CN106946812B - 作为个性化抗癌药的胱天蛋白酶原活化化合物的设计、合成和评价 - Google Patents

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Abstract

在实施方案中描述了与诱导细胞(例如癌细胞)死亡有关的组合物和方法。公开了化合物和相关的合成方法及其用途，包括化合物在治疗癌症和选择性诱导细胞凋亡的疗法中的用途。公开了神经毒性效应比其它化合物低的化合物。

Description

作为个性化抗癌药的胱天蛋白酶原活化化合物的设计、合成 和评价
相关申请的交叉参引
本申请要求由Hergenrother等人于2009年2月9日提交的美国临时申请61/151,064的优先权，该申请的全部内容通过引用的方式纳入本文。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是在美国国立卫生研究所(National Institutes of Health)授予的R01-CA120439、美国国立卫生研究所授予的1 T32 GM070421和美国国立卫生研究所授予的F31-CA13013801S1的政府资助下完成的。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
凋亡(或程序性细胞死亡)在所有多细胞生物的发育和体内平衡中起主要作用(Shi Y，2002，Molecular Cell 9：459-470)。癌症的常见特点是对天然凋亡信号的抗性。根据癌症的种类，这种抗性通常是由于凋亡级联中关键蛋白的上调或下调，或者是由于编码这些蛋白的基因中的突变。这种变化发生于内在凋亡途径(其如经漏斗般(funnel)通过线粒体和胱天蛋白酶-9)和外在凋亡途径(其涉及死亡受体和胱天蛋白酶-8的作用)。例如，已在癌症中观察到了蛋白(例如p53、Bim、Bax、Apaf-1、FLIP等)的合适水平的改变。所述改变可导致有缺陷的凋亡级联，其中上游的促凋亡信号无法得到充分地传递来活化执行者(executioner)胱天蛋白酶——胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7。图1显示了所述凋亡级联的一些方面。
由于大多数凋亡途径最终会涉及胱天蛋白酶原-3的活化，上游的基因异常在凋亡线路中有效“断裂”，结果这类细胞会非典型地增殖。基于凋亡在癌症中的主要作用，已努力开发了靶向凋亡级联中的特定蛋白的治疗剂。例如，对级联成员(例如p53)和Bcl家族中的蛋白或者对凋亡抑制蛋白(IAP)家族的肽结合剂或小分子结合剂具有促凋亡活性，促进Apaf-1低聚化的化合物也具有促凋亡活性。但是，因为这种化合物靶向所述凋亡级联上的较早(或中间至较高)位置，这些成员的下游蛋白具有突变的癌症仍然可对抗这些化合物可能的有利效果。
为了治疗目的，优选地鉴定直接活化所述凋亡级联中较远下游的促凋亡蛋白的小分子。本发明的方法涉及所述级联中的这种较低的位置，因此甚至能够杀死在其上游凋亡结构中具有突变的那些细胞。此外，如果在癌细胞中上调促凋亡蛋白，则本文公开的治疗策略可具有较大的成功可能性。在本发明中，本发明人努力鉴定了从靶向凋亡的重要下游效应蛋白——胱天蛋白酶原-3开始的小分子。
胱天蛋白酶原-3向胱天蛋白酶-3的转变或活化可导致生成有活性的“执行者”胱天蛋白酶形式，其随后会催化对多种蛋白底物的水解。活性胱天蛋白酶-3是异二聚体的同二聚体，并且通过蛋白水解胱天蛋白酶原-3产生。在体内，这种蛋白水解活化是通常通过胱天蛋白酶-8或胱天蛋白酶-9的作用发生。为了确保前酶或酶原不被过早活化，胱天蛋白酶原-3具有12个氨基酸的“安全闩”(safety catch)，其可阻断蛋白水解接触到IETD部位(氨基酸序列为ile-glu-thr-asp)。参见Roy，S.et al.；Maintenance of caspase-3proenzymedormancy by an intrinsic″safetycatch″regulatory thpeptide，Proc.Natl.Acad.Sci.98，6132-6137(2001)。
这种安全闩能使胱天蛋白酶原-3抵抗自体催化活化和胱天蛋白酶-9引起的蛋白水解。突变研究表明，三个连续的天门冬氨酸残基似乎是所述安全闩的关键组分。所述安全闩的位置对pH敏感；因此，一旦细胞酸化(这发生在凋亡过程中)，则认为所述安全闩允许接触蛋白水解部位，并且活性胱天蛋白酶-3可通过胱天蛋白酶-9的作用或者通过自体活化机理产生。
在具体癌症中，胱天蛋白酶原-3的表达被上调。对来自20个结肠癌患者的原代分离物的研究揭示了，平均而言，在这类分离物中胱天蛋白酶原-3相对邻近的非癌组织被上调了6倍(Roy et al.，2001)。此外，胱天蛋白酶原-3在某些成神经细胞瘤、淋巴瘤和肝癌中被上调(Nakagawara，A.et al.，1997，Cancer Res.57：4578-4584；Izban，K.F.etal.，Am.J.Pathol.154：1439-1447；Persad，R.et al.，Modern Patholo.17：861-867)。再者，美国国家癌症研究所治疗发展部(National CancerInstitute(NCI)DevelopmentalTherapeutics Program)对用于癌症筛选的60个细胞系组中胱天蛋白酶原-3水平进行了***评价。评价揭示了某些肺癌、黑素瘤、肾癌和乳腺癌显示出极大提高的胱天蛋白酶原-3表达水平(Svingen，P.A.et al.，Clin.Cancer Res.10：6807-6820)。
由于活性胱天蛋白酶-3在完成凋亡中的作用、胱天蛋白酶原-3在某些癌细胞类型中相对较高的表达水平以及值得注意的由安全闩介导的对其自体活化的抑制，本发明人有理由认为直接修饰胱天蛋白酶原-3的小分子可被鉴定，并且这类分子在靶向癌症治疗中可能有广泛应用。
在本文中本发明人尤其公开了，包括能够诱导细胞死亡的小分子的组合物和方法。在一些实施方案中，一些组合物和方法涉及可直接或间接与程序性细胞死亡途径成员(例如胱天蛋白酶原-3)相互作用的化合物。在一些实施方案中，与其它直接或间接与程序性细胞死亡途径成员(例如胱天蛋白酶原-3)相互作用的化合物相比，本发明的组合物和方法具有降低的神经毒性。
发明内容
本发明在广义上提供了治疗性治疗的化合物、组合物和方法。在一些实施方案中，本发明适用于多种癌症疾病和癌细胞种类的情况，例如乳腺癌、淋巴瘤、肾上腺癌、肾癌、黑素瘤、白血病、成神经细胞瘤、肺癌、脑癌和本领域中已知的其它癌症。
还需进一步说明的是，已经发现了能够活化通常以其无活性形式在癌细胞中过表达的酶的化合物。所述化合物可诱导癌细胞中的程序性细胞死亡(凋亡)，包括上调胱天蛋白酶原-3的化合物。许多癌症会抵抗标准化学治疗。本发明的化合物可以利用在癌细胞中可能被上调的生物靶，因此甚至在其凋亡机构有缺陷的细胞中也被证明可起作用。这些化合物也可成功用于靶向癌症疗法，其中有利的是选择性杀死癌细胞，同时对胱天蛋白酶原-3水平较低的非癌细胞的副反应相对较低。这些副反应可包括毒性，特别是神经毒性。
不欲拘泥于具体理论，据信本发明的化合物、组合物和方法的实施方案可通过在癌细胞治疗中有效的凋亡或程序性细胞死亡的调节机理发挥作用。在一个优选的实施方案中，凋亡的调节通过诱导凋亡实现。在另一个实施方案中，凋亡的调节通过抑制凋亡实现。
提供了具有N-酰基腙锌-螯合核心的化合物，所述核心具有至少一个连接于末端苯基环的极性基团。还提供了具有原-羟基N-酰基腙锌螯合核心的化合物，所述核心具有至少一个连接于末端苯基环的极性基团。
更特别地，提供了具有式(FX1)的化合物：
Figure BSA0000135556050000031
其中
X1、X2、X3、X4和X5各自独立地为C或N，其中当X1、X2、X3、X4和X5为N时，相应的R10、R11、R12、R13或R14不存在；
R10、R11、R12、R13、R14、R3、R7、R8和R9之一含有选自以下的极性基团：氨磺酰基、硝基、氨基、羧基、磺酰基和芳基磺酰基；
R10、R11、R12、R13、R14、R3、R7、R8和R9中的其它基团各自独立地选自：氢、卤素、氨磺酰基、硝基、氨基、羧基、磺酰基、芳基磺酰基、烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和C2-C6烯基；n和m各自独立地为1至3的整数；R4和R5各自独立地为CH或N；A为O或S；R6为氢或C1-C6烷基；X为氧；并且R2为氢、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基。
还提供了具有式(FX11)的化合物：
Figure BSA0000135556050000032
其中
X1、X2、X3、X4和X5各自独立地为C或N，其中当X1、X2、X3、X4和X5为N时，相应的R10、R11、R12、R13或R14不存在；
R10、R11、R12、R13和R14之一含有选自以下的极性基团：氨磺酰基、硝基、氨基、羧基、磺酰基和芳基磺酰基；
R10、R11、R12、R13和R14中的其它基团各自独立地选自：H、卤素、氨磺酰基、硝基、氨基、羧基、磺酰基、芳基磺酰基和烷氧基；n和m各自独立地为1至3的整数；R4和R5各自独立地为CH或N；A为O或S；R6为氢或C1-C6烷基；R3、R7、R8、R9各自独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或C2-C6烯基；X为氧；并且R2为氢、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基。
