CN106978399A - nlrp3基因敲除的小鼠巨噬细胞系及构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种nlrp3基因敲除的细胞系及构建方法，该方法利用CRISPR技术将染色体基因组上NLRP3的基因一个***A而另外一个缺失AG而使得细胞完全丧失该蛋白的表达。而且该缺失细胞系形态生长速度等方面均与对照细胞无明显的差异。使用内毒素LPS能激活TNF‑α的表达，激活缺失细胞系的免疫反应，与正常细胞无显著性差异；而使用NLRP3的激活剂，其炎性小体激活的能力丧失，基本无IL‑1β的分泌。证实本发明中细胞系NLRP3功能缺失，而其它功能未受影响。综上，本发明中NLRP3缺失细胞系Nlrp3‑/‑RAW可作为研究NLRP3蛋白质功能、NLRP3炎性小体、药物负筛选的良好细胞模型。

Description

nlrp3基因敲除的小鼠巨噬细胞系及构建方法
技术领域
本发明涉及细胞系，具体地指一种nlrp3基因敲除的细胞系及构建方法。
背景技术
NLRP3也叫cryopyrin，属于NOD样受体家族(NLRs)，作为一种模式识别受体识别病原体相关分子模式，激活一种由NOD受体NLRP3、ASC受体及caspase-1所组成的蛋白复合体——炎性小体，激活下游的细胞因子IL-1β及IL-18，炎性小体的激活是重要的天然免疫反应。近十年针对NLRP3的研究也十分火热，其能识别危险信号分子如受损细胞释放的尿酸晶体及ATP，也能识别在病原感染过程中释放的穿孔毒素、某些病毒复制过程中产生的RNA等。因其受体识别的广泛性，能被多种类型的危险信号或病原体所激活，且目前已证实其在多种疾病过程中发挥重要作用。且作为炎症反应的核心，NLRP3炎症小体可能为各种炎症性疾病的治疗提供新的靶点。其在基础研究及临床疾病治疗中具有十分重要的意义。
RAW246.7是小鼠巨噬细胞的传代细胞系，在RAW246.7细胞中缺失NLRP3的表达，便于NLRP3蛋白质功能的研究。因利用CRISPR技术，对细胞的基因组进行操作，且能筛选基因敲除的细胞纯合子，利于细胞表型的稳定传代。目前虽然市面上有售人单核细胞型淋巴瘤THP1细胞中NLRP3缺失表达的细胞系，但是其未在蛋白质水平验证其缺失，且未见在鼠源细胞系中缺失nlrp3基因报道。
发明内容
本发明的目的提供了一种NLRP3基因敲除的细胞系及构建方法。本发明利用CRISPR技术靶向特异性和切割效率高的特点对细胞的基因组进行突变改造，能完全终止该基因的表达，达到敲除的效果；因其在基因组水平对细胞进行改造，且双染色体均发生突变，得到的nlrp3基因完全敲除的细胞系，而且该性状能十分稳定遗传，为进一步为研究NLRP3蛋白功能提供更可靠的细胞模型。
为实现上述目的，本发明提供的一种NLRP3表达缺失的小鼠RAW细胞系，所述细胞系的全基因组中，第11号染色体一个上的NLRP3基因的第一段外显子基因序列(NLRP3基因序列登入于NCBI，其登入号为GI:372099099，第一段外显子基因序列如SEQ IDNO.1所示，其位于NLRP3基因序列上的59543119-59543398的位点处)上***一个碱基A，造成该基因移码而提前终止表达；另外一个染色体上NLRP3基因的第一段外显子基因序列上缺失碱基AG，造成该基因不能正确表达，从而达到NLRP3基因敲除的目的。
作为优选方案，所述细胞系的全基因组中，第11号染色体一个的NLRP3基因上的第一段外显子基因序列92位点上***一个碱基A(该92位点对应于NLRP3基因上59543210位点)，另外一个染色体上NLRP3基因第一段外显子基因序列上92和93位点上碱基AG缺失(这两个位点对应于59543210和59543211位点)。
