CN107058238A - 抗cd10蛋白单克隆抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了抗CD10蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗CD10单克隆抗体和应用。本发明所述抗CD10蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞保藏编号为CGMCC NO：13286。本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗CD10蛋白单克隆抗体(克隆号：UMAB235)，且与CD10蛋白特异性结合，而与蛋白芯片上近10000种其他蛋白无交叉反应，显著提高了CD10蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于各种肿瘤组织及其微环境中CD10的检测。

Description

抗CD10蛋白单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗CD10蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗CD10单克隆抗体和应用。

背景技术

CDl0分子最初作为普通急性淋巴细胞白血病抗原(CALLA)被发现，由MME基因编码含750aa的一个相对分子质量为90-110kDa的II型单链穿膜糖蛋白。CDl0主要表达在骨髓中的早期B细胞和胎儿胸腺的一群细胞上，主要是CD2^-的细胞。CDl0可以鉴别骨髓来源的T细胞前体，随着细胞进入T细胞的分化，CDl0的表达开始减少。在B细胞内，CDl0的表达随着细胞获得膜表面免疫球蛋白而开始减少。CDl0也表达在生发中心的B细胞上和成熟的中性粒细胞上。在非造血组织中，CDl0分子也表达在许多组织细胞上，如肾小管和肾小球细胞、小肠上皮细胞、骨髓基质细胞、胆管、乳腺和涎腺的肌上皮细胞等，脑组织中触突膜，培养的纤维母细胞和某些实体肿瘤细胞系上也有CDl0的表达。

CDl0分子广泛分布在各种组织，具有中性肽链内切酶(NEP)的功能，并且表达在不同的组织，其功能不尽相同。目前广泛应用于用血液***肿瘤以及部分实体肿瘤的诊断和预后判断，还用于造血细胞分化发育研究和部分组织干细胞的研究。

目前临床上通常用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)实验检测肿瘤组织内肿瘤细胞中CD10的表达状况，其实验方法的核心为特异性结合CD10的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对CD10蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供抗CD10蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗CD10单克隆抗体和应用，提高所述杂交瘤细胞产生的单抗与CD10蛋白的结合特异性并应用到相关产品的制备中。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

抗CD10蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC NO：13286。

本发明所述抗CD10蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得：

(1)重组表达载体的构建：根据CD10 ORF核苷酸序列(CD10 ORF核苷酸序列如SEQID NO.1所示，2250bp；CD10氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)设计引物，以OriGene公司产品CD10全长质粒RC224141为模板，进行PCR扩增CD10的C末端411-750aa片段，基因两侧分别引入限制性内切酶位点EcoRI和XhoI，***表达载体pET-23a(+)(Novagen公司,货号69745-3)，构建CD10重组表达质粒pET-23a/rCD10；

(2)CD10重组蛋白的表达与纯化：将CD10重组表达质粒转化入E.Coli，扩增培养后裂解离心取上清，His亲和层析柱纯化，获得纯化的CD10重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的CD10重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗CD10特异性抗体的杂交瘤细胞株；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得CD10单克隆抗体。通过免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

经过上述方法制备后，筛选出能够稳定分泌抗CD10单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为UMAB235，亚型鉴定为IgG1，并于2016年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO：13286。

同时，本发明还提供一种抗CD10蛋白单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC NO：13286的杂交瘤细胞分泌产生。制备抗CD10蛋白单克隆抗体可采用本技术领域常规方法，如通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得CD10单克隆抗体。

本发明所述保藏编号为CGMCC NO：13286的杂交瘤细胞染色体稳定，其分泌产生的抗CD10蛋白单克隆抗体为IgG1型，效价较高。所述单克隆抗体的蛋白印记(Western-Blot)检测结果显示在K562，Ramos和Raji细胞中的CD10蛋白。

同时免疫组化检测结果显示，其能够特异性识别肾透明细胞癌组织、乳腺癌组织、淋巴瘤组织、正常扁桃体和肾组织中的CD10蛋白。

此外，采用OriGene高密度蛋白芯片检测所述单抗的特异性试验表明，本发明所述单克隆抗体与近10000种其他蛋白无交叉反应。

因此，本发明还提供了保藏编号为CGMCC NO：13286的的杂交瘤细胞在制备抗CD10蛋白单克隆抗体中的应用以及所分泌的抗CD10蛋白单克隆抗体在制备检测CD10蛋白的免疫检测产品中的应用。

