CN107007835B - 载普鲁士蓝靶向纳米复合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

发明公开了载普鲁士蓝靶向纳米复合物，包括其内部包裹有普鲁士蓝纳米粒子的PEG化叶酸靶向乳酸/羟基乙酸共聚物外壳，PEG化叶酸靶向乳酸/羟基乙酸共聚物外壳上分布有紫杉醇。本发明要解决的技术问题是提供一种可实现光声/磁共振多模态显像，进而实现影像介导的治疗，综合***，提高肿瘤治疗疗效的载普鲁士蓝靶向纳米复合物及其制备方法。

Description

载普鲁士蓝靶向纳米复合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及高分子化合物领域，具体涉及一种载普鲁士蓝靶向纳米复合物及其制备方法。
背景技术
乳腺癌(breast cancer)是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，为肿瘤相关性死亡的第二大原因，仅次于肺癌，严重影响妇女身心健康甚至危及生命。因此，乳腺癌的诊断显得尤为重要，而乳腺癌的诊断依赖于影像技术的发展，并进一步影响乳腺癌的治疗和预后。乳腺钼靶X线摄影检查为近年来最有效的乳腺癌诊断手段之一，但是仍有辐射的风险。超声和磁共振(MRI)在乳腺癌的诊断、分期和随访中也有着重要的作用，且没有辐射的风险；然而，限制的空间分辨率和对比度不佳影响了超声在乳腺癌早期诊断中的作用。磁共振(MRI)具有空间分辨率高并且无组织穿透性限制的优点，但存在灵敏度相对较低的缺点，且价格昂贵。光声成像(Photoacoustic(PA)imaging，PAI)是一种新兴的非侵入性的成像方式，和超声成像相比具有高分辨率的优点；然而，由于组织深部固有生色团(如氧化血红蛋白和脱氧血红蛋白)对光吸收不佳，PAI在探测深部组织的时候有相对限制。所以，将近红外吸收物质作为造影剂可用于光声成像探测深层组织引起了广泛的兴趣。
综上所述，通过结合光声成像和磁共振成像的多模态显像，可以达到高分辨率和高敏感性，以期探测深部组织来达到安全无辐射的早期诊断乳腺癌，实时治疗监控和改善预后的目的。但是，要实现高效多模态显像，多功能多模态分子探针造影剂尤为重要。以纳米材料为基础的分子探针，可以使多种不同成像方法相结合，克服各自局限性，更直观形象地为组织或疾病提供更深层次的信息。所以，新颖的光声/磁共振成像的多模态造影剂是近年来学者研究的热点。
光热疗法(Photothermal therapy，PTT)是一种非侵入性的微创的肿瘤治疗方法，近年来多有研究，它利用光热物质把近红外光转变为热来“烧死”肿瘤细胞。然而，光热疗法中，产生的热分布不均一可能导致肿瘤消融不彻底导致复发和转移。如果将光热疗法和化疗结合可以显著的增加综合***的效率。然而传统的化疗药物对癌细胞无特异性，在杀死癌细胞的同时也会对正常细胞和组织造成损伤，由此导致了全身严重的毒副作用，降低了疗效，并且有可能导致药物耐受。从规避这些缺点的角度出发，近年来开发的纳米技术可以结合化疗药物，使抗肿瘤药物选择性的作用于肿瘤细胞，控制药物释放，延长药物在体内的循环时间，减少全身毒副作用；并且，高靶向性药物、控释药物治疗可以定位于原始肿瘤和转移灶，在肿瘤部位高度聚集，有选择性地杀死肿瘤细胞，提高肿瘤治疗效果，降低全身毒副作用。其中，靶向分为被动靶向和主动靶向，都可以使药物递送至肿瘤区域。而主动靶向是基于抗原抗体结合主动靶向肿瘤细胞，可以增加药物在肿瘤部位的浓度，减少在全身健康组织器官的累积，从而增加治疗效果。由此，结合光热治疗和主动靶向的纳米化疗技术将极大的改善肿瘤治疗效果。
纳米诊断治疗进一步应用和发展纳米药物进行先进的诊断治疗，可以控释诊断治疗物质，提高诊断治疗的疗效，减少毒副作用。诊断治疗纳米粒子种类繁多，但是有很多的局限性，包括非特异性积累，循环时间不足，体内分布不佳，较差的生物降解作用，毒性等等。理想的诊断治疗纳米粒子不仅能够在病变组织选择性地快速累积，实现多模态显像，提高有效的治疗，并且安全无毒，无免疫原性，经济实惠。普鲁士蓝纳米粒子(Prussian bluenanoparticles，PB NPs)是美国食品药品监督管理局承认的一种经典的用于临床放射线暴露治疗的药物。近年来PB NPs因为其具有高导电性，杰出的稳定性，良好的生物相容性，粒径大小可控，表面易活化等优点，引起了很多研究者的关注。并且，PB NPs由于其良好的光热转化效率，可作为光热物质应用于光热治疗。然而，PB NPs仍和理想的诊断治疗纳米粒子有一定差距，因为目前研究的基于普鲁士蓝的纳米物质都是裸露的，没有包裹或表面修饰的，随时间延长易于被身体清除。并且，这些大多数基于普鲁士蓝的纳米复合物因为没有携带药物而无法实现结合光热治疗和化疗的综合治疗作用。尽管个别研究设计普鲁士蓝纳米物质可以装载药物，但是如何使普鲁士蓝的纳米物质具有主动靶向功能，使得普鲁士蓝和药物准确地到达肿瘤区域，实现精准治疗，仍是研究的热点。
基于以上的目的，如果可以设计一种可以实现光声/磁共振多模态显像，进而实现影像介导的治疗，合成的靶向纳米复合物可以吸收近红外光能量，转化为热量，提高肿瘤局部的温度，结合化疗药物，即可以实现综合***，提高肿瘤治疗疗效。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可实现光声/磁共振多模态显像，进而实现影像介导的治疗，综合***，提高肿瘤治疗疗效的载普鲁士蓝靶向纳米复合物及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：载普鲁士蓝靶向纳米复合物，包括其内部包裹有普鲁士蓝纳米粒子的PEG化叶酸靶向乳酸/羟基乙酸共聚物外壳，PEG化叶酸靶向乳酸/羟基乙酸共聚物外壳上镶嵌有紫杉醇。
多功能纳米复合物由多种纳米物质组成，已被应用于疾病的诊断和治疗。这些纳米复合物的构成成分中首先有可用于成像的生物医学材料，如有机染料、量子点、磁共振造影剂、CT造影剂等等，其次包括诊断物质，如抗肿瘤药物，DNA、siRNA等等，同时还有载体和一些表面修饰一起构成。其中，生物医学材料如果要安全的递送至靶向组织，必须和生理环境兼容，很多生物医学材料是疏水性的，在体内易被免疫***清除，不能很好的发挥作用。因此，选择一种合适的载体以便其可以和生理环境兼容是非常重要的。
本发明技术方案的载普鲁士蓝靶向纳米复合物，PEG为聚乙二醇的缩写，PEG化叶酸靶向乳酸/羟基乙酸共聚物缩写为PLGA-PEG-FA，将PLGA-PEG-FA内部包裹普鲁士蓝纳米粒子，简称PB NPs，PLGA-PEG-FA的外壳上镶嵌紫杉醇，即PTX，形成载普鲁士蓝靶向纳米复合物，简称PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物，可以实现光声/磁共振多模态显像，进而实现影像介导的治疗。合成的靶向纳米复合物可以吸收近红外光能量，转化为热量，提高肿瘤局部的温度，结合化疗药物，实现综合***，提高肿瘤治疗疗效。经研究发现，本发明的纳米复合物可以通过血管内皮间隙，成功地到达靶向肿瘤区域，具有良好的光热转化能力，随着载普鲁士蓝靶向纳米复合物的浓度增加或激光能量的增加，纳米复合物的光热转化效能增高，在激光开关四个周期的情况下，温度上升和下降稳定，展示了良好的光热转化特性和光热稳定性，可以作为良好的光热物质；可实现药物控缓释的高载药量多功能药物递送***。
进一步，所述的PEG化叶酸靶向乳酸/羟基乙酸共聚物外壳为聚乳酸羟基乙酸PLGA上通过聚乙二醇PEG连接有叶酸FA。
进一步，其外形呈球形；所述的粒径236.6±55.04nm；电位为-24.44±1.7mV。
进一步，所述的紫杉醇的包封率为77.82％，载药量为7.22％。
进一步，在500～900nm波长范围存在一个吸收波峰。
进一步，在1756.23cm-1、2086cm-1均存在吸收峰，在2927cm-1存在特征峰。
进一步，其激光辐照的半衰期为12h。
以上均为本发明载普鲁士蓝靶向纳米复合物的性质及确认。
本发明的另一个技术方案，载普鲁士蓝靶向纳米复合物的制备方法，包括普鲁士蓝纳米粒子的制备和纳米复合物的制备步骤，其中，纳米复合物的制备步骤如下：
(1)称取5mg紫杉醇和50mg PEG化叶酸靶向乳酸/羟基乙酸共聚物放入烧杯中；
(2)向烧杯中加入2mL二氯甲烷，密封杯口，振荡器振荡使其溶解，得A溶液；