本发明还提供了一种利用CRISPR技术构建上述NLRP3基因敲除的巨噬细胞系的方法，包括以下步骤：
1)构建Lenti-V2-mN3质粒
a.根据小鼠NLRP3的，第11号染色体一个上NLRP3基因的第一段外显子基因序列(NLRP3基因序列登入于NCBI，其登入号为GI:372099099，第一段外显子基因序列如SEQIDNO.1所示，其位于NLRP3基因序列上的59543119-59543398的位点)，分析得到sgRNA序列，根据sgRNA序列的得分(图1)，选取打分最高的序列为：
GAAGATTACCCGCCCGAGAA；
b.根据LentiCRISPR V2简称Lenti-V2载体(图2)连接末端的序列特点，设计合成上下游引物序列：
mN3-1:CACCGGAAGATTACCCGCCCGAGAA，
mN3-2：AAACTTCTCGGGCGGGTAATCTTCC；
进行退火并磷酸化后得到含有粘性末端的互补片段mN3，其序列为：
5’-CACCGGAAGATTACCCGCCCGAGAA
CCTTCTAATGGGCGGGCTCTTCAAA-5’
c.将含有粘性末端的片段mN3连接到经过BsmBI消化后的Lenti-V2载体上，得到Lenti-V2-mN3质粒，测序结果显示目标序列成功连入载体。
2)转染293T细胞，获得慢病毒粒子
将293T细胞铺至6孔板中，将慢病毒包装的质粒pMD2.G、psPAX2、lenti-V2-mN3按照1：1：1，每种质粒各按照1.5μg转染细胞，其中pMD2.G能形成病毒囊膜、psPAX2能表达gag和pol进行病毒包装、lenti-V2-mN3质粒不仅含有被包装进入假病毒粒子包装信号、长末端重复序列，还含有cas9蛋白及向导RNA序列及puromycin抗性筛选基因；转染12小时后换液，质粒在细胞中表达进而包装慢病毒粒子，转染48h将细胞培养上清收集起来，12000转4度离心10分钟后，再次得到上清即为含有慢病毒粒子的悬液。
3)RAW感染慢病毒并获得单细胞克隆
a)筛选RAW细胞对抗生素puromycin的敏感浓度
puromycin抗生素在高浓度情况下对细胞存在杀伤的作用。在慢病毒感染后，相应的抗性基因***到染色体表达抗性，即为疑似阳性细胞，其携带puromycin抗性基因，能抵抗puromycin对细胞的杀伤作用。筛选出RAW敏感浓度，可以保留阳性细胞而使阴性细胞死亡。将RAW细胞铺至12孔板中，加入不同浓度的puromycin，连续每天观察细胞状态，获取能够在7天有限时间内将细胞完全杀死的抗生素的浓度。并将此浓度定为后期筛选RAW细胞的敏感浓度，实验中测试到的RAW细胞的敏感浓度为2.5μg/ml；
b)慢病毒感染，筛选发生重组的阳性细胞
使用抗生素puromycin筛选巨噬细胞RAW细胞，然后向筛选的RAW细胞传代至6孔板中，向培养孔中均加入一半体积的DMEM完全培养基和一半体积含有慢病毒粒子的悬液，RAW细胞在6孔板中培养24小时后，将细胞消化转移至新的10cm平皿中同时加入10ml新鲜培养基，并按照RAW细胞的敏感浓度，加入25ug puromycin抗生素筛选阳性细胞，即为NLRP3基因敲除的细胞系。
作为优选方案，所述步骤1)中，sgRNA序列，其序列为：GAAGATTACCCGCCCGAGAA。
作为优选方案，所述步骤2)中，退火磷酸化的引物对：
mN3-1:CACCGGAAGATTACCCGCCCGAGAA，
mN3-2：AAACTTCTCGGGCGGGTAATCTTCC。
本发明的有益效果在于：
在小鼠RAW细胞系中完全缺失NLRP3的表达，利于研究NLRP3蛋白功能的研究，利于针对NLRP3炎性小体的研究，可作为NLRP3靶标药物负筛选的细胞模型。
