CN107064105A - 一种同时检测水产品中日落黄和孔雀石绿的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测水产品中日落黄和孔雀石绿的方法。该方法包括以下步骤：(1)通过水热法制备还原石墨烯(RGO)纳米材料；(2)通过晶种生长法合成金纳米棒(GNRs)；(3)采用电化学富集法在丝网印刷电极上分别吸附溶液中的RGO、GNRs、SY、MG；(4)检测丝网印刷电极表面物质的拉曼光谱信号，从而对水产品中SY、MG进行定性和定量分析检测。本发明采用电化学富集‑SERS检测技术不仅具有分析快速、灵敏度高、样品用量少、应用范围广、操作简便和携带方便等特点，最重要的是，本发明具有优良的选择性，而且不需要标记和分离纯化，可同时对水产品中日落黄和孔雀石绿进行分析检测，且检测限低。

Description

一种同时检测水产品中日落黄和孔雀石绿的方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体地说，涉及一种同时检测水产品中日落黄和孔雀石绿的方法。
背景技术
日落黄(SY)主要用于食品和药物的着色，但用量受到严格的限制。人如果长期或一次性大量食用日落黄等色素含量超标的食品，可能会引起过敏、腹泻等症状，当摄入量过大，超过肝脏负荷时，会在体内蓄积，对肾脏、肝脏产生一定伤害。孔雀石绿(MG)是一种有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀真菌、杀细菌、杀寄生虫的药物，因此可作为鱼类等的杀菌剂，但长期超量使用可致癌、致畸和致突变。我国在农业行业标准《NY5071-2002无公害食品鱼药使用准则》中也将孔雀石绿列为禁用药物。因此，亟待建立针对水产品中SY和MG的现场快速检测方法。
表面增强拉曼散射(SERS)是指当一些分子被吸附到某些粗糙金属(Au、Ag、Cu等)表面时，它们的拉曼散射强度会增加104～106倍。由于SERS技术快速灵敏的特点，广泛用于食品安全、生物检测等方面。金纳米棒修饰还原石墨烯可作为表面增强拉曼基底材料。近年来，中国专利(公开号CN 104977286 A)采用金纳米粒子作为SERS基底对MG进行分析检测，但是实现SY和MG的同时分析检测却鲜有报道。石墨烯是一种新型的二维碳纳米材料，其碳原子之间的杂化方式为sp2杂化。由于石墨烯具有较高的表面积和较强的导电性，因此在电学、光学、生物传感方面具有广阔的应用前景。
水溶液中还原石墨烯(RGO)、日落黄(SY)带负电荷，金纳米棒(GNRs)、孔雀石绿(MG)带正电荷，因此，可采用电化学原位富集的方法，选择性的吸附SY、MG，从而实现水产品中SY和MG的现场快速检测。电化学富集-SERS技术同时具有分析速度快、检测灵敏度高和选择性好等特点，该技术有望进一步应用于环境和食品分析检测领域。
发明内容
为了解决上述现有技术方案中的不足，本发明提供了一种同时检测水产品中日落黄和孔雀石绿的方法。本发明方法能高选择性、快速、灵敏地分析水产品中的日落黄和孔雀石绿。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
一种同时检测水产品中日落黄和孔雀石绿的方法，具体步骤如下：
(1)采用循环伏安法，使用三电极体系，以PBS溶液为缓冲溶液，分别获得还原石墨烯RGO、金纳米棒GNRs、日落黄SY和孔雀石绿MG的氧化还原电位；再根据氧化还原电位，选择合适的SY的富集电位和MG的富集电位，使得上述四种物质在分别富集时不被氧化还原；
(2)利用电化学工作站，采用i-t法，将丝网印刷电极置于水产品提取液中，采用电化学富集法施加富集电位，富集0.5～10min，使得金纳米棒GNRs和孔雀石绿MG充分吸附到电极表面，还原石墨烯RGO和日落黄SY吸附到电极表面；
(3)采用便携式拉曼光谱仪对电极表面进行拉曼信号的检测，获得电极表面样品的SERS图谱；再将其与日落黄SY、孔雀石绿MG固体的SERS图谱对照，进而实现水产品中日落黄SY和孔雀石绿MG定性和定量检测。
