CN106967781A - 一种用于检测电子烟制品对细菌回复突变数影响的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于检测电子烟制品对细菌回复突变数影响的方法，包括如下步骤：(1)受试物的前处理；(2)受试菌的培养；(3)受试菌浓度的确定；(4)受试物检测剂量的设定；(5)受试物分组；(6)S9混合液的配制；(7)受试物的培养；(8)受试物结果判定。本发明综合考察电子烟制品的使用特点，作用方式，建立了电子烟制品样品前处理方法并制定了样品检测剂量，形成了适合电子烟制品的细菌回复突变试验检测方法。

Description

一种用于检测电子烟制品对细菌回复突变数影响的方法
技术领域
本发明属于生物技术应用领域，特别涉及一种用于检测电子烟制品对细菌回复突变数影响的方法。
背景技术
现今，化学物质及其污染物对人体的潜在危害越来越受到社会的普遍关注与重视。B.N.Ames等于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)被世界各国及组织广为采用，是目前国际公认的检测新药、食品添加剂,食品包装材料及化妆品等的致突变性、致癌性的首选试验[1-3]。国际烟草科学研究合作中心CORESTA组织于2002年成立了卷烟烟气体外毒理测试工作组，经过工作组大量的文献调研及研究工作，该工作组推荐采用细菌回复突变试验(Ames试验)对卷烟烟气冷凝物潜在的致突变性进行检测。该检测方法目前已经被国内外烟草公司广泛采用。
烟草监管立法的日趋严格以及吸烟与健康研究的深入，导致了烟草公司寻求风险更低、无环境烟气的新型烟草制品，电子烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。电子烟制品其使用过程中通过电加热或者电子雾化方式使由烟碱、香味物质等组成的液体转化为类似于卷烟烟雾的混合物，再将汽化丙三醇/尼古丁等混合“烟雾”传送至消费者，使人吸入剂量不等的尼古丁而获得类似于抽吸传统卷烟的生理感受。使用过程中不产生烟气，其使用方式显著有别于传统卷烟，检测对象的改变导致样品前处理方法、检测剂量也有所不同，用于检测传统卷烟致突变性的细菌回复突变试验(Ames试验)不能满足电子烟制品致突变性检测的需要，且目前国内外研究机构及烟草公司尚未制定电子烟制品细菌回复突变试验的标准方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测电子烟制品对细菌回复突变数影响的方法，为电子烟制品的安全性评估提供参考。
一种用于检测电子烟制品对细菌回复突变数影响的方法，包括以下步骤：
(1)受试物的前处理；
(2)受试菌的培养；
(3)受试菌浓度的确定；
(4)受试物检测剂量的设定；
(5)受试物分组；
(6)S9混合液的配制；
(7)受试物的培养；
(8)受试物结果判定。
本发明优选的实施方案中，上述方法，包括以下具体步骤：
(1)受试物的前处理：吸取一定量的电子烟原液，按照电子烟原液与无血清细胞培养基的体积比为10～90％的比例进行混合稀释后，放置24h-48h，无菌过滤器过滤除菌，得到待测液，-80℃保存待用；
(2)受试菌的培养：取营养肉汤培养基，加入无菌三角瓶中，将保存的菌株鼠伤寒沙门氏工程菌TA98或TA100接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡，100次/min，振荡培养10h或静置培养16h；
(3)受试菌浓度的确定：用紫外分光光度计测定步骤(2)中的受试菌在600nm下OD值，用适量无菌营养肉汤培养基将菌液稀释，使其OD600值为0.5；
(4)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为4个非零检测剂量，分别为125mg/皿、250mg/皿、500mg/皿、1000mg/皿；
(5)受试物的分组：将受试物分为两组：空白对照组、阳性对照组；各组的构成为：空白对照组只加0.1mL新鲜菌液；阳性对照组为0.1mL新鲜菌液加入受试菌对应阳性物2-氨基芴、敌克松或叠氮钠；
(6)S9混合液的配制：首先将1.65mol/L的氯化钾溶液和0.4mol/L的氯化镁溶液按照体积比为1:1的比例混合后配制成氯化钾-氯化镁溶液；取磷酸缓冲液、氯化钾-氯化镁溶液、0.05mol/L葡萄糖-6磷酸钠盐缓冲液、0.025mol/L辅酶-Ⅱ溶液按照体积比为30:2:5:8比例混合后用0.22μm无菌过滤器过滤除菌后，与S9代谢活化液，按照(9:1)的体积比混合配制成10％的S9混合液备用；
(7)受试物的培养：将步骤(3)制得的测试菌株新鲜菌液0.1mL、步骤(1)制备的受试物烟气总粒相物0.1mL、步骤(6)制备的体积比为10％的S9混合液0.5mL加入约2.0mL的0.6％琼脂的顶层培养基，其中琼脂的顶层培养基与水的比例为：100ml水中含有0.6g培养基；在涡轮混合器上混匀；混匀后迅速倒入1.8％琼脂底层培养基上，其中琼脂的顶层培养基与水的比例为：100mL水中含有1.8g培养基；转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37℃、培养48h，观察结果；
(8)结果分析：计算步骤(7)中培养基上长出的回变菌落数，在背景生长良好的条件下，受试物诱发的回变菌落数等于或大于自发回变菌落数的2倍以上，并有剂量效应关系，即可认为该受试物诱变试验阳性。
