CN106967626B - 合成3-吲哚丁酸的酵母菌及其制备3-吲哚丁酸的应用 - Google Patents
合成3-吲哚丁酸的酵母菌及其制备3-吲哚丁酸的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明为具备合成3‑吲哚丁酸功能的酵母菌及其在发酵制备3‑吲哚丁酸上的应用,解决3‑吲哚丁酸的化学合成工艺复杂,环境污染的问题。制备具备合成3‑吲哚丁酸功能的酵母菌,拉丁名称为Saccharomyces sp.,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期:2017年4月11日,保藏编号:CGMCC NO.14011。该菌株能将微生物发酵制备的IAA转化成IBA,发酵液过滤浓缩结晶制得IBA。
Description
技术领域
本发明涉及一种酵母菌和以微生物发酵的方式制备3-吲哚丁酸的方法。
背景技术
3-吲哚丁酸(IBA)和3-吲哚乙酸(IAA),均是天然存在于植物体内的生长素,能促进细胞***与细胞生长,诱导形成不定根,增加座果,防止落果,改变雌、雄花比率等。广泛应用于农林业生产。3-吲哚丁酸的化学合成方法已有较多报道,目前主要以两种方法,一是由吲哚与γ-丁内酯在四氢萘的回流温度下缩合得到,二是由吲哚与格氏试剂及α-氯代丙腈反应,制得3-丁腈吲哚,再由NaOH水解并与盐酸反应制得。化学合成法步骤较多,反应需高温及强酸强碱参与,对环境污染大。关于3-吲哚丁酸的生物合成,Ludwig-Muller等发现玉米幼苗能将3-吲哚乙酸(IAA)转化为3-吲哚丁酸(IBA),根系发达的玉米品种比生根能力弱的玉米品种具有更高的将IAA 转化为IBA的能力(Ludwig-Müller J, Epstein E.Occurrence and in vivo biosynthesis of indole-3-butyric acid in corn (Zeamays L.)[J]. Plant physiology, 1991, 97(2): 765-770.);用标记的IAA供给无菌培养的拟南芥幼苗,产生一种与IBA fR值相似的标记化合物,随后IBA含量很快下降,形成IBA结合物(Ludwig-Müller J, Epstein E. Indole-3-butyric acid in Arabidopsisthaliana III. In vivo biosynthesis[J]. Plant gro wth regulation, 1994, 14(1):7-14.)。由于IBA比IAA具有相对较好的稳定性,具有更好的促生能力,因此利用微生物将IAA转化为IBA是一条可行的途径。关于微生物发酵制备IBA未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是从植株根际土壤分离筛选一种具备合成3-吲哚丁酸功能的酵母菌。
本发明的另一目的是提供一种通过上述酵母菌发酵制备3-吲哚丁酸的方法。
本发明是这样实现的:
具备合成3-吲哚丁酸功能的酵母菌,拉丁名称为Saccharomyces sp.,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期:2017年4月11日,保藏编号:CGMCC NO.14011。
所述的酵母菌在发酵制备3-吲哚丁酸上的应用,其特征在于该酵母菌进行连续培养,添加培养基和底物3-吲哚乙酸,制备3-吲哚丁酸。
所述的酵母菌在发酵制备3-吲哚丁酸上的应用,其特征在于将该酵母菌接种到含合成-吲哚乙酸的底物的发酵液中,进行连续发酵,从而合成3-吲哚丁酸。
所述的酵母菌在发酵制备3-吲哚丁酸上的应用,其特征在于将该酵母菌接种到产-吲哚乙酸的微生物发酵液中,补充营养物质继续发酵,从而合成3-吲哚丁酸。
本发明所述的酵母菌具备合成3-吲哚丁酸功能,发酵制备IBA条件温和,环境友好,解决了化学合成工艺复杂,环境污染等问题。
