CN107058593A - 一种亚型Ph‑likeALL的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种亚型Ph‑likeALL的检测方法，包括下列步骤：1）分别配制乙醇溶液、预处理液、洗液和酶缓冲液；2）荧光探针溶解；3）将骨髓细胞固化，制成涂片；4）将探针溶液预温到室温，离心，滴加到杂交区域，密封；5）变性杂交；6）除去封片胶，置于考普林缸内洗去盖玻片，取出涂片，用洗液、乙醇溶液漂洗，避光风干；7）复染；8）扫描，确定样本是否有异质性。本检测方法具有简单、快速、成本低、灵敏度高、特异性强、检测全面等优点，能够简单快速全面地检测Ph‑likeALL。

Description

一种亚型Ph-likeALL的检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种亚型Ph-likeALL的检测方法。
背景技术
急性淋巴细胞白血病（简称ALL）是儿童最常见的肿瘤，发病率随年龄的增长而降低，目前重现性染色体改变是ALL的重要标志，包括染色体重组、结构改变等。多年来，临床通过结合上述染色体变异特征，对ALL进行危险分层治疗，使得ALL的治疗效果得到了很大得改善，其中儿童ALL 的5年生存率提高到了85%，然而仍有部分患者治疗预后差，ALL的复发难治性使得该病依然是儿童及成人主要的致死疾病之一。
Ph-likeALL，是根据基因表达谱鉴定的一组疾病，其基因表达谱与BCR-ABL1阳性ALL相似，但不表达BCR-ABL1，所以称之为BCR-ABL1-like ALL，又称为Ph-likeALL。此类ALL主要见于急性前体B细胞淋巴细胞白血病（BCP- ALL），一般缺少BCP-ALL中典型的基因及染色体变异（ETV6-RUNX1、E2A-PBX1、ERG和MLL重排、超二倍体等）且经常会伴有高风险临床特征。研究发现，Ph-likeALL约占SR（标危）和HR（高危）儿童B-ALL的15%，在青年ALL中约为27.4%。与BCR-ABL1阳性ALL相似，Ph-likeALL患者预后差，常规化疗效果不佳，易复发。细胞株和人类白血病细胞表达的ABL1， ABL2， CSF1R和PDGFRB融合基因在体外对达沙替尼（dasatinib）敏感，EPOR 和JAK2对磷酸鲁索替尼（ruxolitinib）敏感，ETV6–NTRK3融合基因对克唑替尼（crizotinib）敏感。上述药物仅针对个别异常的融合基因起到抑制作用，使用有一定的局限性；在检测或者细胞过程时，需要多种药物多次检测，操作繁琐。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上现有技术的缺陷，提供一种亚型Ph-likeALL的检测方法，能够简单快速全面地检测Ph-likeALL。
本发明的技术方案是：一种亚型Ph-likeALL的检测方法，包括下列步骤：
1）分别配制乙醇溶液、预处理液、洗液和酶缓冲液，置2℃-8℃氮气条件储存；
2）荧光探针溶解：向探针管内加10~20μl水，加入150~200μl杂交液，超声溶解30~60s，得到探针溶液；
3）将骨髓细胞固化，涂抹于玻片上，经过预处理，制成涂片；所述固化为肝素化处理或经EDTA-醋酸钠处理；
4）将探针溶液预温到室温，漩涡混匀，离心2~3s，取5~15μl混匀的探针溶液滴加到杂交区域，盖上盖玻片，用封片胶密封；
5）设置程序：先70~80℃变性5~10分钟，然后 35~40℃杂交16~18h；
6）除去封片胶，置于考普林缸内的室温洗液中1~5min洗去盖玻片，取出涂片，用已预热至72~74℃的洗液漂洗1~3min，再用室温65~75%乙醇溶液漂洗1~3min，避光自然风干；
