CN106995832A - 一种通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法 - Google Patents

一种通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法，其步骤如下：(1)选取高温豆粕为原料，打碎，过筛。(2)将高温豆粕充分溶解，进行超声波和纤维素酶酶解处理。(3)将酶解液加入蛋白酶进行酶解，酶灭活，用HCl调节为酸性，离心，取上清液调至中性。(4)将上清液过滤，取滤液加入乙醇沉淀，放置24～48小时，沉淀复溶，冷冻干燥，得粗品糖肽。(5)将粗品糖肽用缓冲液溶解，依次进行离子交换层析、透析、凝胶色谱层析，冷冻干燥，得纯品糖肽。本发明有效的利用高温豆粕，大大提升了高温豆粕的经济价值，制取的高温豆粕水溶性糖肽纯度高，在不同的pH条件下，水溶性糖肽的溶解度＞80％。

Description

一种通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶 性糖肽的方法
技术领域
本发明涉及一种利用超声波复合酶制剂制取高温豆粕水溶性糖肽的方法。
背景技术
豆粕作为大豆油脂加工的副产物，其产量巨大。近几年来，我国豆粕产量增长迅速，年复合增长率为10％左右，2015年豆粕产量为6120万吨，约占世界豆粕产量的26.92％，并且80％为高温豆粕。高温豆粕蛋白质含量为40～50％，但因高温长时间处理，使其水溶性蛋白质高度变性，导致蛋白质提取率较低，严重降低了高温豆粕深加工产品的开发及其使用价值。高温豆粕目前主要作为饲料的蛋白源应用，动物饲料的60％蛋白源来自于大豆的高温豆粕。
由于豆粕中的纤维素和果胶形成复杂的网状结构，并与蛋白质一起形成聚合物构成细胞壁，普通物理、化学或酶制剂等加工方法难以获得蛋白质。因此，提取蛋白质有效的方法是首先破坏完整的细胞壁结构，使包埋于细胞内蛋白质的溶出，提高蛋白提取率，对高温豆粕中蛋白质的开发与利用具有重要的经济价值和社会意义。近几年，从事糖肽的研究单位也多从医药角度出发，研究力量及投入较少，在食品领域中研究也较少。
发明内容
本发明为了提高高温豆粕的附加值，提供了一种工艺先进、工序合理、操作易控的通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法，包括如下步骤：
(1)原料的选取与处理
选取高温豆粕为原料，打碎，过筛，备用。
(2)超声波复合纤维素酶酶解处理
将步骤(1)中选取的高温豆粕用热水充分溶解，控制高温豆粕浓度为2～10g/100ml，进行超声波和纤维素酶酶解处理。
(3)蛋白酶酶解处理
将步骤(2)中制得的酶解液加入蛋白酶进行酶解，酶灭活，用HCl调节为酸性，离心，取上清液调至中性。
(4)粗品糖肽的制备
将步骤(3)中制得酶解上清液过滤，取滤液加入乙醇沉淀，放置24～48小时，沉淀复溶，冷冻干燥，得到粗品糖肽。
(5)纯品糖肽的制备
将步骤(4)中制得的粗品糖肽用缓冲液溶解，依次进行离子交换层析、透析、凝胶色谱层析，冷冻干燥，得到纯品糖肽。
步骤(1)中，所述的高温豆粕打碎过40～100目的筛子。
步骤(2)中，所述的热水温度为60～70℃。
步骤(2)中，所述的超声波和纤维素酶酶解处理的方法为：超声波同步纤维素酶酶解处理。
步骤(2)中，所述的超声波处理的条件为：超声功率100～400W，超声时间10～60min。
步骤(2)中，所述的纤维素酶酶解条件为：纤维素酶酶活添加量300～1500U、纤维素酶酶解pH 3.5～5.5。
步骤(3)中，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶。
步骤(4)中，所述的过滤为抽滤器过滤。
步骤(4)中，所述的乙醇为无水乙醇，滤液中乙醇终浓度为60～90％。
步骤(5)中，所述的缓冲液为0.01M Tris-HCl，pH值为7.2。
步骤(5)中，所述的离子交换层析采用DEAE Cellulose 52离子柱。
步骤(5)中，所述的凝胶色谱层析采用Sephadex G-25柱层析，用去离子水为洗脱液进行洗脱。
本发明选取高温豆粕为原料，用热水进行溶解，首先采用超声波复合纤维素酶酶解高温豆粕，高效破坏细胞壁，细胞内蛋白质的溶出，再利用蛋白酶作用条件温和，有效保持多肽的活性等特点采用蛋白酶酶解，酶解液使用乙醇沉淀获得粗品糖肽。粗品糖肽根据性状、等电点和分子量大小进行离子交换层析和凝胶色谱层析获得水溶性糖肽。
本发明有效的利用高温豆粕，大大提升了高温豆粕的经济价值，制取的高温豆粕水溶性糖肽纯度高，在不同的pH条件下，水溶性糖肽的溶解度＞80％，并且存在O-糖肽键、糖环为吡喃环、糖苷键的构型为α-型糖苷键结构的一种高品质的活性功能助剂——高温豆粕水溶性糖肽。
附图说明
图1为高温豆粕糖肽在不同pH值下的NSI；
图2为β-消除前后高温豆粕糖肽的紫外扫描图谱；
图3为高温豆粕糖肽的红外光谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
具体实施方式一：本实施方式提供了一种通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法，具体实施步骤如下：
一、原料的选取与处理
(1)选取高温豆粕为原料。
(2)将选取的高温豆粕打碎过40～100目筛子，备用。
二、超声波复合纤维素酶酶解处理