在一个实施方案中，R2X在本文提供的任何式和结构中均为-OH。在一个实施方案中，R3在本文提供的任何式和结构中均为甲氧基或烯丙基。在一个实施方案中，在式(FX1)中，R10、R11、R12、R13、R14、R3、R7、R8或R9之一选自：-NO2；
-COOH；
Figure BSA0000135556050000041
其中Ra和Rb各自独立地为氢、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基，
R18和R19各自独立地选自氢和C1-C6烷基，q为O至3的整数；
Figure BSA0000135556050000042
其中R16和R17各自独立地选自氢和C1-C6烷基，并且p为0至3的整数。
在一个实施方案中，在式(FX1)或(FX11)中，R10、R11或R12之一选自：-NO2；
-COOH；
Figure BSA0000135556050000043
其中Ra和Rb各自独立地为氢、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基，R18和R19各自独立地选自氢和C1-C6烷基，并且q为0至3的整数；
Figure BSA0000135556050000044
其中R16和R17各自独立地选自氢和C1-C6烷基，并且p为0至3的整数。
在一个实施方案中，在式(FX1)中，R10、R11、R12、R13、R14、R3、R7、R8或R9之一为
Figure BSA0000135556050000045
其中Ra和Rb各自独立地为氢、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基；R18和R19各自独立地选自氢和C1-C6烷基；q为0至3的整数。
在一个实施方案中，在式(FX1)或(FX11)中，R10、R11、R12、R13、或R14之一为
Figure BSA0000135556050000051
其中Ra和Rb各自独立地为氢、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基；R18和R19各自独立地选自氢和C1-C6烷基；q为0至3的整数。
在一个实施方案中，在式(FX1)或(FX11)中，R12为
Figure BSA0000135556050000052
其中Ra和Rb各自独立地为氢、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基；R18和R19各自独立地选自氢和C1-C6烷基；并且q为0至3的整数。在一个实施方案中，在R12中，Ra和Rb各自为氢，并且q为0。
在一个实施方案中，R3为烯丙基，X为O，并且R2为氢。在一个实施方案中，R12为-S(＝O)2-NH2。在一个实施方案中，R11、R12和R13为甲氧基。在一个实施方案中，R3为烯丙基，X为O，并且R2为氢。在一个实施方案中，X1、X2、X3、X4和X5中的一个或两个为N。
还提供了具有式(FX2)的式(FX1)或(FX11)化合物：
Figure BSA0000135556050000054
其中变量如本文其它地方对式(FX1)或(FX11)的描述。
还提供了具有式(FX12)的式(FX1)或(FX11)化合物：
Figure BSA0000135556050000053
其中变量如本文其它地方对式(FX1)或(FX11)的描述。
还提供了具有式(FX3)、(FX4)、(FX5)或(FX6)的式(FX1)或(FX11)化合物：
Figure BSA0000135556050000061
还提供了具有式(FX7)或(FX8)的式(FX1)或(FX11)化合物：
Figure BSA0000135556050000062
还提供了包含荧光标记物的式(FX1)或(FX11)化合物。还提供了具有结构(FX9)的式(FX1)或(FX11)化合物：
Figure BSA0000135556050000071
在一个实施方案中，还提供了一种在癌细胞中选择性诱导凋亡的方法，包括将能够修饰所述癌细胞的胱天蛋白酶原-3分子的化合物给予所述癌细胞；其中所述化合物为式(FX1)或(FX11)的化合物。在一个实施方案中，还提供了一种选择性诱导癌细胞凋亡的方法，包括将能够修饰所述癌细胞的胱天蛋白酶原-3分子的化合物给予所述癌细胞；其中所述化合物为式(FX1)或(FX11)化合物，并且其中所述癌细胞在需要治疗的患者体内。在一个实施方案中，还提供了一种治疗癌细胞的方法，包括(a)鉴别对以胱天蛋白酶原活化化合物进行的癌细胞治疗的潜在易感性；和(b)使所述癌细胞暴露于有效量的所述胱天蛋白酶原活化化合物；其中所述胱天蛋白酶原活化化合物为式(FX1)或(FX11)化合物。在一个实施方案中，还提供了一种治疗癌细胞的方法，包括(a)鉴别对以胱天蛋白酶原活化化合物进行的癌细胞治疗的潜在易感性；和(b)使所述癌细胞暴露于有效量的所述胱天蛋白酶原活化化合物；其中所述胱天蛋白酶原活化化合物为式(FX1)或(FX11)化合物，其中所述胱天蛋白酶原活化化合物能够活化胱天蛋白酶原-3和胱天蛋白酶原-7中的至少一个。在一个实施方案中，还提供了一种诱导癌细胞死亡的方法，包括将能够活化所述癌细胞的胱天蛋白酶原-3分子的化合物给予所述癌细胞，其中所述化合物为式(FX1)或(FX11)化合物。在一个实施方案中，还提供了一种药物，所述药物包含有效量的一种或多种式(FX1)或(FX11)化合物。在一个实施方案中，还提供了一种制备用于治疗癌细胞的药物的方法，所述药物包含一种或多种式(FX1)或(FX11)化合物。在一个实施方案中，还提供了一种诱导细胞凋亡的方法，包括将式(FX1)或(FX11)化合物给予所述细胞。还提供了一种如本文所述的方法，其中所述胱天蛋白酶原活化化合物的logBB为-0.4至-2。还提供了一种如本文所述的方法，其中所述式(FX1)或(FX11)化合物的logBB为-0.4至-2。还提供了一种如本文所述的方法，其中所述化合物不穿透血脑屏障至(例如)在患者体内引起可感知的神经毒性作用的程度。还提供了一种离体方法，包括使细胞与有效量的式(FX1)或(FX11)化合物接触。还提供了一种处理细胞的方法，该方法包括使细胞与有效量的式(FX1)或(FX11)化合物接触的步骤。还提供了用于治疗的式(FX1)或(FX11)的化合物。还提供了式(FX1)或(FX11)的化合物或所述癌症的治疗。还提供了式(FX1)或(FX11)化合物用于制造治疗癌症的药物的用途。
在一个方面中，本发明化合物上的至少一个取代基为极性基团。在一个实施方案中，A为O。在一个实施方案中，R4和R5都为N。在一个实施方案中，m和n都为1。在一个实施方案中，X1、X2、X3、X4和X5都为C。在一个实施方案中，R6为H。在一个实施方案中，R7、R8和R9都为H。在一个实施方案中，R3为烯丙基。在一个实施方案中，R10和R14为H，R11、R12和R13各自为甲氧基。在一个实施方案中，R2X为-OH。在一个实施方案中，R3为甲氧基。在一个实施方案中，R3、R7、R8和R9之一为甲氧基。在一个实施方案中，R3、R7、R8和R9中的两个为甲氧基。在一个实施方案中，R3、R7、R8和R9中的三个为甲氧基。在一个实施方案中，R10、R11、R12、R13和R14之一为甲氧基。在一个实施方案中，R10、R11、R12、R13和R14中的两个为甲氧基。在一个实施方案中，R10和R13为甲氧基。在一个实施方案中，R10、R11、R12、R13和R14中的三个为甲氧基。在一个实施方案中，R10、R11、R12、R13和R14中只有一个不为氢。在一个实施方案中，R11、R12、R13和R14中只有一个不为氢。在一个实施方案中，R11或R12不为氢。
在本发明的一个方面中，本文所述和所示的任何式的化合物都以荧光标记物进行标记。对本发明的化合物和方法使用荧光标记物使得可追踪所需***中的所述化合物，确定所述化合物浓度，并且如本领域已知，具有其它用途。具体荧光标记物的种类、使用、合成和选择在本领域普通技术人员的技术水平内。在一个具体实施方案中，所述荧光标记物为Alexa Fluor 350。本文意欲包括和公开其它荧光标记物，就如其被逐一列举一样。
在本发明的一个方面中，本发明的化合物穿透血脑屏障的量不足以引起将需要停止治疗的量的神经毒性或其它副效应。在本发明的一个方面中，例如，本发明的化合物的logBB为-0.4至-2。
在本发明的一个方面中，本发明的化合物可诱导癌细胞的细胞死亡。在本发明的该方面的实施方案中，本发明的化合物可诱导淋巴瘤、白血病、黑素瘤、***和乳腺癌细胞的细胞死亡。
如“极性基团”在本领域中所用的，本文使用的该术语包括至少一个至少部分极性的键。极性基团含有至少一个具有偶极矩的键。如“极性基团”在本领域中所用的，本文使用的该术语可包括作为整个化学“基团”一部分的极性基团。
本文使用的氨磺酰基团具有结构：
Figure BSA0000135556050000081
其中Ra和Rb各自独立地为氢、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基；R18和R19各自独立地选自氢和C1-C6烷基；q为0至6的整数。在一个实施方案中，Ra和Rb各自为氢。
本文使用的磺酰基含有结构：-SO2-。在一个实施方案中，所述磺酰基为具有结构
Figure BSA0000135556050000082
的芳基磺酰基的一部分：
