CN106995786B - 一种镰刀菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体公开一种镰刀菌菌株及其应用。通过ITS基因序列鉴定为镰刀菌Fusarium sp.，其保藏编号为CCTCC M 2016582。本发明利用失活FP‑JCCW菌体研究其对铊的吸附行为，得出最佳吸附条件：pH5.0，初始浓度100mg/L，接触时间90min，转速150r/min，生物量2.5g/L。且其吸附更符合Langmuir等温模型和二级动力学方程，为单分子层吸附，以化学吸附为主。FT‑IR、SEM、XRD表征分析显示，FP‑JCCW表面多孔隙，其对铊的吸附主要依靠细胞壁上的羟基、羰基等，且吸附前后菌体晶体结构发生变化。由此推断，失活微生物菌体FP‑JCCW吸附铊是通过静电吸附和表面络合完成。本发明提供的失活微生物FP‑JCCW可作为经济环保、可持续性的吸附剂处理重金属铊污染。

Description

一种镰刀菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及微生物及其应用，具体涉及一种镰刀菌(Fusarium sp.)菌株FP-JCCW，以及其失活微生物作为吸附剂在处理重金属铊污染中的应用。
背景技术
随着工业化进程发展，大规模矿山开采后的重金属处理问题日益凸显。重金属铊毒性强烈，易富集于硫化物，常在矿区开采时迁移，并可随着食物链进入人体，对人类生活有潜在威胁。
对于矿山开采，特别是铊矿和硫铁矿，重金属的有效处理是矿业能否可持续发展的关键。如今重金属的处理，大多以物理和化学方法为主，但两者相较于微生物处理，存在造价高、处理周期长、易造成二次污染等缺陷，且难以处理大量的低浓度污染。微生物处理是目前国内非常活跃的研究领域，如假单胞菌、高耐受性的真菌、深度絮凝微生物等微生物吸附铊的研究都取得较好的效果，其展示了良好的重金属污染处理的应用可能。然而，目前研究大都是利用活性菌株来吸附铊，关于失活微生物的吸附研究还甚少，其可忽视微生物本身对重金属的排斥等阻碍作用。
发明内容
本发明针对采用现有方法处理重金属铊污染存在的上述技术缺陷，提供一种镰刀菌(Fusarium sp.)菌株FP-JCCW，以及利用该菌株的失活微生体作为经济环保、可持续性的吸附剂处理重金属铊污染。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种镰刀菌(Fusarium sp.)菌株，所述菌株为FP-JCCW，是发明人从韶关大宝山受污染植物中筛选出的优良抗铊真菌。该菌株(生物材料)的保藏信息为：
名称：Fusarium sp.FP-JCCW；
保藏编号：CCTCC NO：M 2016582；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；
保藏地址：中国武汉市武汉大学，邮编430072；
保藏时间：2016年10月20日。
本发明通过ITS基因序列鉴定FP-JCCW菌株的分类。ITS基因PCR扩增引物为：ITS1(5‘-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。将其基因序列与NCBI数据库中的相关菌株序列进行BLAST对比，FP-JCCW菌株与镰刀菌Fusarium sp.隶属同一分支，因而将其命名为Fusarium sp.本发明已将FP-JCCW菌株的基因序列已提交NCBI的GENBANK数据库，菌株基因序列登录号为KX349437。
结合ITS基因序列的鉴定结果，本发明所述FP-JCCW菌株与镰刀菌Fusarium sp.具有极高的同源性，因而将其命名为Fusarium sp.FP-JCCW。
FP-JCCW菌株可用于制备一种吸附剂。
进一步地，利用失活的FP-JCCW菌体可制备一种吸附剂。这种吸附剂的制备方法为：将FP-JCCW菌株进行液体培养，过滤得到FP-JCCW菌丝体；然后将菌丝体置于烘箱中烘干；将烘干的菌丝体研磨成粉，得到所述吸附剂。
