CN106962873A - 一种罗汉果中甜苷类的工业化分离提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗汉果中甜苷类的工业化分离提纯方法,先对罗汉果进行粉碎、加热、过滤以及酶处理,在用合成吸附树脂进行处理,通过树脂柱对酶处理液进行分离,最后通过强酸性阳离子交换树脂进行提纯,从包含两种以上成分的溶液中,根据各成分的层析移动速度的差别相对应的把两种成分一分为二,最后并进行检测。采用本发明方法使得甜苷类与蛋白有效的分离,使罗汉果甜苷类成分的浓度达到80~98%,其中罗汉果甜苷Ⅴ的含量达到65~80%,具有高浓度,高效精制分离的优点,成本低,污染小。
Description
技术领域
本发明涉及分离提纯技术领域,具体是一种罗汉果中甜苷类的工业化分离提纯方法。
背景技术
罗汉果是一种天然的甜味剂,罗汉果的学名Siraitia grosvenori(SwingLe)C.),是一种瓜科的,爬藤类的多年根生植物,藤的长度可以达到5m多,地下部分也有块茎,主要分布在中国华南地区,昼夜温差较大,多雾,气候较为凉爽的区域,喜欢在生长在土壤较为柔软,地面多腐植物的山地或斜坡等地。主要在中国广西桂林地区种植。
罗汉果自古以来一般是经过烘干,掰成碎块后加水煎煮后,作为罗汉果茶饮用,罗汉果用水等抽提以后,一般作为料理的甜味剂使用。因为罗汉果对支气管炎、扁桃腺炎、咽喉炎、止咳、祛痰、急性胃炎、便秘等有防治和治疗效果,自古以来在中国是作为汉方的药用果实来食用的。
罗汉果的甜味特性主要来自于各种三萜类的配糖体成分,其中主要是有罗汉果甜苷V,罗汉果甜苷IV,11-环氧罗汉果甜苷V,以及赛门苷I(以下简称为罗汉果甜苷类)等为罗汉果的主要的甜味成分,罗汉果的甜苷类物质,除了具有跟蔗糖相比几百倍的甜度和跟蔗糖非常近似的甜味,跟同样是天然的甜味剂甜菊糖苷,以及甘草提取物相比,还具有综合良好的甜味特点,另外由于罗汉果甜苷类物质在体内不参与能量代谢过程,可以作为减肥的甜味剂和糖尿病患者的甜味剂使用特点。
现有的技术方案中,曾用蛋白分解酶使罗汉果提取液中的蛋白质低分子量化,从而简单有效的将其分离纯化而得到的产品,比市场上销售的普通罗汉果提取物粉末产品的甜味品质更为优异。但是,对有一部分的食品合制造商来说,对于上述罗汉果精制粉末品还是会有一点点的关于风味方面的不满,所有对罗汉果精制粉末产品提出了跟高规格的要求,市场上需要提供具有更优秀的甜味品质的罗汉果甜苷类成分的组成物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种罗汉果中甜苷类的工业化分离提纯方法,以解决上述背景技术中提出的问题。
模拟移动床法,Simulated Moving Bed,简称SMB,从包含两种以上成分的溶液中,根据各成分的层析移动速度的差别相对应的把两种成分一分为二的分离方法。具体过程是,在原液中包含的两个以上的成分对应成分直列连接填充4根以上单位的填充塔,在最下游部分的填充塔和最上游部分的填充塔的填充层连接,通过用原液和洗脱液,根据各个成分相对应填充剂亲合力的差别、原液供给口、洗脱液供给口、原液中含有的成分(填充层内移动速度大的成分)剩下的成分(填充层内移动速度的小的成分)拟似性地相对于填充层(固定相)洗脱液(移动相)的流动,反方向移动,使目的成分得到连续地分离的方法。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种罗汉果中甜苷类的工业化分离提纯方法,具体步骤如下:
(1)罗汉果浓缩液制备