7）滴加复染液到杂交区域，盖上盖玻片，置-25~ -15℃暗处复染20分钟以上；所述复染液由以下重量份数的组分组成：革兰氏染色液5~7份，氯化镁1~3份，柠檬酸0.2~0.6份，荧光素0.5~0.7份，海藻酸钠0.1~0.3份；
8）使用物镜对样本进行扫描，确定样本是否有异质性。
具体的，所述乙醇溶液的体积分数为70~ 85%；所述预处理液为0.9~1.1mol/L的硫氰酸钠溶液；所述洗液由以下重量百分数的组分组成：氯化钠1.7~1.8%，柠檬酸钠0.8~1%，乙基苯基聚乙二醇0.2~0.4%，余量为水；所述酶缓冲液为0.009~0.011mol/L的稀盐酸。
优选地，所述荧光探针共12组，分别为ABL1，ABL2，CSF1R，PDGFRB， CRLF2，JAK2，EPOR，IL2RB，NTRK3，PTK2B，TSLP和 TYK2。
绝大部分Ph-likeALL患者有染色体重排或其他的遗传改变，可激活细胞因子受体或激酶信号。重排基因包括ABL1， ABL2， CRLF2，CSF1R， EPOR， JAK2， NTRK3，PDGFRB，PTK2B， IL2RB，TSLP或TYK2。ABL1，ABL2，CSF1R，JAK2表达和 PDGFRB融合基因导致细胞因子独立性扩增和磷酸化STAT5激活。将上述重排基因进行标记得到荧光探针，与复染液制成试剂盒。
复染液在变性杂交后添加，其效果在复染及观察过程中体现。复染液采用革兰氏染色液为主要成分，荧光素增加荧光效果，添加氯化镁可增加荧光探针的标记显色效果；海藻酸钠有助于细胞均匀地分散和复染，柠檬酸则加快异常细胞的融合过程，细胞均匀分散复染的过程中，异常细胞相互间快速地融合。总之各组分相互有效地配合可以准确快速的观察样本是否有异性。荧光探针囊括了目前已知的所有针对性用药的Ph-likeALL类型，经探针溶液与样本变性杂交后，滴加复染液，能够全面准确地检测Ph-likeALL。
优选地，所述步骤2）荧光探针溶解还包括下列步骤：用移液枪冲洗探针管底部和管壁，振荡混匀20~40s，离心20~40s， 放35~40℃水浴保温溶解5~15分钟；重复上述过程2~3次，将配制好的探针溶液备用或分装冰冻避光保存。
优选地，所述步骤6）考普林缸还用于盛放预处理液、洗液和酶缓冲液，将所述洗液预热至72~74℃，将所述预处理液预热至75~85℃，将所述酶缓冲液预热至36~38℃。
优选地，所述洗液室温下的PH值为7.0±0.2；所述酶缓冲液为0.01mol/L的稀盐酸，室温下的PH值为2.0±0.2。
具体地，所述步骤3）预处理包括如下步骤：a）将涂片60~70℃预热5~10min，用浸蜡脱蜡透明液脱蜡2次每次10~20min，用无水乙醇脱水2次每次3~5min；b）依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度复水，各0.5~2min，吸去残余溶液；c）放在已经预热到75~85℃的预处理液中保温20~40min，取出在纯化水中浸泡1~2min，吸去残余溶液；d）取40~60mg胃蛋白酶干粉溶解在已预热至36~38℃的酶缓冲液中，浸入消化20~30min；e）在纯化水中浸泡1~2min，依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度脱水，各0.5~2min，干燥备用。
优选地，所述步骤a）浸蜡脱蜡透明液为异构烷烃型
优选地，所述步骤c）中所述预处理液为0.9~1.1mol/L的硫氰酸钠溶液。
优选地，所述酶缓冲液为0.01mol/L的稀盐酸，室温下的PH值为2.0±0.2。
优选地，所述扫描的结果中有异质性的特征为有融合细胞。
本发明的有益效果是：
1)本检测方法具有简单、快速、成本低、灵敏度高、特异性强、检测全面等优点，能够简单快速全面地检测Ph-likeALL；