一些实施例中，上述吸附剂的制备方法进一步优化为：将FP-JCCW菌株进行液体培养72h，用8层纱布过滤，得到FP-JCCW菌丝体；然后将菌丝体转移到搪瓷盘中，置于80℃烘箱中进行烤烘6h；将烘干的菌丝体放置研钵里研磨成粉，得到所述吸附剂。
本发明所述吸附剂，可作为经济环保、可持续性的生物吸附材料处理重金属铊污染。
与现有技术相比，本发明至少具有下述的有益效果或优点：
(1)本发明从韶关大宝山污染矿区植物中分离筛选得到一株对铊具有较强抗性的菌株，经BLAST对比同源性，推断为镰刀菌并鉴定为Fusuraium.sp.FP-JCCW，登录号为KX349437。FP-JCCW菌株可作为经济、高效、环境友好的生物吸附材料进行重金属铊污染的处理。本发明给出了失活FP-JCCW菌株对重金属铊的吸附行为及机理，为未来铊的应用与处理提供更多理论依据。
(2)本发明明确了失活微生物FP-JCCW吸附铊的最佳吸附条件：pH5.0，初始浓度100mg/L，接触时间90min，转速150r/min，生物量2.5g/L。
(3)本发明通过建立并对比吸附的Langmuir和Freundlich模型，FP-JCCW菌株的吸附过程更符合Langmuir等温模型，说明其为单分子层吸附，可能吸附过程主要发生在细胞壁上。建立吸附一级和二级动力学方程，发现二级动力学更符合吸附过程，说明吸附过程为化学吸附主导，可能发生表面络合反应。
(4)经过红外光谱分析，在FP-JCCW菌株吸附过程中-OH、C-H、C＝O、-NH2、C-O等基团起主要贡献作用。通过SEM-EDS观察和X射线衍射分析吸附前后的失活微生物FP-JCCW，吸附前的细胞表面不平滑且有孔隙，吸附后细胞形貌有明显变化，且有晶体产生。表征分析后，更明确了FP-JCCW吸附是通过静电吸附和表面络合完成。
附图说明
图1是本发明所述FP-JCCW菌株的***发育树。
图2是实施例所述吸附试验中，pH对Tl+吸附的影响曲线。
图3是实施例所述吸附试验中，Tl+初始浓度对吸附的影响曲线。
图4是实施例所述吸附试验中，接触时间对吸附的影响曲线。
图5是实施例所述吸附试验中，摇床转速对吸附的影响曲线。
图6是实施例所述吸附试验中，生物量对吸附的影响曲线。
图7是实施例所述吸附试验中，建立的Langmuir吸附等温模型。
图8是实施例所述吸附试验中，建立的Freundlich吸附等温模型。
图9是实施例所述吸附试验中，建立的一级动力学方程。
图10是实施例所述吸附试验中，建立的二级动力学方程。
图11是本发明所述FP-JCCW菌株吸附Tl+前A和吸附后B的傅里叶红外光谱变化对比图。
图12是本发明所述FP-JCCW菌株吸附Tl+前A和吸附后B的扫描电镜变化对比图。
图13是本发明所述FP-JCCW菌株吸附Tl+前A和吸附后B的能谱仪分析图。
图14是本发明所述FP-JCCW菌株吸附Tl+前A和吸附后B的X射线衍射分析图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细阐述。
实施例1：FP-JCCW菌株的分离和鉴定
(一)FP-JCCW菌株是从韶关大宝山矿区内筛选出的抗性菌株，具体包括如下的步骤：
(1)配制培养基
PDA培养基：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，自然pH值。
PDA培养基的具体配制过程：将200g马铃薯去皮和芽眼，切成小块后放入1000mL的蒸馏水中一并煮沸至马铃薯变松软而不烂，然后用8层纱布过滤，将滤液重新倒入锅中，加入琼脂和葡萄糖均匀搅拌并补水到1000mL，最后分装于250mL的三角瓶中备用。
(2)驯化培养
将新鲜培养至对数期的内生真菌菌株制成孢子悬浮液，取1mL孢子悬浮液涂布到一定浓度含铊的固体培养基中，置于25℃恒温培养箱中培养72h，观察是否有菌落长出，如有菌落生长，则再吸取1mL孢子悬浮液接种到更高铊浓度的新鲜固体培养基中，继续培养，观察菌落生长情况,确定铊离子的最低抑制浓度。
