CN107033247A - 复合物、蛋白质及二者的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种复合物、蛋白质及二者的制备方法，涉及生物医药的技术领域。本发明提供的复合物稳定性强，在利用胰高血糖素样肽‑1达到长效降血糖功能的基础上，实现能够通过口服的方式给药，为糖尿病相关药物的进一步开发奠定了基础，值得后续的继续研发；本发明提供的蛋白质的制备方法，在75‑85℃的条件下进行物理脱氧，能够大大提高蛋白质的纯度；本发明提供的蛋白质，利用了本发明提供的蛋白质的制备方法制备得到，纯度达到80％以上。并且，通过本发明提供的蛋白质纯化办法能够除去酵母菌发酵引入的热毒蛋白和核酸物质，为蛋白质作为药物制剂的应用后期的安全性和质量研究带来便利。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种复合物、蛋白质及二者的制备方法。
背景技术
糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是以胰岛素相对或绝对不足为特征的代谢性疾病，胰岛素相对或绝对不足引发高血糖，进而导致三大营养物质代谢紊乱，最终影响患者正常生理功能并且引起并发症。全球糖尿病患者与日俱增，预计2030年将达到4.39亿。
胰高血糖素样肽-1是一个含有37个氨基酸的、可对食物摄入作出应答的肽，是由肠L-细胞分泌的。已经发现胰高血糖素样肽-1可刺激胰岛素分泌(促胰岛素活性)，从而引起细胞对葡萄糖的吸收和血清葡萄糖水平下降。然而，胰高血糖素样肽-1活性很低，且血清半衰期仅为3-5分钟。目前，已有研究采用融合蛋白技术以延长胰高血糖素样肽-1在体内的留存时间，但是需每天在饭前注射给药，在临床使用中十分不方便。
因此，开发一种能够口服的，利用胰高血糖素样肽-1达到长效降血糖功能的稳定的蛋白质复合物日益成为研究的热点。
同时，提供一种高纯度的，与胰高血糖素样肽-1能够形成稳定复合物的蛋白质也尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种复合物，以缓解现有技术中存在的利用胰高血糖素样肽-1降糖不能实现口服，且时效短的技术问题。本发明的第二个目的在于提供一种复合物的制备方法。本发明的第三个目的在于提供一种蛋白质的制备方法，以缓解现有技术中存在的纯化方法纯化得到的蛋白质纯度低的技术问题。本发明的第四个目的在于提供一种蛋白质，以缓解现有技术中存在的蛋白质纯度低的技术问题。
本发明提供的一种复合物，包括蛋白质和胰高血糖样素肽-1。
进一步地，所述蛋白质是如下(1)、(2)或(3)：
(1)由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(3)将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由其衍生的蛋白质。
本发明还提供了一种上述的复合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤(a)：将所述蛋白质与所述胰高血糖样素肽-1按照摩尔比例1:8-4:1溶于mops缓冲液中，得到混合液，并调整pH至1.7-10.8；
步骤(b)：将所述混合液于25-35℃进行孵育后，充分震荡；
步骤(c)：将经震荡的混合液进行超生波处理；
步骤(d)：冷藏降温过夜。
进一步地，所述步骤(b)中进行孵育的时间为10-30min，震荡的时间为3-10min。
进一步地，所述步骤(d)中超声波处理的时间为1-5min，所述冷藏的温度为4℃。
本发明还提供了上述的蛋白质的制备方法，包括：
调节酵母发酵液的pH至2.0-4.0，放置8-12h后，加热至75-85℃，进行物理脱氧，离心并收集沉淀。
进一步地，所述酵母发酵液为Pichia酵母发酵液。
进一步地，所述物理脱氧的方法为将惰性气体鼓泡入所述Pichia酵母发酵液的内部。
进一步地，所述物理脱氧的时间为2-6h。
另外，本发明还提供了一种蛋白质，应用上述的制备方法制备得到。
本发明提供的复合物稳定性强，在利用胰高血糖素样肽-1达到长效降血糖功能的基础上，实现能够通过口服的方式给药，为糖尿病相关药物的进一步开发奠定了基础，值得后续的继续研发；本发明提供的蛋白质的制备方法，在75-85℃的条件下进行物理脱氧，能够大大提高蛋白质的纯度；本发明提供的蛋白质，利用了本发明提供的蛋白质的制备方法制备得到，纯度达到80％以上。并且，通过本发明提供的蛋白质纯化办法能够除去酵母菌发酵引入的热毒蛋白和核酸物质，为蛋白质作为药物制剂的应用后期的安全性和质量研究带来便利。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A为本发明提供的蛋白质的液相色谱结果图；
图1B为胰高血糖样素肽-1的液相色谱结果图；
图1C为本发明提供的蛋白质液相色谱图与胰高血糖素样肽-1液相色谱图的叠加图；
图1D为本发明提供的蛋白质与胰高血糖样素肽-1在摩尔比例为1：1时形成复合物的液相色谱结果图；