2)荧光探针囊括了目前已知的所有针对性用药的Ph-likeALL类型，全面的检测可以为临床指导用药提供有利依据；
3)荧光探针具有很强的特异性，只结合特定位点的染色体，特异性强；
4)采用荧光原位杂交技术，荧光信号在显微镜下一目了然，灵敏度很高；
5)获得骨髓细胞后可迅速处理成涂片，一般可在2-5天内出结果。
附图说明
图1为FISH正常细胞示意图，1、橙色，2、绿色。
图2为FISH异常细胞，1、橙色，2、绿色，3、融合。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
以下所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进，亦落入本发明要求的保护范围之内。
实施例一
一种亚型Ph-likeALL的检测方法，包括下列步骤：
1）分别配制乙醇溶液、预处理液、洗液和酶缓冲液，置2℃-8℃氮气条件储存；所述乙醇溶液的体积分数为70~ 85%；所述预处理液为0.9~1.1mol/L的硫氰酸钠溶液；所述洗液由以下重量百分数的组分组成：氯化钠1.7~1.8%，柠檬酸钠0.8~1%，乙基苯基聚乙二醇0.2~0.4%，余量为水；所述酶缓冲液为0.009~0.011mol/L的稀盐酸；
2）荧光探针溶解：向探针管内加10~20μl水，加入150~200μl杂交液，超声溶解30~60s，得到探针溶液；所述荧光探针共12组，分别为ABL1，ABL2，CSF1R，PDGFRB， CRLF2，JAK2，EPOR，IL2RB，NTRK3，PTK2B，TSLP和 TYK2；
3）将骨髓细胞固化，涂抹于玻片上，经过预处理，制成涂片；所述固化为肝素化处理或经EDTA-醋酸钠处理；
4）将探针溶液预温到室温，漩涡混匀，离心2~3s，取5~15μl混匀的探针溶液滴加到杂交区域，盖上盖玻片，用封片胶密封；
5）设置程序：先70~80℃变性5~10分钟，然后 35~40℃杂交16~18h；
6）除去封片胶，置于考普林缸内的室温洗液中1~5min洗去盖玻片，取出涂片，用已预热至72~74℃的洗液漂洗1~3min，再用室温65~75%乙醇溶液漂洗1~3min，避光自然风干；
7）滴加复染液到杂交区域，盖上盖玻片，置-25~ -15℃暗处复染20分钟以上；所述复染液由以下重量份数的组分组成：革兰氏染色液5~7份，氯化镁1~3份，柠檬酸0.2~0.6份，荧光素0.5~0.7份，海藻酸钠0.1~0.3份；
8）使用物镜对样本进行扫描，确定样本是否有异质性。
所述步骤2）荧光探针溶解还包括下列步骤：用移液枪冲洗探针管底部和管壁，振荡混匀20~40s，离心20~40s， 放35~40℃水浴保温溶解5~15分钟；重复上述过程2~3次，将配制好的探针溶液备用或分装冰冻避光保存。
所述步骤6）考普林缸还用于盛放预处理液、洗液和酶缓冲液，将所述洗液预热至72~74℃，将所述预处理液预热至75~85℃，将所述酶缓冲液预热至36~38℃。
所述洗液室温下的PH值为7.0±0.2；所述酶缓冲液为0.01mol/L的稀盐酸，室温下的PH值为2.0±0.2。
所述步骤3）预处理包括如下步骤：a）将涂片60~70℃预热5~10min，用浸蜡脱蜡透明液脱蜡2次每次10~20min，用无水乙醇脱水2次每次3~5min；所述浸蜡脱蜡透明液为异构烷烃型；b）依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度复水，各0.5~2min，吸去残余溶液；c）放在已经预热到75~85℃的预处理液中保温20~40min，取出在纯化水中浸泡1~2min，吸去残余溶液；d）取40~60mg胃蛋白酶干粉溶解在已预热至36~38℃的酶缓冲液中，浸入消化20~30min；e）在纯化水中浸泡1~2min，依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度脱水，各0.5~2min，干燥备用。
