CN106999550B - 用于抑制可溶生物分子的生物活性的组合物以及方法 - Google Patents

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Abstract

除其他之外，本公开提供结合至并且抑制可溶生物分子的生物活性的组合物及其药物组合物。本公开还提供一些应用(例如，治疗应用)，其中所述组合物是有用的。

Description

用于抑制可溶生物分子的生物活性的组合物以及方法
优先权
本专利申请要求于2014年10月3日提交的美国临时专利申请号62/059,628、于2015年7月29日提交的美国临时专利申请号62/198,519和于2015年7月29日提交的美国临时专利申请号62/198,541的优先权，上述美国临时专利申请各自以引用方式被整体并入本文。
背景技术
临床可用的或正在开发的许多抗癌疗法涉及刺激免疫***以识别或破坏癌症的能力，或两者同时兼具。最突出的三个疗法是来自百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb)的抗检查点抑制剂Yervoy(Ipilimumab，易普利姆玛)、来自默克公司(Merck)的Keytruda(Pembrolizumab，原名Lambrolizumab)以及来自莫菲特癌症中心/国家癌症研究所(Moffitt Cancer Center/National Cancer Institute)的被称为带有肿瘤浸润淋巴细胞的过继性细胞转移(ACT/TIL)的细胞疗法。然而，这些和其他途径涉及受试者的免疫***的净上调，诱发与自身免疫病症类似的潜在严重症状和/或其他显著的副作用。
本领域需要更有效的药理学途径来克服癌症，特别是转移癌，而不扰乱受试者避免自身免疫的能力。除其他之外，本公开提供基于针对利用受试者的自身免疫***对抗癌症的可替换的途径的方法和组合物，包含去抑制肿瘤微环境，即削弱肿瘤的防御***，而不刺激免疫细胞。
发明内容
除其他之外，本公开提供结合至并且抑制可溶生物分子的生物活性的组合物及其药物组合物。本公开还提供一些应用，其中所述组合物是有用的。例如，本文中描述的组合物可用于抑制细胞(如癌细胞)的增殖、生长和/或存活。在另一个实施例中，本文中描述的组合物可以用于结合至并且中和受试者的循环中的毒素(例如动物毒素、细菌毒素和/或植物毒素)、病毒或其它外来化合物。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用并且意味着任何肽连接的氨基酸链，而不管长度或转译后修饰。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。优选的方法和材料如下所述，尽管与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料也可以被用于本发明公开的方法和组合物的实践或测试中。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以引用方式被整体并入本文。
本公开预期任何前述方面和实施方案的所有组合，以及与具体实施方式和实施例中阐述的任何实施方案的组合。
附图说明
图1描绘了结合至可溶形式的TNF受体(TNFR)的颗粒的示例性实施方案。颗粒为1立方微米。颗粒的内表面包含被固定的TNF，所述被固定的TNF能够结合至可溶TNFR并将可溶TNFR从其天然配体隔离(清除)。
图2描绘了结合至可溶形式的TNF受体(TNFR)的颗粒的示例性实施方案。环状颗粒的直径为175nm。颗粒的内表面包含被固定的TNF，所述被固定的TNF能够结合至可溶TNFR并将可溶TNFR从其天然配体中隔离(清除)。
图3描绘了结合至可溶形式的TNF受体(TNFR)的颗粒的示例性实施方案。图左侧的颗粒是八面体，所述八面体具有最长尺寸为100至150nm的芯。图右侧的颗粒是二十面体，所述二十面体具有最长尺寸为200至300nm的芯。每个颗粒还包括从芯多面体结构的顶点指向外的分子突起。这些突起用作“细胞排斥剂”，所述“细胞排斥剂”抑制结合至颗粒的TNF与细胞表面TNFR之间的相互作用。
具体实施方式
本公开的特征在于用于将可溶生物分子从它的天然环境隔离的组合物和方法，例如，从而抑制可溶生物分子的生物活性。例如，本公开提供具有包括选择性地结合至可溶生物分子的药剂(例如，被固定在颗粒的表面上)的表面的颗粒或多个颗粒。一旦可溶生物分子被药剂结合，它被颗粒隔离以致于可溶生物分子具有降低的与可溶生物分子的其他天然结合配偶体(partners)相互作用的能力(例如，大幅度降低的能力或无能力)。因此，可溶生物分子变成惰性的。
I.生物分子
可溶生物分子通常是特异性的结合对的第一构件。如本文中使用的，“结合配偶体”、“特异性的结合配偶体”或“特异性的结合对的构件”通常包括以很大程度的亲和性和特异性彼此结合的结合构件对中的任何构件。一对结合配偶体可以彼此结合以达到样品的其他组分的至少大部分或至少基本上样品的所有其他组分的很大程度的排除，和/或可以具有小于约10-4、10-5、10-6、10-7或10-8M的解离常数等。一对结合配偶体可以以预先确定的方式“配合”在一起，所述预先确定的方式依赖于多个原子相互作用以合作地增加特异性和亲和性。结合配偶体可以衍生自生物***(例如，受体-配体相互作用)、化学相互作用、和/或通过分子烙印技术等。表1中给出了示例性相应的多对结合配偶对，也称为特异性的结合对，其具有任意的和可互换的名称“第一”和“第二”。
本文中使用的术语“生物分子”是指可以对活体产生作用的任何分子。在一些实施方案中，生物分子是原子，如锂或铅(例如，生物分子可以是金属阳离子)。在一些实施方案中，生物分子不是原子或金属离子。例如，生物分子可以是分子，如有机化合物或无机化合物。在一些实施方案中，生物分子是药物，如华法林。生物分子可以是精神活性药物，如二乙酰***。生物分子可以是毒物、毒素或毒液。生物分子可以是过敏原。生物分子可以是致癌物。生物分子可以是化学武器的药剂，如神经药剂。生物分子可以是病毒或类病毒。生物分子可以是生物体的内生分子，如激素、细胞因子、神经递质、可溶胞外受体、抗体或可溶基质蛋白。生物分子可以是肽、多肽、蛋白质、核酸、碳水化合物或糖。生物分子可以包括肽、多肽、蛋白质、核酸、碳水化合物或糖。生物分子可以是脂质、类固醇或胆固醇。
生物分子可以是细胞表面受体的配体。配体可以是天然存在的配体或合成的配体。配体可以是受体的天然配体(例如，由受试者体内产生的配体)或非天然配体(例如，被引入进受试者的配体，如病毒或药物)。生物分子可以是细胞溶质受体或核受体的配体。
表1.特异性的结合对的实施例
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如上所述，已知肿瘤细胞通过排出可溶形式的细胞因子受体来保护自身免受宿主免疫监视，这些可溶受体结合至肿瘤微环境中的免疫细胞产生的细胞因子。例如，癌细胞排出可溶形式的TNF受体和其他细胞因子受体，如IL-2受体和TRAIL受体。这些可溶受体通过减轻细胞对TNFα、IL-2和TRAIL的促凋亡作用而赋予癌细胞生长优势。Karpatova等报道了由人癌细胞的67kD层粘连蛋白受体的排出，这可能增加肿瘤侵袭和转移((1996)J CellBiochem 60(2):226-234)。因此，本文中描述的颗粒可以被设计用于清除可溶形式的细胞表面受体蛋白，例如，用于治疗癌症。
因此，在一些实施方案中，细胞表面受体蛋白由癌细胞表达，和/或细胞表面受体蛋白是癌细胞以细胞表面受体蛋白的可溶形式排出的蛋白质。在一些实施方案中，细胞表面受体蛋白在被激活时诱导凋亡(例如，死亡受体)。在一些实施方案中，细胞表面受体蛋白是肿瘤坏死因子受体(TNFR)蛋白(例如，TNFR-1或TNFR-2)。在一些实施方案中，细胞表面受体蛋白是Fas受体蛋白。在一些实施方案中，细胞表面受体蛋白是TNF相关凋亡诱导配体受体(TRAILR)蛋白、4-1BB受体蛋白、CD30蛋白、EDA受体蛋白、HVEM蛋白、淋巴毒素β受体蛋白、DR3蛋白或TWEAK受体蛋白。在一些实施方案中，细胞表面受体蛋白是白介素受体蛋白，例如IL-2受体蛋白。应当理解，在这样的实施方案中，靶标可溶生物分子可以是可溶形式的细胞表面受体，例如，排出自癌细胞。
本领域技术人员也将会理解本文中描述的颗粒也可用于清除更多种类的可溶生物分子，所述可溶生物分子的生物活性可以是，例如，不期望的。例如，颗粒可以被设计以结合至病毒壳体或包膜的组分，从而从受试者的血液中隔离病毒。在一些实施方案中，颗粒可以被设计在受试者的循环中结合并隔离毒素(例如，细菌毒素、植物毒素和动物毒素(如蛇毒的一种或更多种组分))。在一些实施方案中，颗粒可以被设计结合至并从受试者的循环中隔离小分子(例如，非法药物或小分子毒素)。在这样的实施方案中，颗粒可以用于从身体去除毒素，例如，在被蛇或昆虫咬伤之后。在一些实施方案中，颗粒可以用于治疗、预防、延缓发作或降低受试者的过敏性休克的严重性(例如，通过清除引起过敏性免疫应答的抗原)。
在一些实施方案中，可溶生物分子是病毒，例如，被药剂结合的病毒结构蛋白(如病毒壳体或病毒包膜蛋白)。在这样的实施方案中，颗粒可用作抗病毒疗法，例如，用于感染病毒或有被感染病毒的风险的受试者。
在一些实施方案中，可溶生物分子是小分子或大分子。在一些实施方案中，可溶生物分子的最长尺寸不大于600nm(例如，小于550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50或25nm)。生物分子可以具有约
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至1μm的分子半径，如约
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至约100nm、或约
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至20nm、约1nm至约1μm、约1nm至约100nm或约1nm至约20nm。生物分子可以具有约3amu至约107amu的分子量，如约100amu至约107amu、约3amu至约106amu、约3amu至约105amu、约100amu至约106amu或约400amu至约106amu。
术语“特异性的结合”、“特异性地结合”、“选择性的结合”、“选择性地结合”和类似符合语法规则的术语，如本文中使用的，是指形成在生理条件下相对稳定的复合物的两个分子。典型地，当结合常数(ka)高于106M-1s-1时，结合被认为是特异性的。因此，特异性的结合对的第一构件可以以至少(或大于)106(例如，至少或大于107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015或更高)M-1s-1的ka特异性地结合至所述结合对的第二构件。在一些实施方案中，选择性的相互作用具有小于或等于10-3(例如，8×10-4、5×10-4、2×10-4、10-4或10-5)s-1的解离常数(kd)。
在一些实施方案中，选择性的相互作用具有小于10-8、10-9、10-10、10-11或10-12M的KD。平衡常数KD是动力学速率常数的比率，即kd/ka。在一些实施方案中，选择性的相互作用具有小于1×10-9M的KD。
如本文中使用的，当涉及两个分子之间的相互作用时，术语“相互作用”是指分子彼此的物理接触(例如，结合)。通常，这样的相互作用导致所述分子中的一个或两个的活性(所述活性产生生物学效应)。抑制这样的相互作用导致参与相互作用的一个或更多个分子的活性的破坏。
如本文中使用的，术语“抑制”及其符合语法规则的等同物是指特定作用、功能或相互作用的降低、限制和/或阻断。在一个实施方案中，所述术语是指降低给定输出或参数的水平至至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％的数量或小于相应对照中的数量的数量(例如，特异性的结合对的两个构件之间的相互作用的背景水平)。给定输出或参数的降低的水平无需(尽管其可能)意味着绝对不存在输出或参数。本发明不需要并且不限于完全消除输出或参数的方法。很大程度的抑制可以是，例如两个生物分子(例如结合对的第一和第二构件)之间的相互作用的至少50(例如，55、60、65、70、75、80、85、90或95或更大)％的抑制。
用于检测相互作用或测量一个生物分子对另一个生物分子的亲和性的方法是本领域已知的。例如，两个生物分子的结合可以使用多种技术(如，但不限于，生物膜干涉(BLI)、蛋白质印迹法、斑点杂交、表面等离子体共振法(SPR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、
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或
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测定或基于质谱法的方法)被检测和/或被定量。
