CN107001409A - 疏水性肽的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种通用性优异的制造方法，该方法在用亲水性单元对固相合成后的疏水性肽进行亲水化而进行HPLC纯化时，能够以所有疏水性肽作为纯化对象而不依赖于N末端的氨基酸残基的种类，而且能够根据该疏水性肽的种类而随机应变地选择亲水性单元。本发明是从由以C末端侧键合于该载体的第1肽链构成的带有载体的粗制肽获得纯化肽的方法，该方法包括：亲水化工序A，向带有载体的粗制肽的氨基依次分步导入或一步导入接头和亲水性单元，获得无载体的亲水化肽体；载体切除工序B，用于在从将接头键合于带有载体的粗制肽之前至得到亲水化肽体的任意阶段中、或者在得到了带有载体的亲水化肽体之后，切断第1肽链与载体之间的键；色谱纯化工序，将由亲水化工序A及载体切除工序B得到的无载体的亲水化肽体溶解于水并用液相色谱进行处理；以及接头切除工序，通过化学处理将色谱纯化后的无载体的亲水化肽体中含有的接头‑第1肽链之间的键切断。

Description

疏水性肽的制造方法
技术领域
本发明涉及简便地对键合了载体的粗制肽进行纯化而制造纯化肽的方法、以及适于该纯化肽的制造方法的接头。
背景技术
作为化学合成肽和蛋白质的方法，作为代表性的方法已知有：用聚苯乙烯高分子凝胶珠等作为固相，对其反复进行氨基酸的缩合反应和末端保护基的脱保护，由此使肽链依次延长的固相合成法；以及，在液相中反复进行氨基酸的缩合反应和末端保护基的脱保护，由此使肽链延长的液相合成法。其中，固相合成法中高分子凝胶键合于生成的肽链而不溶，因此可通过过滤等除去原料试剂等可溶性杂质，容易进行粗纯化。然后，对于通过除去高分子凝胶而得到的肽而言，在其为亲水性的情况下，可以利用反相HPLC等进一步进行纯化。然而，在生成的肽为疏水性的情况下，无法用反相HPLC进行纯化，产生难以高纯度化的问题。
作为固相合成的疏水性肽的纯化技术，已知如下方法：一方面从疏水性肽上切断除去固相载体，另一方面使亲水性肽键合，在暂时使疏水性肽亲水化而实施了HPLC纯化后，切断除去该亲水性肽，获得高纯度的疏水性肽。例如，专利文献1中记载了通过应用生物技术而使亲水性肽键合于疏水性肽的技术。但是，在利用生物技术的情况下，其制造效率受到目标疏水性肽的序列的很大影响，有时难以大量生产，存在缺乏技术通用性的问题。
作为将亲水性氨基酸连续地键合于疏水性肽并进行亲水化、HPLC纯化的技术，除了上述使用了生物技术的肽制造方法以外，还已知：利用了Boc固相合成法的技术(非专利文献1)、利用了Fmoc固相合成法的技术(非专利文献2～5等)。在采用这些化学方法形成肽的情况下，由于连续地反复进行氨基酸的保护基的脱保护和肽合成，因此不需要在氨基酸脱保护反应条件下切断疏水性肽与固相载体之间的键。例如，在Boc固相合成法中，为了用作为强酸的TFA对氨基酸的保护基进行脱保护，而使疏水性肽与固相载体之间的键具有耐强酸性。该疏水性肽与固相载体的键的切断通常使用HF。但是，HF危险且有害，需要特殊的制造装置。
在Fmoc固相合成法中，由于可以在碱性条件下进行脱保护，因此与固相载体的键合方法的自由度高。例如，在非专利文献2、3中公开了如下方法：用Fmoc固相合成法在固相载体上合成亲水性肽，接着在其N末端侧键合4-羟甲基苯甲酸作为接头，再用Fmoc固相合成法合成疏水性肽。在该方法中，固相载体与肽链容易切断，而且接头的羟基侧(疏水性肽键合侧)也容易切断。但是，在该方法中，难以根据目标肽(疏水性肽)的氨基酸序列而适当变更亲水性肽，缺乏方法的通用性。另外，在从接头的羟基侧除去亲水性肽时需要强碱性条件。因此，存在因以天冬酰亚胺(aspartimide)化为代表的副反应所导致的纯度降低的隐患，也存在得到的疏水性肽的C末端侧的形态仅限于羧酸的问题。
非专利文献4和5的方法为相同的Fmoc固相合成法，而且在能够用固相合成法先合成疏水性肽(目标肽)方面比上述非专利文献2、3的方法更优异。该方法需要在合成N末端具有亲水性肽和亚苯基型化合物的氨基酸之后完成疏水性肽的序列。因此，由于每个疏水性肽需要N末端具有亲水性肽和亚苯基型化合物的氨基酸，可以认为是繁琐的工艺。另外，最终得到的疏水性肽无法使N末端侧为半胱氨酸、蛋氨酸，缺乏通用性。另外，在该方法中，难以根据目标肽(疏水性肽)的氨基酸序列而适当变更亲水性肽，在这一方面也缺乏方法的通用性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平07-102000号公报
非专利文献
非专利文献1：Englebretsen、D.R.等著、Tetrahedron 1999、55、6623；
非专利文献2：Hossain、M.A等著、Bioconjutgate.Chem.2009、20、1390；
非专利文献3：Choma、C.T.等著、Tetrahedron Letters 1998、39、2417；
非专利文献4：Vorherr、T.著、Chimica Oggi 2007、25、22；
非专利文献5：Dick、F等著、Eur.Pept.Symp.29th、Gdansk 2006、Post e Th009。
发明内容
发明要解决的课题
因此，本发明的目的在于提供一种制造方法，该方法在用亲水性单元对固相合成的疏水性肽进行亲水化并进行HPLC纯化时，能够不依赖于N末端的氨基酸残基的种类而以全部疏水性肽作为纯化对象，且疏水性肽的C末端侧的形态不受羧酸的限制，另外，可以根据疏水性肽的种类而随机应变地选择亲水性单元，而且通用性优异。
解决课题的方法
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果是，首先，以随后向固相合成的目标肽导入接头和亲水性单元的形式，将亲水性单元设计为能够随机应变地进行选择的形式。由此，可以使C末端侧的形态不限定于羧酸而进行亲水化。因此发现，在导入接头和亲水性单元时，只要预先将目标肽与接头的键设计为能够通过化学处理来切断的形式，就能够形成该键而不依赖于目标肽的N末端氨基酸的种类，可以扩展目标肽的种类，且这样的键具有对氨基酸保护基的脱保护条件(作为Fmoc脱保护条件的哌啶条件等)、对从固相载体上切下(TFA条件等)的耐性，能够制造用于HPLC纯化的无载体的亲水化肽体(目标肽、接头和亲水性单元的键合体)，而且在该纯化后可以简便地切断除去亲水性单元及接头，由此完成了本发明。
即，本发明如下所述。
[1]一种纯化肽的制造方法，其是从由载体和以C末端侧键合于该载体的第1肽链构成的带有载体的粗制肽获得纯化肽的方法，该方法包括：
亲水化工序A，向带有载体的粗制肽的氨基依次分步导入或一步导入接头和亲水性单元，获得无载体的亲水化肽体；
载体切除工序B，用于在从将接头键合于带有载体的粗制肽之前至得到亲水化肽体的任意阶段中、或者在得到了带有载体的亲水化肽体之后，切断第1肽链与载体之间的键；
色谱纯化工序，用液相色谱对由亲水化工序A及载体切除工序B得到的无载体的亲水化肽体进行处理；以及
接头切除工序，通过化学处理将色谱纯化后的无载体的亲水化肽体中含有的接头-第1肽链之间的键切断。
[2]根据[1]所述的纯化肽的制造方法，其中，通过催化还原或酸来进行所述接头切除工序。
[3]根据[2]所述的纯化肽的制造方法，其中，使用含有酸和路易斯酸的混合溶液来进行所述接头切除工序。
[4]根据[3]所述的纯化肽的制造方法，其中，使用含有TFA和路易斯酸的混合溶液来进行所述接头切除工序。
[5]根据[4]所述的纯化肽的制造方法，其中，使用含有TFA、TMSOTf及茴香硫醚的混合溶液来进行所述接头切除工序。
[6]根据[2]所述的纯化肽的制造方法，其中，使用pKa-2以下的酸来进行所述接头切除工序。
[7]根据[2]所述的纯化肽的制造方法，其中，使用金属担载催化剂来进行所述接头切除工序。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水性单元为亲水性肽、聚醚或多胺。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水化工序A由使接头键合于粗制肽的氨基的接头键合工序和将亲水性单元键合于得到的接头键合体的接头部位的亲水性单元键合工序构成，
在所述亲水性单元键合工序中，
通过Fmoc固相合成法分步地使多个氨基酸键合于接头部位、或
使预先制备的亲水性肽链键合于接头部位、或
使预先制备的聚醚键合于接头部位、或者
使预先制备的多胺键合于接头部位。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，在通过所述亲水化工序A得到了带有载体的亲水化肽体之后，实施载体切除工序B。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，在接头切除工序后用水或含水溶剂进行清洗。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，通过Fmoc固相合成法使多个氨基酸依次键合于载体，形成所述带有载体的粗制肽。
[13]根据[1]～[12]中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述接头通过形成苄氧羰基氨基或苄氨基而与第1肽链键合。
[14]根据[1]～[13]中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述接头具有：能够与粗制肽形成苄氧羰基氨基或苄氨基的第1基团、和能够与亲水性单元化学键合的第2基团。
[15]根据[1]～[14]中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水性单元的logP(式中，P为在辛醇-水体系中的分配系数)值为-1以下。
[16]根据[1]～[15]中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水性单元为亲水性肽链，所述亲水性肽链含有2个以上选自精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸中至少1种以上的氨基酸残基。
[17]根据[1]～[16]中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水性单元为亲水性肽链，所述亲水性肽链含有2个以上选自天冬氨酸、谷氨酸中至少1种以上的氨基酸残基。
[18]根据[8]～[17]中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水性肽链的氨基酸残基的数量为2以上且35以下。
[19]一种接头，其具有：能够与伯胺或仲胺形成苄氧羰基氨基或苄氨基的第1基团、和能够与亲水性单元化学键合的第2基团。
[20]一种接头，其以下式(1)表示，
[化学式1]
式(1)中，R1为具有受到保护的伯氨基的有机基团，R2为吸电子性基团，n为0～4的整数，Z为下式(a)所表示的碳酸酯基、甲酰基或卤代甲基，
[化学式2]
式(a)中，X表示离去基团，＊表示与化合物(1)的苯环的键合部位。
[21]一种接头，其以下式(2)、下式(4)或下式(6)表示，
[化学式3]
式(2)中，R2为吸电子性基团，n为0～4的整数，Pro为氨基保护基，X为-ORx(式中Rx为杂环酰亚胺基)，R3为碳原子数1～10的亚烷基，
[化学式4]
式(4)中，R2为吸电子性基团，n为0～4的整数，Pro为氨基保护基，R3为碳原子数1～10的亚烷基，
[化学式5]
式(6)中，R2为吸电子性基团，n为0～4的整数，Pro为氨基保护基，R3为碳原子数1～10的亚烷基，X3为卤原子。
[22]一种接头，其以下式(3a)表示。
[化学式6]
发明的效果
根据本发明，以随后向目标肽依次导入接头和亲水性单元的形式，将亲水性单元设计为能够随机应变地进行选择的形式，将目标肽与接头的键制备成能够通过化学处理来切断的形式，因此，目标肽的形态及序列不受限制。因此，能够扩展目标肽的种类，纯化后的亲水性单元的切断也简便。
附图说明
图1是实施例1中得到的亲水化肽体(粗产物)的HPLC分析结果。
图2是实施例1中得到的亲水化肽体(粗产物)的质量分析结果。
图3是实施例1中得到的亲水化肽体(纯化后)的HPLC分析结果。
图4是实施例1中得到的亲水化肽体(纯化后)的质量分析结果。
图5是实施例1中得到的高纯度的疏水性肽GILTVSVAV的HPLC分析结果。
图6是实施例1中得到的高纯度的疏水性肽GILTVSVAV的质量分析结果。
图7是实施例4中得到的亲水化肽体(粗产物)的HPLC分析结果。
图8是实施例4中得到的亲水化肽体(粗产物)的质量分析结果。
图9是实施例4中得到的亲水化肽体(纯化后)的HPLC分析结果。
图10是实施例4中得到的亲水化肽体(纯化后)的质量分析结果。
图11是实施例4中得到的高纯度的疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV的HPLC分析结果。
图12是实施例4中得到的高纯度的疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV的质量分析结果。
具体实施方式
＜纯化肽的制造方法＞
以下所示的简图I示出了本发明的制造工艺的基本情况。以下，在适当参考该简图的同时对本发明详细地进行说明。
[化学式7]
本发明的纯化肽的制造方法以带有载体的粗制肽作为纯化对象(目标)，所述带有载体的粗制肽由载体和以C末端侧键合于该载体的第1肽链构成。因此，其目的在于依次对该纯化对象进行处理，最终得到纯化后的游离的第1肽链(纯化肽)。
从该纯化对象(带有载体的粗制肽)至目标物(第1肽链)的处理步骤有如下工序：
亲水化工序A(简图I中，工序A1a及A1b或A2-I)，向粗制肽(简图I中，带有载体的粗制肽或无载体的粗制肽中的任一种)的氨基依次分步导入或一步导入接头和亲水性单元，获得亲水化肽体(简图I中，带有载体的亲水化肽体或无载体的亲水化肽体中的任一种)；
载体切除工序B(简图I中，工序B1、B2、B3中的任一种)，用于在从将接头键合于带有载体的粗制肽之前得到亲水化肽体的任意阶段中、或者在得到了带有载体的亲水化肽体之后，切断第1肽链与载体之间的键；
色谱纯化工序，将由亲水化工序A及载体切除工序B得到的无载体的亲水化肽体溶于水，并用液相色谱进行处理；以及
接头切除工序，通过化学处理将色谱纯化后的无载体的亲水化肽体中含有的接头-第1肽链之间的键切断。
在该方法中，先在载体上形成第1肽链(目标肽链)，随后键合亲水性单元，因此，能够随机应变地选择亲水性单元，可以提高工艺设计的自由度。而且，根据本发明，在亲水化工序A中将亲水性单元键合于第1肽链，且在切除工序B1～B3中除去了载体，因此，能够使第1肽链亲水化，可以进行色谱纯化。特别是在本发明的方法中，接头与第1肽链之间形成了能够通过化学处理切断的键，这样的键具有对氨基酸保护基除去条件的耐久性，因此，例如可以用Fmoc合成法形成亲水性单元。另外，由于也具有对固相载体的切断除去条件(TFA条件等)的耐久性，因此，即使在导入了亲水性单元之后(当然，即使在导入亲水性单元之前)也可以除去固相载体，设计的自由度极大提高。另外，该键可以不依赖于第1肽链的N末端氨基酸种类而形成，因此能够提高第1肽链(目标肽)的通用性。因此，在色谱纯化结束后可以与上述相同地通过化学处理按照各个切断除去亲水性单元，因此，不需要用于该切断除去的特殊设备，能够简便地制造纯化第1肽链(纯化肽)。以下，按照工序顺序详细地对本发明进行说明。
1.带有载体的粗制肽的制造工序
首先，从作为纯化对象的带有载体的粗制肽的制造工序进行说明。“带有载体的粗制肽”是指由载体和以C末端侧键合于该载体的第1肽链构成的载体与第1肽链的键合体。因此，“第1肽链”是指两个以上的氨基酸能够在氨基与羧基之间形成肽键而聚合的化合物，在本发明中，以纯化该第1肽链作为目标。需要说明的是，在本说明书中，“粗制肽”是包括带有载体的粗制肽和无载体的粗制肽两者的概念。带有载体的粗制肽的制造工序在本发明中不是必须的，经过其它工艺得到的粗制肽也可以适用本发明的纯化方法，但通过下述工序制造带有载体的粗制肽较简便。在下述带有载体的粗制肽的制造工序中，进行将多个氨基酸依次键合于载体的N末端侧的固相肽合成。
上述氨基酸是指至少分别具有1个以上碱性的氨基(-NH2)和酸性的羧基(-COOH)的化合物。在本发明中，上述氨基酸没有特别限定，可优选列举例如：甘氨酸、丙氨酸、3,3,3-三氟丙氨酸、2-氨基丁酸、2-氨基-2-甲基丁酸、正缬氨酸、5,5,5-三氟正缬氨酸、缬氨酸、2-氨基-4-戊烯酸、2-氨基-2-甲基戊烯酸、炔丙基甘氨酸、2-氨基环戊烷羧酸、正亮氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、叔亮氨酸、2-氨基-4-氟-4-甲基戊酸、4-氨基环己烷羧酸、丝氨酸、O-甲基丝氨酸、O-烯丙基丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、半胱氨酸、2-甲基半胱氨酸、蛋氨酸、青霉胺、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、2-氨基己二酸、鸟氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、(1R,2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸、(1R,2S)-1-氨基-2-乙基环丙烷羧酸、肌氨酸、苯丙氨酸、N-甲基丙氨酸、N,N-二甲基丙氨酸等α-氨基酸；氮丙啶羧酸、吖丁啶羧酸、脯氨酸、1-甲基脯氨酸、2-甲基脯氨酸、2-乙基脯氨酸、3-甲基脯氨酸、4-甲基脯氨酸、5-甲基脯氨酸、4-亚甲基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、4-氟脯氨酸、哌可酸、哌啶酸、异哌啶酸等环状氨基酸；β-丙氨酸、异丝氨酸、3-氨基丁酸、3-氨基戊酸、β-亮氨酸等β-氨基酸；4-氨基丁酸、4-氨基-3-甲基丙酸、4-氨基-3-丙基丁酸、4-氨基-3-异丙基丁酸、4-氨基-2-羟基丁酸等γ-氨基酸。优选的氨基酸为天然氨基酸、α-氨基酸等，是天然α-氨基酸，在本发明中，对于1分子氨基酸中的氨基和羧基的数量没有特别限定，例如，可以为1个，也可以为多个。而且，每1分子氨基酸中的氨基与羧基的数量可以相同，也可以不同。
