CN107050429B - 人成纤维生长因子21在制备用于治疗脑卒中药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人成纤维生长因子21(FGF21)在制备用于治疗脑卒中药物中的应用。所述药物对脑卒中的作用主要表现为保护血脑屏障的完整性，抑制脑中神经炎症，促进脑中血管和白质重塑，提高了中风后神经功能的恢复，可极大改善脑卒中患者、糖尿病合并脑卒中患者的脑部损伤。

Description

人成纤维生长因子21在制备用于治疗脑卒中药物中的应用

技术领域

本发明医药技术领域，涉及人成纤维生长因子21(FGF21)的一种新用途，特别涉及人FGF21在制备用于治疗脑卒中药物中的用途。

背景技术

脑卒中俗称“中风”，具有高发病率、高致残率、高复发率和高死亡率的特点，是世界上最重要的致死性疾病之一，也是我国第一位致残和致死性疾病。脑卒中主要分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中两大类，其中80％左右为缺血性脑卒中。缺血性脑卒中是由于脑动脉的血流短暂或持久减少引起的。脑保护药物是目前神经学界的研究热点，目前唯一被证实有效且被推荐为常规治疗的药物是阿司匹林。缺血性脑卒中起病后3小时内使用r-tPA、6小时内动脉使用前尿激酶也被证明有一定疗效。然而，脑卒中的复杂性和多向性仍使其脑保护药物在临床实践上的有效数量极大受限。

值得注意的是，缺血性脑卒中还是糖尿病多种并发症之一，是糖尿病发展到后期(即合并症期)而出现的脑系病变。据统计，糖尿病患者对缺血性脑卒中的敏感性是2-6倍，大约30％的脑卒中患者患有糖尿病并且90％为II型糖尿病(T2D)。与非糖尿病人群相比，糖尿病合并缺血性脑卒中的死亡率提高到两倍，残疾率和复发率高，神经功能损伤恢复慢，神经再生能力减弱以及由于其更高的出血性转化，使得缺血性脑中风的标准用药r-tPA治疗效果变小。目前，尚未发现或公布有对糖尿病合并脑卒中具有较好的治疗效果的药物。

随着生活水平提高及老龄化程度加重，糖尿病患者日益增多，糖尿病增加了缺血性脑卒中的风险，糖尿病合并缺血性脑卒中已成为威胁公众健康的巨大因素。然而，尽管糖尿病引起的肾脏和视网膜微血管并发症已有大量的报道，但对糖尿病引起的神经病变(如脑卒中)机制仍知之甚少。T2D患者通常具有高血糖症、血脂异常和胰岛素抵抗，这些因素加重其中风后长期的功能缺失，也限制了大脑固有的神经修复和重建能力。研究表明对T2D患者中风后单一的胰岛素血糖控制并不能逆转其中风后功能损伤。

因此，寻找有效的靶点药物以治疗脑卒中、甚至糖尿病合并脑卒中是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明人经过大量的研究发现，通过人成纤维细胞生长因子21可以改善脑卒中患者、T2D脑卒中患者的症状，并对改善症状的机理进行了阐述，从而完成本发明。

本发明的目的是提供一种人成纤维生长因子21在制备用于治疗脑卒中的药物中的应用。

本发明的另一目的是提供一种治疗脑卒中的药物，所述药物中含有治疗有效剂量的人成纤维生长因子21。

根据本发明提供的一种人成纤维生长因子21在制备用于治疗脑卒中的药物中的应用，具有以下有益效果：

(1)本发明发现人FGF21能够：1.通过激活PPARγ来保护血脑屏障(BBB)；2.通过抑制NFκB蛋白的表达减轻神经炎症；3.促进由AMPK/Nrf2调节的血管/白质的重构，从而促进脑卒中后的神经再生，因而其可作为各种剂型药物的有效成分，对于脑卒中、糖尿病合并脑卒中的治疗具有极其重大的意义。

(2)FGF21是FGF家族中目前发现的唯一没有促有丝***的基因，从而大大降低了临床用药的风险。

(3)本发明中公开的治疗机理，对以后研究治疗脑卒中、糖尿病合并脑卒中的药物具有指导意义。

附图说明

图1为纯化后FGF21的电泳图；

图2为纯化后FGF21高效液相色谱图；

图3为粘贴去除实验结果；

图4为前肢踩空实验结果；

图5为握力实验结果；

图6为Y迷宫试验结果；

图7为各组梗死体积大小及定量图；

图8为小鼠脑中FGF21、p-FGFR1和FGFR1-β-klotho复合物的表达；

图9为FGF21处理对高糖加IL-1β合并诱导损伤脑血管内皮细胞的紧密连接蛋白表达的影响；

图10为FGF21处理对高糖加IL-1β合并诱导损伤脑血管内皮细胞的粘附因子表达的影响；

图11为FGF21处理对高糖加IL-1β合并诱导损伤脑血管内皮细胞的通透性的影响；

图12为FGF21对磷酸化FGFR1表达的影响；

图13为FGF21对PPARγ表达的影响；

图14为PPARγ对血管内皮细胞渗透性的影响；

图15为FGF21对抗炎因子M2型小胶质细胞的影响；

图16为FGF21对LPS诱导的细胞中炎症因子的影响；

图17为FGF21对LPS诱导的细胞中FGFR1磷酸化、NFκB活性、及PPARγ表达水平的影响；

图18为FGF21对轴突损伤和髓鞘丢失的影响；

图19为FGF21对少突胶质细胞再生的影响；

图20为FGF21对脑中脑血管密度的影响；

图21为FGF21对脑中AMPK/Nrf2活性的影响；

图22为FGF21处理的脑血管内皮细胞条件培养液对OPC细胞增殖的影响；

图23为FGF21对II型糖尿病合并脑卒中小鼠血糖的调节。

具体实施方式

以下通过具体实施方式本发明进行进一步说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚。

成纤维细胞生长因子21(FGF21)是最新发现的和糖脂代谢有关的因子，能改善胰岛β细胞的功能，促进脂肪组织中的葡萄糖吸收，是FGF家族中目前发现的唯一没有促有丝***的基因，从而大大降低了临床用药的风险。它主要在肝脏中表达，在脑中各区域、胶质细胞中均有少量表达。其中，人FGF21(MW:19.5kD)有181个氨基酸，与鼠FGF21的肽链有75％的同一性。