在一些实施方案中，可以使用本领域已知的用于表征两个生物分子的相互作用的动力学参数的任何基于SPR的测定来测定结合。任何商业可获得的SPR仪器包含(但不限于)BIAcore仪器(Biacore AB；瑞典乌普萨拉)、lAsys仪器(Affinity Sensors；马萨诸塞州富兰克林)、IBIS***(Windsor Scientific Limited；英国柏克斯郡)、SPRCELLIA***(日本激光和电子实验室，日本北海道)和SPR检测器Spreeta(德州仪器，德克萨斯州达拉斯)可用于本文中描述的方法。参见，例如，Mullett et al.(2000)Methods 22:77-91；Dong et al.(2002)Reviews in Mol Biotech 82:303-323；Fivash et al.(1998)Curr OpinBiotechnol 9:97-101；和Rich et al.(2000)Curr Opin Biotechnol 11:54-61。
在一些实施方案中，可以使用Octet的BLI(ForteBio有限公司)测定两个生物分子之间的生物分子相互作用。BLI是一种无标记的光学分析技术，所述BLI通过实时测量生物传感器末梢上的蛋白质层的厚度变化来感测被固定在生物传感器末梢上的配体与溶液中的分析物之间的结合。
在一些实施方案中，AlphaScreen(珀金埃尔默仪器有限公司)测定可用于表征两个生物分子的结合。首字母缩略词ALPHA代表放大化学发光亲和均相检测(AmplifiedLuminescent Proximity Homogeneous Assay)。AlphaScreen是一种基于微珠的亲和测定，所述测定通过测量供体和受体珠之间的能量转移产生的信号来感测贴附于供体和受体珠的分子之间的结合。(参见，例如，Eglen et al.(2008)Curr Chem Genomics 1:2-10)。
在一些实施方案中，
Figure BDA0001311699010000061
(珀金埃尔默仪器有限公司)测定可用于表征两个生物分子的结合。AlphaLISA从上述的AlphaScreen测定修改为包含含铕受体珠并且用作传统ELISA测定的替代物。(参见，例如，Eglen et al.(2008)Curr Chem Genomics 1:2-10)
可以使用各种各样的免疫测定技术，包含竞争的或非竞争的免疫测定。术语“免疫测定”包含技术，所述技术包含(但不限于)流式细胞术、FACS、酶免疫分析法(EIA)、如酶多种免疫测定技术(EMIT)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、IgM抗体捕捉ELISA(MAC ELISA)和微粒子酶免疫分析法(MEIA)、以及毛细管电泳免疫测定(CEIA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定法(IRMA)、荧光偏振免疫法(FPIA)以及化学发光分析(CL)。如果需要的话，这样的免疫测定可以是自动化的。免疫测定也可以与激光诱发荧光结合使用。脂质体免疫测定(如流动注射脂质体免疫测定和脂质体免疫传感器)也适合用于本发明。此外，散射比浊分析(其中，例如，生物分子复合物的形成导致增加的光散射，所述光散射作为标志物浓度的函数被转换峰值速率信号)适合于用于本发明的方法。在本发明的优选实施方案中，温育产物通过ELISA、RIA、荧光免疫测定(FIA)或可溶颗粒免疫测定(SPIA)被检测。
在一些实施方案中，可以使用热变性方法(涉及差示扫描荧光测定法(DSF)和差分静态光散射(DSLS))测定两个生物分子的结合。
在一些实施方案中，可以使用基于质谱的方法(如，但不限于，耦合至质谱平台的亲和性选择(AS-MS))测定两个生物分子的结合。这是一种无标记的方法，其中蛋白质和测试化合物被温育，未结合的分子被洗掉，并通过MS分析蛋白质-配体复合物以在解络步骤后进行配体鉴定。
在一些实施方案中，可以使用，例如，可检测标记的蛋白质，如放射性标记的(例如32P、35S、14C或3H)、荧光标记的(例如FITC)或酶标记的生物分子，通过免疫测定或通过色谱检测来定量两个生物分子的结合。
在一些实施方案中，本发明预期了荧光偏振测定和荧光共振能量转移(FRET)测定在直接或间接地测量两个生物分子之间的相互作用的程度的用途。
II.颗粒
如本文中使用的，术语“颗粒”是指可以包括任何材料(例如氧化铝、金属(例如金或铂)、玻璃、二氧化硅、乳胶、塑料、琼脂糖、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯或任何聚合材料)并且可以为任意尺寸或形状的小团块(mass)。在一些实施方案中，颗粒或多个颗粒包括硅。参见，例如，国际专利申请公开号WO 2013/011764、WO 2013/029278和WO 2014/151381以及美国专利申请公开号2014/0271886，其每一个的公开内容以引用方式被整体并入本文。在一些实施方案中，颗粒可以包括或由淀粉组成(参见，例如，国际专利申请公开号WO 2010/084088)。
本文的特征也在于颗粒的收集。在一些实施方案中，多个颗粒具有窄的或宽的多分散性。如本文中使用的，“多分散性”是指特定颗粒群内颗粒的尺寸范围。也就是说，极度多分散的群体可能包含具有1微米的平均尺寸的颗粒，其中单个颗粒的范围为0.1至4微米。在一些实施方案中，“窄的多分散性”是优选的。也就是说，假定特定的平均颗粒尺寸，目前优选的是群体中的单个颗粒与平均颗粒尺寸的差异不超过±20％，优选地不超过±15％，并且目前最优选地不超过±10％。更具体地，颗粒群优选地具有约1微米或更小的平均颗粒尺寸。因此，如果选择1微米的平均颗粒尺寸，群体中的单个颗粒将最优选地在约0.8至约1.2微米的范围内。在一些实施方案中，颗粒群具有约0.3至约1微米的平均颗粒尺寸，例如，约0.4至约0.9、约0.5至0.9、约0.4至0.8、约0.5至0.7、约0.3至0.9或约0.3至约0.7微米。
在一些实施方案中，本公开的特征在于具有确定的平均颗粒尺寸的一些或多个颗粒。如本文中使用的，通过测量单个颗粒的尺寸，然后除以颗粒的总数来获得“平均颗粒尺寸”。平均颗粒尺寸的测定是本领域公知的。典型地，颗粒的最长平均尺寸不大于1μm。在一些实施方案中，颗粒是纳米颗粒。在一些实施方案中，颗粒的最长平均尺寸不大于900(例如850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、450、400、350、250、200或150)nm。在一些实施方案中，颗粒被确定形状和尺寸以在受试者(例如人类受试者)的血液或脉管***(例如动脉、静脉和毛细血管)中循环。示例性颗粒设计在图1至3中阐述。
在一些实施方案中，多个颗粒是多面体的，例如，立方体的。在一些实施方案中，多个颗粒是球形的。在一些实施方案中，本文中描述的任意颗粒可以是多孔的。这样的多孔颗粒包括外表面和所述颗粒的孔的多个内表面。药剂可以，例如，被固定在所述多个内表面上。在一些实施方案中，多个孔具有至少50nm的横截面尺寸。在一些实施方案中，多个孔具有至少100nm的横截面尺寸。例如美国专利申请公开号20140199352、20080277346和20040105821已经描述了多孔纳米颗粒，其每一个的公开内容以引用方式被整体并入本文。例如美国专利号8,778,830和8,586,096已经描述了球形颗粒，其每一个以引用方式被并入本文。
在一些实施方案中，球形颗粒还可以包括从颗粒的球形表面延伸的两个相交的脊，其中每个结构的最长尺寸不大于1μm，并且其中脊被确定尺寸并且被定向：(i)以抑制被固定在球形颗粒的表面上的药剂结合至或激活细胞表面受体蛋白，和/或(ii)当可溶生物分子被结合至药剂时，以抑制可溶生物分子与特异性的结合对的第二构件的相互作用，可溶生物分子是特异性的结合对的第一构件。
在一些实施方案中，多个颗粒是环形的。在这样的实施方案中，药剂可以被固定在颗粒的内周表面上(例如在洞周围，参见图2)。在一些实施方案中，颗粒的直径不大于600(例如，550、500、450、400、350、300、200或150)nm。
在一些实施方案中，本文中描述的颗粒是树枝状的。例如，Du et al.(2015)Small11(4):392-413、美国专利号5,814,272和7,932,311以及美国专利申请公开号No.20040166166描述了这样的颗粒，其每一个的公开内容以引用方式被并入本文。如下文详述的，在一些实施方案中，树枝状颗粒的几何结构是这样以致于被固定在颗粒的内表面上的药剂具有降低或大幅度降低的与细胞表面上的生物分子相互作用的能力，和/或通过药剂被结合至颗粒的可溶生物分子具有降低或大幅度降低的与其同源配体(特异性的结合对的第二构件)相互作用的能力。
在一些实施方案中，多个颗粒是多面体的，例如八面体的或二十面体的(参见，例如，图3)，无论是规则的还是不规则的。颗粒可以包括至少一个来自所述颗粒的顶点中的至少一个的突起(参见，例如，图3)。颗粒可以包括多于一个(例如2、3、4、5、6、7或8或更多个)的来自所述颗粒的顶点的突起。这样的突起可以是，例如，被确定尺寸和/或被定向的：(i)以抑制被固定在球形颗粒的表面上的药剂结合至或激活细胞表面受体蛋白和/或(ii)当可溶生物分子被结合至药剂时，以抑制可溶生物分子与特异性的结合对的第二构件的相互作用，生物分子是特异性的结合对的第一构件。
Ⅲ.包括孔的颗粒
在一些实施方案中，用于制备颗粒的材料(例如硅)可以具有约40％至约95％(如约60％至约80％)的孔隙率。如本文中使用的，孔隙率是材料中的孔隙空间的量度，并且是孔隙体积占材料总体积的分数。在某些实施方案中，载体材料具有至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或甚至至少约90％的孔隙率。在具体实施方案中，孔隙率大于约40％，例如大于约50％、大于约60％或甚至大于约70％。
在某些实施方案中，药剂从材料表面分布至孔深度至少约0.005微米、至少0.05微米、至少约0.1微米、至少约0.2微米、至少约0.3微米、至少约0.4微米、至少约0.5微米、至少约0.6微米或至少约0.7微米。在某些实施方案中，药剂大体上均匀地分布在载体材料的孔中。
药剂可以被装载至颗粒内至一深度，所述深度被测量为与颗粒的总宽度的比率。在某些实施方案中，药剂分布至颗粒中至少约10％的深度、至颗粒中至少约20％的深度、至颗粒中至少约30％的深度、至颗粒中至少约40％的深度、至颗粒中至少约50％的深度，或至颗粒中至少约60％的深度。
孔尺寸可以被预先选择为药剂和靶标生物分子的尺寸特性，以控制生物分子的释放。典型地，太小的孔尺寸妨碍药剂的装载和/或生物分子的结合。例如，材料的平均孔径可以选自针对于高分子量分子(例如200,000-500,000amu)的较大的孔(例如15nm至40nm)和针对于具有较低分子量的分子(例如10,000-50,0000amu)的较小的孔(例如2nm至10nm)。例如，直径约6nm的平均孔尺寸可以适合于分子量为约14,000至15,000amu(如约14,700amu)的分子。分子量约为45,000至50,000amu(如约48,000amu)的分子可以选择直径约10nm的平均孔尺寸。分子量约为150,000nm的分子可以选择直径约25-30nm的平均孔尺寸。
孔尺寸可以被预先选择以适应药剂或生物分子的分子半径。例如，直径约25nm至约40nm的平均孔尺寸可以适合于最大分子半径为从约6nm至约8nm的分子。分子半径可以通过任何合适的方法计算，例如通过使用基于X射线晶体学数据的分子的物理尺寸或使用代表分子的溶液状态尺寸的流体动力学半径来计算。由于溶液状态计算取决于进行计算的溶液的性质，某些测量可能优选使用基于X射线晶体学数据的分子的物理尺寸。如本文中使用的，最大分子半径反映了治疗剂的最大尺寸的一半。
在某些实施方案中，平均孔径被选择以限制孔内分子(例如，蛋白质)的聚集。阻止生物分子(如蛋白质)在载体材料中聚集将是有利的，因为此聚集被认为妨碍了分子受控释放至生物***中。因此，由于孔尺寸和生物分子的尺寸之间的关系，允许例如在任何同一时间只有一个生物分子进入孔的孔，将比允许多个生物分子一起进入孔并在孔内聚集的孔更为优选。在某些实施方案中，多个生物分子可以被装载到孔中，但是由于孔的深度，分布遍及整个孔深度的蛋白质将以较小的程度聚集。
IV.药剂
在一些实施方案中，颗粒的几何结构使得被固定的药剂具有降低的或大幅度降低的与细胞表面上的生物分子相互作用的能力。例如，在一些实施方案中，被固定在本文中描述的颗粒表面上的TNFα或IL-2具有小于50(例如，45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)％的游离TNFα或IL-结合至细胞表面上的TNFα受体或IL-2受体的能力。在一些实施方案中，结合至颗粒的可溶生物分子具有降低的或大幅度降低的与其同源配体(特异性的结合对的第二构件)相互作用的能力。例如，结合至如本文中描述的颗粒的可溶TNFR具有小于50(例如，45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)％的游离可溶TNFR与游离TNFα相互作用的能力。在另一个实施例中，结合至本文中描述的颗粒的可溶病毒粒子(virion)具有小于50(例如，45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)％的游离病毒粒子与其同源细胞表面受体相互作用并感染细胞的能力。能够降低或大幅度降低药剂与细胞表面上的生物分子的相互作用或结合至颗粒的生物分子与其同源配体之间的相互作用的示例性颗粒几何结构在图1至3中描述并在本文中描述。