附图说明
图1为不同sgRNA打分情况图；
图2为lenti-V2的载体图谱图；
图3为挑选的sgRNA连接入lenti-V2后测序的结果图；
图4为pMD2.G和psPAX2的载体图谱；
图5为NLRP3在对照细胞和缺失细胞系中表达的WB检测图；
图6为设计的鉴定引物扩增出的序列片段图；
图7为细胞系NLRP3序列上出现***和缺失突变图；
图8为缺失细胞系和对照细胞形态上无明显差异图；
图9为缺失细胞系对内毒素刺激的敏感性与正常细胞差异不显著；
图10为缺失细胞系IL-1β分泌显著低于正常细胞系。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1构建NLRP3基因敲除的细胞系的方法
1)构建Lenti-V2-mN3质粒
a.根据小鼠NLRP3的cDNA的外显子1的序列(sequence 1)NLRP3基因序列登入于NCBI，其登入号为GI:372099099，第一段外显子基因序列如SEQ IDNO.1所示，其位于NLRP3基因序列上的59543119-59543398的位点处，根据预测，分析得到sgRNA，挑选打分最高的sgRNA(图1)，其序列为GAAGATTACCCGCCCGAGAA；
b.根据sgRNA的得分和Lenti-V2载体(图2)连接末端的序列特点，设计合成上下游引物序列：
mN3-1:CACCGGAAGATTACCCGCCCGAGAA，
mN3-2：AAACTTCTCGGGCGGGTAATCTTCC；
将其按照固定的程序进行退火磷酸化后形成含有粘性末端的片段mN3，其序列如下：
5’-CACCGGAAGATTACCCGCCCGAGAA
CCTTCTAATGGGCGGGCTCTTCAAA-5’
将mN3连接到经过BsmBI消化后的Lenti-V2载体上，得到Lenti-V2-mN3质粒，测序结果显示目标序列成功连入载体(图3)。
2)转染293T细胞，获得慢病毒粒子
将293T细胞铺至6孔板中，将慢病毒包装的质粒pMD2.G(图4)、psPAX2(图5)、lenti-V2-mN3按照1：1：1，每种质粒各按照1.5μg转染细胞；其中pMD2.G能形成病毒囊膜、psPAX2能表达gag和pol进行病毒包装、lenti-V2-mN3质粒不仅含有包装信号、长末端重复序列，还含有能被包装进入假病毒粒子中cas9蛋白及向导RNA序列；转染12小时后换液，一天后需补加500μl完全培养基补充营养，持续培养48小时后，
质粒在细胞中表达进而包装慢病毒粒子，转染48h将细胞培养上清收集起来，12000转4度离心10分钟后，再次得到上清即为含有慢病毒粒子的悬液。
3)RAW感染慢病毒并获得单细胞克隆
a)筛选RAW细胞对抗生素puromycin的敏感浓度
puromycin抗生素在高浓度情况下对细胞存在杀伤的作用。在慢病毒感染后，相应的抗性基因***到染色体表达抗性，即为疑似阳性细胞，其携带puromycin抗性基因，能抵抗puromycin对细胞的杀伤作用。筛选出RAW敏感浓度，可以保留阳性细胞而使阴性细胞死亡。将RAW细胞铺至12孔板中，加入不同浓度的puromycin，连续每天观察细胞状态，获取能够在7天有限时间内将细胞完全杀死的抗生素的浓度。并将此浓度定为后期筛选RAW细胞的敏感浓度，实验中测试到的RAW细胞的敏感浓度为2.5μg/ml；
b)慢病毒感染，筛选发生重组的阳性细胞
使用抗生素puromycin筛选巨噬细胞RAW细胞，然后向筛选的RAW细胞传代至6孔板中，向培养孔中均加入一半体积的DMEM完全培养基和一半体积含有慢病毒粒子的悬液，RAW细胞在6孔板中培养24小时后，将细胞消化转移至新的10cm平皿中同时加入10ml新鲜培养基，并按照RAW细胞的敏感浓度，加入25ug puromycin抗生素筛选puromycin抗性阳性细胞，即为NLRP3基因敲除的细胞系。