图1E为本发明提供的蛋白质与胰高血糖样素肽-1在摩尔比例为4:1时形成复合物的液相色谱结果图；
图1F为本发明提供的蛋白质与胰高血糖样素肽-1在摩尔比例为8:1时形成复合物的液相色谱结果图；
图2A为大鼠离体胰岛细胞胰岛素血浆含量结果图；
图2B为大鼠离体胰岛细胞cAMP积累水平结果图；
图3A为单次给发明提供的复合物的血糖调控结果图；
图3B为多次给发明提供的复合物的糖耐量实验结果图；
图4A为本发明提供的复合物在糖尿病小鼠体内的胰岛素刺激试验结果图；
图4B为模型动物单次给发明提供的复合物后血糖水平测定结果图；
图5A为100nM的复合物的TEM电镜扫描结果图；
图5B为10μM的复合物的TEM电镜扫描结果图；
图5C为1mM的复合物的TEM电镜扫描结果图；
图5D为DLS测定本发明提供的复合物纳米球直径试验结果图；
图6为本发明提供的复合物结果模拟计算图；
图7为不同pH值条件下对本发明提供的复合物进行滴定成膜试验的结果图；
图8A为正常培养基培养的INS-1细胞株；
图8B为经过本发明提供的复合物口服42天后的胰岛组织；
图9为本发明提供的制备方法制备得到的蛋白质经硫酸锌处理后的电泳结果图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
传统的蛋白纯化，一般采用直接超滤或液相纯化的方法，在收率和初纯度上效果均不理想，不仅浪费原材料，而且增加了能源及人工成本。
本发明针对现有技术中，蛋白收率和初纯度效果不理想的技术问题，提供了一种蛋白质的制备方法，包括：
调节酵母发酵液的pH至2.0-4.0，放置8-12h后，加热至75-85℃，进行物理脱氧，离心并收集沉淀。
其中，pH值例如可以为，但不限于2.0,3.0或4.0；放置时间例如可以为，但不限于8h，9h，10h，11h或12h；加热温度例如可以为，但不限于75℃，80℃或85℃。
在本发明中，蛋白质是如下(1)、(2)或(3)：
(1)QQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV(SEQ ID NO.1)；
(2)QQCTTGQLQCCESTSTANDPATSKLLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV(SEQ ID NO.2)；
(3)将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由其衍生的蛋白质，
例如可以为，但不限于：
QQCTTGQLQCCKSTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV(SEQ ID NO.3)或者
QQCTTGQLQCCKSTSTANDPATSKLLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV(SEQ ID NO.4)。
在本发明中，酵母发酵液为Pichia酵母发酵液。
在本发明中，物理脱氧的方法为将惰性气体鼓泡入所述Pichia酵母发酵液的内部。
其中，惰性气体可以为氮气或氩气，优选为氮气。
在另一种实施方式中，物理脱氧的方法为减压真空抽气脱氧。
在本发明中，物理脱氧的时间为2-6h。
其中，物理脱氧的时间例如可以为，但不限于2h，3h，4h，5h或6h。
此外，经过本发明提供的蛋白质制备方法制备得到的蛋白质沉淀，还可以用硫酸锌进行一次处理，进一步提升蛋白质的终纯度。
其中，硫酸锌的浓度为1.3M。
本发明提供的蛋白质的制备方法，在75-85℃的条件下进行物理脱氧，经过这个操作，相比于传统的直接超滤及液相纯化办法在收率和初纯度上具有明显的提高，传统方法在完成超滤或液相纯化后蛋白纯度仅为10％，而采用本发明描述的热鼓泡方法得到的蛋白纯度可达80％以上，在经过一次的硫酸锌(1.3M)沉淀处理后，可使蛋白质的终纯度>90％，满足作为复合物制剂的要求。并且，通过本发明提供的蛋白质纯化办法能够除去酵母菌发酵引入的热毒蛋白和核酸物质，为蛋白质作为药物制剂的应用后期的安全性和质量研究带来便利。
本发明还提供了一种蛋白质，应用了上述的制备方法制备得到。
本发明还提供了一种复合物，复合物包括上述的蛋白质和胰高血糖样素肽-1。
另外，本发明还提供了上述的复合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤(a)：将蛋白质与胰高血糖样素肽-1按照摩尔比例1:8-4:1溶于mops缓冲液中，得到混合液，并调整pH至1.7-10.8；
步骤(b)：将混合液于25-35℃进行孵育后，充分震荡；
步骤(c)：将经震荡的混合液进行超生波处理；
步骤(d)：冷藏降温过夜。
其中，在步骤(a)中，蛋白质与胰高血糖样素肽-1的摩尔比例例如可以为，但不限于1:8,1:5,1:3，1:1,2:1或4:1；调整的pH例如可以为，但不限于1.7,3.5,6.08,6.8或10.8。