将粉碎后的罗汉果干燥原料和水加入不锈钢容器中,边搅拌,在70~92℃下加热处理1.0~3.2h,然后冷却至20~30℃,过滤除去残渣,再用滤芯式过滤泵进行过滤,得到抽提液,加入蛋白分解酶,在33~67℃下搅拌进行酶处理2.7~5.3h,得到酶处理液;
酶处理液用合成吸附树脂处理,用质量分数为2.8~5.2%NaOH溶液过液,再用水进行水洗,再用质量分数为2.8~5.2%的H2SO4过液,再用水进行冲洗,再过合成吸附树脂,用水进行水洗,再用醇溶液进行过液,得到洗出液,用旋转蒸发器进行真空浓缩,得到罗汉果浓缩液;
(2)浓缩液分离
把酶处理液用合成树脂进行处理,先用质量分数为2.8~5.2%的NaOH水溶液通过树脂柱进行活化处理,再用水通过树脂柱,然后再用质量分数为2.8~5.2%的H2SO4水溶液通过树脂柱,然后再用水进行洗涤,再将酶处理液通过树脂柱,再用水洗涤树脂柱,最后用体积分数为48~72%的乙醇溶液通过树脂柱,溶出得到醇溶出液,再将醇溶出液进行真空浓缩以回收醇溶液,并得到浓缩液;
(3)提纯
在树脂柱中充填强酸性阳离子交换树脂,使用同样的多根串联连接的树脂柱,洗脱液为44~76%乙醇水溶液,用定量泵以对串联柱进行循环,循环时间200~490min;检测器设置在第1根~第4根树脂柱的出口处,在UV 203nm和UV 280nm的两种波长下,进行连续检测观察。
作为本发明进一步的方案:所述步骤(1)中,合成吸附树脂先用质量分数为2~5%的H2SO4溶液调整pH为2.8~5.2。
作为本发明进一步的方案:所述步骤(1)中,滤纸的孔径为0.5~2.5μm。
作为本发明进一步的方案:所述步骤(1)和步骤(2)中,醇溶液为体积分数为30~60%的乙醇水溶液。
作为本发明进一步的方案:所述步骤(1)中,蛋白分解酶包括但不限于丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、MSD蛋白酶中的一种。
作为本发明再进一步的方案:所述步骤(3)中,强酸性阳离子交换树脂为苯乙烯磺酸钠凝胶型强酸性阳离子交换树脂。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明方法,使得甜苷类与蛋白有效的分离,使罗汉果甜苷类成分的浓度达到80~98%,其中罗汉果甜苷Ⅴ的含量达到65~80%,具有高浓度,高效精制分离的优点,成本低,污染小。
附图说明
图1为经过酶处理的罗汉果甜苷类提取物与低分子化蛋白质的SMB分离图。
图2为未经过酶处理的罗汉果甜苷类提取物与蛋白质的SMB分离图。
图3为SMB***装置示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)罗汉果浓缩液的调制
将1000g的罗汉果干燥原料和20L的自来水加入20L的不锈钢容器中,在80℃下,加热搅拌2h,冷却至25℃;用30目的钢丝网过筛,并用孔径为1μm的滤纸过滤器过滤,得到过滤提取液;在提取液加入1L水和50g蛋白分解酵素(蛋白酶M SD)搅拌,在45℃下酶处理5h,得到处理液;处理液用合成吸附树脂(三菱化学制造,钻石离子HP 20,1000mL)处理,并进行活性化(用1000mL质量分数为4%NaOH溶液以16mL/min的流速过液,再用3000mL水进行水洗,再用1000mL质量分数为4%的H2SO4以16mL/min的流速过液,最后用3000mL的水进行冲洗),上述合成吸附树脂用质量分数为4%的H2SO4溶液调整pH为4.0,上述20L的提取液以16mL/min的流速过液,用3000mL的水进行水洗。其次,罗汉果甜味的成分,罗汉果甜苷类成分分析,用4000mL体积分数为60%的乙醇溶液以16mL/min的流速过液,得到洗出液3900mL。得到的洗出液为了去除乙醇,使用真空浓缩(旋转蒸发器)得到100g的罗汉果粗加工液,作为SMB处理的试料。