实施例2挑取和筛选NLRP3基因敲除的细胞系
1)扩大培养疑似正确的单细胞集落
培养NLRP3基因敲除的细胞系，在加入抗生素三天后，细胞死亡较多。此时需要换液并补加抗生素进细胞中。在培养7-10天时，会出现单个的细胞克隆。对于单细胞集落的要求应是完全独立，与周围细胞集落没有交集且相距较远。
2)单细胞集落扩大培养
在超净台中挑取1)中圈出的单集落，获取的单克隆细胞铺至24孔板中，此时细胞生长较慢。4-5天细胞会逐渐长满全孔，将长满的细胞传代，分至3个12孔板中，加入足量的培养基及抗生素，得到生长旺盛的细胞，即得到NLRP3基因敲除的细胞系。
实施例3 NLRP3基因敲除的细胞系鉴定
1、从蛋白水平细胞基因组进行鉴定
使用Western及IP裂解液提取疑似正确的细胞系总蛋白，用G250测定蛋白的浓度。配制10％的SDS-PAGE胶，加入约100μg的蛋白在80V、120V的条件下分别电泳30min和90min。电泳完毕后，使用100V的条件湿转转膜80min。用2％BSA Blocking Buffer室温轻摇封闭60min，加一抗Monoclonal ANTI NLRP3antibody produced in mouse，室温孵育120min。用含0.05％Tween-20的TBS洗膜3次后，加二抗Anti-Mouse IgG(whole-molecule)-Peroxidase,室温轻摇孵育60min。使用TBST洗膜5次以清洗掉多余的抗体，再用ECL化学发光试剂盒显色(图6)。结果显示：NLRP3的表达完全缺失。：
2、基因组水平对细胞基因组进行鉴定
使用TAKARA的全基因组提取试剂盒提取细胞基因组，提取方法如下：加入1mlDNAiso Reagent，用枪将细胞吹打至完全散开，室温静置5min；
2、离心，10000g 4℃或室温离心10min，将上清转至新的EP管中；
3、向上述裂解液中加入1中所加DNAiso Reagent的1/2体积的无水乙醇。反复颠倒混匀1-3min。4000g室温离心2min，沉淀DNA；
4、缓慢沿离心管壁加入1ml 75％乙醇(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管壁，12000g 4℃离心5min后，小心弃去乙醇；
5、重复步骤4；
6、将除去乙醇后的基因组DNA沉淀在室温下干燥5-15s(干燥时间过长，会很难溶解)，缓慢加入适量的H2O(可以是40微升)溶解DNA，得到DNA后，再以此单克隆细胞的DNA为模版，使用以下引物：
N3JDP1:CTTCGTTTTCTGGAAGTGG；
N3JDP2:AAAACCCATGGTCAGAGAA，
扩增NLRP3基因部分片段，扩增长度为936bp，扩增完成后将其连接入T载转化得到单个克隆的细菌集落，送测序，该序列为SEQ IDNO.2所示。测序结果显示，NLRP3基因的20个单克隆在PAM区域，存在两种情况的突变，蛋白表达完全缺失的细胞系的测序结果显示11号染色体的细胞系一个上的NLRP3基因上***一个碱基A造成移码突变，另外一个染色体上NLRP3基因缺失一个碱基AG，均造成细胞表达的移码突变(图7)，即可推测该细胞株中11号染色体两个NLRP3基因发生了移码突变，是造成NLRP3缺失表达的直接原因。
实施例4NLRP3基因敲除的细胞系生物学分析
1)细胞形态观察
缺失细胞细胞系与RAW同时连续传代的过程中，发现两者不仅形态上没有显著的差异，而且其生长速度相似。在连续传代十次后，检测细胞的NLRP3蛋白的表达以及对该段基因组测序，发现构建的细胞系十分稳定(图8)。