上述第1肽链对水的溶解性是按照GRAVY(grand average of hydropat hy)得分来进行评价的。GRAVY得分是指蛋白质中的全部氨基酸的平均亲水性得分。GRAVY得分可以按照Kyte等的方法(J.Kyte,RF.Doolittle,J Mol.Biol 152(1982)105)计算，通常，得分为正的肽具有疏水性的倾向，得分为负的肽具有亲水性的倾向。根据本发明，能够对以往难以纯化的疏水性肽进行纯化。以上述GRAVY得分计，这样的疏水性肽优选为-0.5以上，更优选为0以上，进一步优选为0.5以上。上限没有特别限定，但通常为10以下，可以为5以下。
另外，根据本发明，能够对以往难以合成的包含半胱氨酸、蛋氨酸等含硫氨基酸的第1肽链进行纯化，因此，本发明对包含含硫氨基酸的肽的纯化也是有用的。
上述第1肽链的氨基酸残基的数量例如优选为2以上，更优选为4以上，进一步优选为6以上。上限没有特别限定，例如优选为200以下，更优选为150以下，进一步优选为100以下。
在带有载体的粗制肽的制造工序中，通过肽固相合成法制造上述第1肽链。肽固相合成法是指，在聚苯乙烯等水不溶性固相载体上经由直接键合于该载体的接头依次键合氨基酸的C末端而使肽逐渐延长的方法。在完成了希望的序列之后，从载体上切断生成的肽链，由此可以制造希望的肽。根据本合成法，能够不依赖于氨基酸的序列而合成大范围的肽，因此易于全自动化。
作为使多个氨基酸依次键合于载体而合成上述带有载体的粗制肽的方法，优选使用Fmoc基作为N末端保护基的Fmoc固相合成法。通常在Fmo c固相合成法中，可以在酰胺类溶剂(DMF等)和胺类碱(特别是哌啶)等碱性条件下进行脱保护，利用酸性条件(TFA等)从载体上切下生成的肽。
Fmoc固相合成中使用的氨基酸可以使用N末端受到保护的普通的氨基酸。在使接头键合于肽的主链或支链的情况下，可以使用下述氨基酸，所述氨基酸具有在未使用哌啶、TFA的条件下能够脱保护的基团。另外，也可以在第1肽链形成后，向任意的氨基酸残基导入保护基团。
在利用Fmoc固相合成法进行肽合成的情况下，N末端被Fmoc保护，且使羧酸基被活性化的氨基酸与肽的N末端发生反应而形成新的肽键，接着，将Fmoc保护基团脱保护，露出新的N末端，使其与N末端被Fmoc保护且羧酸基被上述方法所活性化后的下一个氨基酸发生反应，以后，重复相同的步骤，由此合成肽链。
上述水不溶性固相载体没有特别限定，可以使用肽固相合成法中广泛应用的例如Rink amide resin、Rink Amide AM resin、Rink amide PEGA res in、Rink amide MBHAresin、Rink amide AM resin、Rink Amide NovaGe l、NovaSyn TGR resin、NovaSyn TGAresin、TentaGel resin、Wang resin、HMPA-PEGA resin、HMP-NovaGel、HMPA-NovaGel、2-Chlorotrityl resin、NovaSyn TGT alcohol resin、HMPB-AM、Sieber Amide resin、NovaSyn T G Sieber resin、4-{4-Formyl-3-methoxyphenoxy}butyryl AM resin、4-Sulfa mylbutyryl AM resin、4-Sulfamylbutyryl AM PEGA、4-Fmoc-hydrozinobe nzoylAM resin、HMBA-AM resin、HMBA-NovaGel、DHP HM等各种载体。固相载体优选在表面具有作为固相合成的起点的氨基，该氨基可以已经被保护。在固相载体的表面存在氨基时，可以经由酰胺基团键合上述第1肽链和载体。
在肽的合成中，可以通过各种活性酯法、或者通过1-羟基苯并***(HO Bt)、1-羟基-7-偶氮苯并***(HOAt)等***类；O-(苯并***-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-偶氮苯并***-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、O-(6-氯苯并***-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HCTU)、N,N,N’,N’-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲六氟硼酸盐(T STU)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基吗啉基碳六氟磷酸盐(COMU)、1H-苯并***-1-基氧基三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP)等氟磷酸盐类；1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)等碳二亚胺类；丙基磷酸酐(T3P)；等所代表的偶联试剂对氨基酸的羧基进行活性化，使其与肽的N末端氨基发生反应，由此形成肽键。
在用Fmoc固相合成法合成了带有载体的粗制肽之后，该带有载体的粗制肽可以根据需要进行过滤，且可以用适当的有机溶剂(例如，DMF、二氯甲烷等)进行清洗。通过这样进行过滤/清洗，可以简便地除去溶解性的杂质(原料等)，能够提高带有载体的粗制肽的纯度。需要说明的是，在以下的工序中，只要在切断除去载体之前，就可以适当实施该过滤/清洗工序。
2.亲水化工序
亲水化工序是本发明的最初的工序，其特征在于，向上述粗制肽(带有载体的粗制肽或无载体的粗制肽中的任一种)的氨基依次分步导入或一步导入接头和亲水性单元，获得亲水化肽体(带有载体的亲水化肽体或无载体的亲水化肽体中的任一种)。
亲水化工序中使用的粗制肽可以使用经过各种工艺得到的粗制肽，从简便方面考虑，可以使用上述工序中制造的带有载体的粗制肽。向上述工序中制造的带有载体的粗制肽导入接头和亲水性单元的方法没有特别限定，可以由接头键合工序(简图I中，A1a)和亲水性单元键合工序(简图I中，A1b)构成，所述接头键合工序使接头键合于带有载体的粗制肽的氨基，所述亲水性单元键合工序将亲水性单元键合于得到的带有载体的接头键合体的接头部位；也可以实施亲水性单元接头复合体键合工序(简图I中，A2-I)，所述亲水性单元接头复合体键合工序将预先使亲水性单元与接头复合而成的复合物(复合体)键合于带有载体的粗制肽的氨基。
另外，在亲水化工序中可以使用无载体的粗制肽。可以与A1a～A1b、A2-I一样地实施使接头键合于该无载体的粗制肽的接头键合工序(简图I中，A1c)、亲水性单元键合工序(简图I中，A1d)、亲水性单元接头复合体键合工序(简图I中，A2-II)。
对于上述接头的键合位置而言，只要是至少键合有1个以上氢原子的粗制肽中的氨基，就可以是第1肽链的末端、支链中的任一者。
＜接头键合工序A1a＞
在本发明中，“接头”是指如下化合物，其具有能够与第1肽链(例如，氨基)键合的第1键合基团，还具有能够与下面叙述的亲水性单元键合的第2键合基团，能够在键合后以与第1肽链和亲水性单元键合的状态存在于第1肽链与亲水性单元之间。在本说明书中，将该接头键合工序中得到的产物称为“接头键合体”，将结合了载体的接头键合体特别称为“带有载体的接头键合体”，将除去了载体的接头键合体特别称为“无载体的接头键合体”。因此，在本发明中，如下面所述，有时在将接头键合于带有载体的粗制肽后，通过肽合成将氨基酸与该接头连接，制备亲水性单元。因此，需要在肽合成条件(特别是在氨基酸的脱保护条件)下不能切断接头与第1肽链之间的键，例如，在利用Fmoc合成法的情况下，要求对脱Fmoc条件的碱性条件的耐久性。另外，对于该接头与第1肽链之间的键而言，要求对于从载体上切下第1肽链时的试剂(例如，在Fmoc固相合成法的情况下，TFA等酸性条件)的耐性。这是由于，在切断第1肽链与载体时使接头与第1肽链之间的键不被切断，可以键合亲水性单元。
为了满足这些要求特性，上述接头的第1肽链侧的上述第1基团具有能够与至少具有1个以上氢原子的伯胺或仲胺(例如，第1肽链的氨基)形成苄氧羰基氨基或苄氨基的第1基团。这样的第1基团不仅能够与第1肽链的N末端等和接头键合，而且具有酸性或碱性条件下的耐性。另一方面，接头的亲水性单元侧的第2基团为能够与亲水性单元化学键合的基团。
作为具有这样的第1基团及第2基团的优选接头，可以列举例如下述式(1)所示的化合物。
[化学式8]
式(1)中，R1为具有受到保护的伯氨基的有机基团，R2为吸电子性基团，n为0～4的整数，Z为下式(a)所表示的碳酸酯基、甲酰基或卤代甲基。
[化学式9]
式(a)中，X表示离去基团，＊表示与化合物(1)的苯环的键合部位。上述式(a)中的离去基团X没有特别限定，例如为氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等卤原子；-ORx…(9)(式中Rx表示脂肪族烃基、脂环烃基、芳香族烃基或杂环基，这些基团任选具有取代基)所示的有机基团。
上述脂肪族烃基的碳原子数优选为1～20，具体而言，可以列举：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正辛基、正癸基、正十二烷基、正十八基等烷基；乙烯基、烯丙基等烯基；乙炔基、炔丙基这样的炔基等。
另外，上述脂环烃基的碳原子数优选为3～20，具体而言，可以列举：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基、降冰片基、金刚烷基这样的环烷基；环戊基甲基、环己基甲基这样的环烷基烷基；等。
上述芳香族烃基的碳原子数优选为6～20，具体而言，可以列举：苯基、萘基、茚基等芳基；苄基、4-苯基丁基等芳烷基；等。
另外，上述杂环基是上述脂环烃基或芳香族烃基中构成环的碳的一部分被氮、氧、硫等碳以外的原子取代后的基团，碳原子数优选为3～20。作为杂环基，更优选为在含氮杂环基中具有至少1个酰亚胺基的含氮杂环酰亚胺基。作为这样的含氮杂环酰亚胺基，可以列举例如下述例示的饱和或不饱和的含氮杂环酰亚胺基。
[化学式10]
作为这样的杂环酰亚胺基，可以特别优选例示出：琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、邻苯二甲酰亚胺基等。
脂肪族烃基、脂环烃基、芳香族烃基或杂环基任选具有取代基，作为所述取代基的例子，可以列举：烷基；氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等卤原子；氨基；羟基；硝基；等。
作为这样的-ORx，可以列举例如：N-琥珀酰亚胺基氧基、N-马来酰亚胺基氧基、N-邻苯二甲酰亚胺基氧基、对硝基苯基氧基、苄基氧基等，其中，优选N-琥珀酰亚胺基氧基。
由于这样的结构，接头能够通过形成苄氧羰基氨基或苄氨基而与第1肽链键合。以下，在本说明书中，根据Z基团的结构，将这些化合物称为碳酸酯型接头、醛型接头或卤素型接头。
在上述式(1)中，R1为具有受到保护的伯氨基的有机基团。作为这样的取代基，只要在有机基团的末端存在受到保护的伯胺基即可，没有特别限定，例如，优选下述式(b)所示的具有受到保护的伯氨基的有机基团。
[化学式11]
(式(b)中，R3为二价烃基，A为选自-CH2-、-O-、-S-及-NH-中的一个取代基，Pro为氨基保护基团，＊表示与化合物(1)的苯环的键合部位。)
在上述式(b)中，R3为二价烃基，更优选为二价的脂肪族烃基，作为上述二价的脂肪族烃基，可以是饱和、不饱和烃基的任一种，特别优选为亚烷基，优选为碳原子数1～10的亚烷基，更优选为碳原子数2～5的亚烷基。例示优选的亚烷基，可以列举例如：-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH(CH2)CH2-、-CH(C2H5)CH2-、-C(CH2)2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-等，其中，优选为-CH2CH2-(亚乙基)、-CH(CH2)CH2-(亚丙基)或-CH2CH2CH2-(三亚甲基)，最优选为-CH2CH2-(亚乙基)。
在上述式(b)中，A为选自-CH2-、-O-、-S-及-NH-中的一个取代基，其中，优选为-O-或-S-，更优选为-O-。
在上述式(b)中，Pro只要是氨基保护基团即可，没有特别限定，可以列举：酰基类、氨基甲酸酯类、酰亚胺类、磺胺类等，其中，优选为乙酰基、叔丁氧羰基(-Boc)、苄氧羰基(-Z)、9-芴甲氧羰基(-Fmoc)、2,2,2-三氯乙氧羰基(-Troc)、烯丙氧羰基(-Alloc)等氨基甲酸酯类保护基团。特别是从能够以上述第1肽链中的氨基作为起点进行随后的反应方面考虑，上述Pro优选与第1肽链中的氨基保护基团相同，更优选为9-芴甲氧羰基(-Fmoc)。
在上述式(b)中，R2为吸电子性基团，更优选为选自卤素、氰基、硝基、磺基、烷氧基羰基及酰基中的至少一种取代基。
作为上述卤素，可以列举氟、氯、溴、碘，其中特别优选氯。
作为上述烷氧基羰基，可以列举例如：甲氧羰基、乙氧羰基、丙氧羰基、丁氧羰基、戊氧羰基、己氧羰基、庚氧羰基、辛氧羰基、癸氧羰基、十八烷氧羰基、以及三氟甲基氧基羰基等。
作为上述酰基，可以列举例如：乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基、1-萘甲酰基、2-萘甲酰基等。其中，优选为碳原子数2～15的酰基，更优选为碳原子数2～10的酰基。
在上述式(1)中，n为0～4的整数，更优选为1、2、3，进一步优选为2。N为2以上时，多个R2可以相同，也可以不同。
R1和R2与苯环的键合位置没有特别限定。R1的键合位置以碳酸酯基计可以为2～6位，进一步优选为2位、3位、4位、5位，更优选为2位或4位，特别优选为4位。另外，键合R2时的键合位置可以为2～6位中的任一个，作为更优选的方式，R2至少可以键合于苯环的3位及5位。
在上述的接头中，上述碳酸酯型接头优选为例如下述式(2)所示的化合物。
[化学式12]
[式(2)中，R2为吸电子性基团，n为0～4的整数，Pro为氨基保护基团，X为-ORx(式中Rx为杂环酰亚胺基)，R3为碳原子数1～10的亚烷基。]优选的X为N-琥珀酰亚胺基氧基，优选的R2、n、Pro、R3与式(1)相同。其中，作为最优选的碳酸酯型接头，例如为下述式(3a)～(3e)所示的化合物。
[化学式13]
[化学式14]
[化学式15]
[化学式16]
[化学式17]
另外，醛型接头优选为例如下述式(4)所示的化合物。
[化学式18]
(式(4)中，R2为吸电子性基团，n为0～4的整数，Pro为氨基保护基团，R3为碳原子数1～10的亚烷基)。优选的R2、n、Pro、R3与式(1)相同。其中，最优选的醛型接头为下述式(5)所示的化合物。
[化学式19]
另外，卤素型接头例如为下述式(6)所示的化合物。
[化学式20]
(式(6)中，R2为吸电子性基团，n为0～4的整数，Pro为氨基保护基团，R3为碳原子数1～10的亚烷基，X3为卤原子。)
本发明的各种接头的制造方法没有特别限定，碳酸酯型接头或醛型接头的制造方法分别包括至少将下述式(7)(式(7)中，R1、R2、n与上述相同)所示的苄醇衍生物的羟甲基碳酸酯化、氧化或卤化的工序。
[化学式21]
对于将上述式(7)所示的苄醇衍生物的羟甲基碳酸酯化的反应而言，其特征在于，在碱存在下使上述式(7)所示的苄醇衍生物与下述式(8)(式(8)中，X1、X2分别为离去基团)所示的化合物发生反应。
[化学式22]
式(8)中，X1、X2的离去基团例如为氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等卤原子；-ORx…(9)(式中Rx表示脂肪族烃基、脂环烃基、芳香族烃基或杂环基，这些基团任选具有取代基)所示的有机基团。
上述脂肪族烃基优选为碳原子数为1～20的烃基，具体而言，可以列举：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正辛基、正癸基、正十二烷基、正十八烷基等烷基；乙烯基、烯丙基等烯基；乙炔基、炔丙基这样的炔基等。
另外，上述脂环烃基的碳原子数优选为3～20，具体而言，可以列举：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基、降冰片基、金刚烷基这样的环烷基；环戊基甲基、环己基甲基这样的环烷基烷基；等。
上述芳香族烃基的碳原子数优选为6～20，具体而言，可以列举：苯基、萘基、茚基等芳基；苄基、4-苯基丁基等芳烷基；等。
另外，上述杂环基是上述脂环烃基或芳香族烃基中构成环的碳的一部分被氮、氧、硫等碳以外的原子取代后的基团，碳原子数优选为3～20。作为杂环基，更优选为在含氮杂环基中具有至少1个酰亚胺基的含氮杂环酰亚胺基。作为这样的含氮杂环酰亚胺基，可以列举例如下述例示的饱和或不饱和的含氮杂环酰亚胺基。
[化学式23]
作为这样的杂环酰亚胺基，可以特别优选例示出：琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、邻苯二甲酰亚胺基等。
脂肪族烃基、脂环烃基、芳香族烃基或杂环基任选具有取代基，作为所述取代基的例子，可以列举：烷基；氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等卤原子；氨基；羟基；硝基；等。
作为这样的-ORx，可以列举例如：N-琥珀酰亚胺基氧基、N-马来酰亚胺基氧基、N-邻苯二甲酰亚胺基氧基、对硝基苯基氧基、苄基氧基等。