(3)分离纯化
首先用自来水冲洗干净采集植物的根、茎、叶表面的泥沙，分别在95％乙醇和0.5％的次氯酸钠中各消毒1min，然后用灭菌生理盐水冲洗3次后用灭菌吸水纸吸干备用，并在无菌条件下切成0.5×0.5cm大小的片段接种到新鲜的PDA培养基上，反置于25℃的恒温培养箱中静止培养。培养3-7d后，若片段边缘长出菌丝，用接种针挑取边缘生长良好的菌丝接种在新的固体培养基上，待新接种的菌丝长成菌落后，再挑取其边缘的菌丝培养，如此反复纯化，得到纯化的菌株。
(二)采用ITS基因测序法对FP-JCCW菌株进行分类鉴定。
ITS基因PCR扩增引物为：ITS1(5‘-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。
扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸60s，进行34个循环，72℃延伸10min。
基因扩增产物纯化后经上海生工测序，将所得序列与GENBANK中已有的ITS序列进行BLAST对比分析，用MEGA5.2进行多重序列比对，采用Kimura-2模型建NJ(Neighbor-joining)***进化树。
将FP-JCCW菌株的DNA进行PCR扩增，并将其基因序列与NCBI数据库中的相关菌株序列进行BLAST对比。结果显示，该菌株与镰刀菌Fusarium sp.隶属同一分支，因而将其命名为Fusarium sp.，并用MEGA5.2软件构建NJ(neighbor-joining)***发育树(图1)，序列已提交NCBI的GENBANK数据库，菌株基因序列登录号为KX349437。
实施例2：FP-JCCW菌株吸附重金属铊的性能及作用机理
为了进一步明确FP-JCCW菌株对重金属铊的吸附特性和初步机理，本实施例以铊为研究对象，于不同的环境条件下研究微生物菌株对铊的吸附特性，利用电镜、红外光谱分析等方法研究菌株吸附重金属铊的初步机理。
(一)FP-JCCW菌株吸附剂的制备
将FP-JCCW菌株进行液体培养72h，用8层纱布过滤，得到FP-JCCW菌丝体。然后将菌体转移到搪瓷盘中，置于80℃烘箱中进行烤烘6h。将烘干的菌丝体放置研钵里研磨成粉，得到失活微生物FP-JCCW(吸附剂)。
这里培养FP-JCCW菌株的液体培养基为PDA液体培养基。PDA液体培养基的制备为：200g去皮马铃薯，切块放入1000ml蒸馏水煮30min，纱布过滤，加入20g葡萄糖，搅拌溶解，定容至1000ml，分装到锥形瓶，121℃灭菌30min。
(二)吸附试验方法及结果
(1)pH对Sr2+吸附的影响
在浓度为20mg/L，体积为20ml的Tl+溶液中，加入0.02g失活微生物FP-JCCW。边振荡边缓慢滴加硝酸或氢氧化钠，分别调节pH至3、4、5、6、7、8、9，30℃恒温150r/min振荡60min。吸附后的溶液8000r/min离心5min，离心后将上清液消解，测定其Tl+浓度。
pH是微生物吸附的一个重要影响因子。由图2可看出，FP-JCCW菌株吸附过程随pH的变化。在pH<5时，吸附量随pH的增大而增大，可能是因为pH过低使得水和氢离子(H3O+)占据了吸附位点，阻碍了失活微生物对Tl+的吸收。在pH＝5是吸附程度达到最高，吸附量为120.9mg/g。随后吸附量随pH增大而降低，pH增大溶液中可能形成氢氧化物胶体，而导致吸附量降低。
(2)铊初始浓度对吸附的影响
分别在浓度为20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L，体积为20ml的Tl+溶液，加入0.02g失活微生物FP-JCCW，30℃恒温150r/min振荡60min。吸附后的溶液8000r/min离心5min，离心后将上清液消解，测定其Tl+浓度。
由图3可看出，FP-JCCW的吸附量随初始浓度的增大而增大。溶液体积一定时，金属离子浓度增大，单位吸附剂吸附量也随之增大，可能是因为吸附剂的吸附位点还未被金属离子充分占据。当溶液中Tl+浓度为100mg/L时，吸附量最高为229.8mg/g。