实施例5NLRP3基因敲除的细胞系功能验证
a)将Nlrp3-/-与正常的RAW细胞复苏传代一次后，取等量的Nlrp3-/-RAW与RAW细胞至12孔板中，加入LPS处理细胞，检测培养上清中分泌的TNF-α，实验结果显示在两种细胞中TNF-α的分泌量无显著差异，证实其对本实验LPS的刺激情况下，缺失细胞系TNF-α的分泌量与对照细胞无差异(图9)。
b)NLRP3炎性小体活性检测
上清中成熟形式的IL-1β的分泌量是衡量炎性小体激活的重要指标。取等量的Nlrp3-/-RAW与RAW细胞至12孔板中，按照炎性小体激活的程序处理细胞：首先将细胞用1ug/ml的LPS预处理细胞，随后加入分别激活NLRP3炎性小体穿孔毒素蛋白溶血素刺激细胞6个小时。检测上清中分泌的IL-1β，在Nlrp3-/-RAW与RAW细胞中，形成NLRP3炎性小体的能力。
检测结果中我们发现Nlrp3-/-RAW与RAW在NLRP3炎性小体激活剂处理的条件下代表炎性小体激活的IL-1β的分泌量在两种细胞中有极显著的差异(图10)，缺失Nlrp3-/-极大影响了NLRP3激动剂激活的IL-1β的分泌，进而说明Nlrp3-/-RAW缺失了nlrp3的表达，影响自身炎性小体的激活。因此，研究RAW缺失Nlrp3的细胞系，可以成为研究Nlrp3炎性小体功能的极好的模型。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> NLRP3表达缺失的细胞系及构建方法和用途
<210> 1
<211> 255
<212> DNA
<213> 第一段外显子部分基因
<400> 1
AGTGTCCGTTGCAAGCTGGCTCAGTATCTAGAGGACCTTGAAGATGTGGACCTCAAGAAATTCAAAATGCATT
TGGAAGATTACCCGCCCGAGAAAGGCTGTATCCCAGTCCCCAGGGGCCAGATGGAGAAGGCAGATCACTTGGA
TCTAGCCACACTCATGATTGACTTCAATGGCGAGGAGAAGGCCTGGGCCATGGCTGTGTGGATCTTTGCTGCG
ATCAACAGGCGAGACCTCTGGGAAAAAGCTAAGAAG
<210> 2
<211>936
<212> DNA
<213> NLRP3基因部分片段
<400> 2
CTTCGTTTTCTGGAAGTGGAGACTTTTAATACCATTCTTCTTTACTCCCATGGGGTTTTCATTCCTGCACTGC
CAGTGTGGACCTAAGCCCCGAGACCCTCGAAAGGGCTGCTGCTGAAGATGACGAGTGTCCGTTGCAAGCTGGC
TCAGTATCTAGAGGACCTTGAAGATGTGGACCTCAAGAAATTCAAAATGCATTTGGAAGATTACCCGCCCGAG
AAAGGCTGTATCCCAGTCCCCAGGGGCCAGATGGAGAAGGCAGATCACTTGGATCTAGCCACACTCATGATTG
ACTTCAATGGCGAGGAGAAGGCCTGGGCCATGGCTGTGTGGATCTTTGCTGCGATCAACAGGCGAGACCTCTG
GGAAAAAGCTAAGAAGGACCAGCCAGAGTGGAGTGAGTAAACAGAAGGGTTTTTGGTTTTGTTTGTTTGTTTG
TTTGTTTCTTACAGTAAGGTACACGTGACATAAAAGGTGGAATTTTAGTAATTTTACATATATGGCTTAGCAA
CAAGAAAACATATGGTTGTGCAACCAACTTCTCATCTTGCACAACTGAAGCTCCCAACACACTAGATGATAAG