(2)罗汉果抽提液的酶处理
将1000g的罗汉果干燥粉碎原料和20L水,加入20L的不锈钢容器,边搅拌下,在80℃下加热处理2h,冷却至25℃,用30目的金属丝网过滤以除去残渣,再用孔径1μm的滤纸过滤,得到抽提液19L,加入1L水和50g蛋白分解酶(蛋白酶MSD,日本天野公司,商品名),在45℃下搅拌进行酶处理5h;
(3)分离
把酶处理液用合成树脂(三菱化学HP20,1000L)进行处理,先用1000ml质量分数为4%的NaOH水溶液以16ml/min流速通过树脂柱进行活化处理,再用3000ml的水以相同的流速通过该树脂柱,然后再用3000ml质量分数为4%的H2SO4水溶液以16ml/min的流速通过该树脂柱,然后再用3000ml水以同样的流速进行洗涤,最后再将20L酶处理液以16ml/min的流速通过树脂柱,再用3000ml的水以同样的流速洗涤树脂柱,最后用4000ml体积分数为60%的酒***溶液以16ml/min的流速通过该树脂柱,溶出得到3900ml的酒精溶出液,再将溶出液进行真空浓缩器进行浓缩回收酒精,得到100g的浓缩液,用作SMB的试料。
SMB处理条件,直径50mm×长50cm玻璃柱中充填700mL苯乙烯磺酸钠的凝胶型强酸性阳离子交换树脂(UBK-550交联度8%,水分含量46~49.5%,三菱化学(株)),使用同样的4根串联连接的玻璃柱,洗脱液为酒精浓度55%的含水乙醇,用定量泵以10mL/min的流速通过4根串联柱进行循环(循环时间280min);检测器设置在SMB装置的第1~第4柱的出口处,用波长UV 203内nm(罗汉果甜苷类检测用)和UV 280nm(蛋白检测用)的2种波长下,进行连续检测观察。
本实验,用酶处理过得到的罗汉果浓缩液和没有酶处理的罗汉果浓缩液进行对比试验。上述的SMB循环过程中的第1个柱的入口,添加50g处理。第1号出口洗脱液的UV230nm和UV 280nm的检测结果如图2和图3所显示的那样,酶处理过的罗汉果浓缩液存在2个峰(峰A,峰B;图2中显示),峰A为罗汉果甜苷类,峰B为低分子化的蛋白质,两个成分已经得到很好的分离。因此,在SMB***的第三个柱出口处,把相当于峰A面积约30%的溶出液导入到SMB***外的回收桶中进行回收。同时,加入跟回收的液量相同量的展开溶剂继续进行循环。通过此操作,回收的得到峰A的30%相当的回收液是几乎不含低分子化的蛋白质的罗汉果甜苷类成分。
其次,SMB***的第4个柱的出口处,把相当于峰B面积约30%的液体量导出到SMB***外的回收桶中。与上述操作过程相同,把与回收液同等量的展开溶剂在回收的同时继续追加循环下去。通过操作,回收得到的峰B的30%相当的回收液(蛋白质画分)中,几乎是不含罗汉果甜苷类成分的低分子化蛋白质成分。
这两种回收液经过浓缩粉末化后,进行罗汉果甜苷类含量和蛋白质含量测定,同SMB处理前的罗汉果甜苷类含量75.8%(罗汉果甜苷Ⅴ含量60.4%)相比,峰A回收液由来的罗汉果甜苷类成分含量达到98.5%(罗汉果SIDⅤ含量是78.8%),用此方法使罗汉果甜苷类成分得到了高度的纯化。峰B回收液中没有检测出含有罗汉果甜苷类。
由此证明,利用SMB装置***,可以把罗汉果提取液中的蛋白质含量几乎除去干净,从而得到高纯度的罗汉果甜苷类成分的组成物产品是可以工业化制造的,此方法是切实可以的。