(3)将200μL、100mg/mL的普鲁士蓝纳米粒子和100μL 4％的聚乙烯醇混合，将混合液逐滴加入至A溶液中，冰浴下声振2分钟，呈现蓝色初乳液；
(4)倒入5mL4％聚乙烯醇溶液中，冰浴条件下再次声振2分钟，得到淡蓝色复乳液；
(5)机械搅拌2小时至二氯甲烷挥发；
(6)以去离子水多次洗涤、离心后收集，得微球；
(7)将微球样品放入4℃冰箱中保存，得载普鲁士蓝靶向纳米复合物。
本发明载普鲁士蓝靶向纳米复合物的制备方法，以PEG化连接了叶酸(folicacid，FA)的PLGA作为成膜材料，采用双乳化法，制备装载普鲁士蓝纳米粒子(Prussianblue nanoparticles，PB NPs)和紫杉醇(Paclitaxel，PTX)的PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向纳米复合物。对其复合物的粒径、电位、表面形态等进行检测；用紫外-可见分光光度法、傅里叶红外光谱仪、激光共聚焦显微镜检测其紫外吸收光谱、红外光谱和各组分结构特征；采用0.647W/cm2,808nm的激光辐照检测其体外光热特性；纳米复合物中紫杉醇的包封率及载药量用高效液相色谱法检测。成功制备出球形、形态规则，大小均匀，性质稳定的PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向纳米复合物。该纳米复合物具有良好的光学吸收性能和光热转化特性，载药量较高，在体外对MBA-MD-231乳腺癌细胞有良好的靶向能力，联合激光辐照，在体外具有良好的联合化疗和光热***细胞的能力。
进一步，所述的普鲁士蓝纳米粒子的制备方法为：
A、将0.5mmol 98mg柠檬酸加入到20mL 1.0mmol/L FeCl3水溶液中，60℃搅拌，得溶液a；
B、然后，将20mL包含0.5mmol柠檬酸的1.0mM亚铁***水溶液逐滴加入a溶液中呈现为清澈的蓝色溶液，60℃搅拌1min；
C、冷却至室温，室温下再搅拌30min，得分散液；
D、将40mL的丙酮加入至分散液，28000rpm离心1h，形成普鲁士蓝纳米粒子沉淀；
E、纯化：普鲁士蓝纳米粒子沉淀用20mL蒸馏水声波降解法溶解，用20mL丙酮分离和离心；
F、重复多次纯化过程；
G、最后，将纯化后的普鲁士蓝纳米粒子沉淀溶于双蒸水中，置于14000MWCO透析袋中，再将透析袋置于双蒸水中透析24h，得普鲁士蓝纳米粒子；
H、将得到的普鲁士蓝纳米粒子放入4℃冰箱中保存。
本发明载普鲁士蓝靶向纳米复合物的制备方法，以PEG化连接了叶酸(folicacid，FA)的PLGA作为成膜材料，采用双乳化法，制备装载普鲁士蓝纳米粒子(Prussianblue nanoparticles，PB NPs)和紫杉醇(Paclitaxel，PTX)的PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向纳米复合物。对其复合物的粒径、电位、表面形态等进行检测；用紫外-可见分光光度法、傅里叶红外光谱仪、激光共聚焦显微镜检测其紫外吸收光谱、红外光谱和各组分结构特征；采用0.647W/cm2,808nm的激光辐照检测其体外光热特性；纳米复合物中紫杉醇的包封率及载药量用高效液相色谱法检测。成功制备出球形、形态规则，大小均匀，性质稳定的PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向纳米复合物。该纳米复合物具有良好的光学吸收性能和光热转化特性，载药量较高，在体外对MBA-MD-231乳腺癌细胞有良好的靶向能力，联合激光辐照，在体外具有良好的联合化疗和光热***细胞的能力。
附图说明
图1为本发明实施例中普鲁士蓝纳米粒子的透射电镜图；
图2为普鲁士蓝纳米粒子扫描电镜图；
图3是PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物的透射电镜图；
图4是PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物的扫描电镜图；
图5是Malvern激光粒径仪检测PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物粒径图；
图6是Malvern激光粒径仪检测PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物的电位分布图；
图7是PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物和PB NPs的紫外分光光度图；
图8是PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物、PB NPs和PLGA-PTX-PEG-FA的傅里叶红外光谱图；
图9是PLGA-PEG-FA的核磁共振氢谱；
图10是PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物在有无激光辐照下的紫杉醇体外缓释曲线；
图11是PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物体外靶向MDA-MB-231细胞放大×600倍；
图12是PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物对MDA-MB-231移植瘤的体内靶向效果，向组和非靶向组(肿瘤用圆圈圈出)；
图13是各组织离体荧光成像图；
图14是PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物+激光辐照组和对照组荷瘤裸鼠肿瘤部位的热红外成像图；
图15是各处理组裸鼠的相对肿瘤体积趋势图。
具体实施方式
本发明载普鲁士蓝靶向纳米复合物的制备方法，具体步骤如下：
一、载普鲁士蓝靶向纳米复合物的制备
1、普鲁士蓝纳米粒子的制备
a、将0.5mmol柠檬酸(98mg)加入到20mL FeCl3(1.0mmol/L)水溶液中，60℃搅拌，得溶液a；
b、然后，将20mL包含等量0.5mmol柠檬酸的亚铁***K4[Fe(CN)6](1.0mM)水溶液逐滴加入上述溶液a溶液，清澈的蓝色溶液呈现，60℃搅拌1分钟；
c、溶液冷却至室温，室温下再搅拌30分钟，得分散液；
d、同等体积40mL的丙酮加入分散液，28000rpm离心1小时，形成普鲁士蓝纳米粒子沉淀；
e、普鲁士蓝纳米粒子沉淀再用20mL蒸馏水声波降解法溶解，用同等体积20mL丙酮分离和离心；
f、纯化过程重复多次，五次～10次；
g、最后，普鲁士蓝纳米粒子沉淀溶于双蒸水，置于14000MWCO透析袋中，将透气袋置于双蒸水中透析24h，以便去除多余的柠檬酸盐和其他小粒子，然后将透析后的普鲁士蓝纳米粒子(PB NPs)放入4℃冰箱中保存。
2、载普鲁士蓝靶向纳米复合物(PLGA-PB-PTX-PEG-FA)的制备
利用双乳化法，制备载紫杉醇靶向纳米复合物。具体步骤如下：
(1)称取5mg紫杉醇和50mg PEG化叶酸靶向乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA-PEG-FA,50：50)的PLGA-PEG-FA放入烧杯中；
(2)向烧杯中加入2mL二氯甲烷(CH2Cl2)，用保鲜膜封住杯口，振荡器振荡使高分子材料和紫杉醇完全溶解；
(3)将200μL普鲁士蓝纳米粒子PB NPs(100mg/mL)和100μL 4％聚乙烯醇PVA的混合液逐滴加入上述溶液中，冰浴条件下声振2分钟，功率130W*80％，呈现蓝色初乳液；
(4)迅速倒入聚乙烯醇5mL PVA溶液(4％)中，冰浴条件下再次充分声振2分钟，功率130W*40％，得到淡蓝色复乳液；
(5)机械搅拌2小时至CH2Cl2充分挥发；
(6)以去离子水多次洗涤、离心后收集微球，得载普鲁士蓝靶向纳米复合物；
(7)以上所制备样品放入4℃冰箱中保存。
实验对照组1：采用相同的方法制备，区别在于：不加普鲁士蓝(步骤(3)中不加普鲁士蓝纳米粒子)的PLGA-PTX-PEG-FA纳米粒；
实验对照组2：采用相同的方法制备，区别在于：不加紫杉醇(步骤(1)不加紫杉醇)的PLGA-PB-PEG-FA纳米粒；
非靶向组：采用相同的方法制备，区别在于：步骤1中用不连叶酸的PLGA-PEG。
进行细胞活性实验及活体荧光实验时，还需在步骤1中加入荧光染料，细胞膜红色荧光探针DiI或细胞膜绿色荧光探针DIR制备载DiI或DIR的PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物，制备和储存过程中注意避光。