本发明优选的实施方案中，步骤(1)中受试物的前处理方法还可以为剑桥滤片捕集法：
采用直线型吸烟机，连续抽吸100口电子烟，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前，抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照如下公式(1)计算电子烟总粒相物的质量mTPM，电子烟总粒相物的英文名称为Total particulate matter，简称TPM：
mTPM＝m1-m0 (1)
式中：
m0：抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
m1：抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入三角瓶中，加入二甲基亚砜，使电子烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/mL；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1ml冻存管中，-80℃保存待用。
本发明优选的实施方案中，步骤(1)中受试物的前处理方法还可以为全烟气暴露瓶捕集法：
采用直线型吸烟机，连续抽吸100口电子烟，采用装有无血清细胞培养基的全烟气暴露瓶捕集，捕集浓度为20口/mL，捕集后用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到待测液，-80℃保存待用。
本发明有益效果：
本发明在传统卷烟制品细菌回复突变实验方法的基础上改进得到的一种适合于电子烟制品致突变性检测的细菌回复突变试验方法；本发明综合考察电子烟制品的使用特点，作用方式，建立了电子烟制品样品前处理方法并制定了样品检测剂量，形成了适合电子烟制品的细菌回复突变试验检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定，使得本方法能够准确有效的检测电子烟制品的致突变性。
具体实施方式
下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明.
本实施例针对4种国外市售电子烟烟液对鼠伤寒沙门氏菌致突变性的测试。
本实施例包括如下具体步骤：
(1)受试物的前处理：吸取一定量的电子烟原液，按照电子烟原液与无血清细胞培养基的体积比为1:5的比例进行混合稀释后，放置32h，用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到待测液，-80℃保存待用；
(2)受试菌的培养：取营养肉汤培养基，加入无菌三角瓶中，将保存的菌株鼠伤寒沙门氏工程菌TA98或TA100接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡，100次/min，振荡培养10h；
(3)受试菌浓度的确定：用紫外分光光度计测定步骤(2)中的受试菌在600nm下OD值，用适量无菌营养肉汤培养基将菌液稀释，使其OD600值为0.5；
(4)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为4个非零检测剂量，分别为125mg/皿、250mg/皿、500mg/皿、1000mg/皿；
(5)受试物的分组：将受试物分为五组：空白对照变组、4组阳性对照组；各组的构成为：空白对照组只加步骤(3)制备的0.1mL新鲜菌液；4组阳性对照组分别为：阳性对照组1：步骤(3)制备的0.1mL新鲜菌液鼠伤寒沙门氏工程菌TA98(+S9)+受试物+阳性物2-氨基芴，其剂量为10μg/皿；阳性对照组2：步骤(3)制备的0.1mL新鲜菌液鼠伤寒沙门氏工程菌TA100(+S9)+受试物+阳性物2-氨基芴，其剂量为10μg/皿；阳性对照组3：步骤(3)制备的0.1mL新鲜菌液鼠伤寒沙门氏工程菌TA98(-S9)+受试物+阳性物敌克松，剂量为50μg/皿；阳性对照组4：步骤(3)制备的0.1mL新鲜菌液鼠伤寒沙门氏工程菌TA100(-S9)+受试物+阳性物叠氮钠，剂量为1.5μg/皿。
(6)S9混合液的配制：首先将1.65mol/L的氯化钾溶液和0.4mol/L的氯化镁溶液按照体积比为1:1的比例混合后配制成氯化钾-氯化镁溶液；取磷酸缓冲液、氯化钾-氯化镁溶液、0.05mol/L葡萄糖-6磷酸钠盐缓冲液、0.025mol/L辅酶-Ⅱ溶液按照体积比为30:2:5:8比例混合后用0.22μm无菌过滤器过滤除菌后，与S9代谢活化液，按照(9:1)的体积比混合配制成10％的S9混合液备用。
(7)受试物的培养：将步骤(3)制得的测试菌株新鲜菌液0.1mL、步骤(1)制备的受试物烟气总粒相物0.1mL、步骤(6)制备的体积比为10％的S9混合液0.5mL加入约2.0mL的0.6％琼脂的顶层培养基，其中琼脂的顶层培养基与水的比例为：100ml水中含有0.6g培养基；在涡轮混合器上混匀；混匀后迅速倒入1.8％琼脂底层培养基上，其中琼脂的顶层培养基与水的比例为：100ml水中含有1.8g培养基；转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37℃、培养48h，观察结果；(8)结果分析：计算步骤(7)中培养基上长出的回变菌落数，在背景生长良好的条件下，受试物诱发的回变菌落数等于或大于自发回变菌落数的2倍以上，并有剂量效应关系，即可认为该受试物诱变试验阳性。