经过研究表明，在一些病理条件下，FGF21发挥着组织损伤修复的功能。重组FGF21已经在多种动物模型如肝脏疾病、糖尿病肾病、动脉硬化斑形成、心肌梗塞、以及糖尿病性心肌病中，显示出一定的治疗效果。虽然FGF21介导的信号通路仍不清楚，但其治疗作用机制可能涉及血管保护和重塑、抗炎、抗氧化应激、晚期糖化终产物的形成抑制和促进组织修复。

目前，尚未有关于FGF21对于脑卒中或糖尿病合并脑卒中的脑代谢、脑保护或认知方面的报道，更未有对这些方面的***研究。

本发明人经过大量的试验，结果发现，外源重组人成纤维细胞生长因子21(rFGF21)可以激活FGFR1-β-klotho复合物，(1)通过激活PPARγ实现对血脑屏障(BBB)的保护；(2)抑制NFκB介导的神经炎症；(3)促进AMPK/Nrf2活化介导的血管/白质重塑；提高了中风后神经功能的恢复，改善了脑卒中患者、T2D脑卒中患者的症状。

因此，本发明的一方面，提供了一种人成纤维生长因子21在制备用于治疗脑卒中的药物中的应用。

在本发明中，所述脑卒中包括糖尿病合并脑卒中，包括II型糖尿病合并脑卒中(即T2D脑卒中)。临床和实验数据表明，T2D患者通常具有高血糖症、血脂异常和胰岛素抵抗，这些因素加剧了对血脑屏障的渗透性和神经炎症，加重了中风后长期的神经功能缺失，也限制了大脑固有的神经修复和重建能力，而这些能力在中风后恢复正常中发挥着重要作用。

为实现人FGF21在制备用于治疗脑卒中的药物中的应用，本发明通过微生物发酵法获得外源重组人FGF21。根据GenBank上人FGF21(NP_061986.1)的蛋白序列优化设计了相应的DNA序列，构建合适的表达载体，将表达载体转移至原核宿主细胞中，得到高蛋白表达水平的菌株，对菌株进行活化和扩增，诱导表达FGF21，通过多步骤分离纯化得到高纯度的FGF21(如图1和图2所示)。

在一种优选的实施方式中，编码人FGF21蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其在5'端有NdeⅠ酶切位点，3'端有BamHⅠ酶切位点。

在进一步优选的实施方式中，所述表达载体中***了人FGF21的编码序列，优选所述表达载体为原核细胞表达载体，如含IPTG诱导的启动子的质粒pET3c，其适用于原核细胞，尤其适合在大肠杆菌中诱导表达。

在进一步优选的实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞，优选为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21(DE3)。大肠杆菌特别是大肠杆菌BL21(DE3)适于表达载体特别是质粒pET3c的表达。

本发明人通过实验发现，FGF21在T2D脑卒中对血脑屏障(BBB)的完整性有保护作用。

中枢神经***疾病常引起血脑屏障结构和功能的剧烈变化，血脑屏障的通透性显著提高以致血浆白蛋白这样的大分子物质都可通过屏障，严重脑损伤导致血脑屏障的严重破坏。通过对FGF21处理前后T2D脑卒中模型即经末梢大脑中动脉闭塞手术后db/db小鼠进行神经功能和认知功能测试，发现FGF21处理可减轻db/db小鼠脑中风后神经功能的损伤(图3～图6)。同时，对小鼠脑梗死体积大小进行比较，FGF21处理后db/db脑卒中小鼠脑梗死体积较处理前明显减小(图7)。以上体内实验均说明，FGF21在T2D脑卒中对血脑屏障完整性具有保护作用，降低了与血脑屏障相关的二级损伤。

血脑屏障通透性的增加是由于脑血管内皮细胞间的紧密连接的开放直接导致的。糖尿病合并脑中风加剧了血脑屏障破坏，其中紧密连接蛋白表达减少是一个很重要的因素。而中风后内皮粘附因子在白细胞向脑内渗透中起着举足轻重的作用，此过程会引起大脑炎症以及血脑屏障的破坏。

因而，进一步地，使用高含量葡萄糖和致炎细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)合并损伤引起的脑血管内皮细胞来模拟急性期db/db T2D小鼠脑中风体外模型，通过对FGF21处理前后，脑血管内皮细胞的通透性、内皮细胞粘附因子、以及紧密连接蛋白表达的影响，进一步确定FGF21对血脑屏障的影响。

研究发现，高含量葡萄糖加IL-1β合并诱导损伤使脑血管内皮细胞紧密连接蛋白表达减少(图9)、内皮细胞中粘附因子增加(图10)、脑血管内皮细胞渗透性增加(图11)，说明血脑屏障可能会被破坏。而FGF21处理能够增加损伤后紧密连接蛋白的表达，抑制粘附因子表达，降低脑血管内皮细胞渗透性。从体外实验，进一步确定了FGF21对血脑屏障的保护作用。

FGF21信号传导需要激活FGF受体(FGFR)，尤其是FGFR1以及它的共受体β-Klotho。通过对db/db T2D脑中风小鼠皮下注射FGF21，发现其脑中FGF21和磷酸化FGFR(p-FGFR1)表达增加，同时脑中有FGFR1-β-klotho复合物的生成，且表达明显(图8)。可以确定，FGF21与其他FGF家族成员不同，因其与肝素之间非常低的亲和力，使得FGF21能通过简单扩散透过血脑屏障，激活FGFR1-β-klotho复合物，实现信号传导。

经研究发现，PPARγ(过氧化物酶体增生物激活受体γ)的激活可能改变紧密连接蛋白的表达，FGF21对血脑屏障通透性的保护可能与其激活相关。我们通过体外实验可以确定，FGF21激活FGFR1-β-klotho复合物，进而使下游PPARγ得到激活，实现对血脑屏障的保护。

在体外实验中，使用高含量葡萄糖和IL-1β合并损伤引起的脑血管内皮细胞进行验证。相较于未经FGF21处理的脑血管内皮细胞，FGF21处理后能使其中FGFR1磷酸化表达增加的同时(图12)，促进PPARγ蛋白表达水平和活性(图13)。抑制PPARγ表达，脑血管内皮细胞的渗透性增加，FGF21的保护作用失效(图14)。