作为一种替换方式，也可将蛋白质与胰高血糖样素肽-1按照摩尔比例1:8-4:1溶于生理盐水中，得到混合液。
其中，在步骤(b)中，进行孵育的温度例如可以为，但不限于25℃，30℃或35℃；进行孵育的时间例如可以为，但不限于10min，20min或30min；震荡的时间例如可以为，但不限于3min，5min或10min。
其中，在步骤(d)中，超声波处理的时间例如可以为，但不限于1min，3min或5min；冷藏的温度为4℃。
利用本发明提供的制备方法制备得到的复合物，稳定性强，在利用胰高血糖素样肽-1达到长效降血糖功能的基础上，实现能够通过口服的方式给药，为糖尿病相关药物的进一步开发奠定了基础，值得后续的继续研发。
本发明的方法可以在传统的市售设备或装置中进行，本领域普通技术人员可以根据本发明方法的条件自行设计所用的设备或装置。所用试剂均为市售，也可以自制。
下面将结合实施例和对比例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1pH值
一种蛋白质的制备方法，包括：
实施例1-1
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0；
实施例1-2
调节Pichia酵母发酵液的pH至2.0；
实施例1-3
调节Pichia酵母发酵液的pH至4.0；
实施例1-4
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0；
对比例1-1
调节Pichia酵母发酵液的pH至1.0；
对比例1-2
调节Pichia酵母发酵液的pH至5.0；
将上述实施例1-1至1-4及对比例1-1和1-2的酵母发酵液放置10h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。其中实施例1-4将沉淀用1.3M的硫酸锌进行一次处理。
为了检验Pichia酵母发酵液不同的pH值对蛋白质的收率和纯度的影响，分别应用实施例1-1至1-4及对比例1-1和1-2提供的制备方法制备蛋白质，并应用western-blot的检测手段对制备所得的蛋白质的收率和纯度进行检测，结果见表1。
表1 Pichia酵母发酵液不同的pH值对蛋白质的收率和纯度的影响
| 收率(％) | 纯度(％) | |
| 实施例1-1 | 46 | 88 |
| 实施例1-2 | 38 | 82 |
| 实施例1-3 | 41 | 83 |
| 实施例1-4 | 39 | 95 |
| 对比例1-1 | 19 | 55 |
| 对比例1-2 | 22 | 68 |
由表1可以看出，应用实施例1-1至1-4提供的制备方法制备蛋白质的收率和纯度较现有技术均有显著的提高。当Pichia酵母发酵液的pH值为3.0，并将沉淀用1.3M的硫酸锌进行一次处理时，收率和纯度最高，为优选pH值。
实施例2放置时间
一种蛋白质的制备方法，包括：调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，
实施例2-1
放置8h；
实施例2-2
放置9h；
实施例2-3
放置11h；
实施例2-4
放置12h；。
对比例2-1
放置5h；
对比例2-2
放置15h；
将上述实施例2-1至2-3和对比例2-1和2-2放置相应时间后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
为了检验不同的放置时间对蛋白质的收率和纯度的影响，分别应用实施例1-1、2-1至2-4及对比例2-1和2-2提供的制备方法制备蛋白质，并应用western-blot的检测手段对制备所得的蛋白质的收率和纯度进行检测，结果见表2。
表2 不同的放置时间对蛋白质的收率和纯度的影响
由表2可以看出，应用实施例2-1至2-4提供的制备方法制备蛋白质的收率和纯度较现有技术均有显著的提高。当放置的时间为10h时，收率和纯度最高，为优选放置时间。
实施例3加热温度
一种蛋白质的制备方法，包括：调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置10h。
实施例3-1
加热至75℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部。
实施例3-2
加热至85℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部。
对比例3-1
加热至70℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部。
对比例3-2
加热至90℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部。
上述实施例3-1和3-2，对比例3-1和3-2处理的发酵液，氮气鼓泡4h后离心并收集沉淀。