另一方面,没有经过酶处理的罗汉果浓缩液,两个峰没有被分离(图3)。因此也根据以上酶处理过的罗汉果粗精制液的实验操作一样,针推没有酶处理过的罗汉果浓缩液进行了相同实验操作。其结果是SMB处理后的罗汉果甜苷类和蛋白质的罗汉果甜苷类含量测定分别为76.2%(罗汉果甜苷Ⅴ含量59.2%),SMB处理前的罗汉果甜苷类含量75.2%(罗汉果甜苷Ⅴ含量58.9%),两个结果相比,罗汉果甜苷类的含量没有明显的得到提高。
由此可见,用SMB装置***对没有经过酶处理的罗汉果浓缩液,罗汉果甜苷类和蛋白质不能被有效的分离。
SBM***装置(如图1),因为是不断连续循环的,因此***内部未回收成分从第1个柱子又返回到入口。这时要是添加新的试样,就会和***内的残留的目的成分一起开始进行第二个周期循环的色谱层析分离过程,同样也会产生同第一个循环相同的分离现象。在各个各柱子的出口处,设置检测器,和进行同样的连续检测操作,由此就可以制造出高浓度的罗汉果甜苷类成分的精制产品。如果把导出的各个组分溶液,用反渗透膜等方法等除去溶液内的成分后,又可以再次使用,这样将会大大的降低成本,和减少对环境的污染。
罗汉果甜苷的含量测定
罗汉果精制粉末样品0.05g,用分析天平精确称量,加入100ml容量瓶,用100ml蒸馏水加满至容量瓶刻度,作为HPLC的分析试样。HPLC的分析条件如下:色谱柱种类SHODEXAsahipak NH2P-50 4E(ID4.6×250mm),展开溶剂75%CH3CN(isocratic)、流速0.8mL/min、检出器OD210nm、光电二极管检测器(200-700nm,吸光度测定),注射量:20μL。利用罗汉果甜苷V标品(和光纯药工业)在100-600ppm浓度下,制作标准曲线,进行测定试样中罗汉果甜苷类含量的测定。然后再根据HPLC的分析罗汉果甜苷V,甜苷IV,11-环氧罗汉果甜苷V以及赛门苷的峰面积和吸光度的大小计算甜苷类的各自的组成比和实际的含量比。得到的该试样的罗汉果甜苷的组成比为:罗汉果甜苷V 80.9%,罗汉果甜苷IV 1.5%,11-环氧罗汉果甜苷V15%,赛门苷2.6%。
另外,蛋白质的含量根据Kjeldahl method测定。
实施例2
实施例1所得到的用SMB精制的罗汉果精制成品和SMB没有进行处理的罗汉果粗加工产品,其罗汉果甜苷类及蛋白质含量测定的结果如表1所示。两个产品中含有的罗汉果甜苷类的各成分的组成,大体上相同,罗汉果甜苷V有78.3%,罗汉果甜苷IV有1.5%、11-环氧罗汉果甜苷V有18.1%、赛门苷I为2.1%。
表1
表1的结果,本发明的SMB处理的产品,同未经SMB处理产品相比,其蛋白质的含量与罗汉果甜苷类的含量比明显有了特别的降低,降低了将近10倍。
实施例3 甜味评价
实施例1调制的SMB处理的本发明的产品和SMB未处理的产品,对其甜味品质进行了品尝评分。两种不同试料用纯水调制成为相同罗汉果甜苷类浓度相同浓度(480ppm)溶液,对照标准样以白砂糖10%的浓度水溶液作为对比标准样,甜味品质的评价,把甜味品质的基本性能分为以下几项内容:丰满的甜味感、后甜味、苦味、厚重的甜味、清爽甜味感、质地重的甜味感、异样甜味感、涩味、刺激性,进行打分评估,甜味品质的评价,采用10个优选的人员进行官能测定。每一个项目都跟标准的糖水进行对比,按照以下1-5级打分制进行评估打分,标准的10%的白砂糖水的标准分为3分。10个人的全项目的评估结果的平均值(STTD)和标准偏差值(SD)的结果列表与表2。
表2
甜味的评价标准:>5,不好;>3,和蔗糖一样;>1,好。