进一步地，本发明人发现，FGF21可抑制神经炎症。

T2D脑卒中会产生明显的脑部炎症，通过体内实验发现，FGF21能够增加db/db T2D小鼠脑中风后脑中抗炎细胞M2型小胶质细胞的数量(图15)。

通过体外实验，FGF21能够抑制经脂多糖(LPS)刺激原代培养的大鼠小胶质细胞(OPC)中M1型促炎因子iNOS和TNF-αmRNA的表达，同时增加M2型抗炎因子Arg1和IGF-1mRNA的表达，进而参与损伤后的修复(图16)。

在小胶质细胞中，PPARγ在同型PPARs中是最主要，也是一个关键的“信息传递者”转录因子，它可通过影响小胶质细胞和巨噬细胞的表型和已活化的小胶质细胞和巨噬细胞中释放的炎症因子来控制转录过程。NFκB是一个早期的调节炎症的关键因子。中风后会使NFκB的表达增加，激活小胶质细胞和巨噬细胞，增加有害的促炎因子的释放。

通过体外实验发现，FGF21能够明显减少LPS诱导的NFκB活性，增加小胶质细胞核中PPARγ的水平(图17)。FGF21作用小胶质细胞，能使其FGFR1磷酸化的表达增加，而给予FGFR抑制剂，FGFR1的磷酸化被抑制。FGF21也能降低经LPS诱导的原代大鼠小胶质细胞核中NFκB的活性，同时增加细胞核蛋白中细胞核转录因子PPARγ的表达，同样加入FGFR抑制剂后，FGF21对PPARγ表达的增加和NFκB活性的降低效果均收到抑制。因而，FGF21激活FGFR1-β-klotho复合物后，还可使下游NFκB活性降低，抑制神经炎症。

本发明人还发现，FGF21可推动血管和白质的重塑。

II型糖尿病在缺血性中风之后会加重血管和白质的损伤，并且减弱其重塑功能。本发明研究表明，在体内和体外培养的血管内皮细胞中，FGF21对脑血管的保护和重构有潜在作用。

对FGF21处理前后的db/db T2D脑中风小鼠进行对比，在分离到的大脑微血管片段中，FGF21提高了促血管生成因子(VEGF-A，IGF-1和eNOS)mRNA水平(表1)。在db/db T2D小鼠中风后，FGF21可减轻轴突的损伤和髓鞘的丢失(图18)；增加损伤周围区域血管密度及少突胶质细胞的再生(图20和图19)。通过FGF21处理过的脑血管内皮细胞条件培养液能促进体外少突胶质细胞细胞的增殖(图22)。

在II型糖尿病模型的脑中，早期炎症和氧化应激干扰了代谢和细胞内稳态，导致与AMPK和Nrf2信号通路相关功能的缺失，从而引起脑血管和退行性疾病。本发明通过实验表明，FGF21处理可明显增加脑中AMPK的磷酸化以及细胞核中Nrf2的活性(图21)，确定了FGF21的一部分作用机制是FGF21上调了AMPK和Nrf2活性，而中风后AMPK和Nrf2的活性增加能够促进神经元修复和神经功能的恢复。

FGF21除对T2D合并脑卒中的脑部治疗有效外，还能够降低脑中风后的高血糖(图23)。研究证明，相对于未经治疗的糖尿病合并脑卒中模型，FGF21治疗后，其血液中葡萄糖的浓度明显降低，同时FGF21也能明显地降低糖化血红蛋白(Hb A1c)的水平。这些均表明FGF21能调节T2D合并脑卒中后对糖的代谢功能。

在本发明中，脑卒中和脑中风含义相同，T2D脑卒中和T2D脑中风含义相同。

本发明的第二方面是提供用于治疗脑卒中，特别是II型糖尿病合并脑卒中的药物，所述药物中含有治疗有效剂量的人成纤维生长因子21。

所述药物还包括其它药学上可接受的载体或辅料，如药学上允许的赋形剂、填充剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、增效剂或其它添加剂。所述药物的给药形态可为针剂。所述药物的制剂形态可采用本领域技术人员熟知常用的制备方法获得。所述药物的给药途径可为皮下注射、静脉注射、肌肉注射或其它有效注射形态。

所述药物对脑卒中，特别是糖尿病合并脑卒中的作用主要表现为(1)保护血脑屏障的完整性；(2)抑制脑中神经炎症；(3)促进脑中血管和白质重塑。

其中，保护血脑屏障的完整性主要体现在：

(1a)FGF21减轻了脑中风后感觉功能和认知功能的损伤；

(1b)FGF21减小了脑中风后脑梗死大小；

(1c)FGF21增加脑血管内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1和VE-cadherin的表达；

(1d)FGF21抑制脑血管内皮细胞中粘附因子VCAM-1和E-selectin的表达；

(1e)FGF21降低脑血管内皮细胞渗透性；

(1f)FGF21使脑中FGFR1磷酸化表达增加，和/或促进PPARγ表达。

抑制脑中神经炎症主要体现在：

(2a)FGF21增加脑中抗炎细胞M2型小胶质细胞的数量；

(2b)FGF21降低脑中促炎因子iNOS mRNA和TNF-αmRNA的表达水平；

(2c)FGF21提高脑中抗炎因子Arg1mRNA和IGF-1mRNA的表达水平；

(2d)FGF21降低脑中炎症因子IL-1βmRNA的表达水平；

(2e)FGF21降低脑中NFκB的活性。

促进脑中血管和白质重塑主要体现在：

(3a)FGF21减轻轴突的损伤和髓鞘的丢失；

(3b)FGF21促进少突胶质细胞的再生；

(3c)FGF21增加脑血管密度；

(3d)FGF21增加脑血管片段中促血管生成因子VEGF mRNA、eNOS mRNA、和IGF-1mRNA的表达水平。

实施例

以下通过具体优选的实施例对本发明进行进一步说明。这些实施例仅是说明性的，并不应理解为对本发明的限制。

实施例1获得外源重组人成纤维细胞生长因子21

实施例1.1高表达菌株的构建

首先根据GenBank上人源FGF21(NP_061986.1)的蛋白序列优化设计了相应的DNA序列，如SEQ ID NO.1所示。随后人工合成了相应的DNA片段，其在5'端有NdeⅠ酶切位点，3'端有BamHⅠ酶切位点。将所得的FGF21的DNA用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切，表达空载体pET3c用相同的酶进行处理。两种酶切片段用T4DNA连接酶连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，Ampicillin抗性筛选阳性克隆，并进行DNA序列分析，以确保所得FGF21的cDNA序列是正确的。将所得的重组质粒命名为pET3c-FGF21。将重组质粒pET3c-FGF21转入进大肠杆菌BL21(DE3)，Ampicillin抗性筛选转化子。最终得到高表达FGF21的菌株。