在式(8)中，X1、X2可以相同，也可以不同。优选的化合物(8)例如为碳酸衍生物(例如，N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯等)、氯甲酸酯化合物(例如，N-琥珀酰亚胺基氯甲酸酯、对硝基苯基氯甲酸酯)等。
碳酸酯化反应中的具有上述式(8)所示的碳酸酯基的化合物的用量相对于上述式(7)所示的苄醇衍生物1mol为0.5倍mol以上，更优选为0.8倍mo l以上，进一步优选为1倍mol以上，优选为3倍mol以下，更优选为2.5倍mol以下，进一步优选为2倍mol以下。
上述碱没有特别限定，可以列举例如：三乙胺、三正丁基胺、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、二异丙基乙胺、吡啶、N,N-二甲基氨基吡啶、1,4-二氮杂双环[2,2,2]辛烷等叔胺类；氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化镁等金属氢氧化物；碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾等金属碳酸盐；碳酸氢锂、碳酸氢钠、碳酸氢钾等金属碳酸氢盐；甲醇锂、乙醇锂、甲醇钠、乙醇钠、甲醇钾、乙醇钾、叔丁醇钾等金属醇盐。其中，优选叔胺类，更优选吡啶或N,N-二甲基氨基吡啶。这些碱可以单独使用1种，也可以组合使用多种。
在对上述式(7)所示的苄醇衍生物的羟甲基进行氧化的反应中，其特征在于使氧化剂发挥作用而对上述式(7)所示的苄醇衍生物进行氧化。
上述氧化剂没有特别限定，可以列举例如：氯酸钾、氯酸钠、氯酸铵、氯酸钡、氯酸钙等氯酸盐；高氯酸钾、高氯酸钠、高氯酸铵等高氯酸盐；过氧化钾、过氧化钠、过氧化钙、过氧化镁、过氧化钡等无机过氧化物；亚氯酸钾、亚氯酸钠、亚氯酸铜等亚氯酸盐；溴酸钾、溴酸钠、溴酸镁等溴酸盐；硝酸铵、硝酸钠、硝酸钾、硝酸钡、硝酸银等硝酸盐；碘酸钾、碘酸钠、碘酸钙等碘酸盐；高锰酸钾、高锰酸铵等高锰酸盐；重铬酸钠、重铬酸铵等重铬酸盐；高碘酸钠、偏高碘酸等高碘酸盐；二氧化锰；三氧化铬、铬酸酐、铬酸、重铬酸等铬酸盐；二氧化铅、亚硝酸钠、次氯酸钾、次氯酸钠、过二硫酸钾、过二硫酸钠、过二硫酸铵、过硼酸钾、过硼酸铵、臭氧、高氯酸、氧化钨、或者过氧化氢等。其中，从容易获得的观点考虑，优选为二氧化锰。这些氧化剂可以单独使用1种，也可以组合使用多种。
在接头键合工序中，需要根据各接头的特性调整反应条件。以下，按照本发明中代表性使用的碳酸酯型接头、醛型接头分别对反应条件进行说明。
<<碳酸酯型接头的情况>>
对使用了碳酸酯型接头时的接头键合工序进行说明。在使用碳酸酯型接头时，通过将碳酸酯型接头与粗制肽混合形成苄氧羰基氨基而使接头与第1肽链的氨基键合，由此形成接头键合体。
在该反应中，相对于粗制肽1mol，碳酸酯型接头的用量优选为0.5倍m ol以上，更优选为1倍mol以上，进一步优选为2倍mol以上，优选为20倍mol以下，更优选为10倍mol以下。
碳酸酯型接头与粗制肽的反应优选在溶剂存在下实施，作为反应溶剂，可以使用例如：二异丙基醚、叔丁基甲基醚、二丁基醚、二烷、二乙二醇二甲醚等醚类溶剂；丙二醇单甲醚乙酸酯等改性醚类；乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯类溶剂；氯仿、二氯甲烷等含卤素类溶剂；等有机溶剂、甲醇、乙醇等醇类；乙二醇、二甲氧基乙烷、四氢呋喃等醚类；乙腈等腈类；二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺类；等水性溶剂。这些反应溶剂可以仅单独使用1种，也可以组合使用多种。其中，优选为酰胺类，更优选为二甲基甲酰胺。
作为上述反应溶剂的用量，相对于粗制肽，优选为50倍重量以下，进一步优选为20倍重量以下，下限没有特别限定，但优选为2倍重量以上。
另外，在本反应中，为了加速反应，可以共存例如三乙胺、三正丁基胺、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、二异丙基乙胺、吡啶、N,N-二甲基氨基吡啶、1,4-二氮杂双环[2,2,2]辛烷等叔胺类作为反应促进剂。
反应温度只要在使用的溶剂的沸点以下即可，没有特别限定，例如优选为0℃以上，更优选为10℃以上，进一步优选为20℃以上，优选为100℃以下，更优选为80℃以下。
反应时间也没有特别限定，优选为1小时以上，更优选为2小时以上，优选为100小时以下，更优选为50小时以下。
反应结束后，可以对得到的接头键合体进行清洗，除去不需要的成分。作为清洗用的溶剂，可以使用反应溶剂一栏中详细叙述的各种溶剂。
<<醛型接头的情况>>
对使用了醛型接头时的接头键合工序进行说明。在使用醛型接头时，使上述醛型接头与上述粗制肽脱水缩合，制造上述醛型接头经由亚氨基键合于上述粗制肽而得到的亚胺化树脂，使还原剂与得到的上述亚胺化树脂反应而还原亚氨基，通过形成苄氨基将上述接头与第1肽链的氨基键合，由此可以制造接头键合体。
上述醛型接头与上述粗制肽的脱水缩合反应通过将醛型接头与粗制肽混合而进行。在制造上述亚胺化树脂时，相对于粗制肽1mol，醛型接头的用量优选为1倍mol以上，更优选为3倍mol以上，进一步优选为5倍mol以上，优选为50倍mol以下，更优选为30倍mol以下，进一步优选为20倍mol以下。
醛型接头与粗制肽的反应优选在溶剂存在下实施，作为反应溶剂，可以使用例如：苯、甲苯、二甲苯等芳香烃溶剂；二异丙基醚、叔丁基甲基醚、二丁基醚、二乙二醇二甲醚等醚类溶剂；丙二醇单甲醚乙酸酯等改性醚类；乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯类溶剂；氯仿、二氯甲烷等含卤素溶剂；环己烷、甲基环己烷、乙基环己烷等环状烃溶剂；戊烷、己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、异十二烷等链状烃溶剂；等有机溶剂、甲醇、乙醇等醇类；乙二醇、二甲氧基乙烷、四氢呋喃等醚类；乙腈等腈类；二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺类；等水性溶剂。这些反应溶剂可以仅单独使用1种，也可以组合使用多种。且中，优选为含卤素溶剂，更优选为二氯甲烷。
作为上述反应溶剂的用量，相对于粗制肽，优选为100倍重量以下，进一步优选为50倍重量以下，下限没有特别限定，但优选为2倍重量以上。
另外，脱水缩合反应中可以适当使用脱水剂。作为上述脱水剂，优选为例如：原甲酸三甲酯、原甲酸三乙酯、原甲酸三丙酯等原甲酸酯类；原乙酸三甲酯、原乙酸三乙酯、原乙酸三丙酯等原乙酸酯类；原丙酸三甲酯、原丙酸三乙酯、原丙酸三丙酯等原丙酸酯类；等所代表的原酸酯类、二甲氧基甲烷、1,1-二甲氧基乙烷、1,1-二甲氧基丙烷、二乙氧基乙烷、1,1-二乙氧基乙烷、1,1-二乙氧基丙烷等所代表的缩醛类、1-甲氧基-1-乙醇、1-甲氧基-1-丙醇、1-甲氧基-1-丁醇、1-乙氧基-1-乙醇、1-乙氧基-1-丙醇、1-乙氧基-1-丁醇等所代表的半缩醛类。其中，优选为原甲酸酯类，更优选为原甲酸三甲酯。
在使用上述脱水剂的情况下，脱水剂的用量相对于粗制肽优选为100倍重量以下，进一步优选为50倍重量以下，下限没有特别限定，但优选为1倍重量以上。
反应温度只要在使用的溶剂的沸点以下即可，没有特别限定，例如优选为0℃以上，更优选为10℃以上，进一步优选为20℃以上，优选为100℃以下，更优选为80℃以下，进一步优选为60℃以下。
反应时间也没有特别限定，优选为1小时以上，更优选为12小时以上，优选为20天以下，更优选为15天以下。
反应结束后，可以对得到的接头键合体进行清洗，除去不需要的成分。作为清洗用的溶剂，可以使用反应溶剂一栏中详细叙述的各种溶剂。
在上述亚胺化树脂的还原反应中，作为还原剂，可以列举例如：氢化铝锂、二异丁基氢化铝、氢化双(2-甲氧乙氧基)铝钠等铝氢化物类；硼氢化锂、硼氢化钠、硼氢化钾等硼氢化碱金属、硼氢化钙、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、三乙基硼氢化锂、三仲丁基硼氢化锂、三仲丁基硼氢化钾等硼氢化合物；三丁基氢化锡；硼烷等，从化学选择性的观点考虑，其中优选为硼氢化合物，更优选为氰基硼氢化钠。
作为上述还原剂的用量，相对于上述亚胺化树脂1质量份，优选为0.1质量份以上，更优选为0.3质量份以上，进一步优选为0.6质量份以上，优选为3质量份以下，更优选为2.5质量份以下，进一步优选为2质量份以下。
亚胺化树脂的还原反应优选在溶剂存在下实施，作为反应溶剂，可以使用例如：苯、甲苯、二甲苯等芳香烃溶剂；二异丙基醚、叔丁基甲基醚、二丁基醚、二乙二醇二甲醚等醚类溶剂；丙二醇单甲醚乙酸酯等改性醚类；乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯类溶剂；乙酸、丙酸等羧酸类溶剂；氯仿、二氯甲烷等含卤素溶剂；环己烷、甲基环己烷、乙基环己烷等环状烃溶剂；戊烷、己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、异十二烷等链状烃溶剂；等有机溶剂、甲醇、乙醇等醇类；乙二醇、二甲氧基乙烷、四氢呋喃等醚类；乙腈等腈类；二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺类；等水性溶剂。这些反应溶剂可以仅单独使用1种，也可以组合使用多种。在使用醇类、羧酸类溶剂时，可以期待加快反应速度。在本发明中，其中优选醇类溶剂、羧酸类溶剂、酰胺类。
作为上述反应溶剂的用量，相对于亚胺化树脂，优选为100倍重量以下，进一步优选为50倍重量以下，下限没有特别限定，但优选为5倍重量以上。
反应温度只要为使用的溶剂的沸点以下即可，没有特别限定，例如优选为0℃以上，更优选为10℃以上，进一步优选为20℃以上，优选为100℃以下，更优选为80℃以下，进一步优选为60℃以下。
反应时间也没有特别限定，优选为1小时以上，更优选为10小时以上，优选为50小时以下，更优选为30小时以下。
反应结束后，可以对得到的接头键合体进行清洗，除去不需要的成分。作为清洗用的溶剂，可以使用反应溶剂一栏中详细叙述的各种溶剂。
得到的接头键合体经由-CH2-NH-键合有接头和粗制肽。但是，-NH-中的氢原子的反应性高，有对随后的反应造成影响的隐患，因此，优选根据需要进行还原反应后的接头键合体(称为还原体树脂)的N保护反应。作为氨基的保护基团，可以列举氨基甲酸酯类、酰亚胺类、磺胺类等，其中，优选为叔丁氧羰基(-Boc)、苄氧羰基(-Z)、9-芴甲氧羰基(-Fmoc)、2,2,2-三氯乙氧羰基(-Troc)、烯丙氧羰基(-Alloc)等氨基甲酸酯类保护基团。醛型接头中的氨基保护基团为Fmoc时，可以选择例如叔丁氧羰基(-Boc)，以便不对该Fmoc的脱保护条件造成影响。
在保护基的导入中，在碱性条件下，可以通过向还原反应后的反应液添加与各保护基团对应的保护试剂来进行。作为上述保护试剂，可以列举例如：甲氧羰基氯、乙氧羰基氯、异丙氧羰基氯、烯丙氧羰基氯、苄氧羰基氯、苯氧羰基氯等氯化物、或二碳酸二叔丁酯等酐等氨基甲酸酯化剂等。
上述保护试剂的用量相对于还原体树脂1mol优选为1～30倍mol，更优选为10～25倍mol。
另外，在上述保护时，为了中和作为副产物生成的酸而加速反应，可以进一步添加碱。作为碱，可以列举：碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸镁、碳酸钙等金属碳酸盐；碳酸氢锂、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铯等金属碳酸氢盐；氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等金属氢氧化物；三乙胺、N-甲基吗啉、乙基二异丙基胺、吡啶等叔胺类。优选为叔胺类，进一步优选为N-甲基吗啉。
上述碱的用量相对于还原体树脂1mol优选为0.5～20倍mol，更优选为3～15倍mol。
N保护反应可以在溶剂存在下实施。作为上述反应溶剂，只要不对反应造成影响就没有特别限制，可以使用例如：水；四氢呋喃、***、1,4-二烷、乙二醇二甲醚等醚类溶剂；苯、甲苯等芳香烃类溶剂；戊烷、己烷、庚烷、甲基环己烷等脂肪烃类溶剂；四氯化碳、氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯苯等含卤素溶剂；乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸叔丁酯等酯类溶剂；二甲基亚砜等二甲基亚砜类溶剂；N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等酰胺类溶剂；二甲基丙撑脲等脲类溶剂；六甲基磷酸三酰胺等磷酸三酰胺类溶剂；丙酮、甲乙酮等酮类溶剂；乙腈、丙腈等腈类溶剂。优选为水；苯、甲苯等芳香烃类溶剂；四氢呋喃、1,4-二烷、甲基叔丁基醚等醚类溶剂；乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸叔丁酯等酯类溶剂；四氯化碳、氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯苯等含卤素溶剂；N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等酰胺类溶剂；进一步优选为DMF。这些溶剂可以单独使用，也可以组合使用2种以上。
作为溶剂的用量，如果过多，则从成本、后处理的观点考虑，不优选，因此，相对于还原体树脂，优选为50倍重量以下，更优选为30倍重量以下。
反应温度只要在使用的溶剂的沸点以下即可，没有特别限定，为了能够在短时间内结束反应且抑制副反应，优选为-10℃以上，更优选为0℃以上，优选为90℃以下，更优选为50℃以下。
反应时间也没有特别限定，优选为1小时以上，更优选为3小时以上，优选为100小时以下，更优选为50小时以下。
＜亲水性单元键合工序A1b＞
在亲水性单元键合工序中，将亲水性单元键合于如上所述得到的接头键合体。该“亲水性单元”是指能够对接头键合体赋予亲水性的单元，其可以键合于上述接头键合体(与第1肽的接头的键合体)的接头部位，例如，亲水性单元自身具有以logP(P为在辛醇-水体系中的分配系数)值计为-1以下的亲水性。通过使这样的亲水性单元经由接头键合于第1肽链，可以在切断除去载体时使第1肽链亲水化，能够进行第1肽链的色谱纯化。需要说明的是，在本说明书中，将该亲水性单元键合工序中得到的产物、即包含第1肽、接头及亲水性单元这三个成分的连接体称为“亲水化肽体”，将键合有载体的连接体特别称为“带有载体的亲水化肽体”，将除去了载体的连接体特别称为“无载体的亲水化肽体”。
logP值是指化合物的疏水性的参数，代表性的辛醇-水体系中的分配系数P可以通过以下方式求出。首先，将化合物(在本发明为亲水性单元)溶解于辛醇(或水)，并向其加入等量的水(或辛醇)，用Griffin振荡器(Griffin flas kshaker)(Griffin&George Ltd.制造)振荡30分钟。随后，以2000rpm离心分离1～2小时，用分光学或GLC等各种方法测定辛醇层及水层中的化合物的各浓度，由此根据下式求出。
P＝Coct/Cw
Coct：辛醇层中的化合物浓度
Cw：水层中的化合物浓度
目前为止，许多研究者对各种化合物的logP值进行了实际测定，由C.Hansch等对这些实测值进行了整理(参考“PARTITION COEFFICIENTS A NDTHEIR USES；ChemicalReviews、71卷、525页、1971年”)。
logP值可以用上述方法求出，但在本发明中，原则上使用通过Advance dChemistry Development制造的ACD/LogP DB Release 100Product Versi on 10.01在温度25℃的条件下计算出的值。
在探索有效的结构作为亲水性单元时，对具有各种logP值的化合物进行了研究，结果发现，亲水化单元的logP值为例如-1以下时，对粗制肽的亲水化有效。另外，在logP值超过-1时，无法发挥足够的亲水性，存在无载体的亲水化肽体的纯化效率降低的隐患。logP值更优选为-1.2以下，进一步优选为-1.5以下。另外，logP值的下限没有特别限定，例如优选为-10以上。
作为具有这样的logP值的亲水性单元，可以列举例如：亲水性肽链、亲水性聚醚或亲水性多胺等。亲水性肽链可以通过将氨基酸依次连接于接头键合体来制备，在该情况下，优选通过Fmoc固相合成法制备。另外，亲水性肽链也可以将另行预先制备的肽链连接于接头键合体。
因此，在亲水性单元键合工序的优选方式中，可以通过以下工序使亲水性单元键合于接头部位。
(1)通过Fmoc固相合成法分步地使多个氨基酸键合于接头部位；
(2)使预先制备的亲水性肽链键合于接头部位；
(3)使预先制备的聚醚键合于接头部位；
(4)使预先制备的多胺键合于接头部位。
以下，对上述各工序进行说明。
(1)利用Fmoc固相合成法进行的亲水化肽体形成
在本方法中，亲水性肽可以通过在上述工序中得到的接头键合体的氨基上用Fmoc固相合成法依次形成肽而得到。在如本方法这样依次形成亲水性肽时，能够验证每1循环中形成的亲水化肽体的性质(例如，亲水性等)，因此不消耗多余的试剂，因此优选。Fmoc固相合成法的具体步骤没有特别限定，例如，可以是与上述的带有载体的粗制肽的制造工序的情况相同的步骤。总之，只要能将循环持续进行至得到希望的亲水性肽链即可，所述循环在碱存在下进行Fmoc的脱保护，对氨基酸或肽进行脱水缩合而延长主链。