在一些实施方案中，被固定在颗粒表面上的药剂是小分子、大环化合物、多肽、拟肽化合物、适配子(aptamer)、核酸或核酸类似物。本文中使用的“小分子”是指具有小于约6kDa并且最优选小于约2.5kDa的分子量的药剂。许多制药公司具有广泛的化学和/或生物混合物库，所述库包括小分子阵列，通常包括真菌、细菌或藻类提取物，所述库可以用应用的任何测定进行筛选。除其他之外，本申请预期了使用小型化学库、肽库或天然产物的集。Tan等描述了一种具有超过二百万种合成化合物的库，所述库与小型化的基于细胞的测定兼容(J Am Chem Soc(1998)120:8565-8566)。
拟肽物可以是化合物，其中受试者多肽的至少一部分被修饰，并且拟肽物的三维结构保持与受试者多肽的三维结构基本上相同。拟肽物可以是本公开的受试者多肽的类似物，所述拟肽物本身是在受试者多肽序列内包含一个或更多个取代或其它修饰的多肽。可替换地，受试者多肽序列的至少一部分可以用非肽结构代替，以致于受试者多肽的三维结构被基本上保留。换句话说，受试者多肽序列内的一个、两个或三个氨基酸残基可以被非肽结构代替。此外，受试者多肽的其它肽部分可以(但不需要)用非肽结构代替。拟肽物(肽和非肽基类似物两者都)可以具有改善的性质(例如降低的蛋白水解、增加的固位力或增加的生物利用度)。拟肽物通常具有改善的口服可用性，这使得它们特别适合于治疗人或动物。应该注意的是，拟肽物可以具有或可以不具有相似的二维化学结构，但是具有共同的三维结构特征和几何结构。每个拟肽物可以还具有一个或更多个独特的附加的结合要素。
适配子是短的寡核苷酸序列，所述适配子可以被用于识别并特异性地结合几乎任何分子(包含细胞表面蛋白)。指数富集配体***进化(SELEX)过程是有力的并且可以被用于容易地鉴定这样的适配子。适配子可以被制备用于治疗和诊断的宽泛范围的重要的蛋白质(如生长因子和细胞表面抗原)。这些寡核苷酸以与抗体相似的亲和性和特异性结合其靶标(参见，例如，Ulrich(2006)Handb Exp Pharmacol 173:305-326)。
如上指出的，术语“抗体”是指包含不同的同种型的抗体的全部抗体，如IgM、IgG、IgA、IgD和IgE抗体。术语“抗体”包含多克隆抗体、单克隆抗体、被嵌合的或嵌合抗体、人源化抗体、灵长类抗体、去免疫抗体和完全人抗体。抗体可以被制备成或衍生自任意多种物种，例如哺乳动物，如人、非人灵长类(例如猩猩、狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。抗体可以是纯化的或重组抗体。
术语“抗体片段”、“生物分子结合片段”或类似术语是指保留结合靶标抗原的能力的抗体的片段。这样的片段包含，例如，单链抗体、单链Fv片段(scFv)、Fd片段、Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。scFv片段是单多肽链，所述scFv片段包含衍生scFv的抗体的重链和轻链可变区两者。此外，胞内抗体、微抗体(minibodies)、三链抗体(triabodies)和双链抗体(diabodies)也包含在抗体的定义中，并且与本文中描述的方法兼容使用(参见，例如，Todorovska et al.(2001)J Immunol Methods 248(1):47-66；Hudson and Kortt(1999)JImmunol Methods 231(1):177-189；Poljak(1994)Structure 2(12):1121-1123；Rondonand Marasco(1997)Annual Review of Microbiology 51:257-283，其每一个的公开内容以引用方式被整体并入本文)。双特异性的抗体(包含DVD-Ig抗体)也被术语“抗体”涵盖。双特异性的抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选地是人或人源化抗体。
如本文中使用的，术语“抗体”还包含，例如单结构域抗体，如被嵌合的(camelized)单结构域抗体。参见，例如，Muyldermans et al.(2001)Trends Biochem Sci26:230-235；Nuttall et al.(2000)Curr Pharm Biotech 1:253-263；Reichmann et al.(1999)J Immunol Meth 231:25-38；PCT申请公开号WO 94/04678和WO 94/25591；美国专利号6,005,079、6,015,695和7,794,981，其全部以引用方式被整体并入本文。在一些实施方案中，本公开提供包括具有修饰的两个VH结构域的单结构域抗体，以致于形成单结构域抗体。
在一些实施方案中，药剂是非抗体支架蛋白。通常通过预先存在的配体或抗原结合蛋白的组合的基于化学的适应调整来获得这些蛋白质。例如，人转铁蛋白对人转铁蛋白受体的结合部位可以使用组合化学被修饰以创造转铁蛋白变体的不同的库，所述库的一些具有对不同抗原的后天的亲和性(参见Ali et al.(1999)J Biol Chem 274:24066-24073)。不涉及结合受体的人转铁蛋白部分保持不变并且用作支架(类似抗体的框架区)以呈现变体结合部位。然后将库作为抗体库针对感兴趣的靶标抗原进行筛选以确定具有对靶标抗原的最佳选择性和亲和性的那些变体。非抗体支架蛋白虽然与抗体功能相似，但与抗体相比具有许多优点，所述优点包含(除其他之外)增强的溶解度和组织穿透性、制造成本更低和易于与其他感兴趣的分子接合(参见Hey et al.(2005)TRENDS Biotechnol 23 (10):514-522)。
本领域技术人员将会理解非抗体支架蛋白的支架部分可以包含，例如全部或部分：金黄色葡萄球菌蛋白A的Z结构域、人转铁蛋白、人第十纤连蛋白III型结构域、人胰蛋白酶抑制剂的kunitz结构域、人CTLA-4、锚蛋白重复蛋白、人脂质运载蛋白、人晶状体蛋白、人泛素或来自大肠杆菌的胰蛋白酶抑制剂(参见Hey et al.(2005)TRENDS Biotechnol 23 (10):514-522)。
在一些实施方案中，药剂是靶标生物分子的天然配体。例如，药剂可以是细胞因子。如本文中使用的，术语“细胞因子”是指影响细胞的功能的任何分泌的多肽并且是调节免疫、炎症或造血反应中的细胞之间的相互作用的分子。细胞因子包含(但不限于)单核因子和淋巴因子，不管何种细胞产生它们。例如，单核因子通常是指由单核细胞产生和分泌的，如巨噬细胞和/或单核白细胞。然而很多其他细胞也产生单核因子，例如天然杀伤细胞、纤维母细胞、嗜碱粒细胞、中性粒细胞、内皮细胞、脑星形胶质细胞、骨髓***、表皮角化细胞和B淋巴细胞。淋巴因子通常是指由淋巴细胞产生的。细胞因子的实施例包含(但不限于)白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子β(TNF-β)。
在一些实施方案中，药剂是肿瘤坏死因子(TNF)家族配体，例如TNF家族配体选自TNFα、TNFβ、Fas配体、淋巴毒素、淋巴毒素α、淋巴毒素β、4-1BB配体、CD30配体、EDA-A1、LIGHT、TLA1、TWEAK、TNFβ和TRAIL。
在一些实施方案中，药剂是靶标生物分子的天然配体的变体，例如白介素多肽的变体，如变体IL-2或变体TNFα。根据本发明的一些实施方案，变体可以包含一种或更多种氨基酸取代、缺失或***。取代可以是保守的或非保守的。如本文中使用的，术语“保守取代”是指用具有相似的空间性质的天然或非天然存在的氨基酸代替给定的多肽中的天然序列中存在的氨基酸。当待替代的天然氨基酸的侧链是极性的或疏水性的时，保守取代应该是用也是极性的或疏水性的天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸，并且可选地与被代替的氨基酸的侧链具有相同或相似的空间性质。保守取代典型地包含以下基团中的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺，丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。一个字母氨基酸缩写如下：丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)。变体还包含全长野生型天然配体的片段以及相对于衍生出所述片段的野生型全长天然配体，包括一个或更多个氨基酸取代、***或缺失的片段。
如本文中使用的，短语“非保守取代”是指通过具有不同电化学和/或空间性质的另一天然或非天然存在的氨基酸代替母体序列中存在的氨基酸。因此，取代氨基酸的侧链可以比被取代的天然氨基酸的侧链显著更大(或更小)和/或可以具有与被取代的氨基酸显著不同的电子性质的官能团。
在一些实施方案中，变体多肽包括相对于衍生出所述变体多肽的野生型全长多肽的至少2个(例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或大于100个)氨基酸取代、缺失或***。在一些实施方案中，变体多肽包含相对于衍生出所述变体多肽的野生型全长多肽的不超过150个(例如不超过145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个)氨基酸取代、缺失或***。
在一些实施方案中，变体多肽(例如，变体IL-2或TNFα多肽)保留至少10(例如，至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100)％的衍生出所述变体多肽的野生型全长多肽结合至靶标生物分子(例如，特异性的结合对的构件，其中野生型全长多肽是所述特异性的结合对的构件)的能力。在一些实施方案中，变体多肽将具有大于衍生出变体的野生型全长多肽的对靶标生物分子的亲和性。例如，在一些实施方案中，变体多肽具有比衍生出变体多肽的野生型全长多肽大2(3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500或甚至1000)倍的对靶标生物分子的亲和性。用于检测或测量两种蛋白质之间的相互作用的方法是本领域已知的并且如上所述。
在一些实施方案中，野生型全长天然配体调节细胞表面受体的活性。因此，相对于野生型天然配体的活性，天然配体的变体可以具有增强的或降低的调节受体活性的能力。例如，在一些实施方案中，变体多肽具有小于90(例如85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或小于5)％的衍生出所述变体多肽的全长野生型多肽的激活细胞表面受体蛋白的能力。在一些实施方案中，变体多肽不激活其结合的受体。
这样的示例性变体多肽是本领域已知的。例如，国际专利申请公开号WO 2012/085891描述了具有降低的三聚能力并且因此具有降低的激活TNF家族受体的能力的TNF家族配体变体(也参见美国专利申请公开号US 2014/0096274，以引用方式并入本文)。然而变体TNF配体保留结合至TNF家族受体的能力。用于比较变体和野生型天然配体之间的活性的合适的方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，可溶生物分子是细胞表面受体的配体，例如细胞因子或趋化因子，如任何的本领域已知的或本文中描述的那些。在一些实施方案中，配体是肿瘤坏死因子(TNF)家族配体或其变体。在一些实施方案中，TNF家族配体是TNFα或其变体。在一些实施方案中，TNF家族配体是Fas配体、淋巴毒素、淋巴毒素α、淋巴毒素β、4-1BB配体、CD30配体、EDA-A1、LIGHT、TLA1、TWEAK、TNFβ、TRAIL或前述任一项的变体。
在一些实施方案中，可溶生物分子是表2中鉴定的一个。
表2.示例性可溶生物分子和/或药剂
Figure BDA0001311699010000131
Figure BDA0001311699010000141
Figure BDA0001311699010000151
“AD”是指自身免疫性病症和/或炎症病症。“OA”是指骨关节炎。
在一些实施方案中，每个颗粒包括多种药剂。所述多种药剂可以包括10至约109份药剂，如约103至约107份药剂或约104至约106份药剂。
V.生产抗体的方法
如上所述，在一些实施方案中，被固定在颗粒或多个颗粒的表面上的药剂是抗体或其抗原结合片段。抗体可以通过本领域已知的方法被引发。例如，可以用免疫原性形式的可溶生物分子(例如，可溶TNFR、毒素或病毒蛋白)免疫哺乳动物(如小鼠、仓鼠或兔子)。可替换地，可以通过使用在体内表达生物分子(例如可溶蛋白质)的核酸进行免疫，从而产生观察到的免疫原性应答。赋予蛋白质或肽免疫原性的技术包含与载体的接合或本领域公知的其它技术。例如，本发明的多肽的肽基部分可以在佐剂的存在下被施用。通过检测血浆或血清中的抗体滴度可以监测免疫进展。标准ELISA或其他免疫测定可与作为抗原的免疫原一起使用以评估抗体水平。
免疫之后，可以获得与本发明的多肽反应的抗血清，如果需要，也可以获得从血清中分离出的多克隆抗体。为了产生单克隆抗体，产生抗体的细胞(淋巴细胞)可以从免疫动物被收获，并通过标准体细胞融合过程与永生化细胞(如骨髓瘤细胞)融合以产生杂交瘤细胞。这样的技术在本领域中是公知的，并且包含例如杂交瘤技术(最初由Kohler和Milstein开发，(1975)Nature,256:495-497)、作为人B细胞杂交瘤技术(Kozbar et al.,(1983)Immunology Today,4:72)和用于产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole et al.,(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.pp.77-96)。可以免疫化学筛选杂交瘤细胞以产生与本发明的多肽特异性地反应的抗体和分离的单克隆抗体。