(3)接触时间对吸附的影响
在浓度为20mg/L，体积为20ml的Tl+溶液中，加入0.04g失活微生物FP-JCCW。30℃恒温150r/min分别振荡10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min、110min、120min。吸附后的溶液8000r/min离心5min，离心后上清液消解，测定剩余Tl+浓度。
由图4可看出，吸附量皆随接触时间的的增加而增大，到90min基本到达平衡。但接触时间越长，铊离子有可能会被析出。因此90min为最佳条件，吸附量为116.8mg/g。
(4)摇床转速对吸附的影响
在浓度为20mg/L，体积为20ml的Tl+溶液中，加入0.04g失活微生物FP-JCCW。分别在30r/min、60r/min、90r/min、120r/min、150r/min、180r/min下30℃恒温振荡60min。吸附后的溶液8000r/min离心5min，离心后上清液消解，测定剩余Tl+浓度。
由图5可看出，转速小于150r/min，吸附量随着转速增大而增大。在150r/min时达吸附峰值，吸附量为117.3mg/g，之后在180r/min时吸附量突然降低。转速增大，使得铊离子与FP-JCCW菌株的接触阻力减小，与吸附位点接触的机会增多，因此吸附量增大。可转速过快，可能导致吸附剂的吸附位点受到破坏，吸附量降低。
(5)生物量对吸附的影响
在浓度为20mg/L，体积为20ml的Tl+溶液中，分别加入0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L失活微生物FP-JCCW，30℃恒温150r/min振荡60min。吸附后的溶液8000r/min离心5min，离心后上清液消解，测定剩余Tl+浓度。
由图6可看出，在生物量为0.5g/L-4g/L的范围内，吸附量随着生物量增大而增大。这可能因为生物量增多，吸附位点增多，吸附量也随之升高。生物量大于2.5g/L后，吸附量随生物量增大而降低。可能因为离子浓度不足，使得铊离子与吸附位点的吸附阻力增大。吸附量在生物量为1g/L时达到最大为117.6mg/g，是因为金属离子浓度一定，而生物量增多，所以单位吸附剂FP-JCCW的吸附量降低。
(6)等温吸附研究
根据初始浓度对吸附剂FP-JCCW的影响试验数据，建立Langmuir和Freundlich模型进行分析其吸附，分析结果如图7和图8。
由图7和图8可看出，吸附剂FP-JCCW的吸附过程更接近于Langmuir吸附等温模型，吸附剂吸附铊离子是以单分子层吸附为主。Langmuir等温线的相关系数R2为0.9911，理论吸附饱和量B＝129.87mg/g，吸附常数K＝0.0246，代入Langmuir吸附经验式Co/W＝1/KB+Co/B，得Co/W＝3.2034+0.0077Co。
(7)吸附动力学研究
根据接触时间对吸附剂FP-JCCW的影响试验数据，建立一级动力学和二级动力学方程进行分析其吸附，分析结果如图9和图10。
由图9和图10可看出，吸附剂FP-JCCW的吸附过程更符合准二级动力学拟合，吸附过程以化学吸附为主。一级动力学采用10-80min的数据进行拟合，R2＝0.9672，能较好的描述FP-JCCW吸附的初始阶段。二级动力学描述了FP-JCCW吸附全过程的状态，R2＝0.9879。因此，吸附过程是由物理吸附和化学吸附共同作用，物理吸附主要作用在吸附的初始阶段，可能发生静电吸附。而化学吸附在全过程起到了主导作用，可能发生表面络合。
(三)FP-JCCW菌株对铊的SEM及FT-IR分析
(1)红外图谱(FT-IR)分析：取烘干的吸附剂2mg加入200mg光谱纯溴化钾(质量比1:100)在玛瑙研钵中研磨，压成均匀透明的薄片，利用拉曼红外光谱仪对样品进行分析。
