcaaggc cacattgact gtcgacacat cttccagcac agcctacatg 300
catctcaaca gcctgacatc tgaggactct gcaatctttt actgtgcgag agaggggttt 360
gcttattggg gccaagggac tctggtctct gtctctgaag ccaaaacaac acccccatca 420
gtctatccac tggcccctgg gtgtggagat acaactggtt cctccgtgac tctgggatgc 480
ctggtcaagg gctacttccc tgagtcagtg actgtgactt ggaactctgg atccctgtcc 540
agcagtgtgc acacmttccc agctctcctg cagtctggac tctacactat gagcagctca 600
gtgactgtcc cctccagcac ctggccaagt cagaccgtca cctgcagcgt tgctcaccca 660
gccagcagca ccacggtgga caaaaaactt gagcccagcg ggcccatttc aacaatcaac 720
ccctgtcctc catgcaagga gtgtcacaaa tgcccagctc ctaacctcga gggtggacca 780
tccgtcttca tcttccctcc aaatatcaag gatgtactca tgatctccct gacacccaag 840
gtcacgtgtg tggtggtgga tgtgagcgag gatgacccag acgtccagat cagctggttt 900
gtgaacaacg tggaagtaca cacagctcag acacaaaccc atagagagga ttacaacagt 960
actatccggg tggtcagcac cctccccatc cagcaccagg actggatgag tggcaaggag 1020
ttcaaatgca aggtcaacaa caaagacctc ccatcaccca tcgagagaac catctcaaaa 1080
attaaagggc tagtcagagc tccacaagta tacatcttgc cgccaccagc agagcagttg 1140
tccaggaaag atgtcagtct cacttgcctg gtcgtgggct tcaaccctgg agacatcagt 1200
gtggagtgga ccagcaatgg gcatacagag gagaactaca aggacaccgc accagtcctg 1260
gactctgacg gttcttactt catatatagc aagctcaata tgaaaacaag caagtgggag 1320
aaaacagatt ccttctcatg caacgtgaga cacgagggtc tgaaaaatta ctacctgaag 1380
aagaccatct cccggtctcc gggtaaagct agctgaaaaa 1420
<210> 2
<211> 471
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 2
Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Gly Gln
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Thr Gly Tyr Ser Met His Trp Val Lys Gln Ser His Arg Lys Ser Pro
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Lys Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Val Thr Thr Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Arg Phe Thr Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile
100 105 110
Phe Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
115 120 125
Val Ser Val Ser Glu Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser
180 185 190
Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
195 200 205
Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
210 215 220
Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn
225 230 235 240
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu
245 250 255
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val
260 265 270
Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val
290 295 300
Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met
325 330 335
Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser
340 345 350
Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser
385 390 395 400
Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr
405 410 415
Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn
435 440 445
Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser
450 455 460
Arg Ser Pro Gly Lys Ala Ser
465 470
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 3
Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 4
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Gly Gln Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ser His Arg Lys Ser Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Val Thr Thr Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Thr Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val
100 105 110
Ser Glu Ala Lys
115
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 5
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Ser Met His
1 5 10
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 6
Lys Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Val Thr Thr Tyr Asn Gln Arg Phe Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 7
Glu Gly Phe Ala Tyr
1 5
<210> 8
<211> 712
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 8
atgcattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtcc 60
agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag 120
gtcaccataa cctgcagtgc ctcctcaagt gtccgttata ttcactggtt ccagcagaag 180
ccaggcactt ctcccaaact cttgatttat agcacatccg acctggcttc tggagtccct 240
gctcgcttca gtggcggtgg atctgggacc tcttactctc tcacaatcag ccgaatggag 300
gctgaagatg ctgccactta ttactgccag caaaggactg gttacccgct cacgttcggt 360
gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420
ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 480
taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 540
ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 600
acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 660
gcatcaactt cacccatcgt caagagcttc aacaggaatg agtgttagaa aa 712
<210> 9
<211> 235
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 9
Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Val Arg Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg
100 105 110
Thr Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
130 135 140
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
165 170 175
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
195 200 205
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Ala Ser Thr Ser
210 215 220
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 10
Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly
20
<210> 11
<211> 102
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 11
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Gly Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys
100
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 12
Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile His
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 13
Ser Thr Ser Asp Leu Ala Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 14
Gln Gln Arg Thr Gly Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 15
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 15
atgaagtgct cctgggtcat cttcttcctc atggccgtgg tgaccggagt gaactctgag 60
gtgcaactcc agcagtcagg agctgaaatc gtgaagccag gcgcaagtgt gaagctgtcc 120
tgcaccgctt ctgggttcaa catcaaggac acctacatgc actgggtgaa gcagcggcca 180
gagcaggggt tggagtggat tggcagaatt gaccctagga acgacaacac caagtttgac 240
cctaagtttc gcgggaaagc aacactgact gccgatacat ccagcaatac tgcctacctg 300
cagctgagca gccttacatc cgaggatgcc gccgtctact actgtgtgcc cgtccccaca 360
aggagctggt attttgatgt gtggggggcc ggcactagcg tcacagtctc cagcgccaaa 420
acaaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 480
gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc 660
tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 720
ggtcccccat gcccaccctg cccagcacct gagttcgaag ggggaccatc agtcttcctg 780
ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840
gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 900
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg 960
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020
gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080
ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 1140
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260
tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc 1320
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 1380
ctgtctctgg gtaaagctag ctga 1404
<210> 16
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly
1 5 10 15
Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Ile Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
35 40 45
Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Arg Asn Asp Asn Thr Lys Phe Asp
65 70 75 80
Pro Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ala Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Val Pro Val Pro Thr Arg Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp
115 120 125
Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr
225 230 235 240
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro
245 250 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
260 265 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
275 280 285
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
290 295 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
305 310 315 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325 330 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
355 360 365
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
370 375 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
385 390 395 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
405 410 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
420 425 430
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
435 440 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450 455 460
Lys Ala Ser
465
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly
1 5 10 15
Val Asn Ser
<210> 18
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Ile Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Arg Asn Asp Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Val Pro Thr Arg Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys
115 120
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His
1 5 10
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