为了检验不同的加热温度对蛋白质的收率和纯度的影响，分别应用实施例1-1、3-1和3-2及对比例3-1和3-2提供的制备方法制备蛋白质，并应用western-blot的检测手段对制备所得的蛋白质的收率和纯度进行检测，结果见表3。
表3 不同的加热温度对蛋白质的收率和纯度的影响
由表3可以看出，应用实施例3-1和3-2提供的制备方法制备蛋白质的收率和纯度较现有技术均有显著的提高。当加热温度为80℃时，收率和纯度最高，为优选加热温度。
实施例4物理脱氧的时间
一种蛋白质的制备方法，包括：调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置10h后，加热至80℃。
实施例4-1
同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，2h后离心并收集沉淀。
实施例4-2
同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，3h后离心并收集沉淀。
实施例4-3
同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，5h后离心并收集沉淀。
实施例4-4
同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，6h后离心并收集沉淀。
对比例4-1
同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，1h后离心并收集沉淀。
对比例4-2
同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，7h后离心并收集沉淀。
为了检验物理脱氧的不同时间对蛋白质的收率和纯度的影响，分别应用实施例1-1、4-1至4-4及对比例4-1和4-2提供的制备方法制备蛋白质，并应用western-blot的检测手段对制备所得的蛋白质的收率和纯度进行检测，结果见表4。
表4 物理脱氧的不同时间对蛋白质的收率和纯度的影响
由表4可以看出，应用实施例4-1至4-4提供的制备方法制备蛋白质的收率和纯度较现有技术均有显著的提高。当物理脱氧的时间为4h时，收率和纯度最高，为优选物理脱氧时间。
由以上实施例及对比例可以看出，当调节Pichia酵母发酵液的pH为3.0，放置时间为10h，加热温度为80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部4h，制备得到的蛋白质收率和纯度最高，为优选制备条件。
利用优选蛋白制备条件制备得到的蛋白质，与胰高血糖样素肽-1制备得到复合物。
实施例5蛋白质与胰高血糖样素肽-1的摩尔比例
一种蛋白质与胰高血糖样素肽-1复合物的制备方法，包括：
实施例5-1
将蛋白质与胰高血糖样素肽-1按照摩尔比例1:3溶于mops缓冲液中。
实施例5-2
将蛋白质与胰高血糖样素肽-1按照摩尔比例1:5溶于mops缓冲液中。
实施例5-3
将蛋白质与胰高血糖样素肽-1按照摩尔比例1:8溶于mops缓冲液中。
实施例5-4
将蛋白质与胰高血糖样素肽-1按照摩尔比例1:1溶于mops缓冲液中。
实施例5-5
将蛋白质与胰高血糖样素肽-1按照摩尔比例2:1溶于mops缓冲液中。
实施例5-6
将蛋白质与胰高血糖样素肽-1按照摩尔比例4:1溶于mops缓冲液中。
对比例5-1
将蛋白质与胰高血糖样素肽-1按照摩尔比例1:10溶于mops缓冲液中。
对比例5-2
将蛋白质与胰高血糖样素肽-1按照摩尔比例10:1溶于mops缓冲液中。
将上述实施例5-1至5-6及对比例5-1和5-2的混合液调整pH至6.08后，于30℃进行孵育20min，充分震荡5min，之后超声波处理2min后，于4℃冷藏降温过夜。
为了验证蛋白质与胰高血糖样素肽-1的不同摩尔比例对制备得到的复合物的稳定性及包封率的影响，分别应用实施例5-1至5-6及对比例5-1和5-2提供的制备方法制备复合物，通过液相法检测制备所得的复合物的稳定性，并应用透析法检测制备所得的复合物的包封率，检测结果见表5。
表5 蛋白质与胰高血糖样素肽-1的摩尔比例对复合物的影响
| 稳定性(％) | 包封率(％) | |
| 实施例5-1 | 88 | 91 |
| 实施例5-2 | 77 | 84 |
| 实施例5-3 | 83 | 88 |
| 实施例5-4 | 81 | 88 |
| 实施例5-5 | 76 | 86 |
| 实施例5-6 | 75 | 79 |
| 对比例5-1 | 25 | 15 |
| 对比例5-2 | 24 | 19 |
由表5可以看出，应用实施例5-1至5-6提供的制备方法制备复合物的稳定性和包封率均处于较高水平。当蛋白质与胰高血糖样素肽-1的摩尔比例为1:3时，稳定性和包封率最高，为优选摩尔比例。
实施例6孵育温度
一种蛋白质与胰高血糖样素肽-1复合物的制备方法，包括：将蛋白质与胰高血糖样素肽-1按照摩尔比例1:3溶于mops缓冲液中，得到混合液。
实施例6-1
实施例6得到的混合液于25℃进行孵育。
实施例6-2
实施例6得到的混合液于35℃进行孵育。
对比例6-1