二、载普鲁士蓝靶向纳米复合物(PLGA-PB-PTX-PEG-FA)的一般性质检测、光热特性、紫杉醇的包封率及载药量、体外缓释实验。
1、普鲁士蓝纳米粒子及载普鲁士蓝靶向纳米复合物(PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物)基本性质：
(1)采用透射电镜和扫描电镜观察普鲁士蓝纳米粒子PB NPs和PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物表面形态和结构特点；
(2)Malvern激光测径仪及表面电位仪测量PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物粒径大小、分布及表面电位；
(3)采用紫外-可见分光光度法检测PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物和普鲁士蓝纳米粒子的吸收光谱；
(4)采用傅里叶红外光谱仪检测PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物、普鲁士蓝纳米粒子和PLGA-PTX-PEG-FA的红外光谱；
(5)采用激光共聚焦显微镜检测PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物的各个组分。5.0mL1.12mg/mL柠檬酸盐保护的普鲁士蓝纳米粒子加入到0.55mg(0.8μmoles)5-(aminoacetamido)fluorescein和23μg(120nmols)N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimidehydrochloride。反应混合物搅拌过夜，然后用3000MWCO膜透析一周，去除未反应的染料。用连接染料的PB NPs和连接DiI的PLGA-PTX-PEG-FA制作PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物。共聚焦显微镜以不同的发射波长检测PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物的各个组分的荧光。
(6)采用1H-NMR确认PLGA-PEG-FA的结构。
检测的结果为：
(1)如图1、图2所示，制得的普鲁士蓝纳米粒子，透射电镜和扫描电镜显示为立方体形状，粒径约为40-50nm。如图3、图4所示，光镜及扫描电镜下观察，PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物呈球形，表面光滑，大小均一，分散性好。
(2)如图5、图6所示，Malvern激光粒径仪检测出PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物粒径为(236.6±55.04)nm，表面电位为(-24.44±1.7)mV。
(3)如图7所示，紫外-可见分光光度计检测出在PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物和PB NPs在500～900nm波长范围都出现一个吸收波峰，大约位于702nm附近。
(4)如图8所示，傅里叶红外光谱图结果显示，PLGA-PTX-PEG-FA和PB NPs的吸收峰位于1756.23cm-1and 2086cm-1，而PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物同时具有上述两个特征峰。并且，PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物出现了CH2的位于2927cm-1的特征峰。
(5)激光共聚焦显微镜显示，PB NPs激发后为绿色荧光，PLGA-PTX-PEG-FA为红色荧光，而PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物为橙黄色荧光。
(6)如图9所示，采用1H-NMR确认PLGA-PEG-FA的结构，化学位移值为1.0和4.9ppm峰分别属于PLGA上-CH3和-CH-的氢质子，即峰1和峰4；化学位移值为的3.4ppm峰属于PEG上的-CH2-氢质子，即峰2；化学位移值为4.1ppm的峰属于叶酸上的芳香胺氢质子，即峰3。化学位移值为6.5和6.8ppm的小峰归属为叶酸的芳香核质子，即峰5和峰6。
2、PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物体外光热特性
制备各种浓度的PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物(0.625mg/mL、1.25mg/m、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL)、PLGA-PTX-PEG-FA(20mg/mL)。
(1)将20mg/mL PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物、PLGA-PTX-PEG-FA和双蒸水各200uL置于24孔板中，用808nm，输出功率0.647W/cm2的激光辐照10分钟。
(2)将上述制得的不同浓度的PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物各200uL置于24孔板中，用808nm，输出功率0.647W/cm2的激光辐照10分钟。
(3)将20mg/mL PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物各200uL置于24孔板中，分别输出功率为0.328W/cm2,0.647W/cm2,1.218W/cm2，808nm的激光辐照10分钟。
(4)将5mg/mL PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物用808nm，输出功率0.647W/cm2的激光辐照50s，关闭380s为一周期，辐照四周期。
上述处理导致的温度变化，用红外成像仪检测，每10s记录一次温度。
检测的结果为：
(1)经激光辐照后，PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物温度上升明显，起始温度约为27.5℃，约在100s时，温度上升至70.2℃，后维持于70.2℃-71.5℃之间，从520s之后，温度继续上升至90.4℃。而双蒸水组和PLGA-PTX-PEG-FA组温度由于激光辐照上升至41℃左右，没有继续上升；如表1-1-1所示：
表1-1-1 不同组别试剂0.647W/cm2激光辐照10分钟的温度变化
Figure BDA0001309556420000081
Figure BDA0001309556420000091
(2)不同浓度的PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物经激光辐照后，可见各组均有不同程度的温度上升，呈现上升温度和纳米复合物的浓度呈正相关的趋势，如表1-1-2所示：
表1-1-2 不同浓度PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物0.647W/cm2激光辐照10分钟的温度变化
Figure BDA0001309556420000092
(3)20mg/mL PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物经不同功率激光辐照后，温度均有不同程度上升，呈现上升温度和激光功率正相关的趋势，如表1-1-3所示：
表1-1-3 20mg/mL PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物分别用0.328,0.647and1.218W/cm2激光辐照10分钟的温度变化
Figure BDA0001309556420000093
Figure BDA0001309556420000101