Arg Ile Asp Pro Arg Asn Asp Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
Val Pro Thr Arg Ser Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 22
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 22
atggagaccc attcccaagt gttcgtctac atgctgctct ggctctccgg agtcgaagga 60
gacatcgtga tgacccagtc tcacaagttc atgtccacca gcgtgggcga tagagtgtct 120
attacctgca aggcctcaca ggacgtgggg aaatccgtcg tgtggtttca gcagaagcct 180
ggccagagtc caaagctttt gatctactgg gcaagcacca ggcacacagg ggtgcccgat 240
cggtttacag gcagcgggag cggcactgat tttactctga caatttccaa cgtccagagc 300
gaggacctgg ctaattattt ctgtcagcag tacactagct acccctacat gtacacattc 360
ggggggggca caaagctcga gatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 420
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct atgcctgcga agtcacccat 660
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtgc tagctga 717
<210> 23
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 23
Met Glu Thr His Ser Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser
1 5 10 15
Gly Val Glu Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser
20 25 30
Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Gly Lys Ser Val Val Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asn Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Thr
100 105 110
Ser Tyr Pro Tyr Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ala Ser
225 230 235
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 24
Met Glu Thr His Ser Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser
1 5 10 15
Gly Val Glu Gly
20
<210> 25
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Lys
20 25 30
Ser Val Val Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Leu Ala Asn Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Thr Ser Tyr Pro
85 90 95
Tyr Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
100 105
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 26
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Lys Ser Val Val
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 27
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 28
Gln Gln Tyr Thr Ser Tyr Pro Tyr Met Tyr Thr
1 5 10
<210> 29
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 29
atggagagac actggatctt gctcctgctg ttgtccgtga ccgctggagt ccatagccag 60
gtccaactgc aacagtccgg agcagaactt gctaggcctg gagcaagcgt caaaatgtcc 120
tgtaaggctt ccggatacac cctcgcaagc tacaccctgc actgggtgaa gcagcgccct 180
gggcaggggc ttgaatggat tggctatatt aatcccaaca gtggctatac caactacatc 240
cagaagttca aggacaaggc caccctcaca gccgacaaga gctcatcaac tgcttacatg 300
cagctgagtt ctctgacatc tgaggacagt gccgtgtact actgcgctaa aggcggcggg 360
gatcggtatt gtacagattg cgccatggat tattggggcc agggcacatc tgtgactgtg 420
tctcccgcca aaacaaaggg cccatccgtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 480
tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 660
aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720
gagtccaaat atggtccccc atgcccaccc tgcccagcac ctgagttcga agggggacca 780
tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 840
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 900
gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 960
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1080
gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1140
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1200
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 1320
gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1380
aagagcctct ccctgtctct gggtaaagct agctga 1416
<210> 30
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 30
Met Glu Arg His Trp Ile Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu
35 40 45
Ala Ser Tyr Thr Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ile
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Gly Asp Arg Tyr Cys Thr Asp Cys Ala
115 120 125
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Pro Ala Lys
130 135 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
145 150 155 160
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165 170 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180 185 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195 200 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr
210 215 220
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
225 230 235 240
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
245 250 255
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
340 345 350