作为优选，所述免疫检测产品为试剂盒、试纸或芯片。

本发明还提供一种免疫组化检测的试剂盒，包括保藏编号为CGMCC NO：13286的杂交瘤细胞分泌产生的抗CD10蛋白单克隆抗体。所述免疫检测试剂盒可检测肿瘤组织及其微环境中CD10的表达状况。

此外，本发明还提供保藏编号为CGMCC NO：13286的杂交瘤细胞分泌产生的抗CD10蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤组织及其微环境中淋巴细胞的试剂盒中的应用。

作为优选，所述肿瘤包括肾透明细胞癌、淋巴瘤和乳腺癌。

本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗CD10蛋白单克隆抗体，且与CD10蛋白特异性结合，而与蛋白芯片上近10000种其他蛋白无交叉反应，显著提高了CD10蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于各种肿瘤组织及其微环境中CD10的检测。

生物保藏信息说明

UMAB235，分类命名为CD10单克隆抗体杂交瘤细胞株，于2016年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO：13286。

附图说明

图1所示为实施例1中克隆位点图；

图2所示为实施例2中CD10蛋白SDS-PAGE结果图；

图3所示为实施例4中CD10蛋白蛋白印记Western-Blot结果图(一抗为UMAB235分泌产生的CD10单抗，1:500)；

图4所示实施例5肾透明细胞癌组织免疫组化检测结果图(一抗为UMAB235分泌产生的CD10单抗，1:600)；

图5所示实施例5淋巴瘤组织免疫组化检测结果图(一抗为UMAB235分泌产生的CD10单抗，1:600)；

图6所示实施例5乳腺癌组织免疫组化检测结果图(一抗为UMAB235分泌产生的CD10单抗，1:600)；

图7所示实施例5人正常扁桃体组织免疫组化检测结果图(一抗为UMAB235分泌产生的CD10单抗，1:600)；

图8所示实施例5人正常肾组织免疫组化检测结果图(一抗为UMAB235分泌产生的CD10单抗，1:600)；

图9所示实施例6origene蛋白芯片鉴定结果图(一抗为UMAB235分泌产生的CD10单抗,1:100；二抗为Alexa 647-标记的驴抗鼠IgG，1:500)。

具体实施方式：

本发明公开了抗CD10蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗CD10单克隆抗体和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面就本发明提供的抗CD10蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗CD10单克隆抗体和应用做进一步说明。

实施例1：CD10重组表达质粒的构建

根据CD10的全长cDNA序列模板RC224141(Origene公司产品，货号RC224141)，针对其C端411-750aa片段设计两条引物并分别引入酶切位点EcoRI和XhoI，克隆入表达载体pET-23a(+)(Novagen公司,货号69745-3)，建立CD10的C末端片段411-750aa蛋白的重组原核表达质粒，经测序确定重组质粒的正确性。克隆位点设计如图1所示。

实施例2：CD10重组蛋白的表达与纯化

1、转化E.Coli感受态细菌：取一个1.5ml离心管，加入100μl感受态细胞悬液，置冰上：加入2ul质粒pET-23a/rCD10，用移液器轻柔混匀。冰上静置20min；42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3～5min；加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(180rpm)1小时；取100ul菌液，至含有抗生素Amp的LB固体培养基上，涂布均匀；待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12～16小时，菌落生长良好而又未互相重叠时，取出，然后挑单菌落菌株于5ml LB(Amp+)挑上述单菌落菌株于5ml LB(Amp+)培养基220rpm培养8小时后转移至1升LB(Amp+)培养基扩大培养，待其生长到OD280＝0.6后加入IPTG至终浓度为0.25mM诱导蛋白表达，继续4度200rpm振荡培养12～14小时后，4度离心菌液，收集菌体沉淀。

2、蛋白纯化：将上步收集的菌体沉淀用PBS缓冲液重选并进行超声破碎(超声探头为6Ф，功率为400W，全程工作时间30min,每个循环超声3秒间隔5秒)，离心(12000rpm,5min)，收集上清，并按照Novagen公司蛋白纯化方法进行纯化(Novagen,Ni-NTA His-BindResin试剂盒，货号：70666-5)，收获得到纯化的带His标签的重组蛋白rCD10/411-750aa。