本发明中，步骤(1)中，还原石墨烯RGO通过水热法制备；金纳米棒GNRs通过晶种生长法合成。
本发明中，步骤(1)中，日落黄SY的富集电位为0.01～0.25V；孔雀石绿MG的富集电位为-0.25～-0.01V。
本发明中，步骤(3)中，激发波长为785nm，积分时间为1～60s。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、通过电化学富集法和SERS技术联用，可同时实现样品中的日落黄和孔雀石绿的选择性富集和检测，该法不仅可消除其他物质的干扰，而且可提高日落黄和孔雀石绿的检测灵敏度；
2、通过电化学富集法在丝网印刷电极表面吸附溶液中的日落黄和孔雀石绿分子，可极大提升分析检测的灵敏度，该法具有操作简便、应用范围广泛、快速高效和便于携带等特点，而且样品用量少，满足了痕量检测的需求；
3、通过电化学工作站和便携式拉曼光谱仪联用，可实现对产品中日落黄和孔雀石绿的现场快速定性和定量检测，根据日落黄和孔雀石绿的浓度与拉曼信号强度之间的线性关系，检测限(DL)根据3倍测定空白标准偏差(δ)与线性曲线斜率(k)的比值计算得到，即DL＝3δ/k，可得到日落黄和孔雀石绿的检测限分别为5×10-7mol/L和5×10-9mol/L；根据线性曲线列出定量检测最大浓度为5×10-3mol/L，此即为检测上限。
附图说明
图1是本发明实施例的检测方法的流程图。
图2是本发明实施例中日落黄、孔雀石绿固体的SERS图谱。
图3是本发明实施例中电化学富集日落黄前后的SERS图谱。
图4是本发明实施例中电化学富集不同浓度日落黄的SERS图谱，图中所示标记(五角星)为日落黄的图谱特征峰。
图5是日落黄的标准品浓度与特征峰强度(1592±2cm-1)线性关系示意图。
图6是本发明实施例中电化学富集孔雀石绿前后的SERS图谱。
图7是本发明实施例中电化学富集不同浓度孔雀石绿的SERS图谱，图中所示标记(五角星)为孔雀石绿的图谱特征峰。
图8是孔雀石绿的标准品浓度与特征峰强度(1172±2cm-1)线性关系示意图。
具体实施方式
实施例1：电化学富集-表面增强拉曼技术检测日落黄和孔雀石绿
(1)制备还原氧化石墨烯
利用改进的Hummers法制备氧化石墨烯，定容获得0.5mg/mL氧化石墨烯絮凝，取5mL氧化石墨烯于蒸馏烧瓶中，加入5μL水合肼(35％)作为还原剂，再加100μL氨水(28％)，充分搅拌，并在95℃下回流1h。静置室温，10000rpm的速度离心20min，取下层液定容得到0.5mg/mL的还原氧化石墨烯溶液。
(2)由晶种法制备金纳米棒
a.制备金纳米种子溶液：室温条件下(25-28℃)，配制9.75ml 0.1mol/L十六烷基三甲基溴化铵水溶液，均匀搅拌至透明，滴加0.25ml 0.01mol/L氯金酸水溶液，待其在溶液中均匀分散后，快速加入0.6mL新鲜配制的0.01mol/L硼氢化钠溶液(冰水浴)，溶液由浅黄色变成棕黄色，均匀搅拌3min，室温静置2h后备用。
b.制备和纯化金纳米棒溶液：室温条件下，配制10ml 0.1mol/L的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，再加入0.5mL 0.01mol/L氯金酸水溶液，混合均匀后再加入0.1mL 0.01mol/L硝酸银，0.2mL 1mol/L盐酸，充分搅拌，加入80μL 0.1mol/L抗坏血酸，溶液由深黄色变为无色，加入12μL已制备好的金种子溶液，均匀搅拌3分钟，室温静置6h。制备好的金纳米棒通过8000rpm离心5min，洗涤三次，除去多余的十六烷基三甲基溴化铵。所得金纳米棒浓度为1.8nM。
(3)确定四种物质的氧化还原电位
利用电化学工作站，所用电极为丝网印刷电极，工作电极和辅助电极为碳电极，对电极为银-氯化银电极，采用循环伏安法(CV)，具体步骤如下：
a.石墨烯的氧化还原电位：把氧化石墨烯滴在丝网印刷电极的工作电极上，自然晾干；以5mL 0.1mol/L的PBS溶液(含0.1mol/L氯化钾)为电解液，扫描电压为0.4～-1.2V，扫描速率为50mv/s，得到石墨烯的氧化还原电位。