实施例1.2菌株的活化和扩增(FGF21发酵)

将检定合格的菌株接种(接种量10％)于一代培养基，37℃培养4h，转接(接种量10％)到二代培养基中，37℃培养10～12h供发酵罐接种用。

将发酵培养基装入200L容积的发酵罐中(发酵罐预先进行空消115℃，30min)，然后进行实消灭菌(115℃，30min)，再将适量上述培养的二代种子液接种(接种量10％)于发酵罐中，采用高密度发酵培养工艺，通过控制葡萄糖的流加速率、通气量及搅拌速率等控制培养液DO值不低于30％，当菌体OD600达到15-18左右，加入IPTG进行诱导表达。诱导1h后加流加培养基，诱导4h终止发酵。

发酵结束后，用管式离心机(16000r/min)分离发酵液中的菌体，收取菌体。

实施例1.3 FGF21纯化

1)包涵体的制备

将湿菌体悬浮于10倍体积(w/v)的含25mmol/L Tris(pH 8.0)、150mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA-2Na的缓冲液中；按所需的FGF21湿菌体，以1:1000(w/w)、1：10000(w/w)比例称取溶菌酶和DNA酶，将其用裂解液溶解加入至菌体混悬液中，室温搅拌裂解过夜，镜检破菌液至视野内无完整菌体，再用高速冷冻离心机(9000r/min，4℃)分离、收集沉淀。

将上一步的沉淀悬浮于相对于湿菌体15倍体积(w/v)的含25mmol/L Tris(pH8.0)、150mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA-2Na，0.2％去氧胆酸钠的洗涤液Ⅰ中，充分搅拌溶解混匀后，用高速冷冻离心机(9000r/min，4℃)分离、收集沉淀。

再将上一步的沉淀悬浮于相对于湿菌体20倍体积(w/v)的含25mmol/L Tris(pH8.0)、150mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA-2Na，0.2％Triton-X 100的洗涤液Ⅱ中，充分搅拌溶解混匀后，用高速冷冻离心机(9000r/min，4℃)分离、收集沉淀即为FGF21包涵体。

2)包涵体变复性

将包涵体悬浮于15倍体积(w/v)的含25mmol/L Tris(pH 8.9)、2mmol/L EDTA-2Na、8mol/L尿素的变性液中，4℃充分搅拌溶解混匀后，加入至透析袋(截留分子量为7000kd)中。再将FGF21变性液置于200倍体积(w/v)的含25mmol/L Tris(pH 8.9)、2mmol/LEDTA-2Na的复性液中4℃透析过夜。透析结束后，用高速冷冻离心机(9000r/min，4℃)分离、收集上清。

3)纯化

将上述所得粗制FGF21上清液首先过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱，用25mmol/L Tris(pH8.9)、10mmol/L EDTA-2Na、0.03mol/L NaCl平衡液平衡并除杂蛋白后，用25mmol/L Tris(pH8.9)、10mmol/L EDTA-2Na、0.1mol/L NaCl的洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白峰。

将上一步目的蛋白收集液再过疏水柱，先用25mmol/L Tris(pH8.9)、2mol/L NaCl的缓冲液平衡并除杂蛋白后，将上样溶液NaCl浓度调至2mol/l后上样，再用25mmol/L Tris(pH8.9)、0.1mol/L NaCl的洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白峰。将收集的目的蛋白溶液浓缩后过Sephadex G25Coarse凝胶过滤层析柱，用20mmol/L PB(pH 7.4)，50mM NaCl的缓冲液进行洗脱，收集活性峰，经SDS-PAGE和高效液相色谱检测，得到纯度＞95％的FGF21蛋白，即外源重组人成纤维细胞生长因子21(rFGF21)，说明书附图中示为rFGF21，说明书中简称FGF21，如图1和图2所示。图中1为取三份纯化后的FGF21蛋白样品(样品1、2和3)进行SDS-PAGE后图谱；图2为FGF21的高效液相色谱图。

实施例2 FGF21在T2D脑卒中对血脑屏障完整性的影响

实施例2.1动物实验(体内实验)

II型糖尿病模型(T2D模型)：在肥胖诱导的II型糖尿病研究中，使用最广泛的动物模型是先天瘦素缺失(ob/ob)和瘦素受体缺失(db/db)的啮齿动物模型。本发明中使用C57BLKS-Leprdb II型糖尿病小鼠(db/db T2D小鼠，杰克逊实验室库存号000642，12-13周龄)。此模型已广泛用在糖代谢和并发症新机制的研究，而且db/db T2D脑卒中模型反映了BBB的破坏、神经炎症、血管/白质受损。

缺血性脑卒中模型：由于II型糖尿病啮齿类动物模型大脑中动脉闭塞(MCAO)的死亡率高达70％，我们选择了II型糖尿病且大脑中动脉闭塞的小鼠作为缺血性脑卒中模型。

获得缺血性脑卒中模型的步骤如下：将II型糖尿病小鼠麻醉后呈仰卧位固定，在手术显微镜下，沿颈前部正中切开皮肤，分离双侧颈总动脉，用缝线穿过但不结扎；将小鼠右侧卧位固定，在眼内眦与外耳道连线处做一纵向切口，分离颞肌，用缝线将颞肌向两边牵拉暴露颞骨；用颅钻钻孔，去除骨瓣，剥离硬脑膜，暴露大脑中动脉；小心钩起大脑中动脉并用电凝器凝断，用生理盐水冲洗降温；再次将小鼠仰卧位并用血管夹夹闭双侧颈总动脉，缝合伤口，60min后松开动脉夹并缝合皮肤。