实施例6得到的混合液于20℃进行孵育。
对比例6-2
实施例6得到的混合液于40℃进行孵育。
将上述实施例6-1、6-2及对比例6-1和6-2的混合液调整pH为6.08后，孵育20min，充分震荡5min，之后超声波处理2min后，于4℃冷藏降温过夜。
为了验证不同孵育温度对制备得到的复合物的稳定性及包封率的影响，分别应用实施例5-1、6-1和6-2及对比例6-1和6-2提供的制备方法制备复合物，通过实施例5提供的方法检测制备所得的复合物的稳定性和包封率，检测结果见表6。
表6 不同孵育温度对复合物的稳定性及包封率的影响
| 稳定性(％) | 包封率(％) | |
| 实施例5-1 | 88 | 91 |
| 实施例6-1 | 79 | 86 |
| 实施例6-2 | 80 | 86 |
| 对比例6-1 | 24 | 43 |
| 对比例6-2 | 31 | 51 |
由表6可以看出，应用实施例6-1和6-2提供的制备方法制备复合物的稳定性和包封率均处于较高水平。当孵育温度为30℃时，稳定性和包封率最高，为优选孵育温度。
实施例7孵育时间
一种蛋白质与胰高血糖样素肽-1复合物的制备方法，包括：将蛋白质与胰高血糖样素肽-1按照摩尔比例1:3溶于mops缓冲液中，得到混合液，调整混合液的pH至6.08，将混合液于30℃进行孵育。
实施例7-1
将实施例7得到的混合液孵育10min。
实施例7-2
将实施例7得到的混合液孵育30min。
对比例7-1
将实施例7得到的混合液孵育5min。
对比例7-2
将实施例7得到的混合液孵育40min。
将上述实施例7-1和7-2及对比例7-1和7-2的混合液充分震荡5min，之后超声波处理2min后，于4℃冷藏降温过夜。
为了验证不同孵育时间对制备得到的复合物的稳定性及包封率的影响，分别应用实施例5-1、7-1和7-2及对比例7-1和7-2提供的制备方法制备复合物，通过实施例5提供的方法检测制备所得的复合物的稳定性和包封率，检测结果见表7。
表7 不同孵育时间对复合物的稳定性及包封率的影响
| 稳定性(％) | 包封率(％) | |
| 实施例5-1 | 88 | 91 |
| 实施例7-1 | 81 | 90 |
| 实施例7-2 | 85 | 85 |
| 对比例7-1 | 34 | 41 |
| 对比例7-2 | 33 | 44 |
由表7可以看出，应用实施例7-1和7-2提供的制备方法制备复合物的稳定性和包封率均处于较高水平。当孵育时间为20min时，稳定性和包封率最高，为优选孵育时间。
实施例8孵育pH值
一种蛋白质与胰高血糖样素肽-1复合物的制备方法，包括：将蛋白质与胰高血糖样素肽-1按照摩尔比例1:3溶于mops缓冲液中，得到混合液。
实施例8-1
将实施例8得到的混合液调节pH至1.7。
实施例8-2
将实施例8得到的混合液调节pH至3.5。
实施例8-3
将实施例8得到的混合液调节pH至6.8。
实施例8-4
将实施例8得到的混合液调节pH至10.8。
对比例8-1
将实施例8得到的混合液调节pH至1.2。
对比例8-2
将实施例8得到的混合液调节pH至11.5。
将上述实施例8-1至8-4及对比例8-1和8-2的混合液于30℃进行孵育20min。充分震荡5min，之后超声波处理2min后，于4℃冷藏降温过夜。
为了验证不同孵育时间对制备得到的复合物的稳定性及包封率的影响，分别应用实施例5-1、8-1至8-4及对比例8-1和8-2提供的制备方法制备复合物，通过实施例5提供的方法检测制备所得的复合物的稳定性和包封率，检测结果见表8。
表8 不同孵育pH对复合物的稳定性及包封率的影响
同时，也开展了不同pH值对于复合物形成纳米球颗粒的影响，具体试验操作为：分别在pH为1.7、3.5、6.08、6.8及10.8的条件下采用滴定成膜的试验，证实复合物在pH＝6.08是具有良好的纳米球形态，结果如图7所示。
由表8及图7可以看出，应用实施例8-1至8-4提供的制备方法制备复合物的稳定性和包封率均处于较高水平。当孵育pH为6.08时，稳定性和包封率最高，为优选孵育时间。
为了进一步说明本发明的有益效果，结合上述优选条件，即用实施例1-4、2-1、3-1和4-1提供的各条件制备蛋白质，制备得到的蛋白质的电泳结果如图9所示，其中M为蛋白maker，lane 1为蛋白质终产品，lane 2为Pichia酵母发酵液。并用所得蛋白质与胰高血糖样素肽-1应用实施例5-1和实施例6-1提供的优选条件制备复合物，并通过以下实验检测制备得到的复合物的各项指标。
1.液相色谱
采用液相色谱方法，检测利用优选条件制备得到的复合物的形成及最佳的复合物装载比例。结果如图1A、1B、1C、1D、1E和1F所示。其中，从图1A中可以看出，蛋白质的滞留时间为3.3min；从图1B中可以看出，胰高血糖样素肽-1的滞留时间为5.2min；从图1D中可以看出，随着胰高血糖样素肽-1：蛋白质的摩尔比的提高，液相色谱中18.5min清晰可见复合物的形成；从图1E和1F中可以看出，在蛋白质：胰高血糖样素肽-1的摩尔比例为4:1(图1E)或8:1(图1F)时，最终胰高血糖样素肽-1均可完全被蛋白质包裹形成复合物。