b.金的氧化还原电位：把金涂在丝网印刷电极的工作电极表面，自然晾干；以5mL0.1mol/L的PBS溶液(含0.1mol/L氯化钾)为电解液，扫描电压为-0.1～1.2V，扫描速率为50mv/s，得到金的氧化还原电位。
c.日落黄的氧化还原电位：5mL 1×10-4mol/L的日落黄和PBS混合溶液为电解液，扫描电压为-1～0.2V，扫描速率为50mv/s，得到日落黄的氧化还原电位。
d.孔雀石绿的氧化还原电位：5mL 1×10-4mol/L的孔雀石绿和PBS混合溶液为电解液，扫描电压为0.05～0.9V，扫描速率为50mV/s，得到孔雀石绿的氧化还原电位。
根据以上四种物质的氧化还原电位，选择日落黄的最佳富集电位为0.2V：孔雀石绿的最佳富集电位为-0.2V。
(4)电化学方法富集-SERS检测日落黄
利用电化学工作站，采用i-t法，将丝网印刷电极置于反应液中，该反应液含有3mL5×10-4M日落黄溶液(pH＝3～4)、50μL还原氧化石墨烯(0.5mg/mL)、100μL氯化钠溶液(0.1mol/L)，控制富集电位为0.2V，富集时间为5min。
对上述富集后的丝网印刷电极，采用便携式拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，激发波长为785nm，积分时间为10s，获得样品的SERS图谱，与SY、MG固体的拉曼图谱对照(图2)，从而实现日落黄的检测。如图3所示，电化学富集前后日落黄的信号明显增强。
配制不同浓度的日落黄标准溶液，采用电化学富集-SERS检测其光谱信号，采用拉曼光谱峰1393±2cm-1、1592±2cm-1作为判定日落黄的特征峰。随着待测溶液中日落黄的浓度逐渐加大(5.0×10-7mol/L～5.0×10-3mol/L)，拉曼光谱图中1393±2cm-1、1592±2cm-1两处的特征峰强度随之逐渐增大(图4)，选择以1592±2cm-1对应峰强度结合线性曲线(图5)可对日落黄的含量进行计算。
(5)电化学方法富集-SERS检测孔雀石绿
利用电化学工作站，采用i-t法，将丝网印刷电极置于反应液中，该反应液含有3mL5×10-5M孔雀石绿溶液、100μL金纳米棒(1.8nmol/L)、100μL氯化钠溶液(0.1mol/L)，控制富集电位为-0.2V，富集时间为5min。
对上述富集后的丝网印刷电极，采用便携式拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，激发波长为785nm，积分时间为10s，获得样品的SERS图谱，与MG固体的拉曼图谱对照(图2)，从而实现孔雀石绿的检测。如图6所示，电化学富集前后孔雀石绿的信号明显增强。
配制不同浓度的孔雀石绿标准溶液，采用电化学富集-SERS检测其光谱信号，采用拉曼光谱峰1172±2cm-1、1618±2cm-1作为判定孔雀石绿的特征峰。随着待测溶液中孔雀石绿的浓度逐渐加大(5.0×10-9mol/L～5.0×10-3mol/L)，拉曼光谱图中1172±2cm-1、1618±2cm-1两处的特征峰强度随之逐渐增大(图7)，选择以1172±2cm-1对应峰强度结合线性曲线(图8)可对孔雀石绿的含量进行计算。
实施例2：检测水产品中的日落黄和孔雀石绿
图1示意性地给出了本发明实施例的水产品中日落黄和孔雀石绿的流程图，所述检测方法包括以下步骤：
(1)鱼肉样品的预处理
鱼肉中孔雀石绿及其代谢物的提取和净化的具体步骤如下：称取2.00±0.02g鱼肉于50m L离心管中，加入500μL 9.5g/L的盐酸羟胺溶液避光放置10min，然后涡旋振荡使肉分散均匀。加入10m L乙腈和1.0±0.1g无水硫酸镁后大力涡旋1min，再加入4.0±0.1g中性氧化铝后放入摇床中在250rpm条件下振荡10min。之后样品3220rpm离心5min，用移液枪移取上层清液至15m L离心管中。将收集到的提取液在50℃的水浴下用氮气流吹干，然后用1.0mL 0.003mol/L的2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌溶液(溶剂为乙腈)溶解残留物，轻微振荡10min后，转移到装有0.5g中性氧化铝的1.5mL离心管中，涡旋混合30～60s(视不同鱼而定，使颜色接近无色。最后，转速为20000rpm离心5min，用0.45μm的有机相滤膜过滤上清液。