(4)5mg/mL PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物经四周期激光开关辐照后，可见温度升高趋势一致，未见明显温度峰值下降，如表1-1-4所示：
表1-1-4 5mg/mL PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物用0.647W/cm2激光辐照50s，关闭激光380s，四周期的温度变化
时间(s) 0 50 430 480 860 910 1290 1340 1720
温度(℃) 24.5 52.1 26.7 55.1 26.7 56.0 26.7 55.8 26.5
3、紫杉醇包封率、载药量及体外缓释
1)PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物紫杉醇的包封率及载药量
采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)检测紫杉醇的包封率及载药量，具体步骤如下：
(1)用甲醇溶解紫杉醇粉末，分别配成12.5μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，75μg/mL，90μg/mL，100μg/mL，200μg/mL的溶液；
(2)高效液相色谱仪对进样进行检测，结果绘制成标准曲线；
(3)取50mgPLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物(紫杉醇投入量5mg)溶于1mLDMSO和2mL二氯甲烷的混合物，充分混匀至微球全部溶解，取0.1mL用0.9mLDMSO稀释,用0.22μmPVDF膜过滤后上机检测，(色谱条件：检测波长227nm，流动相为乙腈：水(45:55，V/V)，进样10μL)，按以下公式计算紫杉醇的包封率及载药量：
包封率(％)＝纳米复合物中药物含量/总药物投放量×100％；
载药量(％)＝纳米复合物中包封药物的量/纳米复合物总重量×100％。
2)PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物体外缓释实验
利用透析法检测PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物的体外缓释特性，并分为激光辐照组和对照组，具体步骤如下：
(1)取50mgPLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物沉淀溶于0.5mL去离子水中，激光辐照组取0.2mL置于24孔板中，暴露于808nm、输出功率0.647W/cm2的激光辐照10分钟，后加入1mL去离子水。对照组取上述纳米复合物溶液0.2mL加入1mL去离子水。
(2)将两组分别装于透析袋中(截留分子量：8000Da)，两端封口夹密封后，完全浸没于装有150mL缓释介质(0.01％Tween-80，0.02％叠氮钠，30％乙醇)的蓝口瓶中。
(3)并将蓝口瓶置于恒温振动器中持续震荡(37℃，120rpm)；
(4)在上述步骤完成后2h,4h,6h,8h,12h,1d,2d,3d,and 4d，分别取出1mL透析液，再补充1mL新鲜的缓释介质；
(5)将缓释样本存放于-20℃冰箱中，待取样完成后用HPLC法检测样本中紫杉醇含量；
(6)分别计算不同时间点PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物中紫杉醇的累积释放百分率(％)，绘制随时间变化，药物释放曲线。
检测的结果为：
PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物中紫杉醇的包封率为77.82％，载药量为7.22％。
如图10所示，PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物中紫杉醇在体外4d内的释药时间曲线可以看出，激光辐照组和对照组药物的半衰期分别为12h和48h，激光的辐照加速了药物释放。激光辐照组可见纳米复合物中紫杉醇在第1天发生突释，1d后释药速度减慢。而对照组药物缓慢释放，呈逐渐上升态势。第4d时激光辐照组和对照组的药物累积释放量分别为79.26％和65.73％。
三、载普鲁士蓝靶向纳米复合物的体外寻靶和细胞毒性实验
1、细胞寻靶实验
人乳腺癌细胞株MDA-MB-231。将细胞置于37℃、5％CO2恒温培养箱中常规培养，培养基配方为含10％胎牛血清和0.1mg/mL链霉素，100U/mL青霉素的DMEM培养液。常规换液，每隔1天用0.25％胰蛋白酶消化细胞进行传代培养。
取对数生长期状态的细胞，以1×104/皿的密度接种于激光共聚焦培养皿中。培养24h，待细胞贴壁呈生长状态。
实验分为3组：
靶向组(PLGA-PB-PTX-PEG-FA)、非靶向组(PLGA-PB-PTX-PEG)、受体封闭组；
每组各3个培养皿。每组加入等量的经DiI标记的相应试剂，其中受体封闭组预先加入适量叶酸抗体，共孵育1h后，再加入靶向纳米复合物。混匀后放入CO2培养箱内孵育20min后取出培养皿，PBS缓冲液反复冲洗，将游离纳米复合物冲洗掉后向每个培养皿中加入4％多聚甲醛1.5mL，孵育10分钟。弃去多聚甲醛，PBS冲洗三遍。加入DIO40uL/皿，孵育10分钟。弃去DIO，PBS冲洗三遍。加入DAPI 40uL/皿，孵育10分钟。弃去DIO，PBS冲洗三遍。滴入少许PBS保持皿内干燥，在CLSM下观察各组纳米复合物与细胞的结合情况。
检测结果为：由激光共聚焦显微镜观察到，细胞膜红色荧光探针DiI标记的纳米复合物呈红色荧光，细胞膜绿色荧光探针DiR可将乳腺癌细胞膜标记为绿色荧光，DAPI可将乳腺癌细胞核标记为蓝色荧光。如图11所示，可观察到，MDA-MB-231+靶向组中，较多的红色荧光(b处)纳米复合物紧密结合在MDA-MB-231细胞膜周围，说明该靶向纳米复合物具有独特主动靶向乳腺癌细胞的能力。而MDA-MB-231+非靶向组、受体封闭组这两个处理组的细胞周围几乎观察不到红色的荧光纳米复合物。
2、细胞毒性实验
将处于对数生长期状态的MDA-MB-231细胞种于96孔板中，每孔细胞密度为8×103个，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养24h。
实验组为有细胞且加入试剂组、阴性对照组为有细胞但不加试剂组、空白对照组为没有细胞也不加试剂组；
每组分别设置6个平行复孔。分组如下：PLGA-PB-PTX-PEG-FA组、PLGA-PB-PEG-FA组、游离PTX组、PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组，PLGA-PB-PEG-FA+NIR组，NIR组。选择每孔分别加入上述混合培养基的各种试剂(10mg/mL,100μL/孔，紫杉醇的浓度约为0.7mg/mL)，NIR组不加入任何试剂，孵育2h。后取出96孔板，弃去孔内培养基，PBS冲洗后加入50μL/孔新鲜培养基。其中PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组，PLGA-PB-PEG-FA+NIR组及NIR组每孔用输出功率0.693W/cm2，808nm激光辐照45s。最后，每孔补充足够的新鲜培养基，放入孵箱中孵育24h。24h后，每孔各加入10μL CCK8，孵育1h后，用酶标仪于450nm出检测各孔吸光值(OD值)。用以下公式计算实验组的细胞活性率：
细胞活性率(％)＝(实验组OD值-空白对照组)/(对照组平均OD值-空白对照组OD值)×100％。
检测结果为：
CCK8法测得各处理组的细胞活性率(％)如表1-2-1所示。表1-2-1显示了各组在相同紫杉醇浓度(C[PTX]≈0.7mg/mL)条件下，与MDA-MB-231细胞孵育后对其活性的影响。结果显示，靶向纳米复合物联合激光辐照组(PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR)对细胞的毒性作用最强，为22.57±4.47％，与其他各组相比P＜0.05，差别具有统计学意义。与单纯紫杉醇组比较(47.52±3.47％)，靶向纳米粒不带药物组联合激光组(PLGA-PB-PEG-FA+NIR)的细胞活性偏低(32.00±3.73％)，靶向纳米复合物组(PLGA-PB-PTX-PEG-FA)的细胞活性偏高(60.01±3.85％)。而PLGA-PB-PEG-FA组和NIR组的细胞活性高于90％，这表明PB NPs和高分子聚合物本身的毒性非常低，几乎可以忽略，并且单独激光辐照对细胞活性没有影响，说明试剂组联合激光辐照组导致的细胞活性降低，是由激光辐照后试剂产生的光热作用导致的细胞活性降低。