具体实施方式:
实施例1:
本发明酵母菌Saccharomyces sp.,详细分离筛选步骤如下:
(1)样品采集:采取根系发达的植株根际土壤。
(2)菌株分离:称取上述土样10g置于盛有100ml无菌水的250ml灭菌三角瓶中,置28℃摇床中振荡半小时得悬浮液,再用无菌水逐步将悬浮液稀释至10-3,10-4,10-5三种稀释度待用,分别取0.1ml上述稀释悬浮液涂布于含固体PDA培养基平板,每个稀释度涂布3个平板,置28℃温箱中培养一周,长出的菌株纯化后做后续试验。固体PDA培养基配方如下:马铃薯 200克、葡萄糖 20克、琼脂 15~20克/升、自来水1000毫升、自然PH。
(3)具有合成IBA功能的菌株筛选:将步骤(2)中得到的各个菌株分别接种于有50ml液体PDA培养基的三角瓶中,并置于28℃摇床培养,转速为150rpm,培养2d后,按200mg/kg的量添加IAA到液体培养基,继续培养2d后离心取上清液通过液相色谱测定是否有IBA,选取有IBA的菌株为具有合成IBA功能的菌株。液体PDA培养基配方如下:马铃薯 200克、葡萄糖 20克、自来水1000毫升、自然PH。
(4)菌株合成IBA性能鉴定:将步骤(3)分离到的具有合成IBA功能的菌株转接到盛有50ml液体PDA培养基的250ml三角瓶中培养至稳定期,添加3-吲哚乙酸IAA继续培养后测定IBA得率。不同时间重复3次以上操作。结果表明,具有合成IBA功能的菌株的IBA得率为添加IAA含量的65%-70%,性能稳定。
(5)具有合成IBA功能的酵母菌有如下特征:
菌落形态特征:PDA培养基上菌落为乳白色,有光泽,平坦,边缘整齐。
(6)菌株的分类鉴定:利用ITS序列鉴定,即酵母ITS序列通用引物进行PCR扩增并测序,再与国际NCBI GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)核苷酸数据库比对,核苷酸同源性为99%,结合菌落、菌体形态特征鉴定为酵母菌(Saccharomyces sp.)。于2017年4月11日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏,其保藏号为CGMCCNO.14011,自编号:LY1。
实施例2:
具有合成IBA功能的酵母菌连续培养在合成IBA上的应用。
(1)从斜面保藏管接种一环酵母菌LY1到50 ml液体PDA培养基中,置28℃摇床中,150rpm振荡培养到指数期,作为一级种子液;液体PDA培养基配方如下:马铃薯 200克、葡萄糖 20克、自来水1000毫升、自然PH,
(2)取步骤(1)中得到的种子液,以5%体积的接种量接种到20L发酵罐的液体PDA培养基中,28℃通气培养到指数期,作为二级种子液,
(3)将二级种子液接种到200L发酵罐的YPDA培养基中,培养至稳定期,添加重量百分浓度为0.8%浓度的3-吲哚乙酸溶液(3-吲哚乙酸用饱和碳酸氢钠溶液溶解或少量乙醇溶解),调节pH至6.5,温度28℃,发酵罐压力0.05-0.08Mpa、溶氧40-80mg/kg,发酵12h后将溶氧降低到0-10mg/kg,继续培养12h,放出发酵液,补充YPDA培养基按以上操作参数进行连续发酵。YPDA培养基为:20 g蛋白胨、10 g酵母浸粉、2 g葡萄糖,适量水溶解后加入15 ml0.2%腺嘌呤溶液,定容到1 L,
(4)放出的发酵液进行减压浓缩至原体积的五分之一加酸调节pH至灰白色结晶析出,抽滤、水洗后烘干即的IBA,IBA得率为IAA添加量的68%,提取IBA后的滤液调节pH至中性可制成液体肥料,无废弃物排放,安全环保。
实施例3:
该具有合成IBA功能的菌株接种到产IAA的微生物发酵液中合成IBA的应用。