所有来自于FGF21处理db/db T2D脑卒中小鼠的数据都和两个非治疗脑卒中的对照组相比，即正常血糖对照组(db/+)和db/db T2D组。

动物实验：采用1.5mg/kg外源重组人成纤维细胞生长因子21(rFGF2，说明书附图中示为rFGF21，说明书中简称FGF21)皮下注射C57BLKS-Leprdb db/db T2D小鼠(杰克逊实验室库，雄性，12周龄)，每12h一次，每天剂量3.0mg/kg，共给药14天。分3组进行测试并比较：正常血糖db/+小鼠组(简称db/+组，非治疗组)、db/db T2D小鼠组(简称db/db组，非治疗组)和FGF21治疗成年雄性db/db T2D小鼠组(简称db/db+FGF21组，治疗组)，每组12只。脑中风后即为db/+脑中风组，db/db脑中风组，db/db+FGF21脑中风组。

数据处理：对于参数和连续变量的测量，如病灶大小、血脑屏障通透性、mRNA和蛋白表达水平、免疫组织化学、生化分析，使用Tukey-Kramer Post-hoc tests方差分析。对于非参数序数据(例如，神经行为的结果)，我们使用非参数秩和检验，Post-hoc Mann-Whitney tests。P<0.05有统计学意义。

实施例2.1.1 FGF21减轻了脑中风后神经功能的损伤

在中风前以及中风后1、3、5、7和14天，通过粘贴去除实验、前肢踩空实验和握力实验来评估感觉功能，中风后28天通过Y迷宫测试认知功能。所述试验为本领域中常规的测试手段，在此不做具体限定。测试结果如图3～图6所示，其中，*P<0.01，与db/+脑中风组相比；^#P<0.01，与db/db脑中风组相比。

如图3所示，粘贴去除实验表明，db/db脑中风组所花的时间与db/+脑中风组相比增加，而FGF21可使其时间降低。

如图4所示，前肢踩空实验表明，db/db脑中风组的脚步错误的百分数与db/+脑中风组相比增加，而FGF21用药的第3天至第14天可使其脚步错误降低。

如图5所示，握力实验表明，db/db脑中风组握力与db/+脑中风组相比没明显变化，而FGF21用药的第3天、第5天、第7天和第14天可使其握力增加。

如图6所示，Y迷宫实验，db/db脑中风组的正确交替选择百分数与db/+脑中风组相比明显降低，而FGF21用药第14天可使其增加。

由上述测试结果可知，FGF21减轻了db/db小鼠脑中风后神经功能的损伤。

实施例2.1.2 FGF21减小了脑中风后脑梗死大小

在上述行为学实验测试后处死小鼠，取脑组织进行脑梗死大小的测定。

检测结果如图7所示，左图是HE染色脑梗死大小图，右图是各组梗死体积的定量图。(n＝6)。*P<0.05，与db/+脑中风组相比；^#P<0.05，与db/db脑中风组相比。

HE染色及定量分析结果显示，与db/+脑中风组相比，db/db脑中风小鼠脑梗死体积明显增大，给药14天后，FGF21明显减小了db/db脑中风小鼠脑梗死体积。

实施例2.1.3 FGF21可穿过BBB激活脑中的FGFR1发挥神经保护作用(机理)

FGF21信号传导需要激活FGFR，尤其是FGFR1及其共受体β-Klotho复合体。采用2mg/kg FGF21皮下注射C57BLKS-Leprdb db/db T2D小鼠，2h后取脑，Western Blot测定小鼠脑中FGF21和磷酸化的FGFR1(p-FGFR1)的表达(图8A)，通过免疫共沉淀检测FGFR1-β-klotho复合物形成(图8C)，以未经FGF21处理的C57BLKS-Leprdb db/db T2D小鼠作对照组。

由图8A和8B可知，相较于未注射FGF21组小鼠，注射FGF21组小鼠脑中FGF21水平增加，相应地，p-FGFR1的表达得到显著增加。

由图8C可知，相较于未注射FGF21的小鼠，注射FGF21组小鼠脑中出现FGFR1-β-klotho复合物。图8A～C说明皮下注射FGF21后，FGF21可穿过BBB激活脑中的FGFR1及FGFR1-β-klotho复合物，实现信号传导。

实施例2.2细胞实验

由于T2D脑中风病理生理的异质性，在体外我们不能得到类似体内环境的理想模型。高血糖和炎症细胞因子对于早期BBB的完整性分布起着重要作用，也会导致T2D中风的二次脑损伤。因此，我们将采用高含量葡萄糖(HG)加IL-1β合并损伤血管内皮细胞完整性的体外模型来模拟T2D脑卒中BBB的损伤。

细胞实验：采用25mmol/L D-葡萄糖加30ng/L IL-1β合并损伤脑血管内皮细胞来模拟急性期db/db T2D小鼠脑中风体外模型。

实施例2.2.1 FGF21增加脑血管内皮细胞紧密连接蛋白的表达

糖尿病合并脑卒中加剧了血脑屏障的破坏，其中紧密连接蛋白表达减少是一个很重要的因素。

脑血管内皮细胞用高糖(HG)加IL-1β合并损伤处理后，加50nmol/L FGF21处理，为HG-IL-1β+FGF21组。其与对照组：正常脑血管内皮细胞和HG-IL-1β合并损伤处理后的脑血管内皮细胞进行比较。通过RT-PCR和Western Blot分析紧密连接蛋白ZO-1和粘附连接蛋白VE-cadherin的表达，检测结果如图9所示。

其中，A.Western blot检测脑血管内皮细胞紧密连接蛋白的表达。B.ZO-1的定量图。C.VE-Cadherin的定量图。(n＝5)。*P<0.01，与正常对照组相比；^#P<0.01，与HG-IL-1β+FGF21组相比。*P<0.01，与正常对照组相比；^#P<0.01，与HG-IL-1β组相比。