构成上述亲水性肽的氨基酸没有特别限定，可以使用第1肽链一栏中详细叙述的各种氨基酸。在亲水性肽中，可以从这些氨基酸中组合使用不同种的氨基酸，也可以单独使用同种的氨基酸。在本发明中，为了提高上述亲水性肽的亲水性，优选上述亲水性肽具有例如来自于具有碱性支链的氨基酸的单元，具体而言，优选上述亲水性肽链的全部氨基酸残基中含有2个以上的下述残基，更优选含有4个以上的下述残基，上限没有特别限定，优选含有35个以下的下述残基，更优选含有20个以下的下述残基，进一步优选含有10个以下的下述残基，所述残基为选自精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸中至少1种以上的氨基酸残基。根据相同的原因，优选上述亲水性肽具有例如来自于具有酸性支链的氨基酸的残基，具体而言，优选上述亲水性肽链的全部氨基酸残基中含有2个以上的下述残基，更优选含有4个以上的下述残基，上限没有特别限定，优选含有35个以下的下述残基，更优选含有20个以下的下述残基，进一步优选含有10个以下的下述残基，所述残基为选自天冬氨酸、谷氨酸中至少1种以上的氨基酸残基。
上述亲水性肽链的氨基酸残基的数量没有特别限定，例如为2个以上，更优选为3个以上，进一步优选为4个以上，优选为35个以下，可以为20个以下，可以为10个以下。构成亲水性肽的氨基酸残基的数量增加时，对接头键合体与亲水性肽链的键合体(亲水化肽体)中的亲水性肽链的亲水化的贡献率增高，因此易于控制上述亲水化肽体的特性。
(2)利用预先制备的亲水性肽链进行的亲水化肽体的形成
在将上述亲水性肽链键合于接头键合体之前，可以预先通过液相合成法、固相合成法制造希望的亲水性肽链，并将得到的亲水性肽链键合于接头。
(3)利用预先制备的聚醚进行的亲水化肽体的形成
亲水性单元不限于多肽，也可以是聚醚或多胺。上述亲水性聚醚没有特别限定，例如为在主链骨架中具有-Ry-O-所示的重复单元的化合物。作为Ry，可以列举例如：-CH2CH2-、-CH(CH3)CH2-、-CH(C2H5)CH2-、-C(CH3)2CH2-、-(CH2)4-。亲水性聚醚可以是由这些重复单元中的1种重复单元构成的均聚物，也可以是共聚物。
-Ry-O-所示的重复单元的数量例如优选为1～200，更优选为50～150。
对于亲水性聚醚而言，优选在亲水性聚醚中含有50重量％以上-Ry-O-所示的重复单元，进一步优选含有80重量％以上，更优选含有95重量％以上。
对于亲水性聚醚而言，凝胶渗透色谱(GPC)的以换算为聚苯乙烯计的数均分子量优选为例1000～100,000左右。
(4)利用预先制备的多胺进行的亲水化肽体的形成
上述多胺没有特别限定，可以列举例如，键合了至少2个以上氨基的脂肪烃，作为上述脂肪烃，可以是饱和脂肪烃(链状或环状)或不饱和脂肪烃的任一者。键合于多胺的氮原子的氢原子可以是被取代或未被取代中的任一者，为了提高亲水性，优选未被取代。
具体地例示这样的多胺，可以列举例如：二亚乙基三胺、N-(2-氨基乙基)-1,3-丙二胺、N-(3-氨基丙基)-1,3-丙二胺、亚精胺、双(六亚甲基)三胺、4-(氨基甲基)-1,8-辛二胺、三亚乙基四胺、1,4,7,11-四氮杂十一烷、N,N’-双(3-氨基丙基)乙二胺、N,N’-双(2-氨基乙基)-1,3-丙二胺、N,N’-双(3-氨基丙基)-1,3-丙二胺、精胺、三(2-氨基乙基)胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺等链状脂肪族多胺；1,4,7-三氮杂环壬烷、1,5,9-三氮环十二烷、环烯、1,4,8,11-四氮环十四烷、1,4,8,12-四氮环十五烷、六环烯、3,3’-二氨基联苯胺、1,2,4,5-苯四胺等环状脂肪族多胺。
＜亲水性单元接头复合体键合工序A2＞
为了将接头和亲水性单元键合于粗制肽而得到亲水化肽体，可以将亲水性单元与接头预先键合成一个化合物的亲水性单元接头复合体导入粗制肽的氨基。通过预先制备复合体，可以缩短从粗制肽至亲水性肽体的制造工艺，能够提高工艺总体的效率。
复合体中的亲水性单元及接头可以使用与上述接头键合工序A1a、亲水性单元键合工序A1b相同的亲水性单元及接头。作为该复合体的制备方法，可以采用与亲水性单元键合工序A1b相同的方法，在将复合体键合于粗制肽的情况下，可以采用与上述接头键合工序A1a相同的方法。
需要说明的是，在将亲水性单元接头复合体键合于粗制肽之后，可以根据需要进一步延长亲水性单元侧的氨基酸。例如，作为亲水性单元接头复合体，预先准备有限种类的复合体作为基本单元，将该基本单元键合于粗制肽后，在根据粗制肽的特性延长氨基酸等时，可以减少作为基本单元而预先准备的亲水性单元接头复合体的种类，是很简便的。
另外，A2-II也可以用与A2-I相同的方法实施。
3.载体切除工序
载体切除工序是指将载体和第1肽链断开的工序。不仅将接头及亲水性单元键合于第1肽链，而且可以通过切除载体而使第1肽链亲水化。需要说明的是，在本说明书中，将接头及亲水性单元键合、且载体被切除后的第1肽链称为无载体的亲水化肽体。
该载体切除工序只要在下面叙述的色谱纯化工序之前即可，可以在任意阶段实施，例如，可以在从将接头键合于带有载体的粗制肽之前至得到亲水化肽体的任意阶段中、或者在得到带有载体的亲水化肽体之后，切断第1肽链与载体之间的键。具体而言，可以从由第1肽链和载体形成的带有载体的粗制肽上切除载体(参考简图I的载体切除工序B1)，也可以从将接头键合于带有载体的粗制肽而得到的带有载体的接头键合体上切除载体(参考简图I的载体切除工序B2)，还可以从将接头和亲水性单元键合于带有载体的粗制肽而得到的带有载体的亲水化肽体上切除载体(参考简图I的载体切除工序B3)。在从带有载体的粗制肽上切除载体时(载体切除工序B1)，可以与上述同样地实施接头键合工序A1a，由得到的无载体的粗制肽得到无载体的接头键合体(简图I的A1c)，而且实施亲水性单元接头复合体键合工序A2，由无载体的粗制肽得到无载体的亲水化肽体。另外，通过与上述同样地实施亲水性单元键合工序A1b，可以由无载体的接头键合体得到无载体的亲水化肽体(简图I的A1d)，所述无载体的接头键合体通过实施载体切除工序B2、或者通过在接头键合工序A1a中对无载体的粗制肽进行处理而得到。需要说明的是，在本发明中，优选在通过上述亲水化工序得到了亲水化肽体后实施载体切除工序(即，简图I的载体切除工序B3)。
在这些载体切除工序B1、B2、B3中，对连接上述第1肽链与上述载体的酰胺键或酯键进行水解。在从载体上切下第1肽链时，可以实施在固相合成法中广泛采用的操作。例如，在用Fmoc固相合成法形成了第1肽链、亲水性单元的情况下，可以通过用于切断的试剂进行处理而从载体上切下第1肽链。
上述切断用试剂可以使用从通常的载体上切下的条件中使用的试剂。切断用试剂在制成水溶液使用的情况下，以容积比计，上述切断用试剂占该试剂100％的浓度优选为40％以上，更优选为50％以上，优选为100％以下，在97％以下也没有问题。
另外，上述切断用试剂可以含有TIS(三异丙基硅烷)。以容积比计，TI S占试剂100％的浓度优选为1％以上，更优选为1.5％以上，优选为20％以下，更优选为10％以下。
切断工序可以在无溶剂下(可允许由上述试剂混入的溶剂)实施，可以根据需要在溶剂存在下实施。作为其溶剂，可以列举：水、有机溶剂、水性溶剂等，有机溶剂包含例如：四氯化碳、氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯苯等含卤素溶剂等；水性溶剂包含例如：甲醇、乙醇等醇类；乙二醇、二甲氧基乙烷、四氢呋喃等醚类；丙酮、二烷等酮类；乙腈等腈类；二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺类；等。这些溶剂可以单独使用，也可以组合使用2种以上。
处理温度只要在使用的溶剂的沸点以下即可，没有特别限定，例如，优选为0℃以上，更优选为10℃以上，优选为100℃以下，更优选为80℃以下，进一步优选为60℃以下。
另外，处理时间例如优选为0.5小时以上，更优选为1小时以上，进一步优选为1.5小时以上，优选为20小时以下，更优选为10小时以下。
作为反应后的后处理，可以进行用于从反应液中获得产物的通常的处理。具体而言，通过对切断后的载体进行过滤等而进行分离，并根据需要进行浓缩、清洗，然后加入有机溶剂使其析出而获得固体的操作等通常的纯化方法，可以进一步提高纯度。
第1肽的支链的保护基可以通过载体切除工序中的处理进行脱保护，也可以未脱保护。如果能够通过载体切除工序中的处理将键合于第1肽的支链的保护基也进行脱保护，则可以省略支链的脱保护工序，因此简便。另外，在载体切除工序中未对第1肽的支链进行脱保护的情况下，可以另行实施第1肽链的支链的脱保护。键合于第1肽链的支链的保护基可以在亲水性单元导入前或导入后的任一阶段中进行脱保护。另外，支链的脱保护可以根据保护基而利用通常的方法来实施。
4.色谱纯化工序
如上所述键合接头亲水性单元、且切除了载体的第1肽链(无载体的亲水化肽体)具有亲水性，因此能够进行色谱纯化。因此，在色谱纯化工序中，用液相色谱对通过亲水化工序及载体切除工序得到的无载体的亲水化肽体进行处理。此时，优选预先将亲水化肽体溶解于水中。
色谱纯化所使用的柱和洗脱液可以根据待纯化的无载体的亲水化肽体的种类、待分离的杂质而适当选择。柱的填充剂没有特别限定，可以广泛使用公知的填充剂，作为代表性的填充剂，可以优选例示出例如：硅胶、十八烷基键合硅胶、辛基键合硅胶、丁基键合硅胶、三甲基甲硅烷基键合硅胶、弗罗里硅土(Florisil)、氧化铝、氧化锆、羟基磷灰石、苯乙烯-乙烯基苯共聚物、聚甲基丙烯酸酯、聚羟基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、离子交换树脂、活性炭等。装填了这些填充剂的柱可以单独使用，也可以组合2种以上使用。
另外，洗脱液可以根据待使用的柱、纯化对象目标物以及除去对象杂质而适当制备，例如，可以使用将水与亲水性有机溶剂(例如，甲醇、乙醇等醇类；乙二醇、二甲氧基乙烷、四氢呋喃等醚类；丙酮、二烷等酮类；乙腈等腈类；二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺类；等)适当组合而成的混合溶液。该混合溶液可以溶解适当的酸(例如，TFA、蚁酸、乙酸等)。
色谱纯化工序可以根据需要实施2次以上，柱(填充剂)和/或洗脱液可以每次变更。
5.接头切除工序
在接头切除工序中，通过化学处理对色谱纯化后的无载体的亲水化肽体所含有的接头-第1肽链之间的键进行切断。作为上述化学处理，可以举出例如利用催化还原或酸进行的处理等。
＜利用催化还原反应进行的接头的切断＞
利用催化还原反应进行的接头的切断优选在溶剂存在下实施。作为上述溶剂，可以列举例如：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇、正戊醇等醇类溶剂；乙酸、甲酸、丙酸等羧酸类溶剂；四氢呋喃、***、二烷等醚类；乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯等酯类溶剂；二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等卤代烃类；甲苯等芳香烃类；丙酮、2-丁酮、3-甲基-2-丁酮、2-戊酮、4-甲基-2-戊酮、2-己酮等酮类溶剂；N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮等酰胺类；乙腈等腈类；这些溶剂可以仅单独使用1种，也可以组合使用多种。其中，在溶剂100重量％中，优选含有碳原子数3～8的醇类溶剂10～100重量％，更优选含有30～100重量％。
催化还原反应中使用的上述溶剂的用量没有特别限定，例如，以相对于亲水化肽体的重量比率计，优选为2倍量以上，更优选为5倍量以上，优选为500倍量以下，更优选为400倍量以下。
作为催化还原反应的氢源，例如，可以使用氢气、甲酸或其盐，从经济性的观点考虑，优选使用氢气。在使用氢气的情况下，通常优选将氢气压调整至大气压(1.013×105Pa)～0.5MPa的范围来进行。
作为催化还原反应用的催化剂，例如，可以使用含有铂、钯等的催化剂，其中，优选含有钯的催化剂，特别优选担载于活性炭的钯催化剂等金属担载催化剂。
催化还原反应可以通过在溶剂及氢源的存在下使亲水化肽体与催化剂的混合物发生反应来实施。反应温度只要在使用的溶剂的沸点以下即可，没有特别限定，例如，优选为0℃以上，更优选为15℃以上，进一步优选为30℃以上，优选为70℃以下，更优选为60℃以下。另外，反应时间也没有限制，例如优选为1小时以上，更优选为3小时以上，进一步优选为5小时以上，优选为50小时以下，更优选为30小时以下。
在催化还原反应结束后，除去了接头的第1肽链通常进行后处理，例如，可以通过浓缩、溶解于有机溶剂、过滤、清洗、析出等的操作来进行分离纯化。
＜利用酸进行的接头的切断＞
作为本工序中使用的酸，可以列举例如：TFA(三氟乙酸)、TCA(三氯乙酸)等卤代羧酸类；氢溴酸、盐酸、硫酸等无机酸；对甲苯磺酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、氟磺酸等磺酸类等。优选pKa为0以下的酸，进一步优选pKa为-2以下的酸，下限没有特别限定，但通常pKa为-20以上，优选pKa为-18以上。这些酸可以单独使用1种，也可以组合使用多种。相对于亲水化肽体，酸的用量以重量比计优选为10倍量以上，更优选为20倍量以上，优选为100倍量以下，更优选为80倍量以下。
利用酸进行的接头的切断反应可以在溶剂存在下实施。作为上述溶剂，可以列举例如：乙酸、丙酸等羧酸类溶剂；水等。这些溶剂可以单独使用1种，也可以组合使用多种。相对于亲水化肽体，上述溶剂的用量以重量比计优选为1倍量以上，更优选为2倍量以上，优选为100倍量以下，更优选为50倍量以下。
作为这样的溶剂，优选必须含有TFA的溶剂，更优选为含有TFA和TFA以外的无机酸两者的混合溶液、或者含有TFA和路易斯酸的混合溶液。作为含有TFA和TFA以外的无机酸两者的混合溶液，例如，优选为含有HBr(浓度优选为15～40％)、乙酸、茴香硫醚及TFA的混合溶液。另外，作为含有TFA和路易斯酸的混合溶液，可以列举例如：含有TFA、三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)以及茴香硫醚的混合溶液；含有TFA、TMSOTf以及间甲酚的混合溶液等。从实用性的观点考虑，更优选使用含有TFA和路易斯酸的混合溶液。
另外，在利用酸进行的接头的切断反应中，也可以使用在酸中含有三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)、三甲基溴硅烷(TMSBr)、三甲基碘硅烷(TMSI)、BF3***络合物、Cp2HfCl2-AgClO4等路易斯酸作为反应促进剂的混合溶液。相对于亲水化肽体，上述反应促进剂的用量以重量比计优选为1倍量以上，更优选为5倍量以上，优选为100倍量以下，更优选为50倍量以下。
在利用酸进行的接头的切断反应中，可以添加用于加速反应的添加剂。作为上述添加剂，可以列举例如：苯酚、间甲酚、对甲酚、茴香醚、茴香硫醚、二苯硫醚、二甲基硫醚。这些添加剂可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
反应温度只要在使用的溶剂的沸点以下即可，没有特别限定，例如，优选为-35℃以上，更优选为-20℃以上，进一步优选为-10℃以上，优选为100℃以下，更优选为80℃以下，进一步优选为60℃以下。
反应时间也没有特别限定，优选为0.1小时以上，更优选为1小时以上，进一步优选为2小时以上，优选为50小时以下，更优选为30小时以下，进一步优选为20小时以下。
在利用酸进行的反应结束后，除去了接头的第1肽链通常进行后处理，例如，可以通过实施加入通常的有机溶剂使肽析出并获取的操作等来进行分离纯化。
6.清洗工序
为了对上述工序中得到的疏水性肽进一步进行纯化，可以实施清洗除去亲水性单元与接头的键合体的清洗工序。在本工序中，用任选含有助剂的水或含水溶剂对通过接头切除工序得到的无载体且无接头的第1肽链进行清洗。
上述含水溶剂例如为水与亲水性溶剂的混合物，作为该亲水性溶剂，可以列举例如：甲醇、乙醇等醇类；乙二醇、二甲氧基乙烷、四氢呋喃等醚类；丙酮、二烷等酮类；乙腈等腈类；二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺类；等水性溶剂。这些水或含水溶剂可以根据需要含有中和剂、缓冲剂等助剂。作为上述中和剂，可以列举例如：碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等无机碱化合物。另外，作为上述缓冲剂，可以例示出例如：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等磷酸盐或羧酸盐等。
清洗操作可以根据需要实施2次以上，清洗中使用的水或含水溶剂可以每次变更。可以使清洗操作后的纯化肽干燥，除去残渣，制成产品。
如上所述，在亲水化工序A和载体切除工序B中处理带有载体的粗制肽，接着在色谱纯化工序及接头切除工序中进行处理，由此能够高度且简便地对肽进行纯化。而且，本发明不限于肽的种类，通用性优异，适于简便地对各种肽进行纯化的用途。
本申请主张基于2014年9月26日申请的美国专利申请第62/055,991号的优先权。本申请参考并引用2014年9月26日申请的美国专利申请第62/055,991号说明书的全部内容。
实施例
以下，列举实施例更具体地对本发明进行说明，本发明当然不受下述实施例的限制，也当然可以在符合上述/下述的主旨的范围内进行适当变更来实施，这些均包含于本发明的技术范围内。
本申请实施例中使用的装置如下所述。
·自动肽合成装置：Protein Technologies,Inc制造的Symphony
·NMR：日本电子株式会社制造的“JMTC-500”
·质量分析装置：使用Bruker Dartonics公司制造的“microflex”，基质使用二羟基苯甲酸(dihydroxybenzoic acid)。
·HPLC分析装置；株式会社岛津制作所制造的“SPD-10Avp”“LC-10Advp”“SCL-10Avp”“DGU-12A”“CTO-10Asvp”“C-R8A”