所述步骤c）中所述预处理液为0.9~1.1mol/L的硫氰酸钠溶液。
所述酶缓冲液为0.01mol/L的稀盐酸，室温下的PH值为2.0±0.2。
所述扫描的结果中有异质性的特征为有融合细胞。
实施例二
一种亚型Ph-likeALL的检测方法，包括下列步骤：
1）分别配制乙醇溶液、预处理液、洗液和酶缓冲液，置2℃-8℃氮气条件储存；所述乙醇溶液的体积分数为70~ 85%；所述预处理液为0.9~1.1mol/L的硫氰酸钠溶液；所述洗液由以下重量百分数的组分组成：氯化钠1.7~1.8%，柠檬酸钠0.8~1%，乙基苯基聚乙二醇0.2~0.4%，余量为水；所述酶缓冲液为0.009~0.011mol/L的稀盐酸；
2）荧光探针溶解：向探针管内加10~20μl水，加入150~200μl杂交液，超声溶解30~60s，得到探针溶液；所述荧光探针共12组，分别为ABL1，ABL2，CSF1R，PDGFRB， CRLF2，JAK2，EPOR，IL2RB，NTRK3，PTK2B，TSLP和 TYK2；
3）将骨髓细胞固化，涂抹于玻片上，经过预处理，制成涂片；所述固化为肝素化处理或经EDTA-醋酸钠处理；
4）将探针溶液预温到室温，漩涡混匀，离心2~3s，取5~15μl混匀的探针溶液滴加到杂交区域，盖上盖玻片，用封片胶密封；
5）设置程序：先70~80℃变性5~10分钟，然后 35~40℃杂交16~18h；
6）除去封片胶，置于考普林缸内的室温洗液中1~5min洗去盖玻片，取出涂片，用已预热至72~74℃的洗液漂洗1~3min，再用室温65~75%乙醇溶液漂洗1~3min，避光自然风干；
7）滴加复染液到杂交区域，盖上盖玻片，置-25~ -15℃暗处复染20分钟以上；所述复染液由以下重量份数的组分组成：革兰氏染色液5~7份，氯化镁1~3份，柠檬酸0.2~0.6份，荧光素0.5~0.7份，海藻酸钠0.1~0.3份；
8）使用物镜对样本进行扫描，确定样本是否有异质性。
所述步骤2）荧光探针溶解还包括下列步骤：用移液枪冲洗探针管底部和管壁，振荡混匀20~40s，离心20~40s， 放35~40℃水浴保温溶解5~15分钟；重复上述过程2~3次，将配制好的探针溶液备用或分装冰冻避光保存。
所述步骤6）考普林缸还用于盛放预处理液、洗液和酶缓冲液，将所述洗液预热至72~74℃，将所述预处理液预热至75~85℃，将所述酶缓冲液预热至36~38℃。
所述洗液室温下的PH值为7.0±0.2；所述酶缓冲液为0.01mol/L的稀盐酸，室温下的PH值为2.0±0.2。
所述步骤3）预处理包括如下步骤：a）将涂片60~70℃预热5~10min，用浸蜡脱蜡透明液脱蜡2次每次10~20min，用无水乙醇脱水2次每次3~5min；所述浸蜡脱蜡透明液为异构烷烃型；b）依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度复水，各0.5~2min，吸去残余溶液；c）放在已经预热到75~85℃的预处理液中保温20~40min，取出在纯化水中浸泡1~2min，吸去残余溶液；d）取40~60mg胃蛋白酶干粉溶解在已预热至36~38℃的酶缓冲液中，浸入消化20~30min；e）在纯化水中浸泡1~2min，依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度脱水，各0.5~2min，干燥备用。
所述步骤c）中所述预处理液为0.9~1.1mol/L的硫氰酸钠溶液。
所述酶缓冲液为0.01mol/L的稀盐酸，室温下的PH值为2.0±0.2。
所述扫描的结果中有异质性的特征为有融合细胞
实施例三
一种亚型Ph-likeALL的检测方法，包括下列步骤：