将步骤一中选取的高温豆粕调节浓度为2～10g/100ml，温度为60～70℃，pH值为7，浸泡1～3h，将充分溶解的高温豆粕溶液用HCl调节pH值为3.5～5.5，加入活化后的纤维素酶，纤维素酶添加量为300～1500U，在超声功率100～400W、超声时间10～60min的条件下进行处理，酶灭活。
三、蛋白酶酶解处理
将步骤二中制得的酶解液加入碱性蛋白酶进行酶解，控制碱性蛋白酶添加量为15000～75000U、酶解pH值为8.0～10.0、酶解时间为2.5～4.5h、酶解温度为45～65℃，酶灭活，用HCl调节为酸性，离心，取上清液调至中性。
四、粗品糖肽的制备
将步骤四中制得的酶解上清液使用抽滤器过滤，取滤液加入乙醇沉淀，滤液中乙醇终浓度为60～90％，放置24～48h，沉淀复溶，冷冻干燥，得到粗品糖肽。
五、纯品糖肽的制备
将步骤四中制得的粗品糖肽用缓冲液Tris-HCl溶解，采用DEAE Cellulose 52离子柱进行离子交换层析，用Tris-HCl含0～1mol/L NaCl缓冲液进行洗脱，收集蛋白和糖二者重合的吸收峰，透析除盐，再采用Sephadex G-25柱进行凝胶色谱层析，纯水为洗脱液，收集蛋白和糖二者重合的吸收峰，冷冻干燥，得到纯品糖肽。
本实施方式所提供的利用超声波复合酶制剂处理高温豆粕制取水溶性糖肽的方法，对高温豆粕溶液进行超声法处理，超声波可以产生强烈振动、空化效应及搅拌作用，导致细胞组织松散，促使细胞中有效成分的溶出，加入纤维素酶酶解，破会细胞壁结构，包藏在细胞内部的蛋白成分不断释放出来，再加入蛋白酶，使大分子蛋白水解成小分子肽，通过乙醇沉淀获得粗品糖肽，依据性状、等电点和分子量大小采用DEAE Cellulose 52离子交换层析和Sephadex G-25凝胶色谱层析分离纯化，获得蛋白含量为58～65％，糖含量为22～30％，在不同的pH条件下，水溶性糖肽的溶解度＞80％，并且存在O-糖肽键、糖环为吡喃环、糖苷键的构型为α-型糖苷键结构的一种高品质的活性功能助剂——高温豆粕水溶性糖肽。
具体实施方式二：本实施方式提供了一种通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法，具体实施步骤如下：
一、原料的选取与处理
(1)选取高温豆粕为原料。
(2)将选取的高温豆粕打碎过80目筛子，备用。
二、超声波复合纤维素酶酶解处理
将步骤一中选取的高温豆粕调节浓度为5g/100ml，温度为65℃，pH值为7.5，浸泡2h，将充分溶解的高温豆粕溶液，用HCl调节pH值为4.5，加入活化后的纤维素酶，纤维素酶添加量为1000U，在超声功率200W、超声时间30min的条件下进行处理，酶灭活。
三、蛋白酶酶解处理
将步骤二中制得的酶解液加入碱性蛋白酶进行酶解，控制碱性蛋白酶添加量为35000U、酶解pH值为9.0、酶解时间为3.5h、酶解温度为55℃，酶灭活，用HCl调节为酸性，离心，取上清液调至中性。
四、粗品糖肽的制备
将步骤四中制得的酶解上清液使用抽滤器过滤，取滤液加入乙醇沉淀，滤液中乙醇的终浓度为80％，放置30h，沉淀复溶，冷冻干燥，得到粗品糖肽。
五、纯品糖肽的制备
将步骤四中制得的粗品糖肽用缓冲液0.01M Tris-HCl，pH值为7.2溶解，采用DEAECellulose 52离子柱进行离子交换层析，用Tris-HCl含0.5mol/L NaCl缓冲液进行洗脱，收集蛋白和糖二者重合的吸收峰，透析除盐，再采用Sephadex G-25柱进行凝胶色谱层析，纯水为洗脱液，收集蛋白和糖二者重合的吸收峰，冷冻干燥，得到纯品糖肽。
具体实施方式三：为了更好地理解和说明本发明，本实施方式中给出了本发明所得的高温豆粕水溶性糖肽有关测试方法并进行分析：
一、溶解性的测定
将1％的样品溶液调节到pH值为3～10，37℃条件下搅拌1h，离心(12,000g，30min)取上清液，上清液中的蛋白含量采用Lowry法测定。
pH值为3～10的范围内，高温豆粕水溶性糖肽的NSI随着pH值增加，NSI呈现增大趋势，并且在不同的pH的条件下，高温豆粕糖肽都具有较高的NSI，即使在酸性条件下高温豆粕糖肽NSI＞80％。
二、高温豆粕水溶性糖肽的糖肽键特征分析
采用β-消除反应：取1mL 1mg/mL的糖肽溶液与1mL 0.4mol/L的NaOH溶液，在45℃水浴中反应2h，蒸馏水为对照组，进行紫外扫描(范围190～400nm波长)，比较β-消除反应前后的变化，以判断其糖肽键连接型式。
糖肽键是指糖链和肽链的连接键，糖基异头碳原子上的羟基与肽链氨基酸残基上的酰胺基或羟基脱水形成的糖苷键，主要有N-糖肽键和O-糖肽键两种类型。O-糖肽键在稀碱液的作用下易发生β-消去反应，与糖链连接的苏氨酸或丝氨酸发生解离，转化为α-氨基丁烯酸和α-氨基丙烯酸，从而在240nm处产生明显的紫外吸收。未经处理高温豆粕水溶性糖肽在240nm的吸光度值为0.055(紫线)，经β-消除反应处理后，240nm的吸光度升高到0.105(红线)，出现明显的特征吸收，表明高温豆粕水溶性糖肽存在O-糖肽键。
三、高温豆粕水溶性糖肽的红外光谱分析
将糖肽1mg与100mg KBr混匀，研钵中研磨10min，压制成片，在500～4000cm-1区间进行红外光谱扫描。
在1033cm-1附近有强吸收峰表示有吡喃糖基C-O-C的伸缩振动；834cm-1处吸收峰表明含有α-型糖苷键。高温豆粕水溶性糖肽的糖环为吡喃环、糖苷键的构型为α-型糖苷键结构。