其中R16和R17各自独立地选自氢和C1-C6烷基，其中所述芳基可任选地在环上被一个或多个杂原子取代并且可任选地被一个或多个卤原子、硝基、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基取代，p为0至6的整数。磺酰基可以任何合适的取代基(例如氢或C1-C6烷基)封端。
本文使用的烯丙基是指烯基-CH2-CH＝CH2。
本文使用的硝基含有结构-NO2。在一个实施方案中，硝基可为烷基硝基的末端基团，其中一至六个任选被取代的亚甲基在硝基官能团之前。本文使用的羧基含有结构：-COOH。在一个实施方案中，羧基由C1-C6烷基替代氢而封端。
附图说明
图1显示了胱天蛋白酶原-3的小分子活化的一些方面。
图2显示了PAC-1选择性杀死多种癌细胞。
图3显示了PAC-1阻滞小鼠异种移植癌症模型中的肿瘤生长。
图4显示了PAC-1阻滞小鼠体中的肿瘤生长。
图5显示了PAC-1可缓解Zn2+对胱天蛋白酶原-3的抑制。正如通过裂解Ac-DEVD-pNA底物所评价的，锌抑制体外胱天蛋白酶原-3(D9A/D28A/D175A)突变体(D3A，2.5μM)活性的能力在存在PAC-1(50μM)的情况下被降低。所示数据代表三次试验。
图6显示了，在含有10μM ZnSO4的缓冲液中测定时，PAC-1可增强胱天蛋白酶原-3(D9A/D28A/D175A)(D3A)突变体的活性。
图7显示了，在含有10μM ZnSO4的缓冲液中测定时，PAC-1-I-8可增强胱天蛋白酶原-3(D9A/D28A/D175A)(D3A)突变体的活性。
图8显示了，将ZnSO4滴定至PAC-1的溶液(50μM在50mM Hepes、100mM KNO3、pH 7.2缓冲液中)可引起PAC-1的UV-可见光谱的变化。所示的是以5μM的增量由0至75μM的ZnSO4浓度。
图9显示了，用连续变化方法分析PAC-1-Zn2+结合相互作用和进行化学计量。基于峰值的位置，确定化学计量为1∶1，确定Kd为42nM。误差棒代表平均值的标准偏差。
图10显示了，将ZnSO4滴定至PAC-1-I-8的溶液(50μM，在50mMHepes、100mM KNO3、pH7.2缓冲液中)不引起PAC-1-I-8的UV-可见光谱的变化。
图11显示了由改变PAC-1-II-7浓度引起的细胞死亡百分数。
图12显示了由改变PAC-1-IV-3浓度引起的细胞死亡百分数。
图13显示了PAC-1-II-6的锌结合。
图14显示了共焦显微术研究的结果。
图15显示了PAC-1-Zn2+复合物的最低能量构象异构体。
图16显示了体外表征S-PAC-1。A)PAC-1和S-PAC-1的结构。B)Zn2+：S-PAC-1复合物的形成曲线。S-PAC-1以46±5nM的Kd结合锌。C)S-PAC-1在体外活化胱天蛋白酶原-3D3A。将浓度10μM的未切割的胱天蛋白酶原-3(D3A)在存在15μM外源锌的情况下孵育。加入50μMS-PAC-1在最初五分钟过程中导致活性快速增加，之后在随后的60分钟中缓慢增加。D)S-PAC-1可诱导U-937细胞的凋亡。将U-937细胞与50μM S-PAC-1孵育12小时，通过膜联蛋白V/PI染色进行分析。
图17显示了S-PAC-1的特征。A)对小鼠腹膜内给药的S-PAC-1的药代动力学。将C57/BL6小鼠用125mg/kg溶解于2-羟丙基-b-环糊精的S-PAC-1经过腹膜内给药进行处理。在不同的时间将小鼠处死并抽血。血清中S-PAC-1的浓度通过LC确定。125mg/kg的S-PAC-1具有约170μM的血浆浓度峰值和约1小时的半衰期。B)研究用猎狗中单剂量S-PAC-1的药代动力学。对四只猎狗静脉给予单剂量的S-PAC-1(25mg/kg在2-羟丙基-β-环糊精中)，在不同时间抽血，并通过LC确定血清的S-PAC-1浓度。S-PAC-1在狗中具有约150μM的血浆浓度峰值和约3小时的半衰期。C)对三只健康的猎狗连续输注给予S-PAC-1。狗在10分钟的时间内接受初始负荷剂量，之后在接下来的24小时内恒速输注。在不同时间点抽血并通过LC分析确定血浆中S-PAC-1浓度。S-PAC-1的连续输注被很好地耐受，并且在狗中成功确立了稳态的S-PAC-1血清浓度。
图18显示了带有淋巴瘤的狗中的S-PAC-1的药代动力学。对参加临床试验的狗给予7mg/kg的负荷剂量和3mg/kg/hr的恒速输注24(A-C)或72(D-E)小时。在不同时间点抽血并通过LC分析确定S-PAC-1的血清浓度。
图19显示了S-PAC-1处理的抗肿瘤效果。上图)在7周时间内患者1的RECIST分值。箭头指示治疗天数。在处理过程中，患者1出现了RECIST分值降低27％。处理结束后，肿瘤尺寸迅速增大(第42天)。下图)下颌***(显示轮廓)的CT扫描显示，在处理之前(第0天)和给予S-PAC-1一周后(第7天)肿瘤尺寸的显著减小。
图20显示了代表性的EGTA荧光滴定测定数据，其中S-PAC-1-Zn：KD＝46±5nM。
具体实施方式
一般而言，本文使用的术语和短语具有其领域认可的含义，其可参见于本领域技术人员已知的标准的教科书、期刊参考文献和上下文。
应用以下缩写。IAP，凋亡抑制剂；PAC-1，胱天蛋白酶原活化化合物1；PARP，聚(ADP-核糖)聚合酶。
提供以下定义以阐明其在本发明的上下文中的具体用法。
本文使用的术语“化学治疗试剂”是指任何能够减小或防止癌细胞、癌细胞群、肿瘤或其它恶性组织的生长、增殖或扩散的物质。该术语还意在包括任何抗肿瘤或抗癌试剂。
本文使用的术语“有效量”意在包括诸如药用有效量或治疗有效量的范围。例如，在一些实施方案中，该量能够实现有利状态、有利结果、筛选测定中的功能活性或者临床状态改善。
本文使用的术语“癌细胞”意在包括本领域中广义理解的定义。在一个实施方案中，该术语是指被异常调节的细胞，其会导致人或动物中的癌症临床病症。在一个实施方案中，该术语可以指人或动物中的细胞系或细胞或者来自人或动物的培养的细胞系或细胞。癌细胞可为各种各样分化的细胞、组织或器官类型，这是本领域中可理解的。
术语“烷基”是指支化或非支化的饱和烃链(优选具有1至22个碳原子)的单价团(monoradical)和含有一个或多个环的环烷基(具有3至22个碳原子)。短烷基为含有1至6个碳原子的烷基，包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基，包括所有其异构体。长烷基为含有8-22个碳原子的烷基，优选含有12-22个碳原子的烷基、含有12-20个碳原子的烷基和含有16-18个碳原子的烷基。
术语“环烷基”是指具有单环或多个稠环的3至22个碳原子环烷基。环烷基包括具有3-8元环的环烷基和具有5和6元环的环烷基。环烷基包括例如单环结构，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基等，或多环结构，例如金刚烷基等。
术语“烯基”是指支化或非支化的不饱和烃基团(优选具有2至22个碳原子)的单价团和含有一个或多个环的环烯基(具有3至22个碳原子)，其中至少一个环包含双键。烯基可含有一个或多个双键(C＝C)，其可为缀合的。优选的烯基为具有1或2个双键的烯基。短烯基为具有2至6个碳原子的烯基，包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基，包括所有其异构体。长烯基为具有8-22个碳原子的烯基，优选具有12-22个碳原子的烯基、含有12-20个碳原子的烯基和具有16-18个碳原子的烯基。术语“环烯基”是指具有单环或多个稠环的3至22个碳原子的环状烯基，其中至少一个环含有双键(C＝C)。环烯基包括例如单环结构，例如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环辛烯基、环辛二烯基和环辛三烯基。术语烯丙基表示烯基-CH2-CH＝CH2。
术语“炔基”是指不饱和烃的单价团，优选具有2至22个碳原子并且具有一个或多个三键(C≡C)。炔基包括乙炔基、炔丙基等。短炔基为具有2至6个碳原子的炔基，包括所有其异构体。长炔基为具有8-22个碳原子的炔基，并且优选具有12-22个碳原子的炔基、具有12-20个碳原子的炔基和具有16-18个碳原子的炔基。
术语“芳基”是指含有6至22个碳原子的不饱和芳香族碳环基团的基团，具有单环(例如苯基)、一个或多个环(例如联苯)或多个稠环，其中至少一个环是芳香族的(例如萘基、二氢菲基、芴基或蒽基)。芳基包括苯基、萘基等。芳基除包含不饱和芳环之外还可包含烷基、烯基或炔基的部分。术语“烷芳基”是指含有烷基部分的芳基，即-亚烷基-芳基和-被取代的亚烷基-芳基。这类烷芳基例如苄基(-CH2-苯基)、苯乙基等。
如本文所述，烷基、烯基、炔基和芳基任选地是被取代的(所述术语可包括被取代的变体)并且可包含1-8个非氢取代基，取决于所述基团中碳原子的数目和所述基团的不饱和程度。本文所述的所有这些变化可以是非取代的(其中任何可为氢的可变化基团都为氢)或者被一个或多个选自以下的非氢取代基取代：卤素(包括氟、氯、溴或碘)、C1-C3卤代烷基、羟基(OH)、巯基(HS-)、C1-C6烷基、C1-C3烷基、C1-C6烷氧基、C1-C3烷氧基、苯基、苄基、烯基、C2-C4烯基、炔基、C2-C4炔基、-NH2、-NR’H、-NR’R”、R’CO-、R’R”NCO-、R’CO-NH-或R’CO-NR’-，其中R’和R”为C1-C6烷基、C1-C3烷基或苯基。
术语“氨基”是指基团-NH2或基团-NE’R”，其中各R’和R”独立地选自氢、烷基或芳基。