·HPLC纯化装置；XXVarian制造的“ProStar(制备色谱装置)”和Rai ning制造的“DYNAMAX AbsorbanceDetector model uv-D II(UV检测装置制备色谱装置)”
合成例1
4-(2-Fmoc-氨基)乙氧基-3,5-二氯苄基琥珀酰亚胺基碳酸酯(3a)
[化学式24]
将4-(2-Fmoc-氨基)乙氧基-3,5-二氯苯甲醇(纯度98.3％、200mg、0.429mmol)溶解于二氯甲烷(4mL)。向其中依次加入N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(165mg、0.643mmol)的乙腈(8mL)溶液和吡啶(51.8μL、0.643mmol)。在25℃下搅拌3小时后，进行了浓缩。向残渣中加入乙酸乙酯(50mL)进行溶解，用10％碳酸氢钠水(25mL，3次)、H2O(25mL，2次)、饱和食盐水(25mL，1次)依次进行了清洗。用硫酸镁干燥有机层，然后进行过滤和浓缩，获得了活性化碳酸酯型接头(3a)的白色固体(276.7mg，定量产率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.77(d,3JHH＝7.0Hz,2H),7.62(d,3JHH＝7.5Hz,2H),7.40(dd,3JHH＝15.0and 7.5Hz,2H),7.33(t,3JHH＝7.5Hz,2H),5.51(bs,1H),5.21(s,2H),4.41(d,3JHH＝7.0Hz,2H),4.25(t,3JHH＝7.0Hz,1H),4.20-4.16(m,2H),3.68-3.65(m,2H)
合成例2
4-(2-Fmoc-氨基)乙氧基-1-甲酰基苯(5)
[化学式25]
向4-(2-Fmoc-氨基)乙氧基苯甲醇(1.00g、2.57mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液加入二氧化锰(4.47g、51.4mmol)，在25℃下搅拌35小时。进行硅藻土过滤。将滤液浓缩后，通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷/二氯甲烷＝1/1/1)纯化，以0.92g白色固体的形式获得了醛型接头(5)(2.37mmol、产率92％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ9.90(s,1H),7.85(d,3JHH＝8.5Hz,2H),7.75(d,3JHH＝7.5Hz,2H),7.59-7.57(m,2H),7.40-7.39(m,2H),7.31-7.26(m,2H),7.01(d,3JHH＝8.0Hz,2H),5.19(s,1H),4.45(d,3JHH＝7.0Hz,2H),4.22(t,3JHH＝6.5Hz,1H),4.14-4.10(m,2H),3.66-3.63(m,2H)
合成例3
2-(2-Fmoc-氨基)乙氧基-3,5-二氯苄基琥珀酰亚胺基碳酸酯(3d)
[化学式26]
向2-(2-Fmoc-氨基)乙氧基-3,5-二氯苯甲醇(458mg、1.00mmol)的CH2Cl2(14mL)溶液添加N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(384mg、1.5mmol)的乙腈(28m L)溶液，制成均匀的溶液。向其中用时1分钟滴加吡啶(0.121mL、1.5mmol)，然后在25℃下搅拌11小时。减压馏去溶剂，向残渣中加入EtOAc(100mL)。用饱和碳酸氢钠水(50mL，3次)、水(50mL，4次)和饱和食盐水(50mL，1次)依次进行清洗，对得到的EtOAc层进行利用MgSO4的干燥和过滤，并进行减压浓缩，以白色固体的形式得到了2-(2-Fmoc-氨基)乙氧基-3,5-二氯苄基琥珀酰亚胺基碳酸酯(纯度94.7％；615mg、0.972mmol、产率97％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.77(d,3JHH＝7.5Hz,2H),7.63(d,3JHH＝7.5Hz,2H),7.45(d,4JHH＝2.0Hz,1H),7.40(t,3JHH＝7.5Hz,2H),7.33-7.30(m,2H),7.32(d,4JHH＝2.5Hz,1H),5.57(t,3JHH＝6.0Hz,1H),5.32(s,2H),4.40(d,3JHH＝7.0Hz,2H),4.25(t,3JHH＝7.0Hz,1H),4.12(t,3JHH＝5.0Hz,2H),3.66(dt,3JHH＝5.5Hz and 5.0Hz,2H),2.79(s,4H)
合成例4
4-(2-Fmoc-氨基)乙氧基-3,5-二溴苄基琥珀酰亚胺基碳酸酯(3b)
[化学式27]
向4-(2-Fmoc-氨基)乙氧基-3,5-二溴苯甲醇(547mg、1.00mmol)的CH2Cl2(14mL)溶液加入N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(384mg、1.5mmol)的乙腈(28m L)溶液，制成均匀的溶液。向其中用时1分钟滴加吡啶(0.121mL、1.5mmol)，然后在25℃下搅拌11小时。减压馏去溶剂，向残渣中加入EtOAc(100mL)。用饱和碳酸氢钠水(50mL，3次)、水(50mL，4次)和饱和食盐水(50mL，1次)依次进行清洗，对得到的EtOAc层进行利用MgSO4的干燥和过滤，并进行减压浓缩，获得了白色固体(纯度93.2％；674mg、0.913mmol、产率91％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.77(d,3JHH＝7.5Hz,2H),7.62(d,3JHH＝7.5Hz,2H),7.57(s,2H),7.41(t,3JHH＝7.5Hz,2H),7.32(t,3JHH＝7.5Hz,2H),5.52(t,3JHH＝6.0Hz,1H),5.21(s,2H),4.42(d,3JHH＝6.5Hz,2H),4.25(t,3JHH＝6.5Hz,1H),4.13(t,3JHH＝6.5Hz,2H),3.69-3.66(m,2H),2.85(s,4H)
合成例5
4-(2-Fmoc-氨基)乙氧基-3-硝基苄基琥珀酰亚胺基碳酸酯(3c)
[化学式28]
向4-(2-Fmoc-氨基)乙氧基-3-硝基苯甲醇(纯度94.5％；0.63g、1.37mmol)的CH2Cl2(14mL)溶液加入N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(530mg、2.07mmol)的乙腈(28mL)溶液，制成均匀的溶液。向其中用时1分钟滴加吡啶(0.167mL、2.07mmol)，然后在25℃下搅拌4小时。减压馏去溶剂，向残渣中加入EtO Ac(100mL)。用饱和碳酸氢钠水(50mL，3次)、水(50mL，4次)和饱和食盐水(50mL，1次)依次进行清洗，对得到的EtOAc层进行利用MgSO4的干燥和过滤，并进行减压浓缩，以白色固体的形式得到了4-(2-Fmoc-氨基)乙氧基-3-硝基苄基琥珀酰亚胺基碳酸酯(3c)(纯度92.9％；794mg、1.28mmol、产率93％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.97(d,4JHH＝1.5Hz,1H),7.74(d,3JHH＝7.5Hz,2H),7.62-7.59(m,1H),7.60(d,3JHH＝7.0Hz,2H),7.38(t,3JHH＝7.5Hz,2H),7.29(t,3JHH＝7.5Hz,2H),7.11(d,3JHH＝8.5Hz,1H),5.48(t,3JHH＝5.5Hz,1H),5.29(s,2H),4.38(d,3JHH＝7.0Hz,2H),4.23-4.19(m,3H),3.69-3.66(m,2H),2.84(s,4H)
合成例6
4-(6-Fmoc-氨基)己氧基-3,5-二氯苄基琥珀酰亚胺基碳酸酯(3e)
[化学式29]
向4-(6-Fmoc-氨基)己氧基-3,5-二氯苯甲醇(360mg、0.7mmol)的CH2Cl2(5mL)溶液添加N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(269mg、1.05mmol)的乙腈(10mL)溶液，再滴加吡啶(83mg、1.05mmol)的乙腈(1mL)溶液，然后在25℃下搅拌4小时。减压馏去溶剂，向残渣中加入EtOAc(20mL)。用饱和碳酸氢钠水(10mL，3次)、水(10mL，1次)和饱和食盐水(10mL，1次)依次进行清洗，用硫酸镁对得到的EtOAc层进行干燥，然后滤去硫酸镁，将滤液进行减压浓缩，以高粘性的白色固体的形式得到了4-(6-Fmoc-氨基)己氧基-3,5-二氯苄基琥珀酰亚胺基碳酸酯(3e)(383mg、产率96％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.77(d,J＝7.5Hz,2H),7.60(d,J＝7.5Hz,2H),7.40(t,J＝7.5Hz,2H),7.34(s,2H),7.32(t,J＝7.0Hz,2H),4.7(d,J＝6Hz,2H),4.40(d,J＝7Hz,2H),4.23-4.20(m,1H),4.03(t,J＝6.5Hz,2H),3.25-3.18(m,2H),2.85(s,4H),1.88-1.80(m,2H),1.60-1.51(m,4H),1.47-1.38(m,2H)。
实施例1
＜带有载体的粗制肽的制造：Rink酰胺树脂担载9残基疏水性肽GILT VSVAV(GRAVY得分：2.31)＞
通过Fmoc/Boc固相合成法，使用0.41mmol/g的Rink酰胺树脂及作为偶联试剂的O-(6-氯苯并***-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HCTU)，利用自动肽合成装置合成了标题所述的带有载体的粗制肽。
＜接头键合工序(对Rink酰胺树脂担载9残基疏水性肽GILTVSVAV连接活性化碳酸酯型接头(3a))＞
将溶解于DMF(0.7mL)的活性化碳酸酯型接头(3a)(73.7mg、0.123mmol)与Rink酰胺树脂担载9残基疏水性肽GILTVSVAV(0.41mmol/g、100mg、0.041mmol)混合，在25℃下振荡14小时。接着进行过滤，用DMF(10mL)和二氯甲烷(10mL)清洗得到的带有载体的接头键合体，得到了连接有活性化碳酸酯型接头(3a)的带有载体的接头键合体122mg。
得到的接头键合体按照下述简图制成了高纯度的疏水性肽。
[化学式30]
＜亲水性单元键合工序＞
用DMF(3mL)清洗2次带有载体的接头键合体(616mg)，再用CH2Cl2(3mL)清洗1次，然后在减压下除去过量的溶剂。向其中加入20％(v/v)哌啶DMF溶液(3mL)，在25℃下振荡20分钟，然后进行过滤，实施了脱Fmoc反应。总计重复了4次该哌啶处理操作，最后用DMF(3mL)进行了清洗。加入DMF(3mL)溶液，所述DMF溶液是相对于脱Fmoc后的带有载体的接头键合体1mol以Fmoc氨基酸︰HOBt︰HBTU︰DIPEA(二异丙基乙胺)＝3mol︰3mol︰6mol的比率添加后的DMF溶液，在25℃下搅拌20分钟，然后进行过滤，使Fmoc氨基酸进行偶联。总计重复了3次该偶联操作。通过茚三酮试剂的显色反应确认不存在未反应的氨基之后，重复进行利用20％哌啶DMF溶液的脱Fmoc反应、偶联操作，直至得到希望的序列。由此，获得了在接头分子上连接了依次由(Fmoc)Gly、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Gly、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Gly、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Gly、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Gly、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Gly构成的11残基肽链的带有载体的亲水化肽体963mg。
＜载体切除工序＞
向带有载体的亲水化肽体(200mg)加入TFA(三氟乙酸)︰TIS(三异丙基硅烷)︰H2O＝95︰2.5︰2.5(容积比、2mL)的混合溶液，在25℃下振荡2小时。滤去载体，用TFA(1mL)清洗了残渣。混合滤液和清洗液，并加入己烷(5mL)，剧烈振荡，然后静置，使其分离为两相。除去己烷层(上层)，向残留的TFA层加入***(5mL)时，析出了固体。进行离心分离，然后除去上清液，用***进一步清洗3次固体。通过在减压下馏去***，以白色固体的形式得到了无载体的亲水化肽体的粗产物71mg。
对获得的亲水化肽体进行了HPLC分析及质量分析。将结果示于以下，将得到的图谱示于图1、2。
＜无载体的亲水化肽体(粗产物)＞
HPLC柱：SUPELCO Discovery BIO Wide Pore C18-5、25cm×4.6mm、5μm
流速：1mL/mL
柱温：40℃
波长：220nm
洗脱液：0.1％TFA乙腈/0.1％TFA水溶液＝0→100(0-20分钟)、100(20-34.5分钟)、100→0(34.5-35分钟)、0(35-39.9分钟)
保留时间：13.7分钟
MALDI-TOF MS：(M+H+)m/z＝2101.917(计算值：2101.14)
＜色谱纯化工序＞
基于以下的条件进行了利用高效液相色谱(HPLC)的无载体的亲水化肽体的纯化。示出实施条件、结果。另外，将得到的图谱示于图3、4。
HPLC纯化条件
柱：SUPELCO C18柱
洗脱液：0.1％TFA水溶液/0.1％乙腈溶液＝85/15→50/50(70分钟)
流速：20mL/分
检测波长：225nm
＜无载体的亲水化肽体(纯化物)＞
HPLC柱：SUPELCO C18柱
流速：1.0mL/分
柱温：40℃
检测波长：225nm
洗脱液：0.1％TFA水溶液/0.1％乙腈溶液＝95/5→40/60(8分钟)
保留时间：4.8分钟
MALDI-TOF MS：(M+H+)m/z＝2103.6(计算值2101.14)
＜接头切除工序(利用催化还原反应进行的接头的切断)＞
将无载体的亲水化肽体(10mg)溶解于甲醇(3mL)，加入10％Pd/C(10％water wet；30mg)。进行容器内的氢气置换，使其为1气压的氢气体氛围下。将混合物在50℃下搅拌15小时，然后减压馏去溶剂。向得到的残渣加入三氟乙酸(1.0mL)并进行过滤。用TFA(1mL)清洗固体，将滤液和清洗液混合，加入己烷(5mL)，剧烈振荡，然后静置，使其分离为两相。除去己烷层(上层)，向残留的TFA层加入***(5mL)时，析出了固体。离心分离后除去上清液，进一步用***对固体实施了3次清洗操作。通过在减压下馏去***，得到了11.8mg的白色粉末。
＜疏水性肽的获得(可溶部位的除去)＞
用10％碳酸氢钠1.0mL和乙腈/H2O＝1/1(容积比)1.0mL依次对上一工序中得到的切断接头后的疏水性肽实施了清洗操作。通过对残渣进行真空干燥，以白色粉末的形式获得了疏水性肽GILTVSVAV 5.0mg。将得到的疏水性肽的HPLC分析结果及质量分析结果示于图5、6。
实施例2
＜带有载体的粗制肽的制造：Tenta Gel树脂担载淀粉状蛋白β(17～40片段)LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(GRAVY得分：1.63)＞
通过Fmoc/Boc固相合成法，使用0.41mmol/g的Tenta Gel树脂及作为偶联试剂的O-(6-氯苯并***-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HCTU)，利用自动肽合成装置合成了标题所述的带有载体的粗制肽。
＜接头键合工序(向Tenta Gel树脂担载淀粉状蛋白β(17～40片段)连接活性化碳酸酯型接头(3a))＞
将溶解于DMF(3mL)的活性化碳酸酯型接头(3a)(144mg、0.24mmol)与TentaGel树脂担载淀粉状蛋白β(17～40片段)(0.15mmol/g、800mg、0.12mmol)混合，在25℃下振荡2小时。接着，用DMF(10mL)和二氯甲烷(10mL)清洗带有载体的接头键合体，由此得到了连接有活性化碳酸酯型接头(3a)的带有载体的接头键合体846mg。
＜亲水性单元键合工序＞
通过与实施例1相同的Fmoc固相合成法，对带有载体的接头键合体(846mg)重复Fmoc基的脱保护与Fmoc氨基酸的偶联操作。由此，在接头分子上连接依次由(Fmoc)Gly、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Gly、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Gly、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Gly、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Gly、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Gly构成的总计由11个氨基酸构成的肽链，得到了992mg带有载体的亲水化肽体2。
＜载体切除工序(序列中含有S原子的情况)＞