表1-2-1 不同处理组对MDA-MB-231细胞活性的影响
Figure BDA0001309556420000131
综上：PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向纳米复合物具有良好的靶向乳腺癌MDA-MB-231细胞的能力，为后续体内靶向实验和进一步靶向肿瘤成像和治疗提供了实验基础和理论依据；PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向载药纳米复合物辅助激光辐照后，可使化疗作用和光热作用相结合，使毒性作用发挥到最大，细胞存活率最低。形成的纳米复合物具有良好的生物安全性，具有化疗作用，可杀伤肿瘤细胞，可联合光热作用，结合靶向作用，可靶向肿瘤部位，减少全身化疗毒副作用，最大程度的杀伤肿瘤细胞，为后续体内综合治疗打下了坚实的实验基础。
四、载普鲁士蓝靶向纳米复合物体内寻靶实验
选取呈对数生长期的MDA-MB-231细胞，以0.25％胰酶消化，然后以1000r/min的转速离心5min，离心后以无菌PBS液稀释成1×107/mL数量级，用计数板计数。用碘伏局部消毒裸鼠背部皮肤，然后由助手轻轻提起裸鼠臀背部皮肤，用1mL注射器在皮下注射0.15mL，形成皮丘。接种完后重新放回笼内饲养，每1-2天观察一次。
选取10只MDA-MB-231乳腺癌移植瘤模型裸鼠进行小动物活体荧光成像，随机分为两组：靶向纳米复合物(DIR/PLGA-PB-PTX-PEG-FA)组和非靶向纳米复合物(DiR/PLGA-PB-PTX-PEG)组，每组5只。显像前腹腔注射1％戊巴比妥钠进行麻醉。麻醉后行注射前小动物活体荧光成像，后经尾静脉缓慢注射靶向纳米复合物和非靶向纳米复合物，每只注射用量为0.2mL(20mg/mL)，注射成功后分别于1h、2h、4h、6h及24h利用小动物活体荧光成像***采集图像。背景荧光被滤除以便更好的观察效果。对比观察两组组肿瘤局部的荧光强度，利用Living Image软件***对图像进行定量分析。两组肿瘤区体内靶向效率用总辐射效率×107(total radiant efficiency×107)表示。待24h成像完毕后，处死裸鼠，解剖肿瘤、心、肝、脾、肺、肾、脑，行离体荧光成像，并计算各部位离体荧光强度。
检测结果为：
如图12所示，小动物活体荧光结果显示注射前两组均未见荧光显示，在尾静脉注射靶向纳米复合物后，靶向组可见肿瘤内部、脾、脑、脊柱有强烈的红色荧光(划圈处)，标志着DiR标记的靶向纳米复合物在此聚集，在注射后1h荧光最强。随时间延长，肿瘤、脊柱、脑部的荧光强度逐渐减低，而肝区的荧光强度逐渐加强。在注射靶向纳米复合物24h时，肿瘤区域、脾和肝区仍可见少量荧光显示。与之相反，尾静脉注射非靶向纳米复合物后，非靶向组肿瘤内部没有荧光显示，而肝区见荧光显示，在24h后消失。Living Image软件***分析靶向组和非靶向组肿瘤区域荧光强度如表2-1-1，靶向组肿瘤区域荧光强度明显高于非靶向组，P＜0.05，差异具有统计学意义。并且，靶向组肿瘤区域荧光在尾静脉注射靶向纳米复合物1h后最强，后逐渐降低，但在24h肿瘤区仍可见荧光显示，并明显高于注射前肿瘤区域荧光强度。
如图13所示，离体活体荧光可见两组的肝、脾、肺均有荧光显示，但只有靶向组的肿瘤有荧光显示，非靶向组的肿瘤没有荧光聚集(a)。离体各部位荧光强度如表2-1-2，靶向组离体肿瘤和脾组织荧光强度明显高于非靶向组，P＜0.05，差异具有统计学意义。
表2-1-1 靶向组和非靶向组的在体肿瘤部位荧光强度(×107)
时间点 靶向组 非靶向组
pre 2.22±0.02 2.30±0.06
1h 395.95±9.26 23.43±12.01*
2h 264.00±41.15 23.86±11.53*
4h 209.30±48.51 24.23±11.14*
6h 174.60±37.19 24.65±11.24*
24h 147.30±28.28 26.43±11.17*
注：与靶向组相比，*P<0.05。
表2-1-2靶向组和非靶向组各组织离体荧光强度(×107)
Figure BDA0001309556420000141
Figure BDA0001309556420000151
注：与靶向组相比，*P<0.05。
综上：实验经尾静脉注射DiR标记的靶向和非靶向纳米复合物的方法，经尾静脉注射入裸鼠体内，于注射前和注射后1h、2h、4h、6h及24h利用小动物活体荧光成像***观察带荧光探针的纳米复合物在裸鼠肿瘤内及其在体内的生物学分布情况。结果显示，尾静脉注射纳米复合物1h后，靶向纳米复合物在肿瘤组织的分布明显高于非靶向纳米复合物组，这说明PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向纳米复合物良好的体内主动靶向乳腺癌细胞的特性。在尾静脉注射纳米复合物24h后，靶向组肿瘤区仍可见荧光显示，说明PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向纳米复合物因为其纳米粒径，具有主动靶向和EPR(enhanced permeability and retentioneffect)效应导致的被动靶向作用。尾静脉注射PLGA-PB-PTX-PEG非靶向纳米粒后，非靶向纳米粒因缺乏叶酸靶向集团，未来得及到达肿瘤区域，大部分就被肝脏代谢，故肿瘤区域未见荧光聚集，荧光显影主要聚集在肝区。量化荧光强度指标显示，靶向组肿瘤荧光强度明显高于非靶向组，差异具有统计学意义，证实了PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向纳米复合物良好的体内靶向能力。
五、载普鲁士蓝靶向纳米复合物增强光声/磁共振多模态显像实验
1、体外光声显像
将PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物及PLGA-PTX-PEG-FA配制为不同浓度的溶液(2.5mg/mL，5mg/mL，10mg/mL，20mg/mL)，并以双蒸水作为对照组进行光声显像。将各组试剂加入2.5％凝胶模型中，使用
Figure BDA0001309556420000153
光声成像***，采集未载普鲁士蓝的纳米粒(PLGA-PTX-PEG-FA)、载普鲁士蓝纳米复合物(PLGA-PB-PTX-PEG-FA)和双蒸水的光声图像。应用光声***自带软件测量各样品的光声值。
检测结果为：体外光声显影结果显示，与不含PB NPs的纳米粒(PLGA-PTX-PEG-FA)及双蒸水无光声显像相比，PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物的光声显像明显，且随着PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物浓度的增加，光声显像逐渐增强，光声值也逐渐增大，如表2-2-1。
表2-2-1 各浓度PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物、PLGA-PTX-FA-PEG和双蒸水的体外光声值(均数±标准差,n＝3)
Figure BDA0001309556420000152
Figure BDA0001309556420000161
2、体外磁共振显像
将PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物及PLGA-PTX-PEG-FA配制为不同浓度的溶液(2.5mg/mL，5mg/mL，10mg/mL，20mg/mL)，并以双蒸水作为对照组进行磁共振显像。分别放入直径1cm的EP管内，置入盛水容器中，应用荷兰Philips Achieva 3.0T磁共振扫描仪采集T1*WI图像，采用头部线圈，扫描参数为：重复时间(TR)494ms，回波时间(TE)10ms，翻转角(Flip angle)90°，层厚1.0mm，视野(FOV)190mm。每组样品重复三次。应用***软件测定各孔感兴趣区(Region of interest，ROI)信号强度(Signal intensity，SINPs)，以水的信号强度(SIwater)作为对比，利用以下公式计算各样品的信号增强百分比(Percentageofsignal intensity enhancement,PSIE)。