2.生理活性测定
蛋白质与胰高血糖样素肽-1复合物的生理活性评价标准包括：胰岛素刺激分泌功能、cAMP大量积累的结果以及血糖调控功能。本申请严格按照高血糖样素肽-1类似物的评价方法对复合物进行了上述评价。除此之外，添加了动物体内口服给本发明提供的复合物降血糖的评价方法。总体结果证实：复合物具有可口服、长效的降血糖功能，值得后续的继续开发。
2.1离体试验证实复合物的胰岛素刺激分泌和cAMP刺激积累功能
胰岛素刺激分泌：取大鼠离体胰岛细胞，分为对照组和复合物组，每组设3个重复。对照组细胞培养于生理盐水中；复合物组细胞培养于15mmol/L葡萄糖溶液中48h后，加入55μg/L复合物20μL继续培养8小时。收集两组胰岛细胞，分别加入15mmol/L葡萄糖溶液刺激培养1h。收集培养液，用放射免疫法测定其基础及葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平。结果见图2A。
cAMP刺激积累功能：取大鼠离体胰岛细胞，分为对照组，胰高血糖样素肽-1组和复合物组，每组设3个重复。对照组细胞培养于生理盐水中；胰高血糖样素肽-1组细胞培养于15mmol/L葡萄糖溶液中48h后，加入55μg/L胰高血糖样素肽-1溶液，继续培养8h；复合物组细胞培养于15mmol/L葡萄糖溶液中48h后，加入55μg/L复合物20μL继续培养8小时。收集各组胰岛细胞，分别加入15mmol/L葡萄糖溶液刺激培养1h。收集培养液，用放射免疫法测定其基础及葡萄糖刺激的cAMP累计功能。结果见图2B。
其中，图2A为胰岛素血浆含量结果图。试验中血浆胰岛素含量采用放射免疫试剂盒(EIA-胰岛素试剂盒)操作。从图中可以看出，相比于对照组(▼)，复合物组(□)具有明显的胰岛素刺激功能；图2B为cAMP积累水平结果图，从图中可以看出，相比于对照组(○)和胰高血糖样素肽-1组(●)，复合物组(□)大大提高了cAMP的堆积量。由此可知，本发明提供的复合物，具有刺激胰岛素分泌和cAMP的活性功能，且在稳定性上大大优于单纯使用胰高血糖样素肽-1。
2.2正常小鼠的复合物降血糖功能
选用昆明种小鼠，体重20±2g，进行糖耐量研究。
单次给复合物实验：将小鼠分为胰高血糖样素肽-1组和复合物组，每组3只，设3个重复。复合物组小鼠通过灌胃的方法给予溶有本发明提供的复合物的生理盐水(500μg/kg)，胰高血糖样素肽-1组小鼠通过灌胃的方法给予溶有胰高血糖样素肽-1的生理盐水(500μg/kg)，复合物组小鼠灌胃后即刻饲喂拌有糖的饲料(3.5g/kg)，30min-120h分段测量小鼠血糖值。结果如图3A所示。
多次给复合物实验：将小鼠分为胰高血糖样素肽-1组和复合物组，每组3只，设3个重复。复合物组小鼠饲喂拌有本发明提供的复合物的饲料(500μg/kg)，胰高血糖样素肽-1组小鼠饲喂拌有胰高血糖样素肽-1的饲料(500μg/kg)，给复合物30min后饲喂拌有糖的饲料(3.5g/kg)，每天同一时间测量血糖，持续35天。结果如图3B所示(●为复合物组，□为胰高血糖样素肽-1组)。
由图3A的单次给复合物的血糖调控结果可知，单次口服给复合物后，复合物组小鼠的血糖在24小时内仍处于正常范围；由图3B的多次给复合物的糖耐量实验结果可知，复合物组小鼠35天实验后，体内糖化血糖蛋白下降1.09±0.06％。
由此可知，本发明提供的复合物具有稳定的长效降血糖功能。
2.3糖尿病小鼠的复合物降血糖功能
选择单基因遗传的自发性糖尿病小鼠db/db，体重：20±2g，将小鼠分为胰高血糖样素肽-1组和复合物组，每组6只，设3个重复。复合物组小鼠每天饲喂拌有本发明提供的复合物的饲料(500μg/kg)，胰高血糖样素肽-1组小鼠每天饲喂拌有胰高血糖样素肽-1的饲料(500μg/kg)，每天测量血糖水平和胰岛素水平。结果如图4A和4B所示(●为复合物组，○为胰高血糖样素肽-1组)。
其中，图4A为本发明提供的复合物在糖尿病小鼠体内的胰岛素刺激试验，结果表明，复合物增加糖尿病小鼠的血糖敏感性；图4B为模型动物单次给发明提供的复合物后血糖水平测定，结果表明复合物单次给复合物后在20小时内保持了良好的血糖调控能力。
3.复合物的形态学研究
采用透射电子显微镜(TEM)以及动态光散射(DLS)进行针对复合物的形态学研究，结果如图5A、5B、5C及5D所示。
如图5A所示，低浓度(100nM)的复合物的TEM电镜扫描图显示复合物成纳米球状分布；图5B为10μM的复合物的TEM电镜扫描图，图5C为1mM的复合物的TEM电镜扫描图，由图5B和5C可知，当复合物的浓度升高后，TEM扫描图发现这些单独的纳米球还具有相互集结的功能，从而形成了一层稳定的纳米球形网状结构；如图5D所示，采用DLS测定纳米球直径试验结果，证实复合物的大小为80nm。
结果表明，通过控制复合物的自组装条件，最终可形成均一、稳定的纳米颗粒结构。
本申请同时对复合物开展了结果模拟计算，结果证实了本发明提供的蛋白质与胰高血糖样素肽-1可形成纳米球形复合物，如图6所示。