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Gly Lys Ala Ser
465 470
<210> 31
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 31
Met Glu Arg His Trp Ile Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 32
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Ala Ser Tyr
20 25 30
Thr Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ile Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Gly Asp Arg Tyr Cys Thr Asp Cys Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Pro Ala Lys
115 120 125
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 33
Gly Tyr Thr Leu Ala Ser Tyr Thr Leu His
1 5 10
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 34
Tyr Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ile Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 35
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 35
Gly Gly Gly Asp Arg Tyr Cys Thr Asp Cys Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 36
atgcactccc ttgcacttct gttgagcctc ttgctgctgt gcgtgagtga cagcagagct 60
gagaccaccg tgacacagtc tcctgcctct ctgtcaatga ccatcggaga aaaggtgacc 120
atcaggtgca tgactagcat cgacattgac gatgatatga actggtacca gcagaagcca 180
ggggagcctc caaagctgct gatttccgag ggaaagacac tccgccccgg ggtccccagt 240
cggttttcca gctccgggta cggcactgac tttgtcttca ctattgagaa catgctcagc 300
gaggatgtgg ccgattacta ttgtctccaa agcgacaatc tgcccttcac attcggctcc 360
ggcacaaaac tcgagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctatgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gtgctagctg a 711
<210> 37
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 37
Met His Ser Leu Ala Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Cys Val Ser
1 5 10 15
Asp Ser Arg Ala Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Met Thr Ile Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Ile Asp
35 40 45
Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Ser Glu Gly Lys Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Ser Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu
85 90 95
Asn Met Leu Ser Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp
100 105 110
Asn Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ala Ser
225 230 235
<210> 38
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 38
Met His Ser Leu Ala Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Cys Val Ser
1 5 10 15
Asp Ser Arg Ala
20
<210> 39
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 39
Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Thr Ile Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Ile Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Glu Gly Lys Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Met Leu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys
100
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 40
Met Thr Ser Ile Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn
1 5 10
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 41
Glu Gly Lys Thr Leu Arg Pro
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 42
Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Phe Thr
1 5

Claims (46)

1.OX40L抗体在制备用于治疗或预防有其需要的受试者的移植物抗宿主病或移植排斥的组合物中的用途，其包括给予所述受试者治疗有效量的OX40L抗体；其中所述抗体包含：
a）分别如SEQ ID NO: 12-14所示的来自19A3的可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3；和分别如SEQ ID NO: 5-7所示的来自19A3的可变重链的CDR1、CDR2和CDR3；
b）如SEQ ID NO: 2所示的抗体重链和如SEQ ID NO: 9所示的抗体轻链，或其人源化形式；
c）分别如SEQ ID NO: 26-28所示的来自5C6的可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3；和分别如SEQ ID NO: 19-21所示的来自5C6的可变重链的CDR1、CDR2和CDR3；
d）如SEQ ID NO: 16所示的抗体重链和如SEQ ID NO: 23所示的抗体轻链，或其人源化形式；
e）分别如SEQ ID NO: 40-42所示的来自44F3的可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3；和分别如SEQ ID NO: 33-35所示的来自44F3的可变重链的CDR1、CDR2和CDR3；和/或
f）如SEQ ID NO: 30所示的抗体重链和如SEQ ID NO: 37所示的抗体轻链，或其人源化形式。
2.权利要求1所述的用途，其中所述受试者是将接受或已接受移植组织的受试者。
3.权利要求2所述的用途，其中所述受试者患有源自移植组织的并发症，其中所述并发症是移植排斥或GVHD。
4.OX40L抗体在制备用于治疗或预防表达OX40L的受试者的自身免疫疾病和/或与自身免疫疾病相关的炎症的组合物中的用途，其包括给予所述受试者治疗有效量的OX40L抗体；其中所述抗体包含：
a）分别如SEQ ID NO: 12-14所示的来自19A3的可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3；和分别如SEQ ID NO: 5-7所示的来自19A3的可变重链的CDR1、CDR2和CDR3；
b）如SEQ ID NO: 2所示的抗体重链和如SEQ ID NO: 9所示的抗体轻链，或其人源化形式；
c）分别如SEQ ID NO: 26-28所示的来自5C6的可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3；和分别如SEQ ID NO: 19-21所示的来自5C6的可变重链的CDR1、CDR2和CDR3；
d）如SEQ ID NO: 16所示的抗体重链和如SEQ ID NO: 23所示的抗体轻链，或其人源化形式；
e）分别如SEQ ID NO: 40-42所示的来自44F3的可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3；和分别如SEQ ID NO: 33-35所示的来自44F3的可变重链的CDR1、CDR2和CDR3；和/或
f）如SEQ ID NO: 30所示的抗体重链和如SEQ ID NO: 37所示的抗体轻链，或其人源化形式。