(2)制备还原石墨烯，步骤同实施例1
(3)制备和纯化金纳米棒，步骤同实施例1
(4)电化学富集-SERS技术检测鱼肉样品提取液中日落黄和孔雀石绿
利用电化学工作站，采用i-t法，将丝网印刷电极置于上述鱼肉样品的提取液中，该反应液含有50μL还原石墨烯(0.5mg/mL)、100μL金纳米棒(1.8nmol/L)、100μL氯化钠(0.1mol/L)溶液，控制富集电位为-0.2V，富集时间为5min，然后控制富集电位0.2V，富集时间为5min。
对上述富集后的丝网印刷电极，采用便携式拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，激发波长为785nm，积分时间为10s，获得鱼肉样品提取液的SERS图谱，与SY、MG的标准曲线对照，从而获得鱼肉样品中SY和MG的含量，检测结果如表1所示，检测结果与高效液相色谱法比较，两者之间结果偏差小于10％，结果表明本法的检测准确度较好，可替代高效液相色谱法应用于孔雀石绿和日落黄的现场分析检测。
表1
实施例中，根据日落黄和孔雀石绿的浓度与拉曼信号强度之间的线性关系，根据3倍测定空白标准偏差(δ)与线性曲线斜率(k)的比值计算得到检测限(DL)，即DL＝3δ/k，可得到日落黄和孔雀石绿的检测限分别为5×10-7mol/L和5×10-9mol/L；根据线性曲线列出定量检测最大浓度为5×10-3mol/L，此即为检测上限。
本发明方法提供了一种可用于水产品中日落黄和孔雀石绿同时分析检测的方法，该法具有仪器简单、操作简便、测定快速和分析准确度高等特点，有望作为一种便携式分析技术应用于食品的现场快速检测。

Claims (5)

1.一种同时检测水产品中日落黄和孔雀石绿的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)采用循环伏安法，使用三电极体系，以磷酸盐PBS溶液为缓冲溶液，分别获得还原石墨烯RGO、金纳米棒GNRs、日落黄SY和孔雀石绿MG的氧化还原电位；再根据氧化还原电位，选择合适的日落黄SY的富集电位和孔雀石绿MG的富集电位，使得上述四种物质在丝网印刷电极表面富集时不被氧化还原；
(2)利用电化学工作站，采用i-t法，将丝网印刷电极置于水产品提取液中，采用电化学富集法施加正电位，使得金纳米棒GNRs和孔雀石绿MG吸附到丝网印刷电极表面；再施加负电位，使得还原石墨烯RGO和日落黄SY吸附到丝网印刷电极表面；
(3)采用便携式拉曼光谱仪对电极表面吸附物质进行拉曼光谱的检测，获得电极表面物质的表面增强拉曼光谱SERS图谱；再将其与日落黄SY、孔雀石绿MG固体的拉曼图谱对照，进而实现水产品中日落黄SY和孔雀石绿MG的定性和定量检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，还原石墨烯RGO通过水热法制备；金纳米棒GNRs通过晶种生长法合成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，日落黄SY的富集电位为0.01～0.25V；孔雀石绿MG的富集电位为-0.01～-0.25V。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，激发波长为785nm，积分时间为60s。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，以1592±2cm-1对应的峰强度结合线性曲线对样品中日落黄的含量进行定量计算；以1172±2cm-1对应的峰强度结合线性曲线对样品中孔雀石绿的含量进行计算。
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