(1)微生物发酵IAA:将产IAA菌株-肠杆菌LY6(保藏编号CGMCC NO 9539)接种到培养基(胰蛋白胨0.8%、酵母膏0.4%、NaCl 0.7%、葡萄糖2%、果糖0.7%、L-色氨酸0.12%、丙酮酸钠 0.02%、硫酸铜0.01%、水1L,pH 7.2),发酵完成后灭菌15分钟,灭菌后的发酵液用于该具有合成IBA功能的酵母菌合成IBA。
(2)酵母菌种子液制备:从斜面保藏管接种一环该酵母菌LY1到50 ml液体PDA培养基中,置28℃摇床中,150rpm振荡培养到指数期,作为一级种子液;将一级种子液以5%体积的接种量接种到20L发酵罐的液体PDA培养基中,28℃通气培养到指数期,作为二级种子液。液体PDA培养基配方如下:马铃薯 200克、葡萄糖 20克、自来水1000毫升、自然PH。
(3)YPDA培养基浓缩液制备:分别称取100 g蛋白胨、50 g酵母浸粉、10 g葡萄糖,加入适量水溶解后加入75 ml 0.2%腺嘌呤溶液,定容到1 L,配制成10倍YPDA培养基浓缩液,灭菌后装入发酵罐补料***。
(4)二次发酵:将步骤(2)的酵母菌二级种子液和步骤(3)的YPDA培养基浓缩液分别按2%~5%的比例(V:V)泵入步骤(1)已灭菌的发酵液中,调节pH至6.5,温度28℃,发酵罐压力0.05-0.08Mpa、溶氧40-80mg/kg,发酵20h后将溶氧降低到0-10mg/kg,在YPDA培养基继续培养8h,放出二次发酵液。YPDA培养基为:20 g蛋白胨、10 g酵母抽提物、2 g葡萄糖,适量双蒸水溶解后加入15 ml 0.2%腺嘌呤溶液,定容到1 L。
(5)放出的发酵液进行减压浓缩至原体积的四分之一加酸调节pH至灰白色结晶析出,抽滤、水洗后烘干即得IBA。提取IBA后的滤液调节pH至中性可制成液体肥料,无废弃物排放,安全环保。
实施例4:
该具有合成IBA功能的菌株接种到含合成IAA的底物的培养基中,进行连续发酵,从而合成IBA的应用。
(1)酵母菌一级二级种子液制备:方法同实施例2的(1)和(2)。
(2)含合成IAA的底物的培养基配制: L-色氨酸2%、丙酮酸钠0.2%、硫酸镁0.01%、20 g蛋白胨、10 g酵母浸粉、2 g葡萄糖,适量水溶解后加入15 ml 0.2%腺嘌呤溶液,定容到1 L(其中L-色氨酸为合成IAA的底物)。
(3)将二级种子液接种到200L发酵罐的含合成IAA的底物的培养基中,维持pH至6-7,温度28℃,发酵罐压力0.05-0.08Mpa、溶氧40-80mg/kg,搅拌速度160r/min,发酵36h后将溶氧降低到0-10mg/kg,搅拌转速60r/min继续培养12h,放出发酵液。
(4)放出的发酵液的浓缩结晶得IBA,滤液处理同实施例2的(4)。
上述实施例是对本发明的上述内容作进一步的说明,但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于上述实施例。对于本领域的一般技术人员,依据本实用新型实施例的思想,在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处,凡基于上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
Claims (2)
1.合成3-吲哚丁酸的酵母菌,拉丁名称为Saccharomyces sp.,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期:2017年4月11日,保藏编号:CGMCCNO.14011。
2.如权利要求1所述的酵母菌在制备3-吲哚丁酸的应用,其特征在于该酵母菌进行连续培养,添加培养基和底物3-吲哚乙酸,制备3-吲哚丁酸。
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植物体中的吲哚丁酸(IBA);江玲等;《生命科学》;19990615;第11卷(第3期);第135-137页 * |
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