烷氧基为已通过键合于氧而被修饰的烷基，可由式R-O代表，也可称为烷基醚基团。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和庚氧基。烷氧基包括其中所述基团的烷基部分被取代的取代烷氧基，这在本文有关烷基的描述中提供。本文使用的MeO-是指CH3O-。
“卤代烷基”是指被一个或多个相同或不同的本文定义的卤基团取代的本文定义的烷基。代表性的卤代烷基包括例如三氟甲基、3-氟十二烷基、12，12，12-三氟十二烷基、2-溴辛基、3-溴-6-氯庚基等。
术语“卤”或“卤素”是指卤素基团，例如氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)、碘(-I)或砹(-At)。
术语“杂芳基”是指在至少一个环(如果有多于一个环)中具有1至4个选自氧、氮和硫的杂原子的2至22个碳原子芳香基。杂芳基可任选是被取代的。杂芳基尤其包括具有5和6元环的杂芳基以及环中具有一或两个氮的杂芳基、环中有一或两个氧的杂芳基和环中有一或两个硫的杂芳基。
术语“杂环”或“杂环的”是指具有单环或多个稠环的饱和或不饱和基团的单价团，有2-22个碳原子并且在至少一个环中有1至6个杂原子，优选1至4个杂原子，所述杂原子选自氮、硫、磷和/或氧。杂环基团可以是被取代的。环优选地具有3-10个成员，更特别地具有5或6个成员。
术语“酯”是指如本领域中理解的化学实体，特别是可包括(RCO-)形式的基团。
至于含有一个或多个取代基的任何上述基团，应理解，这类基团不含空间上(sterically)不切实际和/或合成上不可行的任何取代或取代形式。本发明的化合物包括对所公开化合物的取代所产生的所有新立体化学异构体。
如本领域中常规和公知的，本文所述式中的氢原子并不总是明确地显示出，例如，连接于芳环和脂环的碳原子的氢原子并不总是明确地显示于式中。本文提供的结构，例如在描述所述式的上下文中，意欲向本领域技术人员表达本发明的方法和组合物的化合物的化学组成，并且如本领域技术人员可理解的，所提供的结构未显示这些化合物的原子之间的具体键角。
应注意，除非上下文另外明确指出，本说明书和所附权利要求述中使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数的提及物。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞和本领域技术人员已知的其等价物，等等。另外，术语“一”、“一或多”和至少“一”在本文中可互换使用。还应注意，术语“包含”、“包括”和“具有”可互换使用。表述“权利要求XX-YY的任一项的”(其中XX和YY表示权利要求编号)意在提供多个替换形式的从属权利要求，并且在一些实施方案中可与术语“如权利要求XX-YY任何一项中的”互换。
除非另外定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域中普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管类似或等价于本文所述方法和材料的任何方法和材料都可用于实施或测试本发明，下面将描述优选的方法和材料。本文中任何信息都不应解释为由于这些公开内容在发明之前而本发明不能早于这些公开内容。
在一些实施方案中，脂质体或微团可用作所述组合物的载体或运载体。
除非另外声明，本文所述或示例组分的每种制剂或结合物都可用于实施本发明。
可将本发明的组合物、制品和制剂配制成用于肠内给药、肠胃外给药、局部给药、气雾剂给药、吸入给药或皮肤给药的诊断或治疗组合物。所述组合物、制品和制剂的局部或皮肤送递也可包括气雾剂、乳剂、凝胶剂、溶液剂等。本发明的组合物、制品和制剂以可有效实现所需诊断和/或治疗效果的剂量给药。这类剂量可以在宽的范围内变化，取决于所述组合物中应用的具体组成、需要检查的器官或组织、临床操作中应用的设备、达到的治疗效力等。这些组合物、制品和制剂含有有效量的所述组合物，以及适合于预计给药类型的常规药用载体和赋形剂。这些组合物、制品和制剂也可任选地包括稳定剂和皮肤渗透增强剂。“患者”或“受试者”，在本文中等同使用，是指动物。具体而言，动物是指哺乳动物，优选人。受试者可以：(1)患有通过给予本发明化合物或组合物可诊断、预防和/或治疗的病症；或者(2)易感通过给予本发明化合物或组合物可诊断、预防和/或治疗的病症。
在一个实施方案中，本发明的组合物为化学治疗剂。
在一个实施方案中，本发明提供了涉及有效浓度(优选约10nM至约100μM)的所公开结构式的化合物和方法。在另一个实施方案中，所述有效浓度为约200nM至约5μM。在一个实施方案中，所述有效浓度被认为是这样一个值，例如在直接胱天蛋白酶原活化测定中、在细胞凋亡诱导测定中或者在动物临床治疗评价中50％活性浓度。在一个优选的实施方案中，该值少于约200μM。在一个优选的实施方案中，该值少于约100μM。
本发明的化合物和可用于本发明方法中的化合物包括具有所公开式的化合物和这些化合物的酯，优选包括可药用的盐和酯。
在一个实施方案中，本发明提供了前药形式的组合物。本发明化合物的前药可用于本发明的方法中。可在体内被转化以提供生物活性、药用活性或治疗活性形式的本发明化合物的任何化合物都是前药。前药的多种实例和形式是本领域中熟知的。生物分子(例如前体蛋白或前体核酸)可为前药。前药的实例见于，尤其是Design of Prodrugs，edited byH.Bundgaard，(Elsevier，1985)，Methods in Enzymology，Vol.42，at pp.309-396，editedby K.Widder，et al.(Academic Press，1985)；A Textbookof Drug Design andDevelopment，edited by Krosgaard-Larsen and H.Bundgaard，Chapter 5，“Design andApplication of Prodrugs，”，H.Bundgaard，at pp.113-191，1991)；H.Bundgaard，Advanced DrugDelivery Reviews，Vol.8，p.1-38(1992)；H.Bundgaard，et al.，JournalofPharmaceutical Sciences，Vol.77，p.285(1988)；and Nogrady(1985)MedicinalChemistry A Biochemical Approach，Oxford University Press，New York，pages388-392)。
在一个实施方案中，本发明的组合物为分离或纯化的形式。
应认识到，不管本文中认为或公开的任何机理解释或设想最终正确与否，本发明的实施方案都是可实施且有用的。
当本文公开一组取代基时，应理解该组和所有亚组的所有单个成员(包括组成员的任何异构体和对映异构体)都分别被公开。当本文使用马库什组或其它分组时，所述组的所有单个成员和组的所有可能组合和亚组合都意在被单独地包括在本公开内容中。发明人预计本说明书中提供的任何马库什组或列表的任一个或多个成员都可根据需要从本发明中排除。当在本文中描述一种化合物使得所述化合物的一种具体异构体或对映异构体未被以例如式或以化学名给出时，该描述意在包括单独或以任何组合形式描述的化合物的每种异构体和对映异构体。此外，除非另外说明，否则本公开内容意在包括本文中公开的化合物的所有同位素变体。例如，应理解，所公开的分子中的任一个或多个氢都可以氘或氚替代。分子的同位素变体通常可用作测定所述分子的标准物以及可用在与该分子或其用途相关的化学和生物研究中。化合物的具体名称旨在示例，因为已知本领域普通技术人员可以不同名称命名相同的化合物。
本文公开的分子可包括一个或多个可电离的基团[可从其上除去质子的基团(例如-OH、-COOH等)或加入质子的基团(例如胺)或者可被季铵化的基团(例如胺)]。这类分子及其盐的所有可能离子形式都意在被单独地包括在本公开内容中。就本文的化合物的盐而言，本领域普通技术人员可在大范围的可获得的抗衡离子中，选择适合于制备本发明的盐的抗衡离子以用于所给定的应用。例如，通常任何阴离子都可用于形成本文的化合物的盐；例如卤素、硫酸根、羧酸根、乙酸根、磷酸根、硝酸根、三氟乙酸根、乙醇酸根、丙酮酸根、草酸根、苹果酸根、丁二酸根、富马酸根、酒石酸根、柠檬酸根、苯甲酸根、甲磺酸根、乙磺酸根、对甲苯磺酸根、水杨酸根等。
本发明的化合物及其盐或酯可以以其互变异构体的形式存在，其中使氢原子换位至所述分子的其它部分并且所述分子的原子之间的化学键相应地重排。应理解，所有互变异构体形式，在其可存在的范围内，都包括在本发明中。另外，所述化合物可具有反式和顺式异构体，并且可含有一个或多个手性中心，因此以对映异构和非对映异构的形式存在。除非本文另外声明，本发明可包括所有这类异构体、单个的对映异构体，以及顺式和反式异构体的混合物、非对映异构体的混合物；对映异构体的非外消旋和外消旋混合物(光学异构体)；和富含一种或多种形式的上述混合物。当不具体提及化合物(或不对称碳)的构型(顺式、反式，或者R或S)时，则意在指多于一种异构体的任一种异构体或混合物。制备过程可使用外消旋体、对映异构体或非对映异构体作为原料。在制备对映异构体或非对映异构体产物时，它们可用常规方法分离，例如通过色谱法或分级结晶。本发明化合物可为游离形式或水合物形式。
除非另外声明，本文描述或示例的组分的每种制剂或结合物都可用于实施本发明。
每当在本申请中描述范围时，例如温度范围、时间范围、logBB或者组成或浓度范围，所有居间范围和亚范围以及所有包括在所给范围内的单个值都意在被包括在本公开内容中。