3、纯化蛋白鉴定：纯化后的重组CD10的C端411-750片段蛋白用SDS-PAGE鉴定，见图2。

由图2结果可见，经过His亲和层析柱纯化，得到高纯度的CD10重组蛋白。

实施例3：抗CD10单克隆抗体杂交瘤细胞及其单克隆抗体的制备筛选

根据标准方法用重组产生的纯化的全长CD10重组蛋白rCD10/411-750aa(以下简称为CD10抗原)用于对B6/C57小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1、动物免疫：经过纯化的CD10抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％PEG(PH 8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用纯化的CD10重组蛋白进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为UMAB235。

4、细胞上清单抗的制备与纯化：将细胞株UMAB235用含15％血清的DMEM培养基培养于10cm培养皿中培养，扩培至约4×10⁷个时，800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×10⁵个/ml。继续培养1～2周后，当细胞死亡率达到60％-70％时(此时细胞密度大概为1-2×10⁶个/ml)，收取细胞悬液6000rpm高速离心20min，取上清，亲和层析法进行上清纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，细胞株UMAB235产生的单抗亚型为IgG1，采用protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装(100uL/管，浓度为1mg/ml)、保存在4-8℃。

实施例4：CD10单克隆抗体UMAB235为一抗的蛋白印记(Western-Blot，以下简称WB)检测

(1)、实验方法：

1、准备细胞：准备K562,HL-60,Ramos和Raji细胞(均购买自ATCC)，培养于含5％CO₂的37℃细胞培养箱中。

2、制备细胞裂解液：将上述细胞消化，水平离心机800-1000rpm/5min离心,PBS洗2次，细胞沉淀用PBS定容到400ul-EP管，加入细胞裂解液，冰浴裂解20分钟后，12000rpm离心10分钟，收集上清加入5X Loading Buffer稀释成1X作为细胞裂解液，-80℃存储备用。

3、SDS-PAGE电泳：恒压180V 50min溴酚兰至凝胶底部。

4、转膜：提前用转移缓冲液浸泡Nc膜与滤纸，三明治形式置于湿转转膜仪，顺序为：电极(-)-海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-电极(+)，一定要保证胶在下膜在上，即凝胶靠近负极。恒流600mA,45分钟。

5、染色：用立春红S染色2min，用蒸馏水清洗，至marker条带显出，用圆珠笔做好标记。蒸馏水冲洗膜。

6、封闭：用封闭液(含5％脱脂奶的TBST)浸没NC膜并置于37℃孵育1小时。

7、一抗孵育：将NC膜置于PR鼠单抗UMAB235(以封闭液将抗体稀释500倍)中，37℃温箱孵育1小时后，再用15mLTBST洗膜15min*3次。(根据容器大小可调整TBST用量)

8、二抗孵育：将NC膜置于HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(Jackson，Catlog No.115-035-146；1：5000)中，室温摇床孵育1小时后，TBST洗膜5次，15min/次。

9、底物曝光：鲁米诺和双氧水1：1混匀后加在NC膜上(1ml/膜),压上X射线胶片曝光，然后将胶片进行显影和定影(暗室中可根据胶片上的荧光估算艳片时间)。

10、根据阴性，阳性，空白对照来进行结果分析和判定，见图3。

(2)、实验结果：

由图3结果可见，CD10鼠单抗UMAB235(1:500)能检测到K562,Ramos和Raji细胞中CD10蛋白，分子量大小与预期相符，而在HL-60和Jurkat细胞中则没有相应大小的条带，表明UMAB235能检测到CD10蛋白的特异性表达。

实施例5：UMAB235分泌产生的单克隆抗体为一抗的免疫组化检测

(1)、实验方法：

1、分别取肾透明细胞癌、Bukitt淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤、乳腺癌、正常扁桃体和肾组织块进行石蜡包埋，使用SAKURA组织切片机进行切片，组织厚度为4μm。

2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修复液(1mM EDTA,pH9.0的10mM Tris-HCL缓冲液)高压锅高压热修复2.5min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

5、加上封闭液(PBS+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封闭液，勿冲洗，加入CD10单抗(UMAB235分泌产生)，稀释比1:600，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。PBST(0.1％Tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。PBST(0.02％Tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。

7、滴加聚合物HRP染色试剂盒中试剂PV8000(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号PV-8000)，37℃孵育15分钟。使用PBS洗涤3次，每次5min。

8、应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。

9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5min x 3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。