由图11可看出，吸附前后的FP-JCCW有着明显变化。3500cm-1附近的吸收峰从3385cm-1移到了3422cm-1，说明在铊离子的环境中细胞壁上羟基(-OH)参与了反应。2920cm-1附近的2926cm-1和2854cm-1吸收峰的强度有所变化，说明吸附过程脂碳链上碳氢键(C-H)参与了反应。1650cm-1附近的吸收峰从1624cm-1移到了1653cm-1，位于酰胺Ⅰ带，说明酰胺基上羰基(C＝O)表现活跃，参与了吸附反应。1450cm-1附近的1458cm-1吸收峰强度有明显变化，说明在铊离子的环境中氨基(-NH2)参与了反应。1088cm-1附近的吸收峰强度也有明显变化，说明是细胞壁上碳水化合物或醇上的碳氧键(C-O)收缩振动引起的。FT-IR红外分析结果表明FW-JCCW吸附铊的过程中主要有-OH、C-H、C＝O、-NH2、C-O等基团参与了反应。
(2)SEM-EDS分析：对吸附前后的菌株粉末进行预处理后，置于FEI Quanta400FEG型环境扫描电子显微镜(捷克FEI公司)下室温扫描观察，得到样品的形貌结构。
由图12可看出，FW-JCCW吸附前后的扫描电镜图有明显变化，表明失活微生物与铊离子发生了反应。吸附前可看出微生物表面不均匀，且有有孔隙结构。吸附后微生物零散的分布，周围分布着一些晶体，可能是形成了铊的化合物。
在能谱分析仪里放入与处理好的吸附前与吸附后的FP-JCCW，进行SEM和EDS分析，研究失活微生物细胞表面沉积物铊的存在。
由图13可看出，失活微生物在吸附铊离子之前，细胞表面存在C、O、P、S、Cl和K峰。在吸附过后，出现了Tl的吸收峰，同时P、S、O元素峰明显减少了，C增加了，可能表明含P、S、O的基团形成了螯合物。另外K元素峰在吸附后消失了，随之出现Na元素峰，有可能吸附与竞争性抑制钾离子有关。
(3)XRD分析：将吸附前后的菌株粉末压片后，放入D/max-2200/PC中进行X射线衍射分析。
在X射线衍射仪里放入与处理好的吸附前与吸附后的FP-JCCW，进行XRD分析。由图14可看出，FP-JCCW吸附前2θ在8.28°、19.69°、28.35°、40.68°、47.22°出现特征峰。吸附后，8.28°、19.69°两处的峰往右偏移了些许为9.03°和19.22°，且其峰值都大大增高，说明晶体结构发生变化，FP-JCCW吸附可能是通过静电吸附和表面络合。
上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Figure IDA0001139167990000011

Claims (6)

1.一种镰刀菌(Fusarium sp.)菌株，其特征在于，所述菌株为FP-JCCW，该菌株于2016年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016582。
2.一种吸附剂，其包含根据权利要求1的菌株。
3.根据权利要求2所述的吸附剂，其包含利用权利要求1的菌株制备的失活菌株。
4.根据权利要求2所述的吸附剂，其特征在于，所述吸附剂的制备方法为：将FP-JCCW菌株进行液体培养，过滤得到FP-JCCW菌丝体；然后将菌丝体置于烘箱中烘干；将烘干的菌丝体研磨成粉，得到所述吸附剂。
5.根据权利要求4所述的吸附剂，其特征在于，所述吸附剂的制备方法为：将FP-JCCW菌株进行液体培养72h，用8层纱布过滤，得到FP-JCCW菌丝体；然后将菌丝体转移到搪瓷盘中，置于80℃烘箱中进行烤烘6h；将烘干的菌丝体放置研钵里研磨成粉，得到所述吸附剂。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的吸附剂，其用于处理重金属铊污染。
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青霉菌和镰刀菌对重金属Cd2+、Cu2+、Zn2+和Pb2+的吸附特性;潘蓉等;《环境科学学报》;20100306;第30卷(第3期);参见全文 *

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