VI.颗粒清除率
在一些实施方案中，颗粒包括清除剂。清除剂可以通过生物学途径促进颗粒的清除，如通过尿液中***、降解、通过肝胆途径***和/或吞噬作用。
例如，颗粒可以包括储存器，其中所述储存器包括清除剂。储存器可以是颗粒体中的孔或孔隙，例如多孔硅颗粒体中的孔隙。
对于包括孔的颗粒，储存器可以是孔，或者储存器可以大于或小于平均孔尺寸。储存器可以由颗粒体中的凹部(例如浅凹部)组成，其中凹部的宽度或直径大于平均孔尺寸的宽度或直径。储存器的宽度或直径可以是平均孔尺寸的宽度或直径的至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、250、300、400或甚至是约500倍。储存器的宽度或直径可以是平均孔尺寸的宽度或直径的约2倍至约10倍，如约2倍至约8倍或约2倍至约6倍。储存器的宽度或直径可以是平均孔径的宽度或直径的约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、250、300、400或甚至是约500倍。
储存器可以包括开口。开口可被盖或构件覆盖，从而抑制清除剂与细胞和/或胞外蛋白(例如，抗体)之间的相互作用。盖或构件可以包括聚合物，如可生物降解的聚合物。盖或构件可以在预定时间段后降解(例如通过水解)，从而将清除剂暴露于细胞和/或胞外蛋白。盖或构件可以在暴露于生物流体(如血浆或细胞外液)约1天至约5年后(如约1天至约3年或约1天至约1年)降解。
预定时间段可以是颗粒处于液体(例如，水液体)中的时间段。预定时间段可以是颗粒体内滞留的时间段(例如，暴露于生物流体、pH、酶和/或温度)。可以通过将颗粒结合至生物分子至少部分地来确定预定时间段。例如，颗粒可以被配置以致于生物分子的结合将清除剂暴露于细胞和/或胞外蛋白(参见例如PCT专利申请公开号WO2014/170899，其以引用方式并入本文)。预定时间段可以是约1天至约5年，如约1天至约3年或约1天至约1年。
美国专利号7,918,842描述了适合用作盖或膜的示例性材料，其以引用方式并入本文。通常，这些材料通过酶水解或在体内或体外暴露于水或通过表面或体积侵蚀而降解或溶解。代表性的合成的可生物降解的聚合物包含：聚(酰胺)，如聚(氨基酸)和聚(肽)；聚(酯)，如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(己内酯)；聚(酸酐)；聚(原酸酯)；聚(碳酸酯)；及其化学衍生物(化学基团的取代、添加，例如烷基、亚烷基、羟基化、氧化和本领域技术人员常规制备的其它修饰)、其共聚物和混合物。可用于盖或膜的其它聚合物包含：聚(醚)，如聚(环氧乙烷)、聚(乙二醇)和聚(四氢呋喃)；乙烯基聚合物-聚(丙烯酸酯)和聚(甲基丙烯酸酯)，如甲基、乙基、其它烷基、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸和甲基丙烯酸，以及其他，如聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)和聚(醋酸乙烯酯)；聚(氨酯)；纤维素及其衍生物，如烷基、羟烷基、醚、酯、硝化纤维素和各种醋酸纤维素；聚(硅氧烷)；及其任何化学衍生物(化学基团的取代、添加，例如，烷基、亚烷基、羟基化、氧化和本领域技术人员常规制备的其它修饰)、其共聚物和混合物。在某些实施方案中，储存器盖由一种或更多种交联聚合物(如交联的聚乙烯醇)形成。
在一些实施方案中，颗粒包括覆层。在一些实施方案中，覆层包括清除剂。覆层可以遮蔽清除剂。
颗粒可以包括第一表面和第二表面；药剂可以被固定在第一表面上；并且覆层可以覆盖第二表面的至少一部分。第一表面可以是内表面或内部表面，例如，第一表面可以被定向以致于药剂具有降低的结合至细胞表面上的分子的能力。内表面或内部表面的实施例包含孔、储存器或管的内壁、环形线圈的内周表面或凹面的中空。内表面或内部表面的其它实施例包含颗粒的外部表面，其中通过一个或更多个突起来保护外表面免受与细胞的相互作用。第二表面可以是外表面，例如，第二表面可以被定向以致于覆层可以与细胞相互作用。
覆层可以抑制颗粒之间的相互作用，例如，覆层可以降低颗粒形成聚集体的倾向。覆层可以抑制颗粒与细胞之间的相互作用，例如，通过呈现生物惰性表面。覆层可以抑制与胞外分子的非特异性的相互作用，例如，生物分子的非特异性的吸附。覆层可以抑制与细胞或胞外分子的特异性的相互作用，例如，覆层可能不利于或延缓颗粒的***或吞噬作用。覆层可以靶向颗粒以进行***或吞噬作用。靶向颗粒以进行***或吞噬作用的覆层或其他特征(例如，“***诱导化合物”)可以通过延缓颗粒的***或吞噬作用的覆层(例如，第二覆层)被遮蔽，例如，以促进血流中的颗粒维持预定量的时间。
颗粒可以包括第二覆层，例如，其中第二覆层由第二多个覆层分子组成。颗粒可以包括第二多个覆层分子。第二覆层和/或第二多个覆层分子可以减小颗粒的体内清除率，例如，通过遮蔽覆层和/或多个覆层分子。第二覆层和/或第二多个覆层分子可以是可生物降解的，例如，在预定时间段后将覆层和/或多个覆层分子暴露于细胞和/或胞外蛋白。第二覆层和/或第二多个覆层分子可以包括可生物降解的聚合物，例如第二多个覆层分子的每个分子可以包括可生物降解的聚合物。第二覆层和/或第二多个覆层分子可以包括抑制吞噬作用的CD47。
在一些实施方案中，颗粒包括第一表面(例如，内表面)和第二表面(例如，外表面)；药剂被固定在第一表面上；并且覆层覆盖第二表面的至少一部分。第一表面的定向可以降低药剂与细胞表面上的分子相互作用的能力。第二表面的定向可以允许覆层与细胞、胞外分子和/或不同颗粒之间的相互作用。覆层与细胞、胞外分子和/或不同颗粒之间的“相互作用”可以是弱的、中性的或不利的相互作用，例如，不利于颗粒与细胞、胞外分子或其它颗粒的稳定结合。可替换地，覆层与细胞和/或胞外分子之间的相互作用可以是特异性的或被设计的相互作用，例如，有利于通过生物学途径(如吞噬作用)进行颗粒的清除。在某些优选实施方案中，第二表面基本上不含药剂。在某些优选实施方案中，第一表面基本上不含覆层。在某些优选实施方案中，覆层覆盖基本上全部的第二表面。
在一些实施方案中，颗粒包括第一表面(例如，内表面)和第二表面(例如，外表面)；药剂被固定在第一表面和第二表面上；并且覆层覆盖第二表面的至少一部分。在这样的实施方案中，覆层(和/或第二覆层)可以抑制药剂与细胞表面上的分子之间的相互作用。在某些优选实施方案中，覆层覆盖基本上全部的第二表面。
在一些实施方案中，颗粒包括第一表面(例如，内表面)和第二表面(例如，外表面)；药剂被固定在第一表面上；并且覆层覆盖第一表面的至少一部分和第二表面的至少一部分。在这样的实施方案中，覆层优选地不会影响药剂特异性地结合至生物分子的能力。在某些优选实施方案中，覆层覆盖基本上全部的第二表面。
在一些实施方案中，颗粒包括表面；药剂被固定在表面上；并且覆层覆盖表面的至少一部分。在这样的实施方案中，覆层可以不影响药剂特异性地结合至生物分子的能力。覆层可以允许药剂中的一些特异性地结合至生物分子并抑制药剂中的一些与生物分子之间的相互作用。覆层可以抑制药剂与细胞表面上的分子之间的相互作用。在某些优选的实施方案中，覆层覆盖基本上全部的表面。
覆层可以包括覆层分子，例如，覆层可以由多个覆层分子组成，或覆层可以由覆层分子群组成。如本文中使用的，术语“多个覆层分子”和“覆层分子群”每个都是指覆层。然而，术语“覆层”可以是指附加的组合物，如水凝胶。覆层分子可以是清除剂(并且因此清除剂可以是覆层分子)。
颗粒可以包括多个覆层分子。颗粒可以包括表面和被固定在所述表面上的多种药剂，并且多个覆层分子中的至少一个分子可以被结合至表面。例如，多个覆层分子的全部或基本上全部的分子可以被结合至表面。
颗粒可以包括表面和第二表面，其中被固定在表面上的多种药剂和多个覆层分子中的至少一个分子可以被结合至第二表面。例如，多个覆层分子的全部或基本上全部的分子可以被结合至第二表面。在一些实施方案中，多个覆层分子中的一些分子被结合至表面，并且多个覆层分子中的一些分子被结合至第二表面。
在一些实施方案中，覆层分子增加颗粒的体内清除率。例如，覆层分子可以包括病原体相关分子模式。
在一些实施方案中，本文中描述的颗粒具有包括***诱导化合物的覆层，所述***诱导化合物促进从循环中去除颗粒，例如，通过肾脏、肝脏/肠(例如，通过胆汁)，或吞噬作用(例如，通过抗原递呈细胞)。多个覆层分子可以是多种***诱导化合物。例如，在其中颗粒是环形的实施方案中，内周表面(例如，第一表面)可以包括被固定的药剂，并且外部表面(例如，第二表面)可以包括诱导颗粒清除的化合物，例如，通过肾脏、肝脏或巨噬细胞。在一些实施方案中，***诱导化合物被编程。也就是说，化合物可以被覆层覆盖，所述覆层随时间(例如，预定量的时间)降解(例如，通过酶的作用、水解或逐渐溶解)，最终暴露***诱导化合物或提高清除率的其它特征。在暴露于生物流体(例如，血浆或细胞外液)约1天至约5年(如约1天至约3年或约1天至约1年)后，覆层可以降解。因此，可以修饰和/或控制颗粒的体内滞留。
覆层可以包括有机聚合物，如聚乙二醇(PEG)。有机聚合物可以附于颗粒，例如，附于颗粒的表面。有机聚合物可以包含PEG、聚乳酸酯(polylactate)、聚乳酸、糖、脂质、聚谷氨酸、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚醋酸乙烯酯(PVA)及其组合。在某些实施方案中，颗粒与PEG共价共轭，所述PEG不利于血清蛋白的吸附，促进有效的尿***并减小颗粒的聚集(参见，例如，Burns et al.Nano Letters,9(1):442-448(2009)以及美国专利申请公开号2013/0039848和2014/0248210，其中的每个以引用方式被并入本文)。
在一个实施方案中，覆层包括至少一个亲水部分，例如，普朗尼克
Figure BDA0001311699010000191
型聚合物(具有通式HO(C2H4O)a(-C3H6O)b(C2H4O)aH)的非离子聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)、三嵌段共聚物聚(乙二醇-b-(DL-乳酸-共-乙醇酸)-b-乙二醇)(PEG-PLGA-PEG)、二嵌段共聚物聚己内酯-PEG(PCL-PEG)、聚(偏二氟乙烯)-PEG(PVDF-PEG)、聚(乳酸-共-PEG)(PLA-PEG)、聚(甲基丙烯酸甲酯)-PEG(PMMA-PEG)等。在具有这样的部分的实施方案中，亲水部分是PEG部分，如：[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]-三甲氧基硅烷(例如，CH3(OC2H4)6-9(CH2)OSi(OCH3)3)、[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]-二甲氧基硅烷(例如，CH3(OC2H4)6-9(CH2)OSi(OCH3)2)或[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]-甲氧基硅烷(例如，CH3(OC2H4)6-9(CH2)OSi(OCH3))。合适的覆层描述于例如美国专利申请公开号2011/0028662(其以引用方式并入本文)。
覆层可以包含聚羟基聚合物，如天然聚合物或含羟基聚合物，所述含羟基聚合物包含多羟基聚合物、多糖、碳水化合物、多元醇、聚乙烯醇、聚氨基酸(如聚丝氨酸)或其它聚合物(如2-(羟乙基)甲基丙烯酸酯)或其组合。在一些实施方案中，聚羟基聚合物是多糖。多糖包含甘露聚糖、普鲁兰、麦芽糖糊精、淀粉、纤维素和纤维素衍生物、树胶、黄原胶、刺槐豆胶或果胶、其组合(参见，例如，美国专利申请公开号2013/0337070，其以引入方式并入本文)。
在一些实施方案中，覆层包括两性离子聚合物(参见，例如，美国专利申请公开号2014/0235803、2014/0147387、2013/0196450和2012/0141797；以及美国专利号8,574,549，其中的每个以引用方式被并入本文)。
其它合适的覆层包含聚α羟基酸(包含聚乳酸或聚丙交酯、聚乙醇酸或聚乙交酯)、聚-β羟基酸(如聚羟基丁酸酯或聚羟基戊酸酯)、环氧聚合物(包含聚氧化乙烯(PEO))、聚乙烯醇、聚酯、聚原酸酯、聚酰胺酯、聚酯酰胺、聚磷酸酯和聚磷酸酯-聚氨酯。可降解的聚酯的实施例包含：聚(羟基链烷酸酯)，包含聚(乳酸)或(聚丙交酯，PLA)、聚(乙醇酸)或聚乙交酯(PGA)、聚(3-羟基丁酸酯)、聚(4-羟基丁酸酯)、聚(3-羟基戊酸酯)和聚(己内酯)或聚(戊内酯)。聚氧杂酯的实施例包含聚(亚烷基草酸酯)(如聚(草酸乙烯酯))和含酰氨基的聚氧杂酯。其它合适的覆层材料包括包含聚乙二醇的聚醚、醚-酯共聚物(共聚(醚-酯))和聚碳酸酯。可生物降解的聚碳酸酯的实施例包含聚原碳酸酯、聚亚氨基碳酸酯、聚烷基碳酸酯(如聚(三亚甲基碳酸酯))、聚(1,3-二氧环己烷-2-酮)、聚(对二氧环己酮)、聚(6,6-二甲基-1,4-二氧环己烷-2-酮)、聚(1,4-二氧环庚烷-2-酮)和聚(1,5-二氧环庚烷-2-酮)。合适的可生物降解的覆层还可以包含聚酸酐、聚亚胺(如聚(乙烯亚胺)(PEI))、聚酰胺(包含聚-N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺)、聚(氨基酸)(包含聚赖氨酸(如聚-L-赖氨酸)或聚谷氨酸(如聚-L-谷氨酸))、聚磷腈(如聚(苯氧基-共-羧基苯氧基磷腈)、聚有机磷腈、聚氰基丙烯酸酯和聚氰基丙烯酸烷基酯(包含聚氰基丙烯酸丁酯)、聚异氰酸酯和聚乙烯吡咯烷酮。