表2的结果显示,SMB处理过的罗汉果产品比较SMB未处理罗汉果产品具有更优越的甜味品质。根据以上结论,本发明的罗汉果甜苷类成分的组成物具有非常良好的甜味品质。
根据以上的结果,用蛋白质分解酶处理过的蛋白质低分子化的罗汉果提取液作为SMB装置***的试料,经过SMB***处理后,罗汉果甜苷类的含量可以达到65-99%的纯度,其蛋白质的含量可以降低到相比于罗汉果甜苷类150重量部对0.2重量部以下的结果,由此证明了高纯度,几乎不含蛋白质含量的罗汉果甜苷类成分的精制方法,高效的低成本的工业化生产是可行的。而且其产品具有非常优异的甜味品质,几乎等同于蔗糖的甜味品质。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (6)
1.一种罗汉果中甜苷类的工业化分离提纯方法,其特征在于,具体步骤如下:
(1)罗汉果浓缩液制备
将粉碎后的罗汉果干燥原料和水加入不锈钢容器中,边搅拌,在70~92℃下加热处理1.0~3.2h,然后冷却至20~30℃,过滤除去残渣,再用滤芯式过滤泵进行过滤,得到抽提液,加入蛋白分解酶,在33~67℃下搅拌进行酶处理2.7~5.3h,得到酶处理液;
酶处理液用合成吸附树脂处理,用质量分数为2.8~5.2%NaOH溶液过液,再用水进行水洗,再用质量分数为2.8~5.2%的H2SO4过液,再用水进行冲洗,再过合成吸附树脂,用水进行水洗,再用醇溶液进行过液,得到洗出液,用旋转蒸发器进行真空浓缩,得到罗汉果浓缩液;
(2)浓缩液分离
把酶处理液用合成树脂进行处理,先用质量分数为2.8~5.2%的NaOH水溶液通过树脂柱进行活化处理,再用水通过树脂柱,然后再用质量分数为2.8~5.2%的H2SO4水溶液通过树脂柱,然后再用水进行洗涤,再将酶处理液通过树脂柱,再用水洗涤树脂柱,最后用体积分数为48~72%的乙醇溶液通过树脂柱,溶出得到醇溶出液,再将醇溶出液进行真空浓缩以回收醇溶液,并得到浓缩液;
(3)提纯
在树脂柱中充填强酸性阳离子交换树脂,使用同样的多根串联连接的树脂柱,洗脱液为44~76%乙醇水溶液,用定量泵以对串联柱进行循环,循环时间200~490min;检测器设置在第1根~第4根树脂柱的出口处,在UV 203nm和UV 280nm的两种波长下,进行连续检测观察。
2.根据权利要求1所述的罗汉果中甜苷类的工业化分离提纯方法,其特征在于,所述步骤(1)中,合成吸附树脂先用质量分数为2~5%的H2SO4溶液调整pH为2.8~5.2。
3.根据权利要求1所述的罗汉果中甜苷类的工业化分离提纯方法,其特征在于,所述步骤(1)中,滤纸的孔径为0.5~2.5μm。
4.根据权利要求1所述的罗汉果中甜苷类的工业化分离提纯方法,其特征在于,所述步骤(1)和步骤(2)中,醇溶液为体积分数为30~60%的乙醇水溶液。
5.根据权利要求1所述的罗汉果中甜苷类的工业化分离提纯方法,其特征在于,所述步骤(1)中,蛋白分解酶包括但不限于丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、MSD蛋白酶中的一种。
6.根据权利要求1所述的罗汉果中甜苷类的工业化分离提纯方法,其特征在于,所述步骤(3)中,强酸性阳离子交换树脂为苯乙烯磺酸钠凝胶型强酸性阳离子交换树脂。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170721 |
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