PSIE＝(SINPs–SIwater)/SIwater×100％。
检测结果为：
T1*WI显像中，与不含PB NPs的纳米复合物(PLGA-PTX-PEG-FA)及双蒸水无T1增强信号相比，PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物增强MRI T1显像明显。且随着PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物浓度的增加，其信号强度增强率(PSIE)逐渐增加，与PLGA-PTX-PEG-FA组相比，P＜0.05，差异有统计学意义，如表2-2-2。说明本实验所制备的纳米复合物具有正性强化效果，PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物浓度越高，其正性强化效应越明显。
表2-2-2 各浓度PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物、PLGA-PTX-FA-PEG和双蒸水的信号强度增强率(均数±标准差,n＝3)
Figure BDA0001309556420000162
注：与PLGA-PB-PTX-PEG-FA相比，*P<0.05。
3、增强体内光声成像
选取15只构建成功的MDA-MB-231乳腺癌移植瘤裸鼠模型进行体内光声成像，随机分为三组：靶向纳米复合物(PLGA-PB-PTX-PEG-FA)组、非靶向纳米复合物(PLGA-PB-PTX-PEG)组和生理盐水组(NS group)，每组5只。显像前腹腔注射1％戊巴比妥钠进行麻醉。麻醉后行注射前体内光声成像，后经尾静脉分别缓慢注射靶向纳米复合物、非靶向纳米复合物及生理盐水，每只注射用量为0.2mL(20mg/mL)，注射成功后分别于1h、2h、4h、6h及24h利用光声成像仪采集图像。保持增强前后扫描切面一致，对比观察三组组肿瘤局部的光声信号强度，选择肿瘤ROI，利用仪器自带软件将注射试剂前后的图像进行光声信号定量分析。利用以下公式计算各样品的光声信号比率(The ratio of PA value,100％)，并绘制出随时间变化的光声信号比率曲线图。
The ratio of PA value＝PApose/PApre×100％。
检测结果为：
利用
Figure BDA0001309556420000172
光声成像***，实时动态观察裸鼠肿瘤显影情况。通过注射对比剂前后各个时间点对比，结果显示，靶向组在注射靶向纳米复合物后，肿瘤区域光声信号在1h最明显，然后逐渐下降，但在24h仍有明显的光声信号。非靶向组在注射非靶向纳米复合物后1h-6h，光声信号未见明显增强，注射后24h后见微弱光声信号。生理盐水组于造影前后光声图像未见明显变化。三种处理组注射各组试剂前后光声信号比率比较，可见非靶向组光声信号比率略有增强，但与生理盐水组相比，P>0.05，差异无统计学意义。而靶向组增强非常明显，且靶向组光声信号比率与其他两组比较，P＜0.05，差异有统计学意义，如表2-2-3。
表2-2-3 各组肿瘤组织的光声比值(均数±标准差,n＝5)
Figure BDA0001309556420000171
注：与生理盐水组相比,#P<0.05；与靶向组相比，▲P<0.05。
4、增强体内磁共振成像
选取15只构建成功的MDA-MB-231乳腺癌移植瘤裸鼠模型进行体内光声成像，随机分为三组：靶向纳米复合物(PLGA-PB-PTX-PEG-FA)组、非靶向纳米复合物(PLGA-PB-PTX-PEG)组和生理盐水组(NS group)，每组5只。腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉后，利用Philips3.0T超导型磁共振仪和小动物线圈进行先行注射前俯卧位平扫，后经尾静脉分别缓慢注射靶向纳米复合物、非靶向纳米复合物及生理盐水，每只注射用量为0.2mL(20mg/mL)，注射成功后分别于1h、2h、4h、6h及24h进行增强扫描。扫描前均常规进行自动匀场，应用T1WI序列，扫描参数如下：TR＝3200ms，TE＝80ms，层厚＝2mm，FOV＝60mm×60mm，NSA＝10。应用***软件选择ROI，测量各时间点增强前后同一层面裸鼠肿瘤及大腿肌肉感兴趣区的信号强度值(Signal intensity,SI)SItumor及SImuscle，计算相对信号强度(Relative signalintensity，SIr)及信号强度增强率(Percentage of signal intensity enhancement,PSIE)：
SIr＝SItumor/SImuscle
PSIE＝(SIrpost-SIrpre)×100％/SIrpre
选择ROI时应尽量在相同部位、相同层面，避开坏死区及囊变等结构，ROI大小保持一致，不同位置感兴趣区测量3次，取平均值。
检测结果为：
对MDA-MB-231乳腺癌移植瘤裸鼠模型进行MRI成像，平扫肿瘤呈较均匀的稍高信号影，与周围组织分界清晰。生理盐水组注射前后，肿瘤信号强度无明显变化。非靶向组PLGA-PB-PTX-PEG和靶向组PLGA-PB-PTX-PEG-FA经尾静脉注射后，随扫描时间延长，非靶向组肿瘤组织的信号强度在24h时略微有所升高，但肿瘤区域信号强度增强率与生理盐水组无统计学差异，P>0.05。而靶向组肿瘤组织信号强度在1h增强最明显，后有所降低，但在24h仍可见明显肿瘤组织增强信号。且靶向组肿瘤区域信号强度增强率与其他两组比较，P＜0.05，差异有统计学意义，如表2-2-4。
表2-2-4 裸鼠MDA-MB-231移植瘤尾静脉注射对比剂前后磁共振信号强度增强率比较
Figure BDA0001309556420000181
Figure BDA0001309556420000182
注：与生理盐水组相比,#P<0.05；与靶向组相比，▲P<0.05。
本发明制备的PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物具有体外良好的光声和MRI显影能力。本发明也比较了没有包裹PB NPs的纳米粒PLGA-PTX-PEG-FA，无法光声和MRI成像，说明PB NPs是主要显影物质，也说明本发明制备的PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物已成功包裹PB NPs，且没有影响其光声和MRI的成像能力。如结果所示，20mg/mL的PLGA-PB-PTX-PEG-FA纳米复合物的信号强度增强百分率为153.15±0.76％，远远高于PLGA-PTX-PEG-FA组的22.11±0.17％，证实该纳米复合物可被用来作为MRI的造影增强剂。
综上所述，实验证明本发明所制备的PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向纳米复合物可以通过与MDA-MB-231细胞表面叶酸受体的特异性结合，靶向乳腺癌肿瘤细胞，增强乳腺癌移植瘤的光声及磁共振显像，有潜力成为光声/磁共振多模态成像增强剂。该纳米复合物不仅可实现肿瘤分子显像，靶向至肿瘤部位后，联合激光，可促进携带的紫杉醇在靶区释放，有望实现影像技术实时监控下的靶向综合治疗，进一步实现肿瘤早期诊断与可视化靶向治疗。
六、载普鲁士蓝靶向纳米复合物综合治疗裸鼠乳腺癌实验
1、联合激光辐照肿瘤表面温度变化
待裸鼠MDA-MB-231移植瘤长至1.0cm左右，选取35只荷瘤鼠，随机分为7组，每组5只。实验分组为：PBS对照组(control)、单纯紫杉醇药物组(PTX)、不含药物纳米粒组(PLGA-PB-PEG-FA)、靶向纳米复合物组(PLGA-PB-PTX-PEG-FA)、不含药物纳米粒+激光辐照组(PLGA-PB-PEG-FA+NIR)、靶向纳米复合物+激光辐照组(PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR)和单纯激光辐照组(NIR)。单纯紫杉醇注射液浓度为1.4mg/mL(与20mg/mL纳米复合物中药物浓度相当)，其他试剂组浓度均为20mg/mL，每只裸鼠分别注射0.2mL相应试剂。治疗方案为：各组给予尾静脉注射相对应试剂，其中根据第二部分显像结果，PLGA-PB-PEG-FA+NIR和PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组在注射试剂后1h左右，用808nm输出功率0.647W/cm2的激光辐照肿瘤区域10min。激光辐照组则仅用上述参数激光辐照肿瘤区域10min。用红外成像仪检测上述处理导致的温度变化，每10s记录一次温度。绘制温度随时间变化柱状图。