聚合的覆层分子的链长可以是约1至约100个单体单元，如约4至约25个单元。
颗粒可以用天然存在的聚合物(包含纤维蛋白、纤维蛋白原、弹性蛋白、酪蛋白、胶原、壳聚糖、胞外基质(ECM)、角叉菜胶、软骨素、果胶、藻酸盐、藻酸、白蛋白、糊精、葡聚糖、明胶、甘露醇、正卤胺、多糖、聚-1,4-葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉(HES)、二醛淀粉、糖原、淀粉酶、羟乙基淀粉酶、支链淀粉、葡萄糖-聚糖、脂肪酸(及其酯)、透明质酸、鱼精蛋白、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、D-甘露糖醛酸、L-古洛糖酸、玉米醇溶蛋白和其他醇溶谷蛋白、藻酸、瓜尔豆胶和磷酸胆碱、以及其共聚物及衍生物)盖覆。覆层还可以包括改性多糖，如纤维素、壳多糖、葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、聚葡萄糖酸酯、透明质酸和盐酸高飞燕草碱(elatin)，以及其共聚物及衍生物。
颗粒可以用水凝胶盖覆。水凝胶可以例如使用选自任何合适的聚合物(如聚(羟烷基(甲基)丙烯酸酯)、聚酯、聚(甲基)丙烯酰胺、聚(乙烯基吡咯烷酮)或聚乙烯醇)的基础聚合物形成。交联剂可以是过氧化物、硫、二氯化硫、金属氧化物、硒、碲、二胺、二异氰酸酯、二硫化烷基苯、二硫化四乙基秋兰姆、4,4’-二硫代***啉、对奎宁二肟和四氯对苯醌中的一种或更多种。此外，含硼酸的聚合物可以被并入水凝胶中，并具有可选的可光聚合性基团。
在某些优选的实施方案中，覆层包括被美国食品和药物管理局(FDA)批准使用的材料。这些FDA批准的材料包含聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚糖乳酸复合物910(每丙交酯单元包括比率为9:1的乙交酯，也称为VICRYLTM)、聚葡糖酸酯(每三亚甲基碳酸酯单元包括9:1比率的乙交酯，也称为MAXONTM)和聚二氧环己酮(PDS)。
覆层与颗粒的附着可以通过共价键或非共价键实现，如通过离子键、氢键、疏水键、配位、粘合剂或物理吸收或相互作用。
常规纳米颗粒盖覆方法包含干法和湿法。干法包含：(a)物理气相沉积(Zhang,Y.et al.Solid State Commun.115:51(2000))，(b)等离子体处理(Shi,D.etal.Appl.Phys.Lett.78:1243(2001)；Vollath,D.et al.J.Nanoparticle Res.1:235(1999))，(c)化学气相沉积(Takeo,O.et al.J.Mater.Chem.8:1323(1998))以及(d)用于基质内原位沉淀纳米颗粒的聚合或非聚合有机材料的热解(Sglavo,V.M.et al.J.MaterSci.28:6437(1993))。用于盖覆颗粒的湿法包含：(a)溶胶-凝胶法以及(b)乳化和溶剂挥发法(Cohen,H.et al.Gene Ther.7:1896(2000)；Hrkach,J.S.et al.Biomaterials 18:27(1997)；Wang,D.et al.J.Control.Rel.57:9(1999))。可以通过电镀、喷涂、浸涂、溅射、化学气相沉积或物理气相沉积来盖覆覆层。此外，用多糖盖覆各种纳米颗粒的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号8,685,538和美国专利申请公开号2013/0323182，其中的每个以引用方式被并入本文)。
在一些实施方案中，颗粒可以适于通过肾***促进清除。具有正常肾功能的受试者的肾清除通常需要至少一个维度小于15nm的颗粒(参见，例如，Choi,H.S.,et al.NatBiotechnol 25(1):1165(2007)；Longmire,M.et al.,Nanomedicine 3(5):703(2008))。然而，较大的颗粒可以在尿液中被***。对于其中颗粒对于肾清除太大的实施方案，颗粒则可以在体内降解到更小尺寸后被清除。
在一些实施方案中，颗粒可以适于通过肝胆***促进清除。包含在肝脏中的枯否细胞的单核吞噬***(MPS)涉及肝摄取和随后的纳米颗粒的胆汁***。已知纳米颗粒的某些尺寸和表面性质可增加肝脏中MPS的摄取(参见Choi et al.,J.of DispersionSci.Tech.24(3/4):475-487(2003)；和Brannon-Peppas et al.,J.Drug DeliverySci.Tech.14(4):257-264(2004)，其中的每个以引用方式被并入本文)。例如，已知增加颗粒的疏水性可增加MPS的摄取。因此，本领域普通技术人员可以选择具有某些特征的颗粒以调节胆汁***。肝胆***允许比可以通过肾脏******的颗粒稍微大的颗粒(例如，10至20nm)的***。对于其中颗粒对于肝胆***太大的实施方案，则颗粒可以在体内降解到更小尺寸后被清除。在这样的实施方案中，通过肝胆***促进清除的覆层可以覆盖颗粒内部表面的一部分，以致于覆层在颗粒降解后变得暴露。颗粒可以包括覆盖表面的一部分的多个覆层分子，例如，疏水性分子。表面可以在颗粒降解后被暴露，以允许被降解的颗粒的清除。
在一些实施方案中，颗粒适于通过吞噬作用促进清除。例如，颗粒可以包括清除剂，其中清除剂包括病原体相关分子模式，例如，通过巨噬细胞用于识别。病原体相关分子模式(PAMPs)包含未甲基化的CpG DNA(细菌)、双链RNA(病毒)、脂多糖(细菌)、肽聚糖(细菌)、脂***甘露糖(细菌)、酵母聚糖(酵母)、支原体脂蛋白(如MALP-2(细菌))、鞭毛蛋白(细菌)、聚(肌苷酸-胞苷酸)酸(细菌)、脂磷壁酸(细菌)和咪唑喹啉(合成)。在优选的实施方案中，PAMP清除剂被遮蔽，以致于巨噬细胞在颗粒结合至一个或更多个靶标之前不会吞噬所述颗粒。例如，PAMP清除剂可以被任何一种上述覆层(例如，聚合的覆层，如可生物降解的聚合的覆层)遮蔽。巨噬细胞可以吞噬与20μm一样大的颗粒(参见，例如，Cannon,G.J.andSwanson,J.A.,J.Cell Science 101:907-913(1992)；Champion,J.A.,et al.Pharm Res25(8):1815-1821(2008))。在一些实施方案中，通过吞噬作用促进清除的清除剂可以覆盖颗粒的内部表面的一部分，以致于清除剂在颗粒降解后变得暴露。颗粒可以包括覆盖表面的一部分的多种清除剂，例如，PAMPs。表面可以在颗粒降解后暴露，以允许被降解的颗粒的清除。清除剂可以覆盖表面的一部分，所述表面与包括药剂的表面重叠。清除剂(例如，PAMPs)可以引发针对颗粒的免疫应答，例如在第二覆层的降解之后或在颗粒降解之后。
在一些实施方案中，针对清除剂(例如，PAMPs)的免疫应答可以超过针对药剂和/或药剂/生物分子复合物的免疫应答，从而抑制或延缓针对药剂和/或药剂/生物分子复合物的免疫应答的开始。例如，颗粒的降解可以将清除剂和药剂(和/或药剂/生物分子复合物)两者暴露于白细胞。PAMP清除剂可以允许由巨噬细胞快速清除被降解的颗粒，从而延缓针对药剂和/或药剂/生物分子复合物的免疫应答(例如，B细胞介导的免疫应答)。
清除剂可以是诱导吞噬作用的钙网蛋白。
在一些实施方案中，颗粒可以在约1天至约5年(如约1天至约3年，或约1天至约1年)内被生物体清除。
VII.给药方法
本公开预期本文描述的组合物(例如，本文描述的任何大体或具体地描述的颗粒或多个颗粒)可以在体外和/或体内被施用于细胞和组织。体内给药包含对疾病的动物模型的给药，如癌症的动物模型，或对有需要的受试者的给药。合适的细胞、组织或受试者包含动物，如伴侣动物、家畜、动物园动物、濒危物种，稀有动物、非人灵长类动物和人类。示例***动物包含狗和猫。
为了在体外递送，如对培养物中的细胞或组织和/或在培养物中的细胞或组织的周围，可以将组合物加入到培养基中，如接触微环境或接触培养基中的可溶材料或接触细胞甚至渗透细胞。期望的活性部位影响用于施用组合物(例如，本文中描述的颗粒)的递送机制和方式。
为了在体内递送，如对体内细胞或组织(包含对细胞和组织的微环境)和/或对有需要的受试者，可以想到许多给药方法。可以基于颗粒组合物和特定的应用和患者来选择特定的方法。各种递送***是已知的并且可以用于施用本公开的药剂。任何这样的方法可以用于施用本文中描述的任何药剂。引入方法可以是肠内或肠胃外，包含但不限于，皮内、肌内、腹膜内、心肌内、静脉内、皮下、肺、鼻内、眼内、硬膜外和口服途径。本公开的组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或弹丸式注射(bolus injection)、通过凭借上皮或皮肤粘膜衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性药剂一起(同时或连续地)被施用。给药可以是***的或局部的。
在某些实施方案中，组合物通过静脉内被施用，如通过弹丸式注射或输注。在某些实施方案中，组合物在口腔、皮下、肌内或腹膜内被施用。
在某些实施方案中，将本公开的组合物局部施用于需要治疗的区域(例如，肿瘤部位，如通过注射到肿瘤中)可以是符合期望的。
肝脏是转移的常见部位。因此，在某些实施方案中，本文中描述的组合物的递送指向肝脏。例如，静脉导管可以放置在肝门静脉中以递送本公开的药剂至肝脏。经由肝门静脉递送的其它方法同样被预期。
在某些实施方案中，本公开的组合物通过静脉内输注被施用。在某些实施方案中，组合物在至少10、至少15、至少20或至少30分钟的时间段内输注。在其他实施方案中，药剂在至少60、90或120分钟的时间段内输注。在某些实施方案中，无论输注时间段，本公开预期每次输注是总体治疗计划的一部分，其中根据规律的时间表(例如，每周、每月等)施用药剂一段时间。然而，在其它实施方案中，组合物通过弹丸式注射递送，例如，作为整体治疗计划的一部分，其中根据规律的时间表施用药剂一段时间。
对于前述任何一种，预期了本公开的组合物(包含一种药剂或两种或更多种这样的药剂的组合)可以通过任何合适的途径或方法在体外或体内被施用。组合物可以作为治疗方案的一部分被施用，其中组合物被一次或多次施用，包含根据特定的时间表施用。此外，预期了本公开的组合物将被配制适用于给药途径和特定的应用。本公开预期了前述特征的任何组合，以及与本文中描述的本公开的任何方面和实施方案的组合。
前述适用于单独使用或组合使用的以及用于本文中描述的任何方法的本公开的任何组合物(例如，颗粒或多个颗粒)。本公开具体地预期了本公开的这样的组合物的特征、组合物以及本部分和具有针对以下描述的各种药物组合物和给药途径的特征的方法的任何组合。
VIII.药物组合物
在某些实施方案中，本公开的主题颗粒或多个颗粒与药学上可接受的载体被配制。一种或更多种组合物(例如，包括本文中描述的颗粒或多个颗粒)可以单独或作为药物制剂(组合物)的组分被施用。如本文中描述的，本文大体或具体地描述的本公开的任何组合物可以被配制。在某些实施方案中，组合物包含两种或更多种本公开的颗粒或与第二治疗剂配制的本公开的颗粒。
本公开的组合物可以以任何方便的方式被配制用于人或兽用药物的给药。润湿剂、乳化剂和润滑剂(如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)、以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、风味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
主题颗粒或多个颗粒的制剂包含例如适用于口服、鼻腔、局部、胃肠外、直肠和/或***内给药的那些。制剂可以方便地以单位剂量形式存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂量形式的活性成分的量将根据待治疗的宿主和给药的具体方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂量形式的活性成分的量将通常是产生治疗效果的化合物的量。
在某些实施方案中，制备这些制剂或组合物的方法包含组合一种或更多种颗粒和载体以及可选的一种或更多种辅助成分。通常，制剂可以用液体载体或细分散的固体载体或两者制备，然后如果需要的话，可以使产品成形。
用于口服给药的制剂可以是胶囊、扁囊剂、药丸、片剂、糖锭(使用风味基，通常为蔗糖和***胶或黄芪胶)、散剂、颗粒剂的形式，或作为水性液体或非水性液体中的溶液或悬混剂，或作为水包油或油包水液体乳剂，或作为酏剂或糖浆，或作为锭剂(使用惰性基，如明胶和甘油，或蔗糖和***胶)和/或作为漱口水等，每一种均含有预定量的本公开的颗粒。除了活性化合物之外，悬混剂可以还包含悬浮剂如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和山梨糖醇酯、微晶纤维素、氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶及其混合物。