Claims (10)

1.一种通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法，其特征在于所述方法步骤如下：
(1)原料的选取与处理
选取高温豆粕为原料，打碎，过筛，备用；
(2)超声波复合纤维素酶酶解处理
将步骤(1)中选取的高温豆粕用热水充分溶解，控制高温豆粕浓度为2～10g/100ml，进行超声波和纤维素酶酶解处理；
(3)蛋白酶酶解处理
将步骤(2)中制得的酶解液加入蛋白酶进行酶解，酶灭活，用HCl调节为酸性，离心，取上清液调至中性；
(4)粗品糖肽的制备
将步骤(3)中制得酶解上清液过滤，取滤液加入乙醇沉淀，放置24～48h，沉淀复溶，冷冻干燥，得到粗品糖肽；
(5)纯品糖肽的制备
将步骤(4)中制得的粗品糖肽用缓冲液溶解，依次进行离子交换层析、透析、凝胶色谱层析，冷冻干燥，得到纯品糖肽。
2.根据权利要求1所述的通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法，其特征在于所述步骤(1)中，热水温度为60～70℃，高温豆粕打碎过40～100目的筛子。
3.根据权利要求1所述的通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法，其特征在于所述步骤(2)中，超声波和纤维素酶酶解处理的方法为：超声波同步纤维素酶酶解处理。
4.根据权利要求1或3所述的通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法，其特征在于所述步骤(2)中，超声波处理的条件为：超声功率100～400W，超声时间10～60min；纤维素酶酶解条件为：纤维素酶酶活添加量300～1500U、纤维素酶酶解pH值为3.5～5.5。
5.根据权利要求1所述的通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法，其特征在于所述步骤(3)中，蛋白酶为碱性蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法，其特征在于所述步骤(4)中，过滤为抽滤器过滤。
7.根据权利要求1所述的通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法，其特征在于所述步骤(4)中，乙醇为无水乙醇，滤液中乙醇终浓度为60～90％。
8.根据权利要求1所述的通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法，其特征在于所述步骤(5)中，缓冲液为0.01M Tris-HCl，pH值为7.2。
9.根据权利要求1所述的通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法，其特征在于所述步骤(5)中，离子交换层析采用DEAE Cellulose 52离子柱。
10.根据权利要求1所述的通过超声波复合酶制剂处理高温豆粕分离纯化制备水溶性糖肽的方法，其特征在于所述步骤(5)中，凝胶色谱层析采用Sephadex G-25柱层析，用去离子水为洗脱液进行洗脱。
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