本文公开的任何参考文献中的信息在一些情况下可表明现有技术状态，例如在其有效提交日期提交的专利文献；发明人意欲根据需要将这些信息应用于本文以排除确实在现有技术中出现的具体实施方案。例如，当化合物被公开和/或要求保护时，应理解，相对于本发明界定为现有技术的化合物，包括参考文献中公开的化合物，都不欲包括在本发明主题权利要求的组合物中。
本文提供的一些参考文献通过引用的方式纳入，以提供有关本发明的原料来源、其它原料、其它试剂、其它合成方法、其它分析方法和其它用途的细节。基于本领域中的知识，本领域普通技术人员会理解具体示例以外的原料、试剂、固体底物、合成方法、纯化方法和分析方法均可应用于实施本发明而不需要借助过多实验。
通过以下非限制性实施例可进一步理解本发明。
实施例1.PAC-1和个性化抗癌疗法
如本文进一步讨论的，凋亡是多细胞生物中常见的程序性细胞死亡类型。逃避凋亡是癌症的一个标志，许多癌症可抗天然凋亡信号。这种抗性最常是由于上游凋亡蛋白的异常表达和突变，这可阻止促凋亡信号向下游的半胱氨酸-天门冬氨酸蛋白酶——胱天蛋白酶的正常传输。最终，执行者胱天蛋白酶-3的活化是大多数凋亡途径中主要的关键步骤。令人惊奇地，在许多癌症中胱天蛋白酶原-3被上调，但上游凋亡级联的变化可防止其被活化。
许多促凋亡化合物已被开发来靶向胱天蛋白酶-3上游的凋亡蛋白。然而，上述障碍通常会阻止这些化合物在癌细胞中发挥其所需的促凋亡效应。一种个性化的且更有效的抗癌策略涉及对所述级联中任何障碍物下游的促凋亡蛋白的直接活化。图1显示了胱天蛋白酶原-3的小分子活化的一些方面。
本发明人已报道了PAC-1是这样的小分子，即其在体外和许多癌细胞系内直接将胱天蛋白酶原-3活化成胱天蛋白酶-3，诱导癌细胞凋亡(Nat.Chem.Biol.2006，2，543-550)。PAC-1还在多种小鼠癌症模型中被证明具有效力。
上游凋亡蛋白的突变和异常表达可阻止促凋亡信号到达下游效应物——胱天蛋白酶。在许多癌症中关键执行者胱天蛋白酶原-3被上调。为了寻找能够直接活化胱天蛋白酶原-3的小分子，已付出了许多努力。其中一些努力在本文中进行了描述，进一步作为本发明的背景技术。
方案1显示了胱天蛋白酶原-3活化剂的示例性高通量筛选。
Figure BSA0000135556050000151
λ最大＝405nm
方案1
以发色底物筛选约20000种化合物目的是筛选它们将胱天蛋白酶原-3活化成活性胱天蛋白酶-3的能力。PAC-1被鉴定为能够以剂量依赖的方式活化胱天蛋白酶原-3的化合物。PAC-1-I-8为显示无活性的结构相关的化合物。
Figure BSA0000135556050000152
图2显示了PAC-1可选择性杀死癌细胞。PAC-1可诱导分离自刚切除的结肠肿瘤的细胞死亡。刚切除的原代结肠肿瘤(和邻近的非癌组织一起)取自23个人，将癌组织和非癌组织分离。PAC-1以与胱天蛋白酶原-3的细胞浓度成比例的方式诱导细胞死亡。圆圈代表取自23个结肠肿瘤的原代癌细胞。黑三角代表多种癌细胞系。菱形为四种非癌细胞类型：Hs888Lu(肺成纤维细胞)、MCF-10A(乳腺成纤维细胞)、Hs578Bst(乳腺上皮细胞)和分离自健康供体骨髓的白细胞。方形为分离自所述23个人的肿瘤边缘的原代非癌细胞。
图3和4显示了癌症的小鼠异种移植模型中肿瘤生长的PAC-1阻滞(Putt，etal.Nat.Chem.Biol.2006，2，543-550)。对于图3，使用NCI-H226(肺癌)细胞系通过皮下注射在小鼠中形成肿瘤，每组八只小鼠，每只小鼠三个肿瘤。通过口服管饲法在第1-21天每天一次给予PAC-1或载体。误差棒为s.e.m。对于图4，以NCI-H226细胞系注射小鼠。依照Putt，etal.Nat.Chem.Biol.2006，2，543-550中描述的方案，以PAC-1(100mg kg-1)经口服管饲法处理所述小鼠。对照小鼠的肺有大量灰色肿瘤块，而接受了PAC-1的小鼠几乎没有可见的肿瘤。
已知锌离子可抑制胱天蛋白酶原-3。PAC-1在存在锌的情况下能够以剂量依赖的方式活化胱天蛋白酶原-3，并且改变锌抑制的IC50。PAC-1-I-8不能活化胱天蛋白酶原-3，但在高浓度下显示出抑制作用。图5、6和7显示，PAC-1可缓解Zn2+对胱天蛋白酶原-3的抑制。检查了锌的浓度范围对胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶原-3酶活性的效应。将所有缓冲剂都首先以
Figure BSA0000135556050000161
树脂处理以除去任何痕量的金属污染物。因为胱天蛋白酶原-3本身会缓慢自蛋白水解成有活性的胱天蛋白酶-3，制备了胱天蛋白酶原-3的三突变体，其中所有三个胱天蛋白酶切割部位都被除去(D9A/D28A/D175A)。与文献中的数据一致，所述胱天蛋白酶原-3的三突变体是蛋白水解稳定的，具有比胱天蛋白酶-3的活性低约200倍(数据未显示)。存在锌的情况下的酶测定表明，该金属可强烈地抑制胱天蛋白酶-3(数据未显示)、胱天蛋白酶原-3(数据未显示)和胱天蛋白酶原-3(D9A/D28A/D175A)突变体(图5)。图6显示了当在含有10μM的ZnSO4的缓冲液中测定时，PAC-1可增强胱天蛋白酶原-3(D9A/D28A/D175A)(D3A)突变体的活性。如所示，PAC-1在高化合物浓度下实际上可抑制这三种酶。图7显示了，当在含有10μM的ZnSO4的缓冲液中测定时，PAC-1-I-8可增强胱天蛋白酶原-3(D9A/D28A/D175A)(D3A)突变体的活性。PAC-1-I-8在高化合物浓度下实际上可抑制这种酶，甚至在不存在ZnSO4的情况下也是如此。
图8、9和10显示了，PAC-1为一种金属螯合剂。在存在锌的情况下，PAC可显示405nm下吸光度的特征性增加。无活性衍生物甚至在高锌浓度下也未显示任何吸光度变化。使用这种吸光度偏移，PAC-1：Zn2+复合物的结合常数可通过连续变化法确定。如图8中所示，以渐增量的ZnSO4滴定PAC-1可导致该化合物的UV-可见光谱的变化。Zn2+结合时的摩尔吸光度的这种偏移可提供一种便捷的方法来确定PAC-1-Zn2+结合的化学计量和该相互作用的离解常数。将所述连续变化方法的变化方案用于该确定。对于总浓度50μM的多种摩尔分数的ZnSO4和PAC-1获得了410nm下的吸光度。然后，将这些值相对于被设为1的化学计量点处的可能最大吸光度值(即当所有Zn2+都被过量PAC-1结合时)标准化。应用所述连续变化方法揭示了PAC-1可以1∶1化学计量结合Zn2+，由图9的曲线图中0.5摩尔分数处的峰证明。从图9还可明显看出的是该小金属-金属相互作用的很强的性质。在1∶1的化学计量下，PAC-1几乎完全将其吸收值偏移至锌结合状态(在1∶1的PAC-1-Zn2+比例下，96％的PAC-1结合于Zn2+)。使用该96％值和方程log Ka＝0.3010-log M+log最大y-2log(1-最大y)，本发明人得到了Kd＝42nM的PAC-1-Zn2+相互作用。虽然PAC-1-Zn2+相互作用的Kd为42nM时，如图8中所示，使用微摩尔浓度的锌仍然观察到吸光度的变化。这是由于在该实验中与Kd相比的高总配体浓度(50μM)。基于该实验中使用的锌和PAC-1的浓度，Adair方程可预测在约30μM锌下PAC-1-Zn2+复合物的半最大总体平均位占据率(half maximal population average siteoccupancy)，与得到的数据一致(图8)。将ZnSO4滴定至PAC-1-I-8中没产生光谱变化(这通过UV-vis光谱法监测)，这与PAC-1-8不结合Zn2+的观点一致。为确认该结果，使用第二种方法来确定PAC-1-Zn2+的离解常数。在该实验中，将预先形成的PAC-1和Zn2+的复合物以EGTA[乙二醇二(p-氨基乙基醚)N，N’-四乙酸，一种金属结合剂，已知对Zn2+有亲和力]滴定，并监测410nm下的吸光度。用EGTA-Zn2+缔合常数的文献值，本发明人计算出PAC-1-Zn2+的离解常数为55nM，大致与通过所述连续变化方法计算的42nM的Kd相符。图10显示了，将ZnSO4滴定至PAC-1-I-8溶液(50μM在50nM的Hepes、100mM的KNO3、pH 7.2缓冲液中)中不会导致PAC-1-I-8的UV-可见光谱变化。所示的是以5μM的增量从0至70μM的ZnSO4浓度。
实施例2.PAC-1和衍生物的合成
分子建模形成了图15中所示的PAC-1-Zn2+复合物的最低能量构象异构体。该结构是使用MMFF力场对23种低能构象异构体进行构象搜索得到。该模型表明与N-酰基腙骨架的相互作用、与酚羟基的相互作用和与苄基环的阳离子-pi相互作用。
合成了结构改变的PAC-1衍生物家族，以研究这些结构组分及其在锌结合中的作用，以及该化合物家族的细胞毒性可能性。
合成了四种类型的衍生物，以研究酚位置(I类)、苄基(II类)、这些环的结合(III类)和N-酰基腙骨架(IV类)。这些类型显示于下文方案2中。
Figure BSA0000135556050000171
方案2