由图9可知，高糖加IL-1β合并诱导损伤使脑血管内皮细胞紧密连接蛋白表达减少，而FGF21能够增加损伤后紧密连接蛋白的表达。

实施例2.2.2 FGF21抑制脑血管内皮细胞中粘附因子的表达

中风后脑血管内皮细胞粘附因子在白细胞向脑内渗透中起着举足轻重的作用，此过程会引起大脑炎症以及血脑屏障的破坏。

脑血管内皮细胞用高含量葡萄糖(高糖，HG)加IL-1β合并损伤处理后，加50nmol/LFGF21处理，为HG-IL-1β+FGF21组。其与对照组：正常脑血管内皮细胞和HG-IL-1β合并损伤处理后的脑血管内皮细胞进行比较。通过RT-PCR和Western Blot检测血管粘附因子VCAM-1和E-selectin的表达，检测结果如图10所示

其中，A.Western Blot检测脑血管内皮细胞经高糖加IL-1β损伤24h后VCAM-1和E-Selectin的表达。B.VCAM-1的定量图。C.E-Selectin的定量图。(n＝5)。*P<0.01，与正常对照组相比；^#P<0.01，与HG-IL-1β组相比。

由图10可知，高糖加IL-1β损伤处理后的脑血管内皮细胞中粘附因子VCAM-1和E-selectin增加，说明血脑屏障可能被破坏。加入FGF21后其水平降低，说明FGF21能够抑制高糖加IL-1β诱导引起的内皮细胞中粘附因子VCAM-1和E-Selectin的表达。

实施例2.2.3 FGF21降低脑血管内皮细胞渗透性

脑血管内皮细胞用高糖加IL-1β合并损伤处理后，加50nmol/L FGF21处理，为HG-IL-1β+FGF21组。其与对照组：正常脑血管内皮细胞和HG-IL-1β合并损伤处理后的脑血管内皮细胞进行比较。通过70KD FITC-葡聚糖检测给药24h后血管内皮细胞的渗透，检测结果如图11所示。其中，*P<0.01，与正常对照组相比；^#P<0.01，与HG-IL-1β组相比。

由图11可知，高糖加IL-1β损伤处理后的脑血管内皮细胞较未处理的正常细胞渗透性明显增大，经FGF21给药后，渗透性得到恢复，说明FGF21能够减轻高糖加IL-1β合并损伤引起的脑血管内皮细胞的通透性。

实施例2.2.4 FGF21使FGFR1磷酸化表达增加(机理)

脑血管内皮细胞用高糖加IL-1β合并损伤处理后，加50nmol/L FGF21、10nmol/LFGFR1抑制剂(PD173074)或两者结合处理，确定FGF21对FGFR1磷酸化表达的影响。图12为Western Blot检测给药2h后FGFR1磷酸化表达。(n＝5)。*P<0.01，与正常对照组相比；^#P<0.01，与HG-IL-1β组相比。

由图12可知，与HG-IL-1β组相比，HG-IL-1β+FGF21组中FGFR1水平得到显著提升，加入FGFR1抑制剂后FGF21失效，说明加入FGF21能使FGFR1磷酸化表达增加。由于FGF21信号传导需要激活FGFR，尤其是FGFR1及其共受体β-Klotho复合体，FGFR1磷酸化表达的增加可进一步印证FGF21对脑血管内皮细胞起保护作用。

实施例2.2.5 FGF21通过激活FGFR1促进PPARγ表达(机理)

将脑血管内皮细胞分别经高糖(HG)加IL-1β合并损伤、损伤后50nmol/L FGF21处理、损伤后FGF21加FGFR1抑制剂(PD173074，10nmol/L)处理，测定细胞中PPARγ的表达水平和活性，以确定FGF21对PPARγ表达的影响，及FGFR1磷酸化和PPARγ激活之间的关系。

测定结果如图13所示，其中，A图为Western Blot检测脑血管内皮细胞核中PPARγ蛋白表达水平，*P<0.05，与正常对照组相比；#P<0.05，与FGF21组相比。B图为核中PPARγ的活性。

由图13可知，HG和IL-1β的加入虽然没有明显降低PPARγ蛋白表达水平，但其活性下降。加入FGF21后，损伤后的脑血管内皮细胞中PPARγ蛋白表达水平和活性明显增加；而加入FGFR1抑制剂PD173074后，PPARγ蛋白表达水平和活性降低。由实施例2.2.4和实施例2.2.5说明，FGF21能明显促进与FGFR1表达成正相关的核中PPARγ水平和活性。

实施例2.2.6 FGF21激活PPARγ保护脑血管内皮细胞的渗透性

脑血管内皮细胞分别经高糖(HG)加IL-1β合并损伤、损伤后50nmol/L FGF21处理、损伤后10nmol/L PPARγ拮抗剂GW9662处理，损伤后FGF21加PPARγ拮抗剂GW9662联合处理，通过70KD FITC-葡聚糖检测血管内皮细胞的渗透，确定PPARγ对血管内皮细胞渗透性的影响，检测结果如图14所示，*P<0.05，与正常对照组相比。

图14显示，FGF21能减轻脑血管内皮细胞的渗透性，使用PPARγ抑制剂GW9662后，FGF21的保护作用受到抑制。结合实施例2.2.4～实施例2.2.5说明，FGF21可以激活FGFR1(或FGFR1-β-klotho复合物)，进而激活PPARγ来保护血管内皮细胞的渗透性。

实施例3 FGF21对T2D脑卒中神经炎症的影响

实施例3.1动物实验

II型糖尿病模型(T2D模型)、缺血性脑卒中模型的构建，动物实验给药和分组(db/+、db/db和db/db+FGF21组)、以及数据处理同实施例2.1。

实施例3.1.1 FGF21增加抗炎细胞-M2型小胶质细胞的数量

通过免疫组化方法测定脑中M2型小胶质细胞的标志物CD206+的免疫组化图，并定量CD206+阳性细胞数量。检测结果见图15，A图为CD206⁺/DAPI免疫组化图(其中，红色示出CD206+阳性细胞)；B图为CD206⁺阳性细胞数量的定量图。(n＝6)。*P<0.05，与db/+脑中风组相比；^#P<0.05，与db/db脑中风组相比。