11、镜检，见图4、图5、图6、图7和图8。

(2)、实验结果：

由图4结果可见，CD10蛋白在肾透明细胞癌组织的肿瘤细胞呈特异性细胞膜表达，如图箭头所示肿瘤细胞。

由图5结果可见，CD10蛋白在淋巴瘤组织中的淋巴细胞上呈特异性细胞膜和细胞质表达，如图箭头所示淋巴瘤细胞。

由图6结果可见，CD10蛋白在乳腺癌组织的肌上皮细胞呈特异性细胞膜和细胞质表达，如图箭头所示肌上皮细胞。

由图7结果可见，CD10蛋白在正常扁桃体组织中的淋巴细胞上呈特异性细胞膜表达，如图箭头所示淋巴细胞。

由图8结果可见，CD10蛋白在正常肾组织中的肾小管和肾小球细胞上呈特异性细胞膜和细胞质表达，如图箭头所示组织细胞。

结果表明本发明UMAB235产生的单克隆抗体能够特异性识别肾透明细胞癌、淋巴瘤组织、乳腺癌、正常扁桃体和肾组织中的CD10蛋白。

实施例6：UMAB235分泌产生的单克隆抗体的特异性蛋白芯片检测

OriGene高密度蛋白芯片上包含10000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。以下为使用OriGene蛋白(OriGene Cat PA100001)芯片进行UMAB235分泌产生的单克隆抗体鉴定实验的方法：

1、将一张蛋白芯片放在50mL离心管中，使用40mL去离子水浸润芯片，置于摇床上，室温混合30分钟。弃掉去离子水，使用10mLPBST平衡芯片。室温处理10分钟。

2、向50mL离心管中加入40mL5％脱脂牛奶(用PBST进行稀释)置于摇床上，室温封闭30分钟。

3、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释一抗UMAB235，稀释比列为1：100。

4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300μL一抗在封口膜上。

5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片NC膜的一面朝下，从芯片的一边接触抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片NC膜，直至整张NC膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4℃环境下，静置，一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。

6、第二天将芯片移至50mL离心管中，使用PBST漂洗芯片两次，去除多余的抗体。使用40mL PBST(0.1％Tween-20)洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤5min。

7、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释二抗Alexa 647-标记的驴抗鼠IgG，稀释比例为1：500。

8、按照上述步骤4，步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育1小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖，以防止发生信号漂白。

9、按照上述步骤6，使用PBST洗涤芯片。

10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。

11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。

12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。

13、根据BSA-Cy3以及BSA-Cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。

14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID，根据裂解液数据库信息，查找到对应蛋白名称，NCBI录入号(accession number)，蛋白ID，蛋白大小等信息。结果见图9。

图9结果显示，在蛋白芯片上的CD10蛋白与UMAB235分泌产生的单克隆抗体特异性结合，而与其他蛋白无任何结合信号，表明本发明所述单抗UMAB235能特异性识别CD10蛋白，而与其他近10000种蛋白无交叉反应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