在用于口服给药的固体剂型(胶囊、片剂、药丸、糖衣丸、散剂、颗粒剂等)中，本公开的一种或更多种组合物可与一种或更多种药学上可接受的载体混合，如柠檬酸钠或磷酸氢钙、和/或以下任何一种：(1)填充剂或增充剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合剂，如，例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或***胶；(3)湿润剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，如季铵化合物；(7)润湿剂，如，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，如白陶土和膨润土粘土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物；和(10)着色剂。在胶囊、片剂和药丸的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。类似类型的固体组合物也可以用作软和硬填充的明胶胶囊中的填充剂，所述胶囊使用诸如乳糖或乳糖之类的赋形剂，以及高分子量聚乙二醇等。用于口服给药的液体剂型包含药学上可接受的乳剂、微乳液、溶液、悬混剂、糖浆和酏剂。除了活性成分之外，液体剂型可以包含本领域通常使用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包含佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、风味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
在某些实施方案中，本公开的方法包含局部对皮肤或粘膜(如在子宫颈和***上的那些)给药。局部制剂可以还包含一种或更多种已知作为皮肤或角质层渗透增强剂有效的各种各样的助剂。这些的实施例是2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇、甲醇或异丙醇、二甲亚砜和氮酮。还可以包含附加的助剂以使制剂在美容上可接受。这些的实施例是脂肪、蜡、油、染料、香料、防腐剂、稳定剂和表面活性剂。也可以包含本领域已知的角质层分离剂。实施例是水杨酸和硫磺。用于局部或经皮给药的剂型包含散剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、药物贴片和吸入剂。本公开的主题药剂可以在无菌条件下与药学上可接受的载体混合，以及与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。除了本公开的主题药剂之外，软膏、糊剂、乳膏和凝胶可以包含赋形剂，如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌，或其混合物。除了本公开的主题药剂之外，散剂和喷雾剂可以包含赋形剂，如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂可以另外包含常规推进剂，如氯氟烃和挥发性未取代的碳氢化合物，如丁烷和丙烷。
适合于非消化道给药的药物组合物可以包括一种或更多种本公开的组合物与一种或更多种药学上可接受的无菌等张水性溶液或非水性溶液、分散液、悬混液或乳剂或无菌散剂的组合，所述无菌散剂可以仅在使用之前重新配制成无菌可注射溶液或分散液，所述无菌散剂可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、溶质，所述溶质与预期的受者的血液或悬混剂或增稠剂等张。可以用于本公开的药物组合物中的合适的水性载体和非水性载体的实施例包含水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。例如通过使用覆层材料(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
这些组合物可以还包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包含各种抗菌和抗真菌剂(如尼泊金、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来确保预防微生物活动。将等张剂(如糖、氯化钠等)包含在组合物中也可以是符合期望的。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延缓吸收的药剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
通过在可生物降解的聚合物(如聚交酯-聚乙交酯)中形成一种或更多种颗粒的微囊剂基质来制备可注射的药性持久的形式。取决于药物与聚合物的比率以及所使用的特定的聚合物的性质，可以控制释药速率。其它可生物降解的聚合物的实施例包含聚(原酸酯)和聚(酸酐)。药性持久的可注射的制剂也通过将药物包埋在与身体组织兼容的脂质体或微乳剂中来制备。
在优选的实施方案中，本公开的组合物根据常规程序被配制为适于对人或动物(如伴侣动物)静脉内给药的药物组合物。必要时，组合物也可以包含增溶剂和局部麻醉剂(如利多卡因)以缓解注射部位的疼痛。当通过输注施用组合物时，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分发。当通过注射施用组合物时，可以提供安瓿的无菌注射用水或盐水，以致于成分可以在给药前被混合。
在另一个实施方案中，将本文中描述的组合物(例如，颗粒或多个颗粒)配制用于皮下、腹膜内或肌内对人或动物(如伴侣动物)给药。
在某些实施方案中，本公开的药剂和颗粒被配制用于局部递送至肿瘤，如用于对瘤内注射的递送。
在某些实施方案中，组合物旨在通过肝门静脉局部对肝脏给药，并且可以相应地配制药剂和颗粒。
在某些实施方案中，特定的制剂适合于在经由多于一种途径递送的情况下使用。因此，例如，适于静脉内输注的制剂也可以适合于经由肝门静脉递送。然而，在其它实施方案中，制剂适合于在一种递送途径的情况下使用，但不适合于在第二递送途径的情况下使用。
本公开的将有效治疗病况(如癌症)，和/或将有效中和可溶TNFR，和/或将有效减小可溶TNFR的量或可溶TNFR的TNFα结合活性，特别是存在于肿瘤微环境中和可选地在血浆中的可溶TNFR，和/或将有效抑制体外或体内肿瘤细胞增殖、生长或存活的药剂或颗粒的量可以通过标准临床技术或实验室技术来确定。此外，可以可选地使用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还将取决于给药途径和病况的严重程度，并且应该根据医师的判断和每个受试者的情况来决定。用于对人或动物给药的有效剂量可以从来自体外或动物模型测试***的剂量效应曲线外推。
在某些实施方案中，本公开的组合物(包含药物制剂)是非热原的。换句话说，在某些实施方案中，组合物基本上是无热原的。在一个实施方案中，本公开的制剂是无热原的制剂，所述无热原的制剂基本上不含内毒素和/或相关的热原物质。内毒素包含被限制于微生物内并且只有当微生物破裂或死亡时才被释放的毒素。热原物质还包含来自细菌的外膜和其他微生物的发热诱导的热稳定物质(糖蛋白)。如果对人施用，这些物质都会引起发热、低血压和休克。由于潜在的有害影响，必须从通过静脉内施用药物溶液中去除即使是少量的内毒素。食品和药物管理局(“FDA”)对在静脉内的药物应用的一个小时内每千克体重的每份剂量设定了5个内毒素单位(EU)的上限(美国药典委员会，药典论坛26(1):223(2000))。当以相对大的剂量和/或跨延长的时间段(例如，如对于患者的整个寿命)施用治疗蛋白质时，即使少量的有害和危险的内毒素可能也是危险的。在某些具体实施方案中，组合物中的内毒素和热原水平小于10EU/mg，或小于5EU/mg，或小于1EU/mg，或小于0.1EU/mg，或小于0.01EU/mg，或小于0.001EU/mg。
前述内容适用于本公开的任何药剂、本文中描述的组合物和方法。本公开具体地预期了本文中描述的本公开的药剂、组合物和方法(单独或组合)的特征与针对本部分及以上所述的各种药物组合物和给药途径所描述的特征的任何组合。
本公开提供了适合用于本公开的方法(“本公开的药剂”)的药剂和药剂的类别的很多概述和具体的实施例。本公开预期了任何这样的药剂或药剂的类别可以如本文中描述的被配制用于体外或体内给药。
此外，在某些实施方案中，本公开预期了组合物，包含药物组合物，所述药物组合物包括与一种或更多种药学上可接受的载体和/或赋形剂配制的本文中描述的本公开的任何药剂。可以使用本文中提供的本公开的药剂的任何功能和/或结构特征来描述这样的组合物。可以以本公开的任何方法在体内或体外使用任何这样的组合物或药物组合物。
类似地，本公开预期了本公开的分离的或纯化的药剂。基于本文中描述的药剂的任何功能和/或结构特征描述的本公开的药剂可以作为分离的药剂或纯化的药剂被提供。这样的分离的或纯化的药剂在体外或体内具有很多用途，包含用于本文中描述的任何体外或体内方法。
IX.应用
本文中描述的组合物(例如，颗粒和其药物组合物)在各种各样的诊断和治疗应用中是有用的。例如，本文中描述的颗粒可以用于治疗癌症、使受试者解毒或治疗病毒或细菌感染。
治疗应用包含使用各种各样的部分取决于于给药途径的方法将一种或更多种本文中描述的组合物施用于受试者(例如，人受试者)。途径可以是，例如，静脉内注射或输注(IV)、皮下注射(SC)、腹腔内(IP)注射或肌肉注射(IM)。
可以通过例如局部输注、注射或借助于植入物实现给药。植入物可以是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜，如硅橡胶膜或纤维。植入物可以被配置为用于持续的或定期的释放组合物至受试者。参见例如美国专利申请公开号20080241223；美国专利号5,501,856、5,164,188、4,863,457和3,710,795；EP488401和EP430539，其中的每一个的公开内容以引用方式被整体并入本文。组合物可以通过基于例如扩散的、易受侵蚀的或对流的***的可植入装置(例如渗透泵、可生物降解的植入物、电扩散***、电渗***、蒸气压泵、电解泵、泡腾泵、压电泵、基于腐蚀的***或机电***)递送至受试者。
如本文中使用的，在体内环境中，术语“有效量”或“治疗有效量”意味着足以治疗、抑制或减轻待治疗的病症的一种或更多种症状或以另外的方式提供期望的药物和/或生理作用(例如，调节(例如增强)对抗原的免疫应答)的剂量。精确的剂量将根据各种各样的因素而变化，如取决于受试者的变量(例如，年龄、免疫***健康等)、疾病和正在进行的治疗。
如本文中使用的，哺乳动物可以是人、非人灵长类(例如，猴子、狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠或小鼠。在一些实施方案中，哺乳动物是婴儿(例如，人类婴儿)。
如本文中使用的，“需要预防”、“需要治疗”或“有需要”的受试者哺乳动物是指由适当的医师(例如，在人的情况下是医生、护士或护师；在非人类哺乳动物的情况下是兽医)的判断，将合理地从给定的治疗中获益的那些。
术语“预防”是本领域公认的，并且当与病况相关使用时，在本领域中是很好理解的，并且包含组合物的给药，相对于不接收组合物的受试者，所述组合物降低受试者哺乳动物中的身体状况的症状的频率或延缓症状的开始。
本文中描述的任何组合物的合适的人剂量还可以在例如I期剂量扩大研究中被评价。参见，例如，van Gurp et al.(2008)Am J Transplantation 8(8):1711-1718；Hanouska et al.(2007)Clin Cancer Res 13(2,part 1):523-531；和Hetherington etal.(2006)Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(10):3499-3500。
这样的组合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物(例如，癌症、毒性或感染的动物模型)中的已知药物程序来确定。这些程序可以用于例如测定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，所述治疗指数可以表达为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的药剂是优选的。虽然表现出毒性副作用的组合物可以被使用，但应该注意，应设计将这样的化合物靶向受影响组织的部位的递送***，并最小化对正常细胞的潜在损伤，从而降低副作用。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以被用于配制用于人的剂量范围。这样的组合物的剂量通常在组合物的循环浓度的范围内，所述组合物的循环浓度包含具有很少或没有毒性的ED50。剂量可以根据所用的剂型和使用的给药途径在这个范围内变化。最初可以从细胞培养测定估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以获得循环血浆浓度范围，所述循环血浆浓度范围包含在细胞培养中测定的IC50(即实现症状的半最大抑制的抗体的浓度)。这样的信息可以被用于更精确地确定人的有用剂量。血浆中的水平可以例如通过高性能液相色谱来测量。在一些实施方案中，例如，当需要局部给药时，可以使用细胞培养或动物模型来确定在局部部位内获得治疗有效浓度所需的剂量。