其中，免疫组化方法为：选取中风后14天小鼠处死，取脑部，采用常规免疫组化方法进行测定。

CD206+阳性细胞定量：使用图像分析软件Imagepro Plus进行定量。

由图15可见，FGF21能够增加db/db T2D小鼠脑中风后，脑中抗炎因子-M2型小胶质细胞(CD206+阳性细胞)的数量。

实施例3.2细胞实验

原代大鼠小胶质细胞培养:分离出生0-2day的大鼠的皮层组织，用0.25％胰酶37℃消化15-20min，加入含10％FBS的DMEM培养基，吹打后种植于75cm²的培养瓶，每隔两天换液一次。培养8-12day后，37℃恒温摇床上摇2h，摇速218rpm。然后将上清1000g离心5min，将细胞种植于培养板或培养皿上用于实验。将细胞分成正常对照组、LPS组和LPS+FGF21组。脂多糖(LPS)的浓度为50ng/mL，FGF21的浓度为50nmol/L。

实施例3.2.1 FGF21减轻小胶质细胞的炎症反应

采用RT-PCR检测M1型小胶质细胞促炎因子iNOS和TNF-αmRNA表达，以及M2型小胶质细胞抗炎因子Arg1和IGF-1mRNA表达。结果如图16所示，其中，A.RT-PCR测定FGF21作用于LPS刺激原代大鼠小胶质细胞各因子mRNA的表达，*P<0.01，与LPS组相比；B.RT-PCR测定FGF21作用于静息态原代大鼠小胶质细胞各因子mRNA的表达。(n＝5)，*P<0.01，与正常对照组相比。

由图16可知，FGF21能够抑制经LPS刺激原代培养的大鼠小胶质细胞中M1型促炎因子基因的表达，同时增加M2型抗炎因子基因的表达。通过RT-PCR测定各因子mRNA的表达结果表明，M1型标志物iNOS mRNA明显降低，同时促炎因子TNF-αmRNA表达也显著降低，说明FGF21能抑制LPS诱导的原代大鼠小胶质细胞向M1型转化。

FGF21作用原代大鼠小胶质细胞8h，结果显示M2型标志物Arg1mRNA的表达增加，同时抗炎因子IGF-1mRNA的表达也增加，说明FGF21能促进静息态的小胶质细胞向具有神经保护作用的M2型转换。

实施例3.2.2 FGF21促进FGFR1的磷酸化抑制NFκB的活性(机理)

通过正常细胞组、LPS组、LPS+FGF21组、及LPS+FGF21+FGFR抑制剂PD173074(10nmol/L)组的对照试验，测定LPS诱导的原代大鼠小胶质细胞中FGFR1的磷酸化水平、NFκB活性及PPARγ的表达。

检测结果如图17所示，其中，A.Western blot测定p-FGFR1表达；C.Western blot测定核蛋白中细胞核转录因子PPARγ的表达，*P<0.01与对照组相比；^#P<0.01与LPS+FGF21组相比。B.试剂盒测定NFκB的活性的表达；*P<0.01与对照组相比；^#P<0.01与LPS+FGF21+抑制剂组相比。

由图17表明，FGF21作用FGFR原代大鼠小胶质细胞2h，能使其FGFR1磷酸化的表达增加，而给予FGFR抑制剂PD173074，FGFR1的磷酸化被抑制。同时，FGF21也能降低经LPS诱导的原代大鼠小胶质细胞核中NFκB的活性，增加细胞核蛋白中细胞核转录因子PPARγ的表达，加入FGFR抑制剂PD173074后，FGF21对PPARγ的表达和NFκB的活性效果均降低。

可知，FGF21能够通过促进FGFR1的磷酸化抑制LPS诱导产生的NFκB的活性，增加小胶质细胞核中PPARγ的表达水平。

实施例4 FGF21对T2D脑卒中血管和白质重塑作用的影响

实施例4.1动物实验

II型糖尿病模型(T2D模型)、缺血性脑卒中模型的构建，动物实验给药和分组(db/+、db/db和db/db+FGF21组)、以及数据处理同实施例2.1。

实施例4.1.1 FGF21减轻轴突的损伤和髓鞘的丢失

通过中风14天后，对三组小鼠脑组织取样，测定FGF21对轴突损伤和髓鞘丢失的影响。通过SMI32免疫组化法鉴定轴突，通过MBP免疫组化检测髓鞘。

检测结果见图18，其中，上图左侧是轴突损伤的标志物SMI32免疫组化图(其中，红色示出标志物SMI32)，右侧是其定量图。下图左侧是髓鞘的标志物MBP的免疫组化图(其中，绿色示出标志物MBP)，右侧是其定量图。(n＝6)。*P<0.05，与db/+脑中风组相比；^#P<0.05，与db/db脑中风组相比。

由图18可知，db/db脑卒中较db/+脑卒中加剧了轴突的损伤及髓鞘的丢失。经FGF21处理后，db/db脑卒中小鼠中轴突损伤虽未达到db/+脑卒中组的水平，但经未处理前有明显改善；而髓鞘水平可恢复至与db/+脑卒中小鼠相同水平。说明FGF21可极大减轻轴突的损伤和髓鞘的丢失。

实施例4.1.2 FGF21促进少突胶质细胞的再生

通过中风14天后，对三组小鼠脑组织取样，在相同的大脑区域，采用免疫组化法检测NG2来鉴别少突胶质细胞(OPC细胞)的再生。

检测结果见图19，其中，左侧是OPC细胞的标志物NG2的免疫组化图(其中，绿色示出标志物NG2)，右侧是其定量图。(n＝6)*P<0.05，与db/+脑中风组相比；^#P<0.05，与db/db脑中风组相比。

由图19可知，经FGF21处理后，db/db脑卒中小鼠的胶质细胞虽然低于db/+脑卒中小鼠，但显著高于未经FGF21处理的db/db脑卒中小鼠。说明FGF21能促进少突胶质细胞的再生。

实施例4.1.3 FGF21增加脑血管密度

通过中风14天后，对三组小鼠脑组织取样，测定FGF21对小鼠脑血管密度的影响。通过免疫组化法检测和量化CD31阳性细胞来分析脑血管密度。

检测结果见图20，其中，左侧是内皮细胞的标志物CD31的免疫组化图(其中，红色示出标志物CD31)，右侧是其定量图。(n＝6)，^#P<0.05，与db/db脑中风组相比。