TCCCCATTACCTAACCCCATCTCCTAGCAACCACCGCTGTTTTCTGTCCCTGTGAACTTTACCTCTATGGATT
CCTCGTGCAGGTAGATTCATGGAGGGCTTGTTTCTTTTGGCTGGCTTACTTCACTTAGCATAATGTGTTCAGG
TACATCAGAATTTCCTTCTTAAAAAAGGTTAATGTTGAATATTCATGTGTGTCTATTACATTGTGCTTGTCTC
ATCTGTGCATATCCATTTGCTATGGATAACTATGTCTATTCAACATCTTCAGTTCTCTGGTTTTGAGTTCGAG
TCTCAAGTATCCCAGGCTGGCTCCAAACACAGAATCCTCTTTTCTCTGACCATGGGTTTT

Claims (5)

1.一种nlrp3基因敲除的小鼠巨噬细胞系，其特征在于：所述细胞系的全基因组中，第11号染色体一个上的NLRP3基因的第一段外显子基因序列上***一个碱基A，另外一个染色体上NLRP3基因的第一段外显子基因序列上缺失碱基AG，其中，第一段外显子基因序列如SEQ IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述nlrp3基因敲除的小鼠巨噬细胞系系，其特征在于：所述细胞系的全基因组中，第11号染色体一个的NLRP3基因上的第一段外显子基因序列92位点上***一个碱基A，另外一个染色体上NLRP3基因第一段外显子基因序列上92和93位点上碱基AG缺失。
3.一种利用CRISPR技术构建权利要求1所述nlrp3基因敲除的小鼠巨噬细胞系的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)构建Lenti-V2-mN3质粒
a.根据小鼠NLRP3的cDNA的外显子1的序列，分析得到sgRNA序列；
b.根据sgRNA序列的得分和Lenti-V2载体连接末端的序列特点，进行退火磷酸化得到含有粘性末端的片段mN3，其序列为：
5’-CACCGGAAGATTACCCGCCCGAGAA
CCTTCTAATGGGCGGGCTCTTCAAA-5’；
c.将含有粘性末端的片段mN3连接到Lenti-V2载体上，得到Lenti-V2-mN3质粒；
2)转染293T细胞，获得慢病毒粒子
将293T细胞铺至6孔板中，将慢病毒包装的质粒pVSV-G、psPAX2、lenti-V2-mN3按照1：1：1，每种质粒各按照1.5μg转染细胞；质粒在细胞中表达，培养离心，得到上清即为含有慢病毒粒子的悬液；
3)RAW感染慢病毒并获得单细胞克隆
使用抗生素puromycin筛选RAW细胞，然后向筛选的RAW细胞传代至6孔板中，向培养孔中均加入一半体积的DMEM完全培养基和一半体积含有慢病毒粒子的悬液，再加入抗生素puromycin继续培养筛选阳性细胞，得到单集落细胞，挑取单集落细胞，继续筛选，然后检测，即的NLRP3表达缺失的细胞系。
4.根据权利要求3所述利用CRISPR技术构建nlrp3基因敲除的小鼠巨噬细胞系的方法，其特征在于：所述步骤1)中，sgRNA序列，其序列为：GAAGATTACCCGCCCGAGAA。
5.根据权利要求3或5所述利用CRISPR技术构建nlrp3基因敲除的小鼠巨噬细胞系的方法，其特征在于：所述步骤2)中，退火磷酸化的引物对：
mN3-1:CACCGGAAGATTACCCGCCCGAGAA，
mN3-2：AAACTTCTCGGGCGGGTAATCTTCC。
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