在本文中描述的任何方法的一些实施方案中，颗粒可以与一种或更多种附加的治疗剂(例如，用于治疗感染或治疗癌症的治疗剂)共同施用于哺乳动物。
在一些实施方案中，可以使用不同的给药途径向哺乳动物施用颗粒和附加的治疗剂。例如，附加的治疗剂可以皮下或肌内施用，并且颗粒可以通过静脉内施用。
X.与肿瘤相关的选择的应用
在一些实施方案中，本文中描述的颗粒可以用于治疗患有癌症的受试者。用于本文中描述的颗粒组合物的示例性药剂和/或可以被这样的颗粒清除的可溶生物分子在本文中描述(例如表2)并且是本领域已知的。例如，能够清除sTNFR、MMP2、MMP9、sIL-2R、sIL-1受体等的颗粒可用于通过缓解免疫去抑制来治疗癌症和/或增强对癌症的免疫应答。
免疫治疗的免疫去抑制途径在某种程度上基于许多癌症患者通常总体上具有免疫学能力，但他们的免疫***在他们的肿瘤的微环境中被局部抑制的概念。如果通过施用本公开的颗粒减轻免疫***的这种抑制，则患者自身的免疫***可以作用于肿瘤。因此，在某些实施方案中，本公开的颗粒提供免疫治疗途径，而无需通过添加意图结合细胞表面受体以引发免疫应答的外源性活性细胞因子来超刺激患者的免疫***，和/或无需以其他方式超刺激患者的免疫***。
不受理论束缚，因为癌症患者通常具有免疫学能力，淋巴细胞识别肿瘤抗原的能力一般不受肿瘤的影响。因此，淋巴细胞被吸引到肿瘤微环境中，就像对任何异常的细胞群集一样，在该点细胞因子和细胞毒性因子(如肿瘤坏死因子(TNF，如TNFα、免疫***的主要细胞毒性“sword”))从淋巴细胞切割到微环境中。如果是病毒感染的细胞而非癌细胞，TNF(如TNFα)将占用(engage)被感染的细胞表面上的TNF受体(TNFR)，导致由细胞凋亡或氧化应激产生的快速破坏，这取决于用于TNF的R1或R2型受体是否被占用。换句话说，在不被肿瘤和/或肿瘤抗原的存在刺激的正常免疫应答的情况下，淋巴细胞部署的TNF将可被利用结合细胞表面TNF受体(R1和/或R2受体)作为增加免疫应答的一部分。即使在肿瘤的情况下，淋巴细胞被部署到肿瘤部位。
然而，许多类型的癌细胞与其他异常的细胞类型(如病毒感染的细胞)表现不同，因为它们过度产生TNF受体(两种类型均是)并将它们排出到肿瘤周围的云状物(cloud)中。因此，癌细胞和/或肿瘤的微环境包含大量的可溶TNF受体。不受理论的束缚，肿瘤微环境中的可溶TNF受体水平超过了健康细胞(如相同组织类型的健康细胞)的微环境中发现的水平。额外地或可替换地，TNF受体排出的速率和程度对于癌细胞来说比从健康细胞更大。此外，不受理论的束缚，在某些实施方案中，癌症患者的血浆中发现的可溶TNF受体的水平可以高于健康患者(healthy patients)。
不管何种机制，在这个模型中，这些排出的可溶TNF受体结合至由被募集的淋巴细胞内生地释放的TNF，中和内生的TNF并且有效地创建肿瘤周围免疫特权的泡状区(bubble)，在所述泡状区之内肿瘤继续生长并且排出更多的TNF受体。换句话说，排出的可溶TNF受体吸收由淋巴细胞内生地产生的TNFα，并且阻止或抑制TNF结合癌细胞上的细胞表面TNF受体。这减小或消除可被利用于结合癌细胞上的细胞表面TNF受体的TNF。可溶TNF受体实质上超出结合至TNFα，因此减小了TNF的活性，如用于结合细胞表面TNF受体的TNFα。
上述情况可以类似地在IL-2和排出的可溶IL-2受体的情况下完成。
本公开提供了药理学途径，所述药理学途径可以被***地或局部地部署以减轻由癌症中的排出的受体产生的免疫***的抑制(例如，免疫去抑制)。本公开提供了用于减小可溶TNF受体和/或可溶IL-2受体(或导致免疫去抑制的任何其他可溶生物分子)(如在癌细胞和肿瘤的微环境中)的量和/或活性(例如，中和活性)的方法和组合物。不受理论的束缚，减少例如可溶TNF受体(例如，如在肿瘤微环境中)的量和/或活性可以被用作抑制细胞(如癌细胞)增殖、生长或存活的方法的一部分。在某些实施方案中，它可以用于抑制细胞(如癌细胞)的存活。本文中描述了示例性方法和药剂。
调节性T细胞(TREGs)可以分泌与癌细胞相同的配体，作为抑制免疫应答的方式，以避免例如由过度活性化T细胞或延长的T细胞功能引起的自身免疫疾病。例如，CD80/B7-1和CD86/B7-2结合至T细胞上的CTLA-4受体并抑制T细胞活性。本文中描述的颗粒不阻滞CTLA-4受体，而是可以被设计为清除CD80/B7-1和/或CD86/B7-2。同样，本文中描述的颗粒可以被设计成清除其它免疫检查点抑制剂(如PD-1L)，例如，使用包括PD-1受体的颗粒。与刺激免疫***治疗癌症的其他途径相比，这样的颗粒组合物提供了几个好处。
在一些实施方案中，受试者是患有、被怀疑患有或有发展癌症的风险的受试者。在一些实施方案中，受试者是被怀疑患有或有发展自身免疫疾病的风险的受试者。
如本文中使用的，“有风险发展”癌症的受试者是具有发展癌症的一个或更多个(例如，二、三、四、五、六、七、八个或更多个)危险因素的受试者。例如，有发展癌症风险的受试者可能具有发展癌症的倾向(即，发展癌症的遗传易感性，如肿瘤抑制基因(例如，BRCA1、p53、RB或APC中的突变)或已经暴露于可以导致病况的条件下。因此，当受试者已经暴露于某些化合物(例如，香烟烟雾中的致癌化合物，如丙烯醛、砷、苯、苯并蒽、苯并芘、钋210(氡)、尿烷或氯乙烯)的诱变或致癌水平时，受试者可以是“有发展癌症的风险”的受试者。此外，当受试者已经暴露于例如大剂量的紫外光或X射线照射，或暴露(例如感染)于引起肿瘤的/肿瘤相关的病毒(如***瘤病毒)、EB病毒、B型肝炎病毒或人T细胞白血病淋巴瘤病毒，受试者可以是“有发展癌症的风险”。癌症是一类疾病或病症，其特征在于，不受控制的细胞***及其通过入侵直接生长进入相邻组织中或通过远处转移(其中癌细胞通过血流或淋巴***转运)植入到远隔的部位来扩散的能力。癌症可以影响所有年龄段的人，但风险有随着年龄增加的趋势。癌症的类型可以包含，例如肺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌、神经组织癌(例如，恶性胶质瘤，如多形成性胶质细胞瘤)、黑素瘤、甲状腺癌、卵巢癌、睾丸癌、***癌、***、***癌或膀胱癌。
类似地，有发展感染风险的受试者是具有增加暴露于病原微生物的可能性的一个或更多个危险因素的受试者。
“被怀疑患有”癌症或感染的受试者是具有癌症或感染的一种或更多种症状的受试者。应当理解，有发展的危险或被怀疑患有癌症或感染的受试者不包含感兴趣物种内的所有受试者。
在一些实施方案中，所述方法包含确定受试者是否患有癌症或自身免疫疾病。
XI.与炎症和自身免疫病症相关的选择的应用
在一些实施方案中，本文中描述的颗粒可以用于治疗炎性病症和/或自身免疫病症。可用于本文中描述的颗粒组合物的示例性药剂和/或可以被这样的颗粒清除的可溶生物分子在本文中描述(例如表2)并且是本领域已知的。例如，能够清除细胞因子(例如，TNFα或白介素，如IL-2、IL-6或IL-1)或趋化因子(例如，CXCL8或CXCL1)的颗粒可以用于治疗各种各样的自身免疫和/或炎性病症。
在一些实施方案中，自身免疫或炎性病症是超敏反应。如本文中使用的，“超敏反应”是指不期望的免疫***应答。超敏反应分为四类。I型超敏反应包含过敏(例如，特应性反应、过敏性反应或哮喘)。II型超敏反应是细胞毒性的/抗体介导的(例如，自身免疫溶血性贫血、血小板减少症、胎儿成红细胞增多病或肺出血肾炎综合症)。III型是免疫复合物疾病(例如，血清病、阿蒂斯反应或SLE)。IV型是延迟型超敏反应(DTH)，细胞介导的免疫记忆应答和抗体无关(例如，接触性皮炎、结核菌素皮试或慢性移植排斥)。如本文中使用的，“过敏”是指通过IgE肥大细胞和嗜碱粒细胞的过度激活为特征的病症。在某些情况下，通过IgE的肥大细胞和嗜碱粒细胞过度激活导致(部分或全部)炎性应答。在某些情况下，炎症应答是局部的。在某些情况下，炎症应答导致气道变窄(即支气管缩小)。在某些情况下，炎症应答导致鼻子中的炎症(即鼻炎)。在某些情况下，炎症应答是全身性的(即过敏反应)。
XII.与病原体和毒素相关的选择的应用
在一些实施方案中，本文中描述的颗粒可以被设计成结合至微生物(例如，病毒或细菌)或微生物的组分(如内毒素)。因此，本文中描述的颗粒可以用于治疗，例如传染病(例如，病毒感染性疾病，包含HPV、HBV、丙型肝炎病毒(HCV)、逆转录酶病毒(如人体免疫缺损病毒(HIV-1和HIV-2))、疱疹病毒(如EB病毒(EBV))、巨细胞病毒(CMV)、HSV-1和HSV-2以及流感病毒。此外，包含细菌、真菌和其他致病性感染，如曲霉属真菌、布鲁格丝虫属、假丝酵母、衣原体、球虫亚纲、隐球菌、恶丝虫属、***、组织胞浆菌属、利什曼虫、分枝杆菌、支原体、草履虫属、百日咳、疟原虫、肺炎球菌、肺囊虫属、立克次体、沙门氏菌、志贺氏杆菌、葡萄球菌、链球菌、弓形虫和霍乱弧菌。示例性物种包含淋病奈瑟氏菌、结核分枝杆菌、白念珠菌、热带假丝酵母、***毛滴虫、***嗜血杆菌、B族链球菌、人支原体(Microplasma hominis)、杜氏嗜血菌、***、***、***、流产布鲁杆菌、羊布鲁氏杆菌、猪布鲁氏菌、犬布氏杆菌、胎儿弯曲菌属、胎儿弯曲菌肠亚种单、钩端螺旋体、单核细胞增多性李斯特氏菌、绵羊布鲁氏杆菌、鹦鹉热衣原体、胎毛滴虫、弓形虫、大肠杆菌、马驹放线杆菌、羊流产沙门菌、马流产沙门菌、铜绿假单胞菌、马棒状杆菌、化脓棒状杆菌、精氨酸放线杆菌、牛生殖道支原体、烟曲霉菌、分棘状棘子须霉菌、马媾疫锥虫、巴西贝虫、破伤风芽孢梭菌、肉毒杆菌；或真菌，如，例如，巴西芽生菌；或其他病原体，例如，恶性疟原虫。还包含国家过敏和传染病研究所(NIAID)优先病原体。这些包含A类药剂，如天花(天花)、炭疽杆菌(炭疽)、鼠疫耶尔森菌(鼠疫)、肉毒杆菌毒素(肉毒中毒)、土拉弗朗西斯菌(土拉菌病)、丝状病毒属(埃博拉出血热、马尔堡出血热)、沙状病毒属(拉沙热(拉沙热))、Junin(阿根廷出血热)和相关病毒；B类药剂，如伯纳特氏立克次氏体(Q fever)、布鲁氏菌(普鲁氏菌病)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(鼻疽)、甲病毒(委内瑞拉脑脊髓炎、东部和西部马脑脊髓炎)、来自蓖麻(蓖麻籽)的蓖麻毒素、蓖麻毒素产气荚膜梭菌；葡萄球菌肠毒素B、沙门氏菌属、痢疾志贺氏菌、大肠杆菌菌株O157:H7、霍乱弧菌、隐孢子虫；C类药剂，如尼帕病毒、汉坦病毒、蜱传播出血热病毒、蜱传脑炎病毒、黄热病和多重耐药性结核病；蠕虫，如血吸虫和绦虫；和原生动物，例如，利什曼原虫(例如，墨西哥利什曼原虫)和疟原虫。
XIII.施用药剂的药盒
在某些实施方案中，本公开还提供包括填充有本公开的至少一种组合物(例如，颗粒或多个颗粒)的一个或更多个容器的药物包装或药盒。可选地与这样的一个或多个容器相关联的可以是由管理制造、使用或销售药物或生物制品的政府机构规定的形式的通知，所述通知反映(a)用于人给药的制造、使用或销售机构的批准，(b)使用说明，或两者均具备。
在某些实施方案中，药盒包含附加的材料以便利主题药剂的递送。例如，药盒可以包含导管、管、输液袋、注射器等中的一种或更多种。在某些实施方案中，组合物(例如，包括本文中描述的颗粒)以冻干形式包装，并且药盒包含至少两个容器：包括冻干组合物的容器和包括适量的水、缓冲液或适合于重构冻干材料的其它液体的容器。
上述适用于本文中描述的任何组合物和方法。本公开具体地预期了这样的组合物和方法(单独或组合)的特征与用于描述本节中描述的各种药盒的特征的任何组合。
在考虑以下实施例时，将进一步理解本公开的这些和其它方面，所述实施例旨在说明本公开的某些特定实施方案，但不旨在限制本公开的范围，本公开的范围由权利要求书限定。
范例
实施例1-用于治疗癌症的方法
人类患者由医师鉴定为患有排出可溶TNFR或可溶IL-2R的癌症(例如，肺癌、结肠癌、乳腺癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌或血液癌)。患者被施用包括以有效治疗癌症的量结合至并且隔离可溶TNFR或IL-2R的颗粒(本文中描述的)的组合物。可选地，患者被给予组合物的“维持剂量”以维持对可溶TNFR或IL-2R的作用的抑制，从而继续增强患者中对癌症的免疫监视。
实施例2-使人解毒的方法
存在具有与肉毒毒素相关的毒性症状的人类患者。患者被施用包括以有效改善与毒性相关的一种或更多种症状的量结合至并且隔离可溶肉毒毒素的颗粒(本文中描述)的组合物。
实施例3-用于治疗病毒性感染的方法
人类患者被医师鉴定为患有HIV-1感染。患者被施用包括以有效降低患者循环中病毒滴度的量结合至并且隔离可溶HIV-1病毒粒子的颗粒(本文中描述)的组合物。患者被给予组合物的“维持剂量”以维持HIV-1病毒粒子滴度的降低，从而抑制患者的感染，以及降低病毒传播至另一个的可能性。
实施例4-制造硅颗粒的方法
多孔硅盘被制造具有1000nm×400nm以及1000nm×800nm的尺寸和可变的孔尺寸。盘的尺寸和形貌以及孔直径通过扫描电子显微镜进行表征。金纳米颗粒(Au)沉积在多孔硅盘的孔中。肿瘤坏死因子(TNFs)通过配位共价键与金纳米颗粒的表面接合。评估配体密度和TNF-Au结合稳定性。
实施例5-制造聚合物颗粒的方法