由图20可知，经FGF21处理后，db/db脑卒中小鼠的脑血管密度高于db/+脑卒中小鼠，显著高于未经FGF21处理的db/db脑卒中小鼠。说明FGF21在增加正常血糖的脑卒中和Ⅱ型糖尿病脑卒中的脑血管密度方面具有明显的效果。

实施例4.1.4 FGF21增加脑血管片段中促血管生成因子mRNA的表达

通过中风14天后，对三组小鼠脑组织取样，测定FGF21对小鼠脑血管再生的影响。通过RT-PCR测定相关因子mRNA表达，结果见表1。其中，*P<0.05，与db/+脑中风组相比；^#P<0.05，与db/db脑中风组相比，n＝6。

表1小鼠脑微血管片段中mRNA水平

Genes	db/+	db/db	db/db+FGF21
				VEGFA	1	0.35±0.05*	0.78±0.12<sup>#</sup>
eNOS	1	1.05±0.09	2.19±0.25<sup>#</sup>
				IGF-1	1	0.50±0.06*	2.75±0.18<sup>#</sup>
IL-1β	1	1.91±0.17*	1.17±0.14<sup>#</sup>

由表1中RT-PCR结果表明，db/db T2D小鼠脑中风后FGF21给药14天，FGF21提高了促血管生成因子VEGFA、eNOS和IGF-1mRNA的表达，减少炎症因子IL-1βmRNA的表达。

实施例4.1.5 FGF21增加脑中AMPK/Nrf2的活性，从而促进脑血管和白质的重构(机理)

通过中风7天后，对三组小鼠脑组织取样，通过Western Blot和活性试剂盒测定脑中AMPK、p-AMPK和Nrf2的活性，结果见图21。其中，A.Western blot测定p-AMPK/AMPK的表达；B.p-AMPK/AMPK的定量图；C.核蛋白中Nrf2的活性。(n＝5)。*P<0.01，与db/+组相比；^#P<0.01，与db/db组相比。

由图21可知，db/db T2D中风后，p-AMPK/AMPK表达及Nrf2的活性较db/+中风显著下降。db/db T2D小鼠用FGF21以3.0mg/kg/day剂量给药7天后，能明显增加脑中AMPK的磷酸化以及细胞核中Nrf2的活性。

实施例4.2细胞实验：FGF21处理的脑血管内皮细胞条件培养液促进少突胶质细胞(OPC)增殖

添加液或内皮细胞条件培养液的收集：(1)无细胞培养基组；(2)无细胞培养基+FGF21(50nmol/L)组；(3)正常内皮细胞培养组；(4)正常内皮细胞培养+FGF21(50nmol/L)组：50nmol/L FGF21加入到内皮细胞培养基6小时后，接着更换成新的培养基，继续培养24h，最后收集内皮细胞条件培养液。将添加液或内皮细胞条件培养液转移到大鼠原代OPC细胞中，其中，(3)组和(4)组内皮细胞条件培养液与OPC细胞培养液以1:1混合，转移作用于OPC细胞，(2)组中FGF21加入水平与(4)组相当。

通过MTT法测定各组细胞的增殖情况，结果如图22所示。其中，(n＝6)，*P<0.01，与无细胞培养液相比；^#P<0.01，与内皮细胞条件培养液组相比。

由图22可知，FGF21处理的脑血管内皮细胞条件培养液对OPC细胞的增殖较其他组有明显增加，并且在此之后，换用未经FGF21处理的正常脑血管内皮细胞条件培养液培养OPC细胞，OPC细胞的增殖仍较(1)、(2)、(3)组有显著提高。说明FGF21处理的脑血管内皮细胞条件培养液可能促进OPC增殖。

实施例5 FGF21对II型糖尿病脑卒中小鼠血糖的调节

II型糖尿病模型(T2D模型)、缺血性脑卒中模型的构建，动物实验给药和分组(db/+、db/db和db/db+FGF21组)、以及数据处理同实施例2.1。

对中风前后各组小鼠的体重、血糖和糖化血红蛋白(Hb A1c)的水平进行监控。测定结果见图23，其中，中风后体重(左侧)、血糖(中间)和糖化血红蛋白(Hb A1c)(右侧)的定量图。(n＝12)。*P<0.01，与db/+脑中风组相比；^#P<0.01，与db/db脑中风组相比。

由图23可知，FGF21能够降低db/db T2D小鼠脑中风后的高血糖。与对照组相比，体重略有降低，但无明显改变。但从第3天到第14天，血液中葡萄糖的浓度明显降低。同时FGF21也能明显地降低糖化血红蛋白的水平。这些数据表明FGF21能调节db/db T2D小鼠脑中风后糖的代谢功能。

SEQUENCE LISTING

<110> 温州市生物医药协同创新中心

麻省总医院(Massachusetts General Hospital)

<120> 人成纤维生长因子21在制备用于治疗脑卒中药物中的应用

<130> 2010

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 561

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catatgcatc cgattccgga tagcagcccg ctgctgcagt ttggtggtca ggtgcgtcag 60

cgttatctgt ataccgatga tgcgcagcag accgaagcgc atctggaaat tcgtgaagat 120

ggtaccgtgg gtggtgcggc ggatcagagc ccggaaagcc tgctgcagct gaaagcgctg 180

aaaccgggtg tgattcagat tctgggtgtg aaaaccagcc gttttctgtg ccagcgtccg 240

gatggtgcgc tgtatggtag cctgcatttt gatccggaag cgtgcagctt tcgtgaactg 300

ctgctggaag atggttataa tgtgtatcag agcgaagcgc atggtctgcc gctgcatctg 360

ccgggtaata aaagcccgca tcgtgatccg gcgccgcgtg gtccggcgcg ttttctgccg 420

ctgccgggtc tgccgccggc gctgccggaa ccgccgggta ttctggcgcc gcagccgccg 480

gatgtgggta gcagcgatcc gctgagcatg gtgggtccga gccagggtcg tagcccgagc 540

tatgcgagct aatgaggatc c 561

Claims (2)

1.人成纤维生长因子21在制备增加II型糖尿病且大脑中动脉闭塞的小鼠脑血管密度的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码人成纤维生长因子21的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

Images