关于这些化合物和类型的另外的信息可见于：Peterson，et al.，J.Med.Chem.2009，52，5721-5731。大多数I-III类化合物是如方案3A所示经缩合合适的酰肼和醛进行合成。如方案3A所示，该缩合反应的产率在72与95％之间，1g是例外，其自发形成二硫化物二聚体，导致产率降低。通过这类缩合反应，合成了11个I类的衍生物(1a-k)、7个II类的衍生物(2a-g)和1个III类的衍生物(3)。方案1中的酰肼结构单元通过以下反应合成：多种苄基氯与哌嗪的反应，所得产物用氯乙酸乙酯的烷基化，之后所得酯与酰肼的反应。醛结构单元是市购的或者从简单原料合成。也可通过类似的缩合反应合成三个IV类衍生物。因此，缺少两个哌嗪氮中的一个的化合物(4a-c)是如方案3反应式1和2所示合成自相应的酰肼和醛。然而，IV类中许多衍生物不能经类似的缩合反应合成，需要另外的合成路径。因此，化合物4d是通过使用NaCNBH3还原PAC-1中的腙来合成(方案4A反应式3)。化合物4e-g是通过27与合适的氯化物反应来合成(方案4A反应式4-6)。这些类型可探测这些环体系的电子学以及复合物中包含的配位杂原子。
Figure BSA0000135556050000181
方案3：PAC-1的合成
改变两个环上的取代基，I-III类PAC-1衍生物是用与方案3A中所示相同的路径合成。
Figure BSA0000135556050000191
方案3A.应注意到，针对该方案提供了“R”变量，用法不必与本公开内容剩余部分的用法相同。本公开内容通篇中所有这类变化都是本领域普通技术人员易于理解的。
IV类化合物是如下所示经过稍微改变合成。
Figure BSA0000135556050000192
方案4.IV类化合物的合成。
一些其它的IV类化合物是使用方案4A中所示的方法合成。
Figure BSA0000135556050000201
方案4A。
这里提供了所述四类化合物的合成方法。材料——除非另外指出，所有试剂均购自Fisher。所有缓冲液都用MilliQ纯净水制备。合成了Ac-DEVD-pNA。Luria肉汤(LB)购自EMD。依托泊苷(Etoposide)购自Sigma。胱天蛋白酶活性缓冲液含有50mM的Hepes(pH 7.4)、300mM的NaCl并经
Figure BSA0000135556050000202
处理。Ni NTA结合缓冲液含有50mM的Tris(pH8.0)、300mM的NaCl和10mM的咪唑。Ni NTA洗涤缓冲液含有50mM的Tris(pH 8.0)、300mM的NaCl和20mM的咪唑。Ni NTA洗脱缓冲液含有50mM的Tris(pH 8.0)、300mM的NaCl和500mM的咪唑。膜联蛋白V结合缓冲液含有10mM的HEPES pH 7.4、140mM的NaCl、2.5mM的CaCl2、0.1％的BSA。C末端接6×His-标记的胱天蛋白酶原-3蛋白如下述进行表达。
细胞培养物——U937人类淋巴瘤细胞和SK-Mel-5人类黑素瘤细胞获自ATCC。细胞培养于补充有10％的FBS和1％的青霉素-链霉素的RPMI 1640生长培养基中。将细胞于37℃下和5％的CO2中孵育。SK-Mel-5细胞的传代培养是通过用0.05％的胰蛋白酶-EDTA(Gibco)稀释液胰蛋白酶消化细胞单层并进一步培养于如上所述补充有FBS和青霉素-链霉素的RPIM 1640生长培养基中而实现。
细胞死亡测定——将U937人类淋巴瘤细胞以5000个细胞/孔的密度铺板于96孔板孔中的200μL的RPMI生长培养基(含有10％的FBS和1％的青霉素-链霉素)中。以不同浓度向每个孔中加入2μL 100×化合物的DMSO储液，使得以浓度为0μM至100μM的化合物处理所述细胞。各浓度均重复试验五次。在各板中，加入10μM的依托泊苷的5个孔作为阳性对照，加入2μL的DMSO的5个孔作为阴性对照。然后，于37℃下和5％的CO2中将所述板孵育72小时。在72小时孵育期后，将这些板用如前所述的磺酰罗丹明B测定法进行分析。具体地，向板的每个孔中加入50μL的80％(w/v)TCA水溶液，然后使板于4℃静置过夜。然后将板用H2O流轻轻地洗涤五次，以除去过量TCA和沉淀的血清蛋白。然后使板进行空气干燥，之后将100μL含0.057％(w/v)磺酰罗丹明B的1％(v/v)乙酸溶液加入至各个孔，在室温下染色30分钟。在染色后，将所述孔用100μL的1％(v/v)乙酸轻轻洗涤5分钟，除去未结合的染料。然后将所述板进行空气干燥。然后将200μL的10mM的Tris碱(pH 10.5)加入至各个孔中，并将所述板置于轨道摇床上维持5分钟。然后在分子动力学(Molecular Dynamics)板读数仪中读出510nm下的OD，计算细胞死亡百分数并相对于阳性对照(100％细胞死亡)和阴性对照(0％细胞死亡)标准化。将各化合物浓度的细胞死亡百分数取平均，作图为化合物浓度的函数。使用Tablecurve 2D将所述数据拟合于对数的剂量响应曲线，并计算IC50值。将实验重复三次，记录计算的IC50值的平均值。确定并记录三次实验的平均值的标准偏差(SEM)。单个的剂量响应曲线未显示。
胱天蛋白酶原-3/胱天蛋白酶-3的重组表达和纯化——准确如前述重组表达并纯化胱天蛋白酶原-3和胱天蛋白酶-3。简言之，胱天蛋白酶原-3和胱天蛋白酶-3是由pHC332表达质粒在大肠杆菌(Eschericha coli)的电感受态BL21(DE3)菌株(Novagen)中表达。将C末端带6×His-标签的蛋白使用Ni NTA树脂(Qiagen)纯化。将含有蛋白的级分收集并合并。通过将所述蛋白加入以
Figure BSA0000135556050000211
树脂处理的装有胱天蛋白酶活性缓冲液(CaspaseActivity Buffer)的PD-10柱(GE Healthcare)，将所述纯化的蛋白进一步纯化以除去任何污染的锌。将所得的溶于胱天蛋白酶活性缓冲液中的不含锌且含蛋白级分合并，测定浓度，将所述蛋白溶液在液氮中快速冷冻并在-80℃下保存。
胱天蛋白酶-3活性测定——在胱天蛋白酶活性缓冲剂中制备不含锌的胱天蛋白酶-3(1μM)的储液(2×)。在胱天蛋白酶活性缓冲液中制备200μM至200nM的多种浓度化合物储液(2×)。制备含有ZnSO4(25μM)的胱天蛋白酶原活性缓冲液储液(10×)。向384孔板的每个孔中加入20μL的胱天蛋白酶-3(最终500nM)、20μL化合物储液和5μL的ZnSO4(最终2.5μM)或缓冲剂。各个板都包括阳性对照孔(0μM的锌且无化合物)和阴性对照孔(2.5μM的锌且无化合物)。将这些板在室温下孵育30分钟。然后，向所述板的每个孔中加入5μL的2mM的Ac-DEVD-pNA底物的储液，然后立即在spectramax板读数仪(Molecular Devices，Sunny Vale，CA)上每1分钟监测405nm下的吸光度持续30分钟。将各个孔的斜率用于确定活性，并相对于阳性对照孔和阴性对照孔标准化，以给出活性百分数。将各化合物浓度(4个孔)的数据取平均，并将活性百分数作图为化合物浓度的函数。使用TableCurve 2D分析所述数据并且拟合于对数剂量响应曲线。大部分化合物在10μM下达到最大活性。确定各化合物在10μM下的活性百分数并记作三次重复实验的平均值和相应的SEM。未显示单独的剂量响应曲线。
EGTA荧光滴定测定——该滴定测定基于公开的方案。在滴定前，在比色皿中装入EDTA(10mM)维持10分钟，之后用无菌去离子水和丙酮洗涤，用于除去任何残留的金属离子。将PAC-1或衍生物(60μM)加入至含有缓冲液(Hepes：50mM，KNO3：100mM，pH7.2)和EGTA(7.3mM)的比色皿中，以达到10倍稀释(PAC-1终浓度：6μM)。渐增地加入Zn(OTf)2(0-10mM)。Zn-PAC-1(或衍生物)复合物的形成是通过荧光强度的增加(ex/em：410nm/475nm)来监测。将475nm下的荧光强度相对于使用MaxChelator程序计算的游离Zn浓度([Zn]f/M)作图。使用KaleidaGraph分析所述数据并拟合于基于由公开方案衍生的Eq S1的形成曲线。
I＝(I最小KD+I最大[Zn]f)/(KD+[Zn]f)
其中I最小和I最大分别定义为游离探针(probe)(在此情况下为PAC-1或衍生物)和Zn-探针复合物的荧光强度。
免疫荧光染色——通过将圆的18mm的1号硼硅盖玻片(VWR)在聚赖氨酸溶液中(Sigma)摇晃1小时，然后以MilliQ洗涤来用聚赖氨酸涂布所述盖玻片。将SK-Mel-5人类黑素瘤细胞在12孔板底的聚赖氨酸涂布盖玻片上培养。当细胞达到约80％汇合时，将所述细胞以DMSO或100μM PAC-1的DMSO溶液(总DMSO＜1％)处理1小时。然后将所述细胞以1mL的PBS洗涤两次。并于室温下在3.7％甲醛的PBS溶液中固定10-15分钟。然后将所述细胞以PBS再洗涤两次，然后以0.1％Triton X-100的PBS溶液透化5分钟。然后将所述细胞放在3％BSA的PBS溶液中封闭10分钟并以1∶500的兔抗胱天蛋白酶原-3的抗体孵育1小时。然后将所述盖玻片以PBS洗涤五次，并以抗兔Alexafluor647缀合的第二抗体的1∶1000稀释液避光孵育20分钟。将所述盖玻片以PBS再洗涤五次并以MilliQ H2O洗涤一次。然后使用Fluorosave(Calbiochem)将所述盖玻片固定在载玻片上，并于黑暗中保存直至进行成像。将细胞在Leica SP2多光子共聚焦显微镜上成像。
活细胞成像——将SK-Mel-5细胞培养于1号硼硅生长室(Nunc)的底部，至约80％的汇合。然后将细胞在37℃下和5％的CO2中以DMSO、25μM的FAM-DEVD-fmk的DMSO溶液、25μM的AF350-PAC-1的DMSO溶液，或者25μM的FAM-DEVD-fmk和25μM的AF350-PAC-1二者同时处理1小时。然后将细胞以不含酚红的RPMI1640生长培养基洗涤5次。然后在成像前将所述细胞于37℃下再孵育2小时。对于用于核染色的SYBR绿染色的细胞，加入在培养基中1∶100000稀释的SYBR绿，然后立即进行成像。使细胞在Leica SP2多光子共聚焦显微镜上成像。