1）分别配制乙醇溶液、预处理液、洗液和酶缓冲液，置2℃-8℃氮气条件储存；所述乙醇溶液的体积分数为70~ 85%；所述预处理液为0.9~1.1mol/L的硫氰酸钠溶液；所述洗液由以下重量百分数的组分组成：氯化钠1.7~1.8%，柠檬酸钠0.8~1%，乙基苯基聚乙二醇0.2~0.4%，余量为水；所述酶缓冲液为0.009~0.011mol/L的稀盐酸；
2）荧光探针溶解：向探针管内加10~20μl水，加入150~200μl杂交液，超声溶解30~60s，得到探针溶液；所述荧光探针共12组，分别为ABL1，ABL2，CSF1R，PDGFRB， CRLF2，JAK2，EPOR，IL2RB，NTRK3，PTK2B，TSLP和 TYK2；
3）将骨髓细胞固化，涂抹于玻片上，经过预处理，制成涂片；所述固化为肝素化处理或经EDTA-醋酸钠处理；
4）将探针溶液预温到室温，漩涡混匀，离心2~3s，取5~15μl混匀的探针溶液滴加到杂交区域，盖上盖玻片，用封片胶密封；
5）设置程序：先70~80℃变性5~10分钟，然后 35~40℃杂交16~18h；
6）除去封片胶，置于考普林缸内的室温洗液中1~5min洗去盖玻片，取出涂片，用已预热至72~74℃的洗液漂洗1~3min，再用室温65~75%乙醇溶液漂洗1~3min，避光自然风干；
7）滴加复染液到杂交区域，盖上盖玻片，置-25~ -15℃暗处复染20分钟以上；所述复染液由以下重量份数的组分组成：革兰氏染色液5~7份，氯化镁1~3份，柠檬酸0.2~0.6份，荧光素0.5~0.7份，海藻酸钠0.1~0.3份；
8）使用物镜对样本进行扫描，确定样本是否有异质性。
所述步骤2）荧光探针溶解还包括下列步骤：用移液枪冲洗探针管底部和管壁，振荡混匀20~40s，离心20~40s， 放35~40℃水浴保温溶解5~15分钟；重复上述过程2~3次，将配制好的探针溶液备用或分装冰冻避光保存。
所述步骤6）考普林缸还用于盛放预处理液、洗液和酶缓冲液，将所述洗液预热至72~74℃，将所述预处理液预热至75~85℃，将所述酶缓冲液预热至36~38℃。
所述洗液室温下的PH值为7.0±0.2；所述酶缓冲液为0.01mol/L的稀盐酸，室温下的PH值为2.0±0.2。
所述步骤3）预处理包括如下步骤：a）将涂片60~70℃预热5~10min，用浸蜡脱蜡透明液脱蜡2次每次10~20min，用无水乙醇脱水2次每次3~5min；所述浸蜡脱蜡透明液为异构烷烃型；b）依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度复水，各0.5~2min，吸去残余溶液；c）放在已经预热到75~85℃的预处理液中保温20~40min，取出在纯化水中浸泡1~2min，吸去残余溶液；d）取40~60mg胃蛋白酶干粉溶解在已预热至36~38℃的酶缓冲液中，浸入消化20~30min；e）在纯化水中浸泡1~2min，依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度脱水，各0.5~2min，干燥备用。
所述步骤c）中所述预处理液为0.9~1.1mol/L的硫氰酸钠溶液。
所述酶缓冲液为0.01mol/L的稀盐酸，室温下的PH值为2.0±0.2。
所述扫描的结果中有异质性的特征为有融合细胞。

Claims (10)

1.一种亚型Ph-likeALL的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
1）分别配制乙醇溶液、预处理液、洗液和酶缓冲液，置2℃-8℃氮气条件储存；
2）荧光探针溶解：向探针管内加10~20μl水，加入150~200μl杂交液，超声溶解30~60s，得到探针溶液；