4.复合物的胰岛细胞恢复功能
由于胰高血糖样素肽-1本身具有抑制胰岛细胞凋亡的功能，并通过这个功能来恢复受损的胰岛细胞。因此，本申请通过评价胰岛细胞的体积来评价复合物的胰岛恢复功能。图8A是正常培养基培养的INS-1细胞株，可以看出前期的高糖处理导致的胰岛萎缩并没有因为回到低糖条件而得到恢复，图8B是经过复合物口服42天后的胰岛组织。结果显示本发明提供的复合物能够明显恢复高糖导致的胰岛损伤。
5.复合物的毒性
本申请进行了小鼠的急毒和长毒试验，结果显示复合物不具备血液和生理毒性。
5.1体重及一般观察
将SC213雄性小鼠分为空白组，溶剂组，低剂量组，中剂量组和高剂量组，每组30只，设3个重复。各组小鼠经皮下给复合物(低剂量组：5mg/kg体重；中剂量组：15mg/kg体重；高剂量组：50mg/kg体重)30天后，测量各组小鼠的体重，结果见表8。
表8 SC213小鼠皮下给复合物30天长期毒性体重表
由表8结果可知，SC213小鼠皮下给本发明提供的复合物一个月后对体重的影响不明显，各组动物体重给复合物中期较空白对照组比增长缓慢，后期恢复；摄入的食水量随着体重的变化有所变化。
5.2脏器指数结果
将SC213雄性小鼠分为空白组，溶剂组，低剂量组，中剂量组和高剂量组，每组20只，设3个重复。各组小鼠经皮下给复合物30天后，通过测定小鼠体重与脏器重量获得各组小鼠的长期毒性脏器指数，结果如表9所示。
表9 SC213小鼠皮下给复合物30天长期毒性脏器指数表
由表9结果可知，SC213小鼠皮下给本发明提供的复合物一个月后脏器指数结果显示，对小鼠的胸腺指数呈剂量相关的增加，高剂量组与空白对照组比具有统计学意义。
5.3生化检测
将SC213雄性小鼠分为空白组，溶剂组，低剂量组，中剂量组和高剂量组，每组8只，设3个重复。各组小鼠经皮下给复合物30天后，采用生化仪测定各组小鼠的长期毒性血液生化指数，结果如表10和表11所示。
表10 SC213小鼠皮下给复合物30天长期毒性血液生化测定表
表11 SC213小鼠皮下给复合物30天长期毒性血液生化测定续表
由表10和表11结果可知，SC213小鼠皮下给复合物一个月后血液生化指标提示无明显与剂量相关的毒性；各组小鼠的血糖值随剂量的增加有所降低，有一定的剂量相关性。
5.4血液学检测
将SC213雄性小鼠分为空白组，溶剂组，低剂量组，中剂量组和高剂量组，每组7只，设3个重复。各组小鼠经皮下给复合物30天后，采用自动生化仪测定各组小鼠的长期毒性血液相关指数，结果如表12至表16所示。
表12 SC213小鼠皮下给复合物30天长期毒性血液学测定表
表13 SC213小鼠皮下给复合物30天长期毒性血液学测定续表-1
表14 SC213小鼠皮下给复合物30天长期毒性血液学测定续表-2
表15 SC213小鼠皮下给复合物30天长期毒性血液学测定续表-3
表16 SC213小鼠皮下给复合物30天长期毒性血液学测定续表-4
注：*表示与空白对照组相比P<0.05,具有显著性差异，**表示与空白对照组比P<0.01，具有极显著性差异。
由表12至表16的结果可知，SC213小鼠皮下给复合物一个月后血液学指标提示无明显的与剂量相关的毒性。
因此，利用本发明提供制备方法制备的蛋白质与胰高血糖素样肽-1的复合物稳定性强，在利用胰高血糖素样肽-1达到长效降血糖功能的基础上，实现能够通过口服的方式给药，为糖尿病相关药物的进一步开发奠定了基础，值得后续的继续研发。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津世传生物科技有限公司
<120> 复合物、蛋白质及二者的制备方法
<160> 4
<210> 1
<211> 83
<212> PRT
<213> Pichia酵母
<400> 1
Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val
20 25 30
Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser
35 40 45
Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys
50 55 60
Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro
65 70 75 80
Val Asn Val
<210> 2
<211> 83
<212> PRT
<213> Pichia酵母
<400> 2
Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Lys Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val
20 25 30
Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser
35 40 45
Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys
50 55 60
Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro
65 70 75 80
Val Asn Val
<210> 3
<211> 83
<212> PRT
<213> Pichia酵母
<400> 3
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1 5 10 15
Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val
20 25 30
Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser
35 40 45
Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys
50 55 60
Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro
65 70 75 80
Val Asn Val
<210> 4
<211> 83
<212> PRT
<213> Pichia酵母
<400> 4
Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys Lys Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Lys Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val
20 25 30
Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser
35 40 45
Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys
50 55 60
Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro
65 70 75 80
Val Asn Val
Claims (10)
1.一种复合物，其特征在于，所述复合物包括蛋白质和胰高血糖样素肽-1。
2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述蛋白质是如下(1)、(2)或(3)：
(1)由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(3)将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由其衍生的蛋白质。
3.如权利要求1或2所述的复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
步骤(a)：将所述蛋白质与所述胰高血糖样素肽-1按照摩尔比例1:8-4:1溶于mops缓冲液中，得到混合液，并调整pH至1.7-10.8；
步骤(b)：将所述混合液于25-35℃进行孵育后，充分震荡；
步骤(c)：将经震荡的混合液进行超生波处理；
步骤(d)：冷藏降温过夜。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中进行孵育的时间为10-30min，震荡的时间为3-10min。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)中超声波处理的时间为1-5min，所述冷藏的温度为4℃。
6.如权利要求2所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
调节酵母发酵液的pH至2.0-4.0，放置8-12h后，加热至75-85℃，进行物理脱氧，离心并收集沉淀。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酵母发酵液为Pichia酵母发酵液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述物理脱氧的方法为将惰性气体鼓泡入所述Pichia酵母发酵液的内部。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述物理脱氧的时间为2-6h。
10.一种蛋白质，其特征在于，应用权利要求6-9任一项所述的制备方法制备得到。
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| CN201710256655.9A CN107033247A (zh) | 2017-04-18 | 2017-04-18 | 复合物、蛋白质及二者的制备方法 |
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