图像分析——为了清楚起见调节图像的亮度和对比度。在图像中，使用Image J调节红色通道以反映10与28之间的线性强度梯度。对于绿色通道，将所述图像调节至0与44之间的线性强度梯度。为补偿显微镜的光学偏移，在x方向手动偏移红色通道5个像素，在y方向手动偏移绿色通道6个像素。将所述图像以半径1个像素的高斯模糊(Gaussian blur)过滤以提高信噪比。使用Image J插件JACoPo，以Manders重叠系数确定重叠％。
PAC-1衍生物的凋亡诱导——将U937细胞(1mL的1×106细胞/mL)以5μL的多种化合物的乙醇储液(达到终浓度50μM)处理。将所述细胞于37℃下孵育12小时。将所述细胞离心(200g维持5分钟)，以PBS(2mL)洗涤，再悬浮于500μL的膜联蛋白V结合缓冲剂中。向各个样品中加入10μL FITC缀合的膜联蛋白V染料(SouthernBiotech)和10μL的碘化丙啶(Sigma)至终浓度50μg/mL。在BentonDickinson LSR II流式细胞仪上分析细胞群。
材料和方法
总述
所有要求无水条件的反应都在经烘干的玻璃器皿中在氮气或氩气的正气氛下进行。标准注射器技术用于液体的无水加入。干的四氢呋喃是通过使其穿过市售溶剂纯化***(Innovative Technologies)中的活化铝柱或分子筛获得。除非另外注明，否则所有原料、溶剂和试剂都市购自供应商并且不经进一步纯化而直接使用。快速色谱法使用230-400目的硅胶进行。酰肼5、PAC-1、1a、1h、3-烯丙基邻羟基苯甲醛、2-巯基苯甲醛、23、30、44是根据经过改动的文献方法制备。
化合物分析
所用NMR实验都用Varian Unity 400MHz或500MHz的光谱仪在CDCI3(Sigma)、CD2OD(sigma)或丙酮-d6(Sigma)中记录，以残留的未氘化溶剂作为内参。记录了化学位移δ(ppm)；耦合常数J(Hz)；多峰性(s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰)；和积分。高分辨质谱数据用伊利诺伊大学质谱实验室(University of IllinoisMassSpectrometry Laboratory)的Micromass Q-Tof Ultima hybridquadrupole/time-of-flight ESI质谱仪记录。所有熔点都未校正。分析型HPLC在Altima C18柱(2.1×20mm)上进行，流动相A为0.1％的TFA水溶液，B为乙腈，使用的梯度***为经5分钟从0％至45％的B，然后在5-10分钟从45％至55％的B，然后在10-15分钟从50％至100％的B，在15-20分钟恒定为100％的B，在20-25分钟从100％至0％的B。LC-MS在C18柱(2.1×5mm)上进行，流动相A为0.1％的TFA水溶液，B为乙腈，使用的梯度***是在0-2分钟恒定为0％的B，然后在2-5分钟从0％至50％的B，然后在5-7分钟从50％至100％的B，在7-8分钟恒定为100％的B，在8-10分钟从100％至0％的B。
方案S1.PAC-1衍生物的合成
Figure BSA0000135556050000241
方案S2.4c的合成
Figure BSA0000135556050000242
方案S3.4a-b的合成
Figure BSA0000135556050000251
方案S4.4f-g的合成
Figure BSA0000135556050000252
方案S5.2d和4e的合成
Figure BSA0000135556050000253
实施例3.PAC-1衍生物的评价
图11显示了化合物I-II-7缓解锌介导的胱天蛋白酶-3抑制。图12显示了化合物I-I V-3缓解锌介导的胱天蛋白酶-3抑制。这些图表示三次独立的剂量响应实验。误差棒代表各个数据点的平均值的标准误差。图13显示了存在和不存在锌的情况下化合物1-II-6的吸收谱。
在细胞培养物中和体外测定法中评价PAC-1衍生物杀死癌细胞、体外活化胱天蛋白酶原-3和结合锌的能力。活化胱天蛋白酶原-3的化合物通常在U937细胞中具有低IC50值。示例性的数据显示于下表1-4中。
细胞死亡的诱导是使用U-937(人类淋巴瘤)细胞系确定的。将U-937细胞以悬浮物形式培养。对于这些实验，使细胞暴露于多个化合物浓度72小时，经过磺酰罗丹明B测定法来定量细胞死亡，从对数剂量相应曲线计算IC50值。
从这些数据可看出，(1)不能结合锌的PAC-1衍生物在体外不活化胱天蛋白酶-3，并且不适于诱导所培养的U-937细胞死亡。该信息表明，PAC-1的锌结合能力对其细胞死亡诱导性质是重要的。(2)邻-羟基N-酰基腙基序对于锌结合是关键性的。(3)几乎所有结合锌的化合物都可在体外活化胱天蛋白酶-3并可诱导所培养的U-937细胞死亡。只有化合物I-IV-1和I-IV-2——它们显示无体外胱天蛋白酶-3活化作用，但仍然对N-937细胞有细胞毒性——对于该趋势是例外。值得注意的是，本发明人发现，这两种化合物(在10μM浓度下)是胱天蛋白酶-3酶活性的相当强的抑制剂；因此，该化合物的任何活化效应都可被这种抑制作用所掩盖。这种抑制效应与以前的数据一致，所述数据证明PAC-1在高化合物浓度下也会抑制胱天蛋白酶原-3/胱天蛋白酶-3。
表1.I类化合物
Figure BSA0000135556050000271
表2.II类化合物
Figure BSA0000135556050000281
表3.III类化合物
Figure BSA0000135556050000282
表4.IV类化合物
Figure BSA0000135556050000291
实施例4.共焦显微术
共焦显微术是以荧光性PAC-1进行，以研究细胞中PAC-1的亚细胞定位，目的是确证PAC-1通过结合Zn2+杀死癌细胞。荧光形式的PAC-1是通过将Alexa Fluor 350“接”至PAC-1而合成，如方案5所示。
Figure BSA0000135556050000292
方案5
以上显示的荧光标记的化合物AF-PAC-1在这些测定法中具有类似于PAC-1的活性(对于U-937细胞的IC50＝14.8(3.2μM；10μM下的胱天蛋白酶-3活化＝6.3(1.6％且在50μM下＝20(3％；锌的Kd＝61(9nM)。图14显示了共焦显微术研究的结果。AF-PAC-1与胱天蛋白酶-3/-7酶活性部位的共定位。以DMSO处理的SK-MEL-5细胞在红色通道和绿色通道中都显示背景水平的染色(在此为渐变灰色(ahaded gray))。仅以FAM-DEVD-fmk处理的细胞未显示任何高于背景水平的染色。仅以AF-PAC-1处理的细胞在细胞质中显示小点状染色(punctatestaining)，在520nm下发射无增加。同时以AF-PAC-1和FAM-DEVD-fmk处理的细胞显示强胱天蛋白酶-3/-7活性的斑点(假着色)和AF-PAC-1的小点状染色(假着色)，其在合并图像中显示良好的共定位。
实施例5.用狗进行的PAC-1临床试验
将PAC-1与2-羟丙基-β-环糊精的制剂以较高的剂量给药至动物。狗出现了急性神经毒性(共济失调和癫痫)。对小鼠的进一步研究显示在高剂量下出现类似的症状。据信PAC-1可穿过血脑屏障(BBB)并螯合所述结合于NMDA受体的抑制性锌。结果是，合成并试验了新化合物PAC-II-9。关于该化合物的进一步的信息在本文其它地方描述。
表5.预测血脑屏障(BBB)穿透性
Figure BSA0000135556050000301
初步结果
Figure BSA0000135556050000302
初步动物研究表明，PAC-1-II-9被用于改善神经毒性问题。
另外的化合物和LogBB数据在表6中提供。
表6
Figure BSA0000135556050000311
Figure BSA0000135556050000321
实施例6.PAC-II-9(S-PAC-1)可降低神经毒性
诱导凋亡性细胞死亡是一种有前景的抗癌策略。凋亡级联中的关键事件是胱天蛋白酶原蛋白水解活化成有活性的胱天蛋白酶——之后可切割数十种细胞底物的半胱氨酸蛋白酶。2006年报道了可增强胱天蛋白酶原-3的催化活性并诱导其自活化成胱天蛋白酶-3的小分子。称为PAC-1的这种化合物可诱导癌细胞的凋亡，并在作为脂质基制剂口服给药或作为胆甾醇颗粒皮下植入时在鼠异种移植物模型下显示抗肿瘤活性。这里报道了在小鼠中对PAC-1(作为静脉推注剂递送)进行评价，并且这些研究表明高剂量的PAC-1可诱导神经毒性。基于该发现和推测的神经毒性机理，设计、合成并评价了被称为S-PAC-1的PAC-1衍生物。与PAC-1类似，S-PAC-1可活化胱天蛋白酶原-3并诱导癌细胞的凋亡性死亡；然而，其不诱导神经毒性，这是在小鼠和狗中评价的。在狗中建立了对S-PAC-1的连续静脉内输注方案，使该化合物达到约15μM的稳态血浆浓度达24小时。在一项小规模临床试验中，以S-PAC-1评价了患有淋巴瘤的五只宠物狗。结果显示，S-PAC-1在这些患者中被很好地耐受，并且这些处理在5名患者的4名中诱导了部分消退或使疾病稳定。