(1)分别在治疗前及治疗后的第3、6、9、12、15、18、21天观察裸鼠生存状况，拍照并利用游标卡尺测量肿瘤的长径及短径，代入下面公式进行计算肿瘤体积(Tumor volume，TV)：
TV＝(L×S2)/2
其中L为测得肿瘤最长径，S为肿瘤最短径。根据肿瘤体积计算相对肿瘤体积(Relative tumor volume,RTV)：
RTV＝TV/TV0
其中TV为各个时间点的肿瘤体积，TV0为治疗前肿瘤体积。根据所算得的相对肿瘤体积值绘制相对肿瘤生长曲线图。治疗21天后，断颈处死裸鼠，剥取肿瘤块并称重。利用下面的公式计算肿瘤抑瘤率(Tumor inhibition rate，TIR)。
TIR＝(1-处理组肿瘤平均质量/对照组肿瘤平均质量)×100％
(2)处死裸鼠后，各组肿瘤解剖后取坏死边界组织以4％多聚甲醛进行固定，石蜡包埋、切片制作后，部分用于HE染色，部分用免疫组化PCNA法检测肿瘤细胞增殖及用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡。解剖PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组和对照组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾以4％多聚甲醛进行固定，石蜡包埋、切片制作后，用于HE染色。HE染色用低倍镜(×100倍)观察。PCNA和TUNEL法以细胞核内出现着色强度高于背景的棕黄色或棕褐色颗粒为阳性标志。用高倍镜(×400倍)观察各切片阳性细胞数，每张切片随机选取5个视野，利用以下公式进行计算：
PCNA：增殖指数(Proliferating index,PI)＝阳性细胞数/细胞总数×100％。
TUNEL:凋亡指数(Apoptotic index,AI)＝阳性细胞数/细胞总数×100％。
检测结果为：如图14所示，尾静脉注射PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向纳米复合物后1h，激光辐照肿瘤区域。60s后红外摄像仪可见肿瘤区域由蓝紫色变为中心红色(A)向黄色(B)、绿色(C)、蓝色(D)渐变的颜色，提示肿瘤区域温度升高，此后肿瘤区域中心红色(A)晕圈不断扩大，提示温度逐渐升高。而激光辐照组，60s后可以见肿瘤区域变为淡蓝色，提示温度有少许升高，约为40℃左右，到10min时，肿瘤区域一直维持淡蓝色晕圈(E)。主要的温度变化如表3-1所示，尾静脉注射靶向纳米复合物后用激光辐照10min，肿瘤表面的温度迅速上升，从34.88±0.75℃上升至52±3.05℃，而肿瘤周围组织的温度经红外摄像仪检测仅为39℃。而激光辐照组(Control)在激光辐照10分钟后，温度仅升至41±0.14℃,如表3-1。
表3-1 靶向纳米复合物+激光辐照组和对照组荷瘤裸鼠肿瘤部位的温度改变(℃，平均值±标准差,n＝5)
时间(s) PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR Control
0 34.88±0.75 36.00±0.71
60 44.43±5.06 40.20±1.00
120 47.13±5.53 40.65±0.07
180 48.60±5.31 40.75±0.21
600 52.00±3.05 41.00±0.14
2、肿瘤生长曲线及质量抑瘤率
单纯紫杉醇药物治疗组给药后裸鼠出现一过性倦怠，活动少，进食差等现象。其余各组裸鼠无明显不良反应。从实验结论可以看出，PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组的荷瘤裸鼠的肿瘤在处理后3天结痂，处理后12天明显缩小，到处理后第21天，未见明显增长。而其他各组肿瘤均有不同程度的增长，其中，NIR组，PLGA-PB-PEG-FA组和对照组相对肿瘤增长明显，PLGA-PB-PTX-PEG-FA组裸鼠肿瘤增长较PTX组缓慢，PLGA-PB-PEG-FA+NIR组相对肿瘤增长比上述两组缓慢，肿瘤体积缩小最明显的为PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组。
各处理组裸鼠MDA-MB-231乳腺癌肿瘤相对肿瘤生长曲线如图15所示，相对肿瘤体积见表3-2，结果显示除了PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组，各处理组裸鼠相对肿瘤体积随着时间延长均呈逐渐增加的趋势。对照组、PLGA-PB-PEG-FA和NIR组生长曲线最陡直，PTX组其次，PLGA-PB-PTX-PEG-FA组和PLGA-PB-PEG-FA+NIR组生长曲线增加较平缓，相对肿瘤体积增加较慢。而PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组相对肿瘤生长曲线呈逐渐下降的趋势，相对肿瘤体积明显缩小。除了NIR组，PLGA-PB-PEG-FA组和对照组，其他各处理组两两比较P<0.05，差异具有统计学意义。各处理组肿瘤抑瘤率见表3-3，可见PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组表现出明显的抑瘤效果，质量抑瘤率为98.86％，其他各组抑瘤率依次下降。PLGA-PB-PEG-FA组和NIR组和PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组相比质量抑瘤率非常低，几乎无法抑制肿瘤生长，肿瘤增长明显。
表3-2 各处理组裸鼠的相对肿瘤体积(平均值±标准差)
Figure BDA0001309556420000211
Figure BDA0001309556420000221
注：与PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR相比，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05。
表3-3 各处理组裸鼠的肿瘤抑制率(100％)
组别 肿瘤抑瘤率(100％)
PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR 98.86％
PLGA-PB-PEG-FA+NIR 86.59％
PLGA-PB-PTX-PEG-FA 74.39％
PTX 65.85％
PLGA-PB-PEG-FA 3.25％
NIR 2.44％
Control 0.00％
3、肿瘤细胞增殖情况
免疫组化PCNA结果显示，各组MDA-MB-231肿瘤组织内均可见到不同数量棕黄色或褐色PCNA阳性细胞的表达，计算各组增值指数(PI)。结果显示如表3-4，PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组的阳性细胞数最少，增殖指数明显低于其他各组，对照组细胞增殖指数最高。除了NIR组，PLGA-PB-PEG-FA组和对照组，其他各处理组两两比较P<0.05，差异具有统计学意义。
4、肿瘤细胞凋亡情况
TUNEL检测以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性标准，凋亡细胞的形态学征象为细胞核成棕黄色，染色质凝聚、浓缩。染色结果显示如表3-4，各处理组的裸鼠肿瘤内均可见到不同数量的阳性细胞，其中PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组的凋亡细胞最多，凋亡指数为(87.06±3.01)％，除了NIR组，PLGA-PB-PEG-FA组和对照组，其他各处理组两两比较P<0.05，差异具有统计学意义。