向带有载体的亲水化肽体(400mg)加入TFA︰茴香硫醚︰3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇︰H2O＝90︰5︰3︰5(容积比)的混合溶液3mL，在25℃下振荡2小时。滤去树脂，用TFA清洗了残渣。将滤液与清洗液混合，加入己烷(5mL)，剧烈振荡，然后静置，使其分离为两相。除去己烷层(上层)，向残留的TFA层加入***(5mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，进一步用***对固体清洗了3次。在减压下馏去***，得到了无载体的亲水化肽体的粗产物133mg。
对得到的亲水化肽体进行了HPLC分析及质量分析。将结果示于以下。
＜无载体的亲水化肽体(粗产物)＞
HPLC柱：SUPELCO Discovery BIO Wide Pore C18-5、25cm×4.6mm、5μm
流速：1mL/分
柱温：40℃
波长：220nm
洗脱液：0.1％TFA乙腈/0.1％TFA水溶液＝0→100(0-20分钟)、100(20-34.5分钟)、100→0(34.5-35分钟)、0(35-39.9分钟)
保留时间：15.7分钟
MALDI-TOF MS：(M+H+)m/z＝3635.872(计算值：3635.887)
＜色谱纯化工序＞
色谱纯化工序用与实施例1相同的方法进行即可。
＜接头切除工序(利用酸性条件进行的接头的切断)＞
向无载体的亲水化肽体(5mg)加入由TFA︰间甲酚︰TMSOTf＝68︰12︰20(容积比)构成的混合溶液1.0mL，在0℃下搅拌4小时。加入己烷(5mL)，剧烈振荡，然后静置，使其分离为两相。除去己烷层(上层)，向残留的TFA层加入***(5mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，用***进一步对固体实施了3次清洗操作。在减压下馏去***，由此得到了粗产物10.1mg。
实施例3
＜带有载体的接头键合工序(向Rink酰胺树脂担载9残基疏水性肽GIL TVSVAV连接醛型接头(5))(GRAVY得分：2.31)＞
将Rink酰胺树脂担载9残基疏水性肽GILTVSVAV(0.41mmol/g；150mg、0.063mmol)、醛型接头(5)(240mg、0.615mmol)、以及二氯甲烷/原甲酸三甲酯混合溶液(容积比2/1；3.0mL)混合，在25℃下振荡13天。进行过滤后，用二氯甲烷(5mL)清洗，并进行减压干燥，得到了155.9mg亚胺化树脂。
向得到的亚胺化树脂26mg加入NaBH3CN(32.0mg、0.51mmol)和DMF/乙酸/甲醇混合溶液(9/9/2.6mL)，在25℃下振荡24小时。进行过滤，并进行利用DMF(3mL)和二氯甲烷(3mL)进行的清洗，得到了还原体树脂28mg。
向得到的还原体树脂(183mg、0.075mmol)中混合二碳酸二叔丁酯(164mg、0.75mmol)、N-甲基吗啉(83μL、0.75mmol)及DMF(1mL)，在25℃下振荡19小时。进行过滤，并进行利用DMF(3mL)进行的清洗，然后再次向树脂添加二碳酸二叔丁酯(164mg、0.75mmol)、N-甲基吗啉(83μL、0.75mmol)及DMF(1mL)，在25℃下振荡23小时。进行过滤、利用DMF(3mL)和二氯甲烷(3mL)进行的清洗，并进行减压干燥，由此得到了连接有醛型接头(5)的带有载体的接头键合体209mg。
得到的带有载体的接头键合体按照以下的简图制成了高纯度的疏水性肽。
[化学式31]
＜亲水性单元键合工序＞
通过与实施例1相同的Fmoc固相合成法，对带有载体的接头键合体(400mg)重复了Fmoc基的脱保护和Fmoc氨基酸的偶联操作。由此，在接头分子上连接了依次由(Fmoc)Gly、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Gly、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Gly、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Gly、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Gly、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Gly构成的总计由11个氨基酸构成的肽链，得到了带有载体的亲水化肽体472mg。
＜载体切除工序＞
通过与实施例1相同的方法，由亲水化肽体(200mg)获得了无载体的亲水化肽体的粗产物(78mg)。对获得的亲水化肽体进行了HPLC分析及质量分析。
＜无载体的亲水化肽体(粗产物)＞
MALDI-TOF MS：(M+H+)m/z＝1989.330(计算值：1989.230)
＜色谱纯化工序＞
色谱纯化工序用与实施例1相同的方法进行即可。
实施例4
＜带有载体的粗制肽的制造：TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(GRAVY得分：1.63)＞
通过使用了自动肽合成仪的Fmoc固相合成法，得到了担载有由Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu(tBu)-Asp(tBu)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val构成的24残基肽的固相树脂(Tenta Gel树脂)。
＜接头键合工序(向TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV连接活性化碳酸酯型接头(3a))＞
将溶解于DMF(3mL)的活性化碳酸酯型接头(3a)(144mg、0.24mmol)与TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(0.15mmol/g、800mg、0.12mmol)混合，在25℃下振荡2小时。接着，进行过滤，并用DMF(10mL)和二氯甲烷(10mL)对得到的带有载体的接头键合体进行清洗，由此得到了连接有活性化碳酸酯型接头(3a)的带有载体的接头键合体846mg。
＜亲水性单元键合工序＞
用DMF(3mL，2次)和CH2Cl2(3mL，1次)依次清洗带有载体的接头键合体(846mg)，在减压下除去过量的溶剂。向其中加入20％(v/v)哌啶DMF溶液(3mL)，并在25℃下振荡20分钟，然后进行过滤，由此进行了Fmoc基的脱保护。总计进行了4次该哌啶处理操作。在用DMF的清洗后，通过与实施例1相同的Fmoc固相合成法重复了Fmoc基的脱保护和Fmoc氨基酸的偶联。由此，在接头分子上连接了依次由(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Lys(Boc)构成的3残基的肽链，得到了带有载体的亲水化肽体860mg。
＜载体切除工序＞
向充分干燥后的带有载体的亲水化肽体(1.24g、0.0954mmol)加入TFA︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容积比、5mL)的混合溶液，在25℃下振荡2小时。滤去载体，用TFA清洗了固体。将滤液与清洗液混合，并加入己烷(5mL)，剧烈振荡，然后静置，使其分离为两相。除去己烷层(上层)，向残留的TFA层加入***(5mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，进一步用***对固体清洗了3次。在减压下馏去***，得到了无载体的亲水化肽体的粗产物196mg。
对得到的亲水化肽体进行了HPLC分析及质量分析。将结果示于以下，将得到的图谱示于图7、8。
＜无载体的亲水化肽体(粗产物)＞
HPLC柱：SUPELCO Discovery BIO Wide Pore C18-5、25cmX4.6mm、5μm
流速：1mL/分
柱温：40℃
波长：220nm
洗脱液：0.1％TFA乙腈/0.1％TFA水溶液＝0→100(0-20分钟)、100(20-34.5分钟)、100→0(34.5-35分钟)、0(35-39.9分钟)
保留时间：13.7分钟
MALDI-TOF MS：(M+H+)m/z＝3038.027(计算值：3037.568)
＜色谱纯化工序＞
基于以下的条件，进行了利用高效液相色谱(HPLC)实施的无载体的亲水化肽体的纯化。示出实施条件、结果。另外，将得到的图谱示于图9、10。
HPLC纯化条件
柱：SUPELCO C18柱
洗脱液：0.1％TFA水溶液/0.1％乙腈溶液＝85/15→50/50(70分钟)
流速：20mL/分
检测波长：225nm
＜无载体的亲水化肽体(纯化物)＞
HPLC柱：SUPELCO C18柱
流速：1.0mL/分
柱温：40℃
检测波长：225nm
洗脱液：0.1％TFA水溶液/0.1％乙腈溶液＝85/15→25/75(20分钟)
保留时间：14.5分钟
MALDI-TOF MS：(M+H+)m/z＝3039(计算值3037.568)
＜接头切除工序(利用酸性条件进行的接头的切断)＞
向无载体的亲水化肽体(20mg)加入由TFA︰茴香硫醚︰TMSOTf＝68︰12︰20(容积比)构成的混合溶液4.0mL，在0℃下搅拌4小时。向TFA层加入***(40mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，用***进一步对固体实施了3次清洗操作。在减压下馏去***，由此得到了粗产物22mg。
＜疏水性肽的获得(可溶部位的除去)＞
用磷酸缓冲液(pH7.2)1mL对上一工序中得到的切断接头后的疏水性肽进行2次清洗，然后再用水1mL清洗2次。对残渣进行真空干燥，由此，以白色粉末的形式得到了12mg疏水性肽Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val。
对上述疏水性肽实施了MALDI-TOF MS分析。结果是测定值为2395.1(计算值2392.287)。将得到的疏水性肽的HPLC分析结果及质量分析结果示于图11、12。
实施例5
＜带有载体的粗制肽的制造：TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(GRAVY得分：1.63)＞
通过使用了自动肽合成仪的Fmoc固相合成法获得了担载有由Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu(tBu)-Asp(tBu)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val构成的24残基肽的固相树脂(TentaGel树脂)。
＜接头键合工序(向TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV连接活性化碳酸酯型接头(3a))＞
将溶解于DMF(3mL)的活性化碳酸酯型接头(3a)(144mg、0.24mmol)与TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(0.15mmol/g、800mg、0.12mmol)混合，并在25℃下振荡2小时。接着，进行过滤，用DMF(10mL)和二氯甲烷(10mL)清洗得到的带有载体的接头键合体，由此获得了连接有活性化碳酸酯型接头(3a)的带有载体的接头键合体846mg。
＜亲水性单元键合工序＞
用DMF(3mL，2次)和CH2Cl2(3mL，1次)依次清洗带有载体的接头键合体(1.60g)，在减压下除去过量的溶剂。向其中添加20％(v/v)哌啶DMF溶液(3mL)，并在25℃下振荡20分钟，然后进行过滤，由此进行了Fmoc基的脱保护。总计进行了4次该哌啶处理操作。在用DMF的清洗后，通过与实施例1相同的Fmoc固相合成法重复了Fmoc基的脱保护和Fmoc氨基酸的偶联。由此，在接头分子上连接了依次由(Fmoc)Arg(Pbf)、(Fmoc)Arg(Pbf)、(Fmoc)Arg(Pbf)、(Fmoc)Arg(Pbf)、(Fmoc)Arg(Pbf)、(Fmoc)Arg(Pbf)构成的6残基肽链，得到了2.11g带有载体的亲水化肽体7。
＜载体切除工序＞
向充分干燥后的带有载体的亲水化肽体(1.24g、0.0954mmol)加入TFA︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容积比、5mL)的混合溶液，并在25℃下振荡2小时。滤去载体，用TFA清洗了固体。将滤液与清洗液混合，并加入己烷(5mL)，剧烈振荡，然后静置，使其分离为两相。除去己烷层(上层)，向残留的TFA层加入***(5mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，进一步用***对固体清洗了3次。在减压下馏去***，得到了无载体的亲水化肽体的粗产物196mg。
＜色谱纯化工序＞
色谱纯化工序用与实施例1相同的方法进行即可。
MALDI-TOF MS：(M+H+)m/z＝3590.686(计算值3589.897)
＜接头切除工序(利用酸性条件进行的接头的切断)＞
向无载体的亲水化肽体(20mg)加入由TFA︰茴香硫醚︰TMSOTf＝68︰12︰20(容积比)构成的混合溶液4.0mL，并在0℃下搅拌4小时。向TFA层加入***(40mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，用***进一步对固体实施了3次清洗操作。在减压下馏去***，由此得到了粗产物22mg。
＜疏水性肽的获得(可溶部位的除去)＞
用磷酸缓冲液(pH7.2)1mL对上一工序中得到的切断接头后的疏水性肽进行2次清洗，进一步用水1mL清洗2次。对残渣进行真空干燥，由此，以白色粉末的形式得到了12.0mg疏水性肽Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val。
对上述疏水性肽实施了MALDI-TOF MS分析。结果是测定值为2392.683(计算值2392.287)。
实施例6
＜带有载体的粗制肽的制造：TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(GRAVY得分：1.63)＞
通过使用了自动肽合成仪的Fmoc固相合成法，得到了担载有由Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu(tBu)-Asp(tBu)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val构成的24残基肽的固相树脂(Tenta Gel树脂)。
＜接头键合工序(向TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV连接活性化碳酸酯型接头(3a))＞
将溶解于DMF(3mL)的活性化碳酸酯型接头(3a)(144mg、0.24mmol)与TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(0.15mmol/g、800mg、0.12mmol)混合，并在25℃下振荡2小时。接着，进行过滤，用DMF(10mL)和二氯甲烷(10mL)对得到的带有载体的接头键合体进行清洗，由此得到了连接有活性化碳酸酯型接头(3a)的带有载体的接头键合体846mg。
＜亲水性单元键合工序＞
用DMF(3mL，2次)和CH2Cl2(3mL，1次)依次清洗带有载体的接头键合体(1.60g)，在减压下除去了过量的溶剂。向其中加入20％(v/v)哌啶DMF溶液(3mL)，并在25℃下振荡20分钟，然后进行过滤，由此进行了Fmoc基的脱保护。总计进行了4次该哌啶处理操作。在用DMF的清洗后，通过与实施例1相同的Fmoc固相合成法重复了Fmoc基的脱保护和Fmoc氨基酸的偶联。由此，在接头分子上连接了依次由(Fmoc)Asp(tBu)、(Fmoc)Asp(tBu)、(Fmoc)Asp(tBu)、(Fmoc)Asp(tBu)、(Fmoc)Asp(tBu)、(Fmoc)Asp(tBu)构成的6残基肽链，得到了带有载体的亲水化肽体1.98g。
＜载体切除工序＞
向充分干燥后的带有载体的亲水化肽体(1.24g、0.0954mmol)添加TFA︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容积比、5mL)的混合溶液，并振荡2小时。滤去载体，用TFA清洗了固体。将滤液与清洗液混合，并加入己烷(5mL)，剧烈振荡，然后静置，使其分离为两相。除去己烷层(上层)，向残留的TFA层加入***(5mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，进一步用***对固体清洗了3次。在减压下馏去***，得到了无载体的亲水化肽体的粗产物196mg。
＜色谱纯化工序＞
色谱纯化工序用与实施例1相同的方法进行即可。
MALDI-TOF MS：(M+H+)m/z＝3343.304(计算值3343.452)
＜接头切除工序(利用酸性条件进行的接头的切断)＞
向无载体的亲水化肽体(20mg)加入由TFA︰茴香硫醚︰TMSOTf＝68︰12︰20(容积比)构成的混合溶液4.0mL，并在0℃下搅拌4小时。向TFA层加入***(40mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，用***进一步对固体实施了3次清洗操作。在减压下馏去***，由此得到了粗产物22mg。
＜疏水性肽的获得(可溶部位的除去)＞
用磷酸缓冲液(pH7.2)1mL对上一工序中得到的切断接头后的疏水性肽进行2次清洗，进一步用水1mL清洗2次。对残渣进行真空干燥，由此，以白色粉末的形式得到了12.0mg疏水性肽Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val。
对上述疏水性肽实施了MALDI-TOF MS分析。结果是测定值为2393.210(计算值2392.287)。