通过乳状液制备聚(交酯-共-乙交酯)(PLGA)颗粒。PLGA颗粒的尺寸和形貌通过扫描电子显微镜、原子力显微镜和透射电子显微镜来表征。颗粒用季铵β-环糊精盖覆，用于巨噬细胞募集(即吞噬)。通过原子力显微镜和透射电子显微镜验证覆层。覆层密度和均匀性通过透射电子显微镜和动态光散射进行表征。
将β-环糊精盖覆的PLGA颗粒与巨噬细胞一起温育，并且通过荧光显微镜和流式细胞仪监测吞噬作用。
β-环糊精盖覆的PLGA颗粒用聚乙二醇(PEG)和硫醇部分的共混物盖覆，以允许阻止巨噬细胞吸收的调理素作用和逃避，以及结合至其他颗粒。PEG和硫醇覆层的均匀性和密度通过原子力显微镜进行表征。覆层稳定性通过将颗粒在介质中温育不同的时间段进行表征。如上文中描述的，通过将颗粒与巨噬细胞一起温育，在不同的时间点监测颗粒的逃避和吸收。
用肿瘤坏死因子(TNF)盖覆PLGA颗粒，并且颗粒通过二硫键组合以形成“海绵”，所述“海绵”包括在海绵的内表面上的TNF。海绵的外表面可选地被不包括TNF的颗粒封闭，以阻止海绵的TNF与细胞之间的相互作用。
实施例6-基于聚合物的颗粒的药代动力学
实施例5的海绵(即，包括实施例5的“海绵”(如103至1012海绵)的组合物)通过静脉内或瘤内施用至原发性和转移性癌症的小鼠模型以及健康对照。通过确定每个给药途径的LD50来确定海绵的毒性。通过LC/MS和ICP针对每种给药途径监测海绵血浆浓度来确定海绵的半衰期。通过采取小鼠的活组织检查和通过LC/MS、ICP和共聚焦显微镜分析海绵组织及其组分来确定海绵的生物分布。
实施例7-基于聚合物的颗粒的功效
实施例5的海绵(即，包括实施例5的“海绵”(如103至1012海绵)的组合物)施用至包括MDA-MB-231或4T1异种移植的小鼠。MDA-MB-231模型被用于评估肿瘤尺寸和生长的降低，4T1模型被用于评估转移的抑制。海绵被每周一次持续6周瘤内施用至MDA-MB-231小鼠，并且定期监测体重和肿瘤尺寸。海绵被每周一次持续6周静脉内施用至4T1小鼠，并且监测转移的数量。
实施例8-基于硅/金的颗粒的药代动力学和功效
用实施例5的多孔硅颗粒重复实施例6和7的实验。
虽然本公开已经参考其具体实施方案被描述，但本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变并且可以取代以等同物。此外，可以进行许多修改使特定情况、材料、物质的组成、过程、工艺步骤或多个步骤适合于本公开的目标、精神和范围。所有这样的修改被意图在本公开的范围之内。

Claims (77)

1.一种颗粒，所述颗粒具有至少一个表面以及被固定在所述表面上的药剂，其中：
所述药剂选择性地与细胞膜结合蛋白的可溶形式结合；并且
所述颗粒包括覆层，其中：
(i)所述覆层抑制所述药剂与细胞表面上的分子的结合；并且
(ii)所述覆层延缓所述颗粒从受试者的血流清除。
2.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述细胞是人的细胞。
3.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述覆层抑制所述药剂与细胞表面上表达的细胞膜结合蛋白的结合。
4.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述药剂是所述细胞膜结合蛋白的配体。
5.根据权利要求4所述的颗粒，其中所述药剂是所述细胞膜结合蛋白的天然配体。
6.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述细胞膜结合蛋白的所述可溶形式是细胞表面受体蛋白。
7.根据权利要求6所述的颗粒，其中所述细胞表面受体蛋白在细胞表面上被激活时诱导细胞凋亡。
8.根据权利要求6所述的颗粒，其中所述细胞表面受体蛋白是肿瘤坏死因子受体(TNFR)蛋白。
9.根据权利要求6所述的颗粒，其中所述细胞表面受体蛋白是Fas受体蛋白。
10.根据权利要求6所述的颗粒，其中所述细胞表面受体蛋白是TNF相关凋亡诱导配体受体(TRAILR)蛋白、4-1BB受体蛋白、CD30蛋白、EDA受体蛋白、HVEM蛋白、淋巴毒素β受体蛋白、DR3蛋白或TWEAK受体蛋白。
11.根据权利要求6所述的颗粒，其中所述细胞表面受体蛋白是白介素受体蛋白。
12.根据权利要求11所述的颗粒，其中所述白介素受体蛋白是IL-2受体蛋白。
13.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述药剂是抗体、抗体的生物分子结合片段、非抗体支架蛋白、小分子、大环化合物、多肽、蛋白质、肽、拟肽化合物、适配子、核酸或核酸类似物。
14.根据权利要求13所述的颗粒，其中所述药剂是抗体或抗体的生物分子结合片段。
15.根据权利要求14所述的颗粒，其中所述药剂是抗体的生物分子结合片段，并且所述生物分子结合片段选自Fab片段、F(ab)2片段、scFv片段和结构域抗体。
16.根据权利要求13所述的颗粒，其中所述药剂是非抗体支架蛋白。
17.根据权利要求13所述的颗粒，其中所述药剂是白介素蛋白或其变体。
18.根据权利要求17所述的颗粒，其中所述白介素蛋白是IL-2蛋白或其变体。
19.根据权利要求13所述的颗粒，其中所述药剂包括肿瘤坏死因子(TNF)家族配体或其变体。
20.根据权利要求19所述的颗粒，其中所述TNF家族配体是TNFα或其变体。
21.根据权利要求19所述的颗粒，其中所述TNF家族配体选自Fas配体、淋巴毒素、淋巴毒素α、淋巴毒素β、4-1BB配体、CD30配体、EDA-A1、LIGHT、TLA1、TWEAK、TNFβ、TRAIL和前述任一项的变体。
22.根据权利要求6所述的颗粒，其中所述药剂不激活细胞表面上表达的所述细胞表面受体蛋白。
23.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒是立方体的或球形的。
24.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒是多孔的并且包括外表面和所述颗粒的孔的多个内表面。
25.根据权利要求24所述的颗粒，其中所述药剂被固定在所述多个内表面上。
26.根据权利要求24所述的颗粒，其中多个孔具有至少50nm的横截面尺寸。
27.根据权利要求26所述的颗粒，其中所述多个孔具有至少100nm的横截面尺寸。
28.根据权利要求23所述的颗粒，其中所述颗粒是球形的，并且所述颗粒还包括从所述颗粒的球形表面延伸的两个相交的脊，并且其中所述脊被确定尺寸并且被定向以抑制被固定在所述球形颗粒的表面上的所述药剂与细胞表面上的所述细胞膜结合蛋白结合。
29.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒是环形的。
30.根据权利要求29所述的颗粒，其中所述药剂被固定在所述颗粒的内周表面上。
31.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒的直径不大于300nm。
32.根据权利要求31所述的颗粒，其中所述颗粒的直径不大于250nm。
33.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒是锥体的、四面体的、六面体的、八面体的、十二面体的或二十面体的。
34.根据权利要求23所述的颗粒，其中所述颗粒包括至少一个从所述颗粒的顶点中的至少一个向外的突起。
35.根据权利要求34所述的颗粒，其中所述颗粒包括多于一个的从所述颗粒的顶点向外的突起。
36.根据权利要求23所述的颗粒，其中所述颗粒包括一个或更多个向外的凸起，并且其中所述一个或更多个突起被确定尺寸并且被定向以抑制被固定在所述球形颗粒的表面上的所述药剂与细胞表面上的所述细胞膜结合蛋白结合。
37.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒被成形并且被确定尺寸以在受试者的脉管***中循环。
38.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒的最长尺寸不大于1μm。
39.根据权利要求38所述的颗粒，其中所述颗粒的所述最长尺寸不大于750nm。
40.根据权利要求39所述的颗粒，其中所述颗粒的所述最长尺寸不大于500nm。
41.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒的最小尺寸至少是300nm。
42.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒包括多种药剂，其中所述多种药剂由10至109种药剂组成。
43.根据权利要求42所述的颗粒，其中所述多种药剂由103至107种药剂组成。
44.根据权利要求43所述的颗粒，其中所述多种药剂由104至106种药剂组成。
45.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒包括多于一种药剂。
46.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒包括至少两种药剂，每种药剂能够选择性地与不同的细胞膜结合蛋白的可溶形式结合。
47.根据权利要求46所述的颗粒，其中所述颗粒的所述表面包括多个地址，每个地址包括不同的药剂。
48.根据权利要求1所述的颗粒，所述颗粒的本体包括氧化铝、金属、玻璃、二氧化硅、乳胶、塑料、琼脂糖、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯或聚合物。
49.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒包括硅。
50.根据权利要求49所述的颗粒，其中所述硅是多孔硅。
51.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述覆层包括多个覆层分子。
52.根据权利要求51所述的颗粒，其中所述多个覆层分子中的至少一个分子被结合至所述颗粒的所述表面。
53.根据权利要求52所述的颗粒，其中所述多个覆层分子抑制所述药剂与细胞表面上的分子的相互作用。
54.根据权利要求53所述的颗粒，所述颗粒还包括第二表面，其中所述多个覆层分子的至少一个分子被结合至所述第二表面。
55.根据权利要求54所述的颗粒，其中所述多个覆层分子包括聚合物。
56.根据权利要求55所述的颗粒，其中所述聚合物包括聚醚、聚-α羟基酸、聚-β羟基酸、糖、脂质、聚乙烯醇、聚酯、聚原酸酯、聚酰胺酯、聚磷酸酯、聚磷酸酯-聚氨酯或其组合。
57.根据权利要求55所述的颗粒，其中所述聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚谷氨酸、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚醋酸乙烯酯(PVA)、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯或其组合。
58.根据权利要求55所述的颗粒，其中所述聚合物是可生物降解的聚合物。
59.根据权利要求58所述的颗粒，其中所述聚合物在暴露于生物流体从1天至4年的时间段后生物降解。
60.根据权利要求59所述的颗粒，其中所述聚合物在暴露于生物流体从1天至1年的时间段后生物降解。
61.根据权利要求51所述的颗粒，其中所述多个覆层分子包括钙网蛋白。
62.根据权利要求51所述的颗粒，其中所述多个覆层分子包括疏水分子。
63.根据权利要求51所述的颗粒，其中所述多个覆层分子减小体内所述颗粒的清除率。
64.根据权利要求63所述的颗粒，其中所述多个覆层分子是可生物降解的。
65.一种组合物，所述组合物包括多个根据权利要求1-64中任一项所述的颗粒。
66.一种药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载体以及权利要求1至64中任一项所述的颗粒。
67.一种已填充的注射器，所述注射器包括根据权利要求66所述的药物组合物。
68.权利要求1-64中任一项所述的颗粒在制造用于抑制受试者中的可溶生物分子的生物活性的药物中的应用。
69.权利要求1-64中任一项所述的颗粒在制造用于治疗患有癌症的受试者的药物中的应用，所述癌症包括癌细胞，所述癌细胞排出可溶形式的至少一种细胞因子受体。
70.根据权利要求69所述的应用，其中所述癌细胞排出可溶形式的TNF受体。
71.根据权利要求70所述的应用，其中所述颗粒包括药剂，所述药剂包括TNFα多肽或其变体。
72.根据权利要求69所述的应用，其中所述癌细胞排出可溶形式的IL-2受体。
73.根据权利要求72所述的应用，其中所述颗粒包括药剂，所述药剂包括IL-2多肽或其变体。
74.根据权利要求69所述的应用，其中所述受试者是哺乳动物。
75.根据权利要求74所述的应用，其中所述哺乳动物是人类。
76.权利要求1-64中任一项所述的颗粒在制造用于治疗癌症或自身免疫性疾病的药物中的应用。
77.根据权利要求76所述的应用，其中所述癌症选自肺癌、结肠癌、乳腺癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌和血液癌。
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