本发明经过改进样品前处理方法和检测剂量后对4种国外市售电子烟产品的烟液原液的致突变性进行了检测，结果见表1。
由以上试验结果可以看出，在本发明方法给出的样品处理方法和检测剂量条件下，四种国外市售电子烟产品在125-1000μg/皿的受试剂量范围内细菌回复突变数与受试剂量间无剂量效应关系，受试物诱发的回变菌落数未大于自发回变菌落数的2倍以上，制品致突变性呈阴性。
表1

Claims (4)

1.一种用于检测电子烟制品对细菌回复突变数影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)受试物的前处理；
(2)受试菌的培养；
(3)受试菌浓度的确定；
(4)受试物检测剂量的设定；
(5)受试物分组；
(6)S9混合液的配制；
(7)受试物的培养；
(8)受试物结果判定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
(1)受试物的前处理：吸取一定量的电子烟原液，按照电子烟原液与无血清细胞培养基的体积比为10～90％的比例进行混合稀释后，放置24h-48h，无菌过滤器过滤除菌，得到待测液，-80℃保存待用；
(2)受试菌的培养：取营养肉汤培养基，加入无菌三角瓶中，将保存的菌株鼠伤寒沙门氏工程菌TA98或TA100接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡，100次/min，振荡培养10h或静置培养16h；
(3)受试菌浓度的确定：用紫外分光光度计测定步骤(2)中的受试菌在600nm下OD值，用适量无菌营养肉汤培养基将菌液稀释，使其OD600值为0.5；
(4)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为4个非零检测剂量，分别为125mg/皿、250mg/皿、500mg/皿、1000mg/皿；
(5)受试物的分组：将受试物分为两组：空白对照组、阳性对照组；各组的构成为：空白对照组只加0.1mL新鲜菌液；阳性对照组为0.1mL新鲜菌液加入受试菌对应阳性物2-氨基芴、敌克松或叠氮钠；
(6)S9混合液的配制：首先将1.65mol/L的氯化钾溶液和0.4mol/L的氯化镁溶液按照体积比为1:1的比例混合后配制成氯化钾-氯化镁溶液；取磷酸缓冲液、氯化钾-氯化镁溶液、0.05mol/L葡萄糖-6磷酸钠盐缓冲液、0.025mol/L辅酶-Ⅱ溶液按照体积比为30:2:5:8比例混合后用0.22μm无菌过滤器过滤除菌后，与S9代谢活化液，按照9:1的体积比混合配制成10％的S9混合液备用；
(7)受试物的培养：将步骤(3)制得的测试菌株新鲜菌液0.1mL、步骤(1)制备的受试物烟气总粒相物0.1mL、步骤(6)制备的体积比为10％的S9混合液0.5mL加入约2.0mL的0.6％琼脂的顶层培养基，其中琼脂的顶层培养基与水的比例为：100ml水中含有0.6g培养基；在涡轮混合器上混匀；混匀后迅速倒入1.8％琼脂底层培养基上，其中琼脂的顶层培养基与水的比例为：100mL水中含有1.8g培养基；转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37℃、培养48h，观察结果；
(8)结果分析：计算步骤(7)中培养基上长出的回变菌落数，在背景生长良好的条件下，受试物诱发的回变菌落数等于或大于自发回变菌落数的2倍以上，并有剂量效应关系，即可认为该受试物诱变试验阳性。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中受试物的前处理方法还可以为剑桥滤片捕集法：
采用直线型吸烟机，连续抽吸100口电子烟，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前，抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照如下公式(1)计算电子烟总粒相物的质量mTPM，电子烟总粒相物的英文名称为Total particulate matter，简称TPM：
mTPM＝m1-m0 (1)
式中：
m0：抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
m1：抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入三角瓶中，加入二甲基亚砜，使电子烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/mL；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1ml冻存管中，-80℃保存待用。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中受试物的前处理方法还可以为全烟气暴露瓶捕集法：
采用直线型吸烟机，连续抽吸100口电子烟，采用装有无血清细胞培养基的全烟气暴露瓶捕集，捕集浓度为20口/mL，捕集后用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到待测液，-80℃保存待用。
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