实施例7
＜带有载体的粗制肽的制造：TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(GRAVY得分：1.63)＞
通过使用了自动肽合成仪的Fmoc固相合成法，得到了担载有由Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu(tBu)-Asp(tBu)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val构成的24残基肽的固相树脂(Tenta Gel树脂)。
＜接头键合工序(向TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV连接活性化碳酸酯型接头(3d))＞
将溶解于DMF(1.5mL)的活性化碳酸酯型接头(3d)(39mg、0.068mmol)与TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(0.15mmol/g、300mg、0.045mmol)混合，并在25℃下振荡2小时。接着，进行过滤，用DMF(10mL)和二氯甲烷(10mL)清洗得到的带有载体的接头键合体，由此得到了连接有活性化碳酸酯型接头(3d)的带有载体的接头键合体。
＜亲水性单元键合工序＞
向带有载体的接头键合体加入20％哌啶的DMF溶液(2mL)并振荡20分钟，进行了Fmoc的脱保护。总计进行了4次该哌啶处理操作。在用DMF的清洗后，通过与实施例1相同的Fmoc固相合成法重复了Fmoc基的脱保护和Fmoc氨基酸的偶联。由此，在接头分子上连接了依次由(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Lys(Boc)构成的3残基肽链，得到了带有载体的亲水化肽体。
＜载体切除工序＞
向充分干燥后的带有载体的亲水化肽体(50mg、0.000311mmol)加入TFA︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容积比、1mL)的混合溶液，振荡2小时。滤去载体，用TFA清洗了固体。将滤液与清洗液混合，并加入己烷(5mL)，剧烈振荡，然后静置，使其分离为两相。除去己烷层(上层)，向残留的TFA层加入***(5mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，进一步用***对固体清洗了3次。在减压下馏去***，得到了无载体的亲水化肽体的粗产物196mg。
＜色谱纯化工序＞
色谱纯化工序用与实施例1相同的方法进行即可。
MALDI-TOF MS：(M+H+)m/z＝3037.812(计算值3037.568)
＜接头切除工序(利用酸性条件进行的接头的切断)＞
向无载体的亲水化肽体(5mg)加入由TFA︰茴香硫醚︰TMSOTf＝68︰12︰20(容积比)构成的混合溶液1.0mL，并在0℃下搅拌4小时。向TFA层加入***(40mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，用***进一步对固体实施了3次清洗操作。在减压下馏去***，由此得到了粗产物6.9mg。
＜疏水性肽的获得(可溶部位的除去)＞
用磷酸缓冲液(pH7.2)1mL对上一工序中得到的切断接头后的疏水性肽(6.9mg)进行2次清洗，进一步用水1mL清洗2次。对残渣进行真空干燥，由此，以白色粉末(3.0mg)的形式得到了3.0mg疏水性肽Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val。
对上述疏水性肽实施了MALDI-TOF MS分析。结果是测定值为2392.939(计算值2392.287)。
实施例8
＜带有载体的粗制肽的制造：TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(GRAVY得分：1.63)＞
通过使用了自动肽合成仪的Fmoc固相合成法，得到了担载有由Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu(tBu)-Asp(tBu)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val构成的24残基肽的固相树脂(Tenta Gel树脂)。
＜接头键合工序(向TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV连接活性化碳酸酯型接头(3b))＞
将溶解于DMF(1.5mL)的活性化碳酸酯型接头(3b)(46mg、0.068mmol)与TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(0.15mmol/g、300mg、0.045mmol)混合，并在25℃下振荡2小时。接着，进行过滤，用DMF(10mL)和二氯甲烷(10mL)对得到的带有载体的接头键合体进行清洗，由此得到了连接有活性化碳酸酯型接头(3b)的带有载体的接头键合体。
＜亲水性单元键合工序＞
向带有载体的接头键合体加入20％哌啶的DMF溶液(2mL)，振荡20分钟，进行了Fmoc的脱保护。总计进行了4次该哌啶处理操作。在用DMF的清洗后，通过与实施例1相同的Fmoc固相合成法重复了Fmoc基的脱保护和Fmoc氨基酸的偶联。由此，在接头分子上连接了依次由(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Lys(Boc)构成的3残基肽链。
＜载体切除工序＞
向充分干燥后的带有载体的亲水化肽体(44mg、0.00410mmol)加入TFA︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容积比、1mL)的混合溶液，并振荡2小时。滤去载体，用TFA清洗了固体。将滤液与清洗液混合，并加入己烷(5mL)，剧烈振荡，然后静置，使其分离为两相。除去己烷层(上层)，向残留的TFA层加入***(5mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，进一步用***对固体清洗了3次。在减压下馏去***，得到了无载体的亲水化肽体的粗产物6.0mg。
＜色谱纯化工序＞
色谱纯化工序用与实施例1相同的方法进行即可。
MALDI-TOF MS：(M+H+)m/z＝3125.946(计算值3125.474)
＜接头切除工序(利用酸性条件进行的接头的切断)＞
向无载体的亲水化肽体(5mg)加入由TFA︰茴香硫醚︰TMSOTf＝68︰12︰20(容积比)构成的混合溶液1.0mL，并在0℃下搅拌4小时。向TFA层加入***(40mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，用***进一步对固体实施了3次清洗操作。在减压下馏去***，由此得到了粗产物7.5mg。
＜疏水性肽的获得(可溶部位的除去)＞
用磷酸缓冲液(pH7.2)1mL对上一工序中得到的切断接头后的疏水性肽进行2次清洗，进一步用水1mL清洗2次。对残渣进行真空干燥，由此，以白色粉末的形式得到了13.0mg疏水性肽Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val。
对上述疏水性肽实施了MALDI-TOF MS分析。结果是测定值为2392.168(计算值2392.287)。
实施例9
＜带有载体的粗制肽的制造：TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(GRAVY得分：1.63)＞
通过使用了自动肽合成仪的Fmoc固相合成法，得到了担载有由Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu(tBu)-Asp(tBu)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val构成的24残基肽的固相树脂(Tenta Gel树脂)。
＜接头键合工序(向TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV连接活性化碳酸酯型接头(3c))＞
将溶解于DMF(1.5mL)的活性化碳酸酯型接头(3c)(39mg、0.068mmol)与TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(0.15mmol/g、300mg、0.045mmol)混合，并在25℃下振荡2小时。接着，进行过滤，用DMF(10mL)和二氯甲烷(10mL)对得到的带有载体的接头键合体进行清洗，由此得到了连接有活性化碳酸酯型接头(3c)的带有载体的接头键合体。
＜亲水性单元键合工序＞
向带有载体的接头键合体加入20％哌啶的DMF溶液(2mL)，振荡20分钟，进行了Fmoc的脱保护。总计进行了4次该哌啶处理操作。在用DMF的清洗后，通过与实施例1相同的Fmoc固相合成法重复了Fmoc基的脱保护和Fmoc氨基酸的偶联。由此，在接头分子上连接了依次由(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Lys(Boc)构成的3残基肽链。
＜载体切除工序＞
向充分干燥后的带有载体的亲水化肽体(44mg、0.00410mmol)加入TFA︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容积比、1mL)的混合溶液，并振荡2小时。滤去载体，用TFA清洗了固体。将滤液与清洗液混合，并加入己烷(5mL)，剧烈振荡，然后静置，使其分离为两相。除去己烷层(上层)，向残留的TFA层加入***(5mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，进一步用***对固体清洗了3次。在减压下馏去***，得到了无载体的亲水化肽体的粗产物8.2mg。
＜色谱纯化工序＞
色谱纯化工序用与实施例1相同的方法进行即可。
MALDI-TOF MS：(M+H+)m/z＝3014.550(计算值3014.638)
＜接头切除工序(利用酸性条件进行的接头的切断)＞
向无载体的亲水化肽体(5mg)加入由TFA︰茴香硫醚︰TMSOTf＝68︰12︰20(容积比)构成的混合溶液1.0mL，并在0℃下搅拌4小时。向TFA层加入***(4mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，用***进一步对固体实施了3次清洗操作。在减压下馏去***，由此得到了粗产物7.0mg。
＜疏水性肽的获得(可溶部位的除去)＞
用磷酸缓冲液(pH7.2)1mL对上一工序中得到的切断接头后的疏水性肽进行2次清洗，进一步用水1mL清洗2次。对残渣进行真空干燥，由此，以白色粉末的形式得到了13.0mg疏水性肽Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val。
对上述疏水性肽实施了MALDI-TOF MS分析。结果是测定值为2396.099(计算值2392.287)。
实施例10
＜带有载体的粗制肽的制造：HMP NovaGEL树脂担载12残基疏水性肽CEWNSAHFIAYK(GRAVY得分：-0.31)＞
通过使用了自动肽合成仪的Fmoc固相合成法，得到了担载有由Ac-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Ala-His(Trt)-Phe-Ile-Ala-Tyr(tBu)-Lys(Boc)构成的12残基肽的固相树脂(HMP NovaGEL树脂)。
＜接头键合工序(向HMP NovaGEL树脂担载12残基疏水性肽CEWNSAHFIAYK连接活性化碳酸酯型接头(3a)＞
将溶解于DMF(3mL)的活性化碳酸酯型接头(3a)(179mg、0.30mmol)与HMP NovaGEL树脂担载12残基疏水性肽CEWNSAHFIAYK(0.27mmol/g、500mg、0.14mmol)混合，并在25℃下振荡2小时。接着，进行过滤，用DMF(10mL)和二氯甲烷(10mL)对得到的带有载体的接头键合体进行清洗，由此得到了连接有活性化碳酸酯型接头(3a)的带有载体的接头键合体。
＜亲水性单元键合工序＞
向带有载体的接头键合体加入20％哌啶的DMF溶液(3mL)，振荡20分钟，进行了Fmoc的脱保护。总计进行了4次该哌啶处理操作。在用DMF的清洗后，通过与实施例1相同的Fmoc固相合成法重复了Fmoc基的脱保护和Fmoc氨基酸的偶联。由此，在接头分子上连接了依次由(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Lys(Boc)构成的3残基肽链。
＜载体切除工序＞
向充分干燥后的带有载体的亲水化肽体(50mg、0.0088mmol)加入TFA︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容积比、1mL)的混合溶液，并振荡2小时。滤去载体，用TFA清洗了固体。将滤液与清洗液混合，并加入己烷(5mL)，剧烈振荡，然后静置，使其分离为两相。除去己烷层(上层)，向残留的TFA层加入***(5mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，进一步用***对固体清洗了3次。在减压下馏去***，得到了无载体的亲水化肽体的粗产物8.2mg。
＜色谱纯化工序＞
色谱纯化工序用与实施例1相同的方法进行即可。
MALDI-TOF MS：(M+H+)m/z＝2028.559(计算值2027.864)
＜接头切除工序(利用酸性条件进行的接头的切断)＞
向无载体的亲水化肽体(5mg)加入由TFA︰茴香硫醚︰TMSOTf＝68︰12︰20(容积比)构成的混合溶液1.0mL，并在0℃下搅拌4小时。向TFA层加入***(4mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，用***进一步对固体实施了3次清洗操作。在减压下馏去***，由此得到了粗产物6.9mg。
＜疏水性肽的获得(可溶部位的除去)＞
用磷酸缓冲液(pH7.2)1mL对上一工序中得到的切断接头后的疏水性肽进行2次清洗，进一步用水1mL清洗2次。对残渣进行真空干燥，由此，以白色粉末的形式得到了疏水性肽Ac-Cys-Glu-Trp-Asn-Ser-Ala-His-Phe-Ile-Ala-Tyr-Lys(3.0mg)。
对上述疏水性肽实施了MALDI-TOF MS分析。结果是测定值为1510.951(计算值1510.678)。
实施例11
＜带有载体的粗制肽的制造：TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(GRAVY得分：1.63)＞
通过使用了自动肽合成仪的Fmoc固相合成法，得到了担载有由Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu(tBu)-Asp(tBu)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val构成的24残基肽的固相树脂(Tenta Gel树脂)。
＜接头键合工序(向TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV连接活性化碳酸酯型接头(3e))＞
将溶解于DMF(1.5mL)的活性化碳酸酯型接头(3e)(55mg、0.068mmol)与TentaGel树脂担载24残基疏水性肽LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(0.15mmol/g、300mg、0.045mmol)混合，并在25℃下振荡2小时。接着，进行过滤，用DMF(10mL)和二氯甲烷(10mL)对得到的带有载体的接头键合体进行清洗，由此得到了连接有活性化碳酸酯型接头(3e)的带有载体的接头键合体。
＜亲水性单元键合工序＞
向带有载体的接头键合体加入20％哌啶的DMF溶液(2mL)，振荡20分钟，进行了Fmoc的脱保护。总计进行了4次该哌啶处理操作。在用DMF的清洗后，通过与实施例1相同的Fmoc固相合成法重复了Fmoc基的脱保护和Fmoc氨基酸的偶联。由此，在接头分子上连接了依次由(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Lys(Boc)、(Fmoc)Lys(Boc)构成的3残基肽链。
＜载体切除工序＞
向充分干燥后的带有载体的亲水化肽体(44mg、0.00410mmol)加入TFA︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容积比、1mL)的混合溶液，并振荡2小时。滤去载体，用TFA清洗了固体。将滤液与清洗液混合，并加入己烷(5mL)，剧烈振荡，然后静置，使其分离为两相。除去己烷层(上层)，向残留的TFA层加入***(5mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，进一步用***对固体清洗了3次。在减压下馏去***，得到了无载体的亲水化肽体的粗产物8.2mg。
＜色谱纯化工序＞
色谱纯化工序用与实施例1相同的方法进行即可。
MALDI-TOF MS：(M+H+)m/z＝3014.550(计算值3014.638)
＜接头切除工序(利用酸性条件进行的接头的切断)＞
向无载体的亲水化肽体(5mg)加入由TFA︰茴香硫醚︰TMSOTf＝68︰12︰20(容积比)构成的混合溶液1.0mL，并在0℃下搅拌4小时。向TFA层加入***(4mL)时，析出了固体。在离心分离后除去上清液，用***进一步对固体实施了3次清洗操作。在减压下馏去***，由此得到了粗产物7.0mg。