5.OX40L抗体在制备用于降低有其需要的受试者的炎性Th2细胞和/或致病性Tfh细胞应答的组合物中的用途，其包括给予所述受试者治疗有效量的OX40L抗体；其中所述抗体包含：
a）分别如SEQ ID NO: 12-14所示的来自19A3的可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3；和分别如SEQ ID NO: 5-7所示的来自19A3的可变重链的CDR1、CDR2和CDR3；
b）如SEQ ID NO: 2所示的抗体重链和如SEQ ID NO: 9所示的抗体轻链，或其人源化形式；
c）分别如SEQ ID NO: 26-28所示的来自5C6的可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3；和分别如SEQ ID NO: 19-21所示的来自5C6的可变重链的CDR1、CDR2和CDR3；
d）如SEQ ID NO: 16所示的抗体重链和如SEQ ID NO: 23所示的抗体轻链，或其人源化形式；
e）分别如SEQ ID NO: 40-42所示的来自44F3的可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3；和分别如SEQ ID NO: 33-35所示的来自44F3的可变重链的CDR1、CDR2和CDR3；和/或
f）如SEQ ID NO: 30所示的抗体重链和如SEQ ID NO: 37所示的抗体轻链，或其人源化形式。
6.权利要求4或5所述的用途，其中所述受试者患有选自以下的自身免疫疾病：过敏性疾病哮喘、特应性皮炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎、炎性肠病、接触性超敏反应、哮喘性气道高反应、自身免疫性糖尿病、动脉粥样硬化、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、溃疡性结肠炎、移植物抗宿主病、移植排斥和多肌炎。
7.权利要求6所述的用途，其中所述自身免疫疾病为***性红斑狼疮。
8.权利要求1、4或5所述的用途，其中所述受试者是人。
9.权利要求1、4或5所述的用途，其中所述抗-OX40L抗体是中和的。
10.权利要求1、4或5所述的用途，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体、重组抗体、嵌合抗体、抗体衍生物、镶嵌抗体、双价抗体或单克隆抗体。
11.权利要求10所述的用途，其中所述抗体是人源化抗体。
12.权利要求1、4或5所述的用途，其中所述抗体包含修饰。
13.权利要求12所述的用途，其中所述修饰是Fc铰链区中的保守氨基酸突变。
14.权利要求12所述的用途，其中所述修饰是聚乙二醇化。
15.权利要求12所述的用途，其中所述修饰是与血清蛋白缀合。
16.权利要求12所述的用途，其中所述修饰是与人血清白蛋白缀合。
17.权利要求12所述的用途，其中所述修饰是与可检测标记缀合。
18.权利要求12所述的用途，其中所述修饰是与诊断试剂缀合。
19.权利要求12所述的用途，其中所述修饰是与酶缀合。
20.权利要求12所述的用途，其中所述修饰是与发光材料缀合。
21.权利要求20所述的用途，其中所述修饰是与荧光或生物发光材料缀合。
22.权利要求12所述的用途，其中所述修饰是与放射性材料缀合。
23.权利要求12所述的用途，其中所述修饰是与治疗剂缀合。
24.一种药物组合物，其包含分离的抗-OX40L抗体，所述抗体包含：
a）分别如SEQ ID NO: 12-14所示的来自19A3的可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3；和分别如SEQ ID NO: 5-7所示的来自19A3的可变重链的CDR1、CDR2和CDR3；
b）如SEQ ID NO: 2所示的抗体重链和如SEQ ID NO: 9所示的抗体轻链，或其人源化形式；
c）分别如SEQ ID NO: 26-28所示的来自5C6的可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3；和分别如SEQ ID NO: 19-21所示的来自5C6的可变重链的CDR1、CDR2和CDR3；
d）如SEQ ID NO: 16所示的抗体重链和如SEQ ID NO: 23所示的抗体轻链，或其人源化形式；
e）分别如SEQ ID NO: 40-42所示的来自44F3的可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3；和分别如SEQ ID NO: 33-35所示的来自44F3的可变重链的CDR1、CDR2和CDR3；和/或
f）如SEQ ID NO: 30所示的抗体重链和如SEQ ID NO: 37所示的抗体轻链，或其人源化形式。
25.权利要求24所述的药物组合物，其中所述抗-OX40L抗体是中和的。
26.权利要求24或25所述的药物组合物，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体、重组抗体、嵌合抗体、抗体衍生物、镶嵌抗体、双价抗体或单克隆抗体。
27.权利要求26所述的药物组合物，其中所述抗体是人源化抗体。
28.权利要求24所述的药物组合物，其中所述抗体包含修饰。
29.权利要求28所述的药物组合物，其中所述修饰是Fc铰链区中的保守氨基酸突变。
30.权利要求28所述的药物组合物，其中所述修饰是聚乙二醇化。
31.权利要求28所述的药物组合物，其中所述修饰是与血清蛋白缀合。
32.权利要求28所述的药物组合物，其中所述修饰是与人血清白蛋白缀合。
33.权利要求28所述的药物组合物，其中所述修饰是与可检测标记缀合。
34.权利要求28所述的药物组合物，其中所述修饰是与诊断试剂缀合。
35.权利要求28所述的药物组合物，其中所述修饰是与酶缀合。
36.权利要求28所述的药物组合物，其中所述修饰是与发光材料缀合。
37.权利要求36所述的药物组合物，其中所述修饰是与荧光或生物发光材料缀合。
38.权利要求28所述的药物组合物，其中所述修饰是与放射性材料缀合。
39.权利要求28所述的药物组合物，其中所述修饰是与治疗剂缀合。
40.权利要求24所述的药物组合物，其还包含载体。
41.一种药物组合物，其包含分离的人源化IgG抗-OX40L抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化IgG抗-OX40L抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO: 5所示的CDR1氨基酸序列、如SEQ ID NO: 6所示的CDR2氨基酸序列和如SEQ ID NO: 7所示的CDR3氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO: 12所示的CDR1氨基酸序列、如SEQ ID NO: 13所示的CDR2氨基酸序列和如SEQ ID NO: 14所示的CDR3氨基酸序列。
42.一种药物组合物，其包含分离的人源化IgG抗-OX40L抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化IgG抗-OX40L抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO: 19所示的CDR1氨基酸序列、如SEQ ID NO: 20所示的CDR2氨基酸序列和如SEQ ID NO: 21所示的CDR3氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO: 26所示的CDR1氨基酸序列、如SEQ ID NO: 27所示的CDR2氨基酸序列和如SEQ ID NO: 28所示的CDR3氨基酸序列。
43.一种药物组合物，其包含分离的人源化IgG抗-OX40L抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化IgG抗-OX40L抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO: 33所示的CDR1氨基酸序列、如SEQ ID NO: 34所示的CDR2氨基酸序列和如SEQ ID NO: 35所示的CDR3氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO: 40所示的CDR1氨基酸序列、如SEQ ID NO: 41所示的CDR2氨基酸序列和如SEQ ID NO: 42所示的CDR3氨基酸序列。
44.一种分离的多核苷酸，其包含编码抗-OX40L抗体或其抗原结合片段的多肽链的核酸序列，所述抗-OX40L抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中：
所述重链可变结构域包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 5-7；所述轻链可变结构域包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 12-14；
所述重链可变结构域包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 19-21；所述轻链可变结构域包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 26-28；或者
所述重链可变结构域包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 33-35；所述轻链可变结构域包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 40-42。
45.一种表达载体，其包含权利要求44所述的多核苷酸。
46.一种宿主细胞，其包含可操作地连接到调节序列的权利要求44所述的多核苷酸。
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