3）将骨髓细胞固化，涂抹于玻片上，经过预处理，制成涂片；所述固化为肝素化处理或经EDTA-醋酸钠处理；
4）将探针溶液预温到室温，漩涡混匀，离心2~3s，取5~15μl混匀的探针溶液滴加到杂交区域，盖上盖玻片，用封片胶密封；
5）设置程序：先70~80℃变性5~10分钟，然后 35~40℃杂交16~18h；
6）除去封片胶，置于考普林缸内的室温洗液中1~5min洗去盖玻片，取出涂片，用已预热至72~74℃的洗液漂洗1~3min，再用室温65~75%乙醇溶液漂洗1~3min，避光自然风干；
7）滴加复染液到杂交区域，盖上盖玻片，置-25~ -15℃暗处复染20分钟以上；所述复染液由以下重量份数的组分组成：革兰氏染色液5~7份，氯化镁1~3份，柠檬酸0.2~0.6份，荧光素0.5~0.7份，海藻酸钠0.1~0.3份；
8）使用物镜对样本进行扫描，确定样本是否有异质性。
2.根据权利要求1所述的亚型Ph-likeALL的检测方法，其特征在于，所述乙醇溶液的体积分数为70~ 85%；所述预处理液为0.9~1.1mol/L的硫氰酸钠溶液；所述洗液由以下重量百分数的组分组成：氯化钠1.7~1.8%，柠檬酸钠0.8~1%，乙基苯基聚乙二醇0.2~0.4%，余量为水；所述酶缓冲液为0.009~0.011mol/L的稀盐酸。
3.根据权利要求1所述的亚型Ph-likeALL的检测方法，其特征在于，所述荧光探针共12组，分别为ABL1，ABL2，CSF1R，PDGFRB， CRLF2，JAK2，EPOR，IL2RB，NTRK3，PTK2B，TSLP和TYK2。
4.根据权利要求1所述的亚型Ph-likeALL的检测方法，其特征在于，所述步骤2）荧光探针溶解还包括下列步骤：用移液枪冲洗探针管底部和管壁，振荡混匀20~40s，离心20~40s，放35~40℃水浴保温溶解5~15分钟；重复上述过程2~3次，将配制好的探针溶液备用或分装冰冻避光保存。
5.根据权利要求1所述的亚型Ph-likeALL的检测方法，其特征在于，所述步骤6）考普林缸还用于盛放预处理液、洗液和酶缓冲液，将所述洗液预热至72~74℃，将所述预处理液预热至75~85℃，将所述酶缓冲液预热至36~38℃。
6.根据权利要求1所述的亚型Ph-likeALL的检测方法，其特征在于，所述步骤3）预处理包括如下步骤：a）将涂片60~70℃预热5~10min，用浸蜡脱蜡透明液脱蜡2次每次10~20min，用无水乙醇脱水2次每次3~5min；b）依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度复水，各0.5~2min，吸去残余溶液；c）放在已经预热到75~85℃的预处理液中保温20~40min，取出在纯化水中浸泡1~2min，吸去残余溶液；d）取40~60mg胃蛋白酶干粉溶解在已预热至36~38℃的酶缓冲液中，浸入消化20~30min；e）在纯化水中浸泡1~2min，依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度脱水，各0.5~2min，干燥备用。
7.根据权利要求8所述的亚型Ph-likeALL的检测方法，其特征在于，所述步骤a）浸蜡脱蜡透明液为异构烷烃型。
8.根据权利要求8所述的亚型Ph-likeALL的检测方法，其特征在于，所述步骤c）中所述预处理液为0.9~1.1mol/L的硫氰酸钠溶液。
9.根据权利要求8所述的亚型Ph-likeALL的检测方法，其特征在于，所述酶缓冲液为0.01mol/L的稀盐酸，室温下的PH值为2.0±0.2。
10.根据权利要求1所述的亚型Ph-likeALL的检测方法，其特征在于，所述扫描的结果中有异质性的特征为有融合细胞。
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