＜疏水性肽的获得(可溶部位的除去)＞
用磷酸缓冲液(pH7.2)1mL对上一工序中得到的切断接头后的疏水性肽进行2次清洗，进一步用水1mL清洗2次。对残渣进行真空干燥，由此，以白色粉末的形式得到了13.0mg疏水性肽Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val。
对上述疏水性肽实施了MALDI-TOF MS分析。结果是测定值为2396.099(计算值2392.287)。
序列表
<110> 株式会社钟化(KANEKA CORPORATION)
阿纳斯派克股份有限公司(AnaSpec, Inc.)
<120> 疏水性肽的制造方法
<130> F15-109PCT
<150> US62/055,991
<151> 2014-09-26
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例中合成的疏水性肽.
<400> 1
Gly Ile Leu Thr Val Ser Val Ala Val
1 5
<210> 2
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例中合成的疏水性肽.
<400> 2
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
1 5 10 15
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
20
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例中合成的疏水性肽.
<400> 3
Cys Glu Trp Asn Ser Ala His Phe Ile Ala Tyr Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例中连接于接头的亲水性肽。
Examples.
<400> 4
Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly
1 5 10
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例中连接于接头的亲水性肽。
Examples.
<400> 5
Lys Lys Lys
1
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例中连接于接头的亲水性肽。
Examples.
<400> 6
Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例中连接于接头的亲水性肽。
Examples.
<400> 7
Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1 5

Claims (22)

1.一种纯化肽的制造方法，其是从由载体和以C末端侧键合于该载体的第1肽链构成的带有载体的粗制肽获得纯化肽的方法，该方法包括：
亲水化工序A，向带有载体的粗制肽的氨基依次分步导入或一步导入接头和亲水性单元，获得无载体的亲水化肽体；
载体切除工序B，用于在从将接头键合于带有载体的粗制肽之前至得到亲水化肽体的任意阶段中、或者在得到了带有载体的亲水化肽体之后，切断第1肽链与载体之间的键；
色谱纯化工序，用液相色谱对由亲水化工序A及载体切除工序B得到的无载体的亲水化肽体进行处理；以及
接头切除工序，通过化学处理将色谱纯化后的无载体的亲水化肽体中含有的接头-第1肽链之间的键切断。
2.根据权利要求1所述的纯化肽的制造方法，其中，通过催化还原或酸来进行所述接头切除工序。
3.根据权利要求2所述的纯化肽的制造方法，其中，使用含有酸和路易斯酸的混合溶液来进行所述接头切除工序。
4.根据权利要求3所述的纯化肽的制造方法，其中，使用含有TFA和路易斯酸的混合溶液来进行所述接头切除工序。
5.根据权利要求4所述的纯化肽的制造方法，其中，使用含有TFA、TMSOTf及茴香硫醚的混合溶液来进行所述接头切除工序。
6.根据权利要求2所述的纯化肽的制造方法，其中，使用pKa-2以下的酸来进行所述接头切除工序。
7.根据权利要求2所述的纯化肽的制造方法，其中，使用金属担载催化剂来进行所述接头切除工序。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水性单元为亲水性肽、聚醚或多胺。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水化工序A由使接头键合于粗制肽的氨基的接头键合工序和将亲水性单元键合于得到的接头键合体的接头部位的亲水性单元键合工序构成，
在所述亲水性单元键合工序中，
通过Fmoc固相合成法分步地使多个氨基酸键合于接头部位、或
使预先制备的亲水性肽链键合于接头部位、或
使预先制备的聚醚键合于接头部位、或者
使预先制备的多胺键合于接头部位。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，在通过所述亲水化工序A得到了带有载体的亲水化肽体之后，实施载体切除工序B。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，在接头切除工序后用水或含水溶剂进行清洗。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，通过Fmoc固相合成法使多个氨基酸依次键合于载体，形成所述带有载体的粗制肽。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述接头通过形成苄氧羰基氨基或苄氨基而与第1肽链键合。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述接头具有：能够与粗制肽形成苄氧羰基氨基或苄氨基的第1基团、和能够与亲水性单元化学键合的第2基团。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水性单元的logP(式中，P为在辛醇-水体系中的分配系数)值为-1以下。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水性单元为亲水性肽链，所述亲水性肽链含有2个以上选自精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸中至少1种以上的氨基酸残基。
17.根据权利要求1～16中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水性单元为亲水性肽链，所述亲水性肽链含有2个以上选自天冬氨酸、谷氨酸中至少1种以上的氨基酸残基。
18.根据权利要求8～17中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水性肽链的氨基酸残基的数量为2以上且35以下。
19.一种接头，其具有：能够与伯胺或仲胺形成苄氧羰基氨基或苄氨基的第1基团、和能够与亲水性单元化学键合的第2基团。
20.一种接头，其以下式(1)表示，
式(1)中，R1为具有受到保护的伯氨基的有机基团，R2为吸电子性基团，n为0～4的整数，Z为下式(a)所表示的碳酸酯基、甲酰基或卤代甲基，
式(a)中，X表示离去基团，＊表示与化合物(1)的苯环的键合部位。
21.一种接头，其以下式(2)、下式(4)或下式(6)表示，
式(2)中，R2为吸电子性基团，n为0～4的整数，Pro为氨基保护基，X为-ORx(式中Rx为杂环酰亚胺基)，R3为碳原子数1～10的亚烷基，
式(4)中，R2为吸电子性基团，n为0～4的整数，Pro为氨基保护基，R3为碳原子数1～10的亚烷基，
式(6)中，R2为吸电子性基团，n为0～4的整数，Pro为氨基保护基，R3为碳原子数1～10的亚烷基，X3为卤原子。
22.一种接头，其以下式(3a)表示，
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110437306A (zh) * 2019-07-24 2019-11-12 西北工业大学 基于希夫碱保护的无溶剂机械化学n→c多肽合成方法及回收方法
CN112358530A (zh) * 2020-11-03 2021-02-12 浙江工业大学 多肽标签、高度可溶性的重组腈水解酶及其在医药化学品合成中的应用
CN112638864A (zh) * 2018-08-27 2021-04-09 贝兰迪克有限责任公司 用于肽纯化的无痕还原性可裂解接头分子

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112566895B (zh) 2018-08-09 2023-10-20 豪夫迈·罗氏有限公司 用于肽合成的可切割接头
CN109053859B (zh) * 2018-08-09 2022-04-05 吉尔生化（上海）有限公司 一种针对中性疏水性多肽的纯化方法
EP3666752A1 (en) * 2018-12-13 2020-06-17 Belyntic GmbH Traceless reductively cleavable linker molecules for peptide purification

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998003193A1 (en) * 1996-07-23 1998-01-29 Kansas State University Research Foundation Methods for purifying synthetic peptides
EP1513866A2 (en) * 2002-06-17 2005-03-16 Abbott Laboratories Assay conjugate and uses thereof
CN1916017A (zh) * 1993-07-06 2007-02-21 霍夫曼-拉罗奇有限公司 生产疏水多肽、蛋白质或肽的方法
CN101094867A (zh) * 2004-10-19 2007-12-26 隆萨股份公司 用于固相肽合成的方法
WO2008022800A1 (de) * 2006-08-24 2008-02-28 Leibniz-Institut Für Pflanzenbiochemie Verfahren zur herstellung von kondensationsprodukten aus n-substituierten glycinderivaten (peptoide) über sequentielle ugi-mehrkomponentenreaktionen
CN101166761A (zh) * 2005-05-04 2008-04-23 隆萨股份公司 肽合成法
CN102014956A (zh) * 2007-08-17 2011-04-13 普渡研究基金会 Psma结合配体-接头缀合物及其使用方法
CN102666565A (zh) * 2009-11-16 2012-09-12 国家科学研究中心 用于纯化由固相肽合成法制备的肽的化合物和方法
WO2013185771A1 (en) * 2012-06-12 2013-12-19 Carlsberg A/S, Carlsberg Forskningscenter Assays for detecting glucosidase activity

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992006107A1 (en) * 1990-10-09 1992-04-16 Nihon Millipore Kogyo Kabushiki Kaisha Process for purifying synthetic peptide, and linker and linker-combining solid-phase carrier used in said process
US5955343A (en) * 1992-12-28 1999-09-21 Massachusetts Institute Of Technology Stable macroscopic membranes formed by self-assembly of amphiphilic peptides and uses therefor

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1916017A (zh) * 1993-07-06 2007-02-21 霍夫曼-拉罗奇有限公司 生产疏水多肽、蛋白质或肽的方法
WO1998003193A1 (en) * 1996-07-23 1998-01-29 Kansas State University Research Foundation Methods for purifying synthetic peptides
US5922840A (en) * 1996-07-23 1999-07-13 Kansas State University Research Foundation Methods for purifying synthetic peptides
EP1513866A2 (en) * 2002-06-17 2005-03-16 Abbott Laboratories Assay conjugate and uses thereof
CN101094867A (zh) * 2004-10-19 2007-12-26 隆萨股份公司 用于固相肽合成的方法
CN101166761A (zh) * 2005-05-04 2008-04-23 隆萨股份公司 肽合成法
WO2008022800A1 (de) * 2006-08-24 2008-02-28 Leibniz-Institut Für Pflanzenbiochemie Verfahren zur herstellung von kondensationsprodukten aus n-substituierten glycinderivaten (peptoide) über sequentielle ugi-mehrkomponentenreaktionen
CN102014956A (zh) * 2007-08-17 2011-04-13 普渡研究基金会 Psma结合配体-接头缀合物及其使用方法
CN102666565A (zh) * 2009-11-16 2012-09-12 国家科学研究中心 用于纯化由固相肽合成法制备的肽的化合物和方法
WO2013185771A1 (en) * 2012-06-12 2013-12-19 Carlsberg A/S, Carlsberg Forskningscenter Assays for detecting glucosidase activity

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONGMAO ZHANG等: "Acid cleavable surface enhanced raman tagging for protein detection", 《ANALYST》 *
FRANZISKA MENDE等: "Solid-Phase Synthesis of Peptide Thioesters with Self-Purification", 《ANGEW. CHEM. INT. ED.》 *
JARED F. STEFANICK等: "Enhanced Cellular Uptake of Peptide-Targeted Nanoparticles through Increased Peptide Hydrophilicity and Optimized Ethylene Glycol Peptide-Linker Length", 《ACS NANO》 *
李敬芬: "《药物合成反应》", 31 August 2010, 浙江大学出版社 *
***等: "色谱法在蛋白质分离纯化中的应用", 《齐齐哈尔大学学报：自然科学版》 *
汪世龙: "《蛋白质化学》", 31 August 2012, 同济大学出版社 *
蒋硕忠: "《绿色化学灌浆技术》", 31 August 2006, 长江出版社 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112638864A (zh) * 2018-08-27 2021-04-09 贝兰迪克有限责任公司 用于肽纯化的无痕还原性可裂解接头分子
CN112638864B (zh) * 2018-08-27 2024-03-08 格瑞罗斯普罗泰恩科技公司 用于肽纯化的无痕还原性可裂解接头分子
CN110437306A (zh) * 2019-07-24 2019-11-12 西北工业大学 基于希夫碱保护的无溶剂机械化学n→c多肽合成方法及回收方法
CN112358530A (zh) * 2020-11-03 2021-02-12 浙江工业大学 多肽标签、高度可溶性的重组腈水解酶及其在医药化学品合成中的应用
CN112358530B (zh) * 2020-11-03 2021-10-15 浙江工业大学 多肽标签、高度可溶性的重组腈水解酶及其在医药化学品合成中的应用
WO2022095221A1 (zh) * 2020-11-03 2022-05-12 浙江工业大学 多肽标签、高度可溶性的重组腈水解酶及其在医药化学品合成中的应用

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