<110> 无锡傲锐东源生物科技有限公司

<120> 抗CD10蛋白单克隆抗体及其用途

<210> 1

<211> 2250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>

1ATGGGCAAGTCAGAAAGTCAGATGGATATAACTGATATCAACACTCCAAAGCCAAAGAAGAAACAGCGAT

GGACTCCACTGGAGATCAGCCTCTCGGTCCTTGTCCTGCTCCTCACCATCATAGCTGTGACAATGATCGC

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CCGGGTTTGG2250

<210> 1

<211> 750

<212> PRT

<213> 人工序列

<400>

1MetGlyLysSerGluSerGlnMetAspIleThrAspIleAsnThrProLysProLysLysLysGlnArgTrpThrProLeuGluIleSerLeuSerValLeuValLeuLeuLeuThrIleIleAlaValThrMetIleAlaLeuTyrAlaThrTyrAspAspGlyIleCysLysSerSerAspCysIleLysSerAlaAlaArgLeuIleGlnAsnMetAspAlaThrThrGluProCysThrAspPhePheLysTyrAlaCysGlyGlyTrpLeuLysArgAsnValIleProGluThrSerSerArgTyrGlyAsnPheAspIleLeuArgAspGluLeuGluValValLeuLysAspValLeuGlnGluProLysThrGluAspIleValAlaValGlnLysAlaLysAlaLeuTyrArgSerCysIleAsnGluSerAlaIleAspSerArgGlyGlyGluProLeuLeuLysLeuLeuProAspIleTyrGlyTrpProValAlaThrGluAsnTrpGluGlnLysTyrGlyAlaSerTrpThrAlaGluLysAlaIleAlaGlnLeuAsnSerLysTyrGlyLysLysValLeuIleAsnLeuPheValGlyThrAspAspLysAsnSerValAsnHisValIleHisIleAspGlnProArgLeuGlyLeuProSerArgAspTyrTyrGluCysThrGlyIleTyrLysGluAlaCysThrAlaTyrValAspPheMetIleSerValAlaArgLeuIleArgGlnGluGluArgLeuProIleAspGluAsnGlnLeuAlaLeuGluMetAsnLysValMetGluLeuGluLysGluIleAlaAsnAlaThrAlaLysProGluAspArgAsnAspProMetLeuLeuTyrAsnLysMetThrLeuAlaGlnIleGlnAsnAsnPheSerLeuGluIleAsnGlyLysProPheSerTrpLeuAsnPheThrAsnGluIleMetSerThrValAsnIleSerIleThrAsnGluGluAspValValValTyrAlaProGluTyrLeuThrLysLeuLysProIleLeuThrLysTyrSerAlaArgAspLeuGlnAsnLeuMetSerTrpArgPheIleMetAspLeuValSerSerLeuSerArgThrTyrLysGluSerArgAsnAlaPheArgLysAlaLeuTyrGlyThrThrSerGluThrAlaThrTrpArgArgCysAlaAsnTyrValAsnGlyAsnMetGluAsnAlaValGlyArgLeuTyrValGluAlaAlaPheAlaGlyGluSerLysHisValValGluAspLeuIleAlaGlnIleArgGluValPheIleGlnThrLeuAspAspLeuThrTrpMetAspAlaGluThrLysLysArgAlaGluGluLysAlaLeuAlaIleLysGluArgIleGlyTyrProAspAspIleValSerAsnAspAsnLysLeuAsnAsnGluTyrLeuGluLeuAsnTyrLysGluAspGluTyrPheGluAsnIleIleGlnAsnLeuLysPheSerGlnSerLysGlnLeuLysLysLeuArgGluLysValAspLysAspGluTrpIleSerGlyAlaAlaValValAsnAlaPheTyrSerSerGlyArgAsnGlnIleValPheProAlaGlyIleLeuGlnProProPhePheSerAlaGlnGlnSerAsnSerLeuAsnTyrGlyGlyIleGlyMetValIleGlyHisGluIleThrHisGlyPheAspAspAsnGlyArgAsnPheAsnLysAspGlyAspLeuValAspTrpTrpThrGlnGlnSerAlaSerAsnPheLysGluGlnSerGlnCysMetValTyrGlnTyrGlyAsnPheSerTrpAspLeuAlaGlyGlyGlnHisLeuAsnGlyIleAsnThrLeuGlyGluAsnIleAlaAspAsnGlyGlyLeuGlyGlnAlaTyrArgAlaTyrGlnAsnTyrIleLysLysAsnGlyGluGluLysLeuLeuProGlyLeuAspLeuAsnHisLysGlnLeuPhePheLeuAsnPheAlaGlnValTrpCysGlyThrTyrArgProGluTyrAlaValAsnSerIleLysThrAspValHisSerProGlyAsnPheArgIleIleGlyThrLeuGlnAsnSerAlaGluPheSerGluAlaPheHisCysArgLysAsnSerTyrMetAsnProGluLysLysCysArgValTrp750

Claims (8)

1.抗CD10蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO：13286。

2.保藏编号为CGMCC NO：13286的杂交瘤细胞在制备抗CD10蛋白单克隆抗体中的应用。

3.抗CD10蛋白单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CGMCC NO：13286的杂交瘤细胞分泌产生。

4.保藏编号为CGMCC NO：13286的杂交瘤细胞分泌产生的抗CD10蛋白单克隆抗体在制备检测CD10蛋白的免疫检测产品中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述免疫检测产品为试剂盒、试纸或芯片。

6.一种免疫组化检测的试剂盒，其特征在于，包括保藏编号为CGMCC NO：13286的杂交瘤细胞分泌产生的抗CD10蛋白单克隆抗体。

7.保藏编号为CGMCC NO：13286的杂交瘤细胞分泌产生的抗CD10蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤组织及其微环境中淋巴细胞的试剂盒中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述肿瘤包括结淋巴瘤、肾透明细胞癌和乳腺癌。