表3-4 各处理组裸鼠肿瘤组织增殖指数(PI)和凋亡指数(AI)(平均值±标准差,100％)
组别 PI(100％) AI(100％)
PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR 17.62±3.27<sup>#</sup> 87.06±3.01<sup>#</sup>
PLGA-PB-PEG-FA+NIR 29.76±2.35*<sup>#</sup> 66.16±5.91*<sup>#</sup>
PLGA-PB-PTX-PEG-FA 48.88±6.74*<sup>#</sup> 48.85±3.98*<sup>#</sup>
PTX 60.05±4.44*<sup>#</sup> 37.81±4.45*<sup>#</sup>
PLGA-PB-PEG-FA 81.40±2.33* 19.91±3.18*
NIR 81.97±5.08* 18.36±5.21*
Control 84.79±3.08* 17.53±7.49*
注：与PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR相比，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05。
5、HE染色
各处理组肿瘤HE染色结果为：PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组肿瘤HE染色可见大量坏死，镜下呈红色片状无结构区域，其内未见肿瘤细胞。PLGA-PB-PEG-FA+NIR组、PLGA-PB-PTX-PEG-FA组、PTX组肿瘤HE染色坏死程度依次减轻，对照组、PLGA-PB-PEG-FA和NIR组肿瘤区域细胞形态基本正常，细胞核染色较正常。PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组的心、肝、脾、肺、肾和对照组对比，HE染色未见明显异常。
综上：实验在尾静脉注射靶向纳米复合物后1h，用激光辐照肿瘤区域10min。肿瘤表面的温度从34.88±0.75℃上升至52±3.05℃，这一温度足以“烧死”肿瘤。而肿瘤周围组织的温度仅为39℃，说明靶向光热治疗的安全性，对周围组织没有损伤。而激光辐照组(Control)在激光辐照10分钟后，温度仅升至41±0.14℃，这一温度不能杀死肿瘤细胞，在后面观察的21d的结果也证实了激光辐照组裸鼠的肿瘤持续增大，并且也排除这样一种可能性，即如此低能量的近红外激光自身产生足够的热，进一步说明PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向纳米复合物真正靶向到了肿瘤区域，经激光照射后产生了足以杀死肿瘤细胞的热量。各实验组处理措施仅实施一次，且激光能量仅为0.647W/cm2，说明制备的靶向纳米复合物具有良好的靶向效果和光热能量，且载药量较高，能聚集于肿瘤区域，结合光热和化疗作用，增加肿瘤治疗效果。后续治疗随访阶段裸鼠肿瘤图片和相对肿瘤生长曲线也说明了这一点，PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组可以显著地抑制肿瘤的生长。PLGA-PB-PEG-FA+NIR组仅次于PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组，也可以抑制肿瘤生长，原因归结为PLGA-PB-PEG-FA的光热作用。PLGA-PB-PTX-PEG-FA和PTX相比，因其具有靶向肿瘤细胞的作用和纳米药物递送功能，可以更多的被肿瘤细胞内吞，使肿瘤局部药物浓度高于游离PTX，从而发挥比PTX更大的抗肿瘤作用。上述实验结果和其他PB NPs相关的文献报道结果类似。而根据实验结果，PLGA-PB-PEG-FA不能抑制肿瘤生长，也说明不带化疗药物的纳米复合物的生物安全性。NIR组也不能抑制肿瘤生长，同上述排除了激光自身发热导致肿瘤细胞死亡的因素。我们的结果证实，制备的PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向纳米复合物可作为理想的体内综合化疗和光热肿瘤治疗的纳米物质。
PCNA和TUNEL法检测细胞增殖和凋亡情况，实验结果也证实了上面的观点。PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组肿瘤细胞增殖指数(PI)最低，而凋亡指数(AI)最低。而肿瘤HE染色显示PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组坏死区域最大，病理切片显示满视野几乎都是无定型坏死细胞形态。这和PCNA、TUNEL结果一致，更进一步证实了PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向纳米复合物高效的综合***的能力。并且，PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR组在随访21d后裸鼠心、肝、脾、肺、肾的HE染色切片和对照组相比，没有明显改变，说明制备的靶向纳米复合物良好的生物安全性。综上所述，制备的PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向纳米复合物有能力成为光声、磁共振多模态显影剂及影像介导下结合化疗和光热综合肿瘤治疗的靶向纳米物质。
对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (7)

1.载普鲁士蓝靶向纳米复合物，其特征在于，包括其内部包裹有普鲁士蓝纳米粒子的PEG化叶酸靶向乳酸/羟基乙酸共聚物外壳，PEG化叶酸靶向乳酸/羟基乙酸共聚物外壳上镶嵌有紫杉醇；
所述载普鲁士蓝靶向纳米复合物由如下方法制备：
(1)称取5mg紫杉醇和50mg PEG化叶酸靶向乳酸/羟基乙酸共聚物放入烧杯中；
(2)向烧杯中加入2mL二氯甲烷，密封杯口，振荡器振荡使其溶解，得A溶液；
(3)将200μL、100mg/mL的普鲁士蓝纳米粒子和100μL 4％的聚乙烯醇混合，将混合液逐滴加入至A溶液中，冰浴下声振2分钟，呈现蓝色初乳液；
(4)倒入5mL4％聚乙烯醇溶液中，冰浴条件下再次声振2分钟，得到淡蓝色复乳液；
(5)机械搅拌2小时至二氯甲烷挥发；
(6)以去离子水多次洗涤、离心后收集，得微球；
(7)将微球样品放入4℃冰箱中保存，得载普鲁士蓝靶向纳米复合物；
所述普鲁士蓝纳米粒子由如下方法制备：
A、将0.5mmol 98mg柠檬酸加入到20mL 1.0mmol/L FeCl3水溶液中，60℃搅拌，得溶液a；
B、然后，将20mL包含0.5mmol柠檬酸的1.0mM亚铁***水溶液逐滴加入a溶液中呈现为清澈的蓝色溶液，60℃搅拌1min；
C、冷却至室温，室温下再搅拌30min，得分散液；
D、将40mL的丙酮加入至分散液，28000rpm离心1h，形成普鲁士蓝纳米粒子沉淀；
E、纯化：普鲁士蓝纳米粒子沉淀用20mL蒸馏水声波降解法溶解，用20mL丙酮分离和离心；
F、重复多次纯化过程；
G、再将纯化后的普鲁士蓝纳米粒子沉淀溶于双蒸水中，置于14000MWCO透析袋中，再将透析袋置于双蒸水中透析24h，得普鲁士蓝纳米粒子；
H、将得到的普鲁士蓝纳米粒子放入4℃冰箱中保存。
2.根据权利要求1所述的载普鲁士蓝靶向纳米复合物，其特征在于：所述的PEG化叶酸靶向乳酸/羟基乙酸共聚物外壳为聚乳酸羟基乙酸PLGA上通过聚乙二醇PEG连接有叶酸FA。
3.根据权利要求2所述的载普鲁士蓝靶向纳米复合物，其特征在于：所述纳米复合物的外形呈球形；所述纳米复合物的粒径236.6±55.04nm；电位为-24.44±1.7mV。
4.根据权利要求3所述的载普鲁士蓝靶向纳米复合物，其特征在于：所述的紫杉醇的包封率为77.82％，载药量为7.22％。
5.根据权利要求4所述的载普鲁士蓝靶向纳米复合物，其特征在于：在500～900nm波长范围存在一个吸收波峰。
6.根据权利要求5所述的载普鲁士蓝靶向纳米复合物，其特征在于：在1756.23cm-1、2086cm-1均存在吸收峰，在2927cm-1存在特征峰。
7.根据权利要求6所述的载普鲁士蓝靶向纳米复合物，其特征在于：其激光辐照的半衰期为12h。
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