在最近十年中，已证明了靶向治疗作为个性化抗癌策略的可能性。这些方法利用了癌细胞中存在的特定蛋白，以相对于正常细胞赋予特异性(1)。这类“个性化”药物可命中产生自染色体易位的靶(2)(用于BCR-ABL融合蛋白的Gleevec(e))，导致组成型活化的突变体形式的蛋白(Iressa和EGFR突变，(4)PLX4032和突变体BRAF(5，6))或在癌细胞中过表达的蛋白(在下文进一步描述)。由于癌症的标志物之一是抗凋亡(7-9)，对于抗癌药物的发现来说凋亡蛋白是特别有用的靶(10)。事实上，已经以靶向凋亡蛋白的失调表达的化合物证明了抗癌活性，所述化合物包括p53-MDM2相互作用的小分子干扰剂(11，12)、Bcl-2的抑制剂(13)和XIAP的配体(14，15)。
半胱氨酸蛋白酶的胱天蛋白酶家族的成员在凋亡的引发和执行中都是关键的参与者。这些酶以低活性酶原(前酶)形式存在于细胞中，其被蛋白水解活化成成熟的高活性酶。对于凋亡来说，最关键的是胱天蛋白酶原-3蛋白水解转化成胱天蛋白酶-3。由于内部和外部凋亡途径都集中于活化胱天蛋白酶原-3，并且由于胱天蛋白酶-3有超过100种细胞底物，所以将胱天蛋白酶原-3活化成胱天蛋白酶-3是凋亡级联中关键且必有的(committed)事件。值得注意的是，胱天蛋白酶原-3在许多肿瘤组织中均过表达，所述肿瘤包括乳腺癌(16)、结肠癌(17)、肺癌(18)、淋巴瘤(19)、成神经细胞瘤(20)、黑素瘤(21)和肝癌(22)，表明活化胱天蛋白酶原-3的小分子相对于正常细胞可能对癌细胞具有选择性。在2006年，本发明人报道发现了被称为PAC-1的小分子，当其作为脂质基制剂口服给药或作为胆甾醇颗粒皮下植入时，其可在体外增强胱天蛋白酶原-3活性，诱导所培养的癌细胞死亡，并在多个小鼠异种移植物模型中有效(23)。PAC-1在体外可通过螯合抑制性锌离子活化胱天蛋白酶原-3(24)，并且衍生物合成和评价显示，PAC-1的生物活性与具有完整的邻-羟基N-酰基腙锌螯合基序有关(25)。许多数据表明，PAC-1可通过螯合来自胱天蛋白酶原-3的锌而诱导癌细胞的凋亡性死亡，最值得注意的是，荧光PAC-1衍生物和细胞胱天蛋白酶-3活性部位的共定位(25)。
作为第一种活化胱天蛋白酶原的化合物，PAC-1的实验证明了胱天蛋白酶原-3活化作为可行的抗癌策略的可能性。为进一步开发PAC-1作为治疗人癌症的实验性治疗物，本发明人试图表征该化合物在静脉内给药时且在更复杂的体内肿瘤模型***中(具体是患有自发性癌症的犬)中的作用。在患有癌症的宠物狗中评价实验性治疗物可提供许多鼠异种移模物模型达不到的优点(26)。在此，本发明人报道了在小鼠中静脉内PAC-1的毒性研究和PAC-1衍生物(被称为S-PAC-1)的发现，所述衍生物可诱导所培养的癌细胞系凋亡，在小鼠和研究用狗中被很好地耐受，并且在对患有自发性淋巴瘤的犬患者的小规模试验中有效。
PAC-1的配制。为加快对用于治疗人癌症患者的胱天蛋白酶原-3活化剂的翻译研究，评价了静脉内给药(常规抗癌剂的最常见药物送递途径)的PAC-1的耐受性。为此目的，本发明人首先优化了配制步骤，该配制步骤可在水溶液中可靠地维持高浓度的PAC-1——一种亲脂的药物。使PAC-1在水溶液中溶解并维持的增溶剂是2-羟丙基-β-环糊精。在200mg/mL的2-羟丙基-β-环糊精的水溶液中，PAC-1以20mg/mL溶解。完全溶解需要将所述水溶液酸化至pH 1.5-2，然后使所述溶液恢复至pH5-6。用该步骤，在4℃下保存时，PAC-1将保持在溶液中并且至少稳定5天。
PAC-1的毒性。在努力表征静脉内给予的PAC-1的可行性和耐受性时，对C57/BL6小鼠经侧尾静脉注射给予10、20、30和50mg/kg的PAC-1(溶解于2-羟丙基-β-环糊精)，然后观察该动物24小时。在10mg/kg的PAC-1下，没有观察到临床毒性征象。以此方式接受了20mg/kg的PAC-1的小鼠表现出轻度的神经症状，包括昏睡和轻度共济失调；这些症状在注射之后持续了20分钟，此时小鼠恢复并且没有显示其它毒性征象。接受了30mg/kg的PAC-1的小鼠表现出明显的神经毒性征象，包括痉挛(1/3)、共济失调(3/3)和失衡(3/3)，从注射5分钟内开始并持续大约15分钟。接受了50mg/kg的PAC-1的小鼠表现出急性神经毒性症状，有更明显的共济失调和失衡。在该剂量下，在所有小鼠中都观察到肌肉痉挛。仅接受2-羟丙基-β-环糊精载体的小鼠没有表现出毒性。尽管在小鼠身中观察到神经毒性，PAC-1已被以较低剂量安全地给予狗。为了证实这种神经毒性没有物种特异性，在10分钟的时程中将60mg/kg的PAC-1经静脉给予一只健康的研究用猎狗。给予这种高浓度的PAC-1导致了类似的神经毒性，包括持续了20分钟的共济失调和痉挛。
鉴于已知的PAC-1在体外对锌的亲和性(24)，及其已被证明的结合细胞锌的能力(25)，本发明人假设在给予溶于2-羟丙基-β-环糊精中的PAC-1的小鼠和狗中观察到的神经毒性是由于螯合被治疗小鼠的中枢神经***内NMDA受体处的胞内锌引起。这种假设与来自对其他锌螯合剂的体内研究的数据一致，所述锌螯合剂可诱导本发明人用PAC-1观察到的神经表型回忆(reminiscent)(27，28)。事实上，预测PAC-1穿透血脑屏障(BBB)的分配的计算机分析(29)中显示，PAC-1具有-0.07的计算logBB。该logBB对应于血液与脑之间的0.85/1.0的分配比，表明极大量的PAC-1可进入中枢神经***。一些研究表明，螯合胞内锌库可缓解对NMDA受体的紧张性抑制(tonic inhibition)，形成神经元(neuronal)兴奋过度(28，30)。
方案1
Figure BSA0000135556050000341
S-PAC-1的克级合成
S-PAC-1的设计。为克服这种神经毒性，本发明人合成了穿透BBB的倾向较低的PAC-1衍生物，以呈现出神经毒性降低并使得可以较高浓度给药。设置在PAC-1的苄基环上的极性官能团应可降低预测的logBB，而同时保持母体化合物的活性。这种S-PAC-1——PAC-1的氨磺酰衍生物——被设计为一种预测穿透BBB能力明显降低(-1.26的logBB)的化合物。S-PAC-1的合成路径表示于方案6；该路径是以前报道的PAC-1合成路径(23)的修改方案。简言之，氨磺酰1偶联于哌嗪2以便以良好产率得到酯3。然后该酯与肼反应生成酰肼4，其之后与醛5缩合以得到S-PAC-1。该路径的所有实验细节以及S-PAC-1和各种中间体的光谱数据可见于本文其它部分。很明显，所述反应序列是可高度放大的；事实上，方案6所列的产率是产生40g的S-PAC-1的产率。这种放大的关键是针对每种中间体开发简单纯化方案。因此，化合物2是通过重结晶从乙醇纯化，酰肼3是通过重结晶从甲醇纯化，终产物是通过硅胶色谱法和重结晶从甲醇纯化。通过以40g规模进行该合成4次，成功制备了超过160g的S-PAC-1。更小规模的S-PAC-1合成的细节可见于本文其它部分。
S-PAC-1可结合锌离子。S-PAC-1的活性在数个生物化学测定法中被表征。用EGTA竞争滴定实验(31)来确定S-PAC-1：Zn2+复合物的结合常数。在该实验中，用不断增加浓度的Zn2+滴定含已知量的EGTA和S-PAC-1的溶液，并在475nm下检测S-PAC-1的荧光。将存在Zn2+的情况下的荧光变化用于作图为形成曲线(图16b)。用已知的EGTA结合常数，可计算游离锌的浓度并用于确定S-PAC-1：Zn2+复合物的结合常数。该复合物的Kd为46±5nM，相比而言S-PAC-1：Zn2+的Kd为52±2nM。(25)(图20)。
EGTA荧光滴定测定法——该滴定测定法基于公开的方案(Huang，Org.Lett.2007，9，4999-5002)。滴定之前，将比色皿以EDTA(10mM)孵育10分钟，然后用无菌去离子水和丙酮洗涤以移除任何残留的金属离子。将PAC-1或衍生物(60μM)加入至含有缓冲液(Hepes：50M，KNO3：100mM，pH 7.2)和EGTA(7.3mM)的比色皿以得到10倍稀释物(终PAC-1浓度：6μM)。以不断增加的量加入Zn(OTf)2(0-10mM)。Zn-PAC-1(或衍生物)复合物的形成是通过荧光强度的增加进行监测的(ex/em：410nm/475nm)。将475nm下的荧光强度相对于用MaxChelaor程序计算的游离Zn浓度([Zn]f/M)作图(Patton，CellCalcium，2004，35，427-431)。所述数据用KaleidaGraph分析并拟合于基于从公开方案衍生的Eq S1的形成曲线。
I＝(I最小KD+I最大[Zn]f)/(KD+[Zn]f)Eq S1
其中I最小和I最大分别定义为游离探针(在此情况下为PAC-1或衍生物)Zn-探针复合物的荧光强度。
S-PAC-1可在体外活化胱天蛋白酶原-3。评价了在存在外源锌的情况下S-PAC-1在体外活化重组表达的胱天蛋白酶原-3的能力。为确保所述酶原的活性被监测，使用了胱天蛋白酶原-3的蛋白酶解不可切割的变体(其中三个天冬氨酸切割部位残基均被突变成丙氨酸(D9A/D28A/D175A))(24，32)。将这种重组表达的蛋白在存在10μM锌的情况下孵育，并将S-PAC-1加入至所述样品中，以15分钟的间隔监测所述酶的活性。如图16c中所示，S-PAC-1可通过缓解锌介导的抑制而快速(5分钟之内)提高所述酶原的酶活性。
S-PAC-1可诱导所培养的多种癌细胞系的细胞死亡。已证实S-PAC-1可在体外螯合锌并活化胱天蛋白酶原-3，评价了S-PAC-1对一组人、犬和鼠癌细胞系的抗癌活性。将细胞用不同浓度的化合物孵育72小时，之后用磺酰罗丹明B测定法来评价细胞死亡(33)。PAC-1和S-PAC-1的IC50值记录于表1A中。在大多数情况下，S-PAC-1与PAC-1等效，但PAC-1在HeLa细胞中似乎更强效。不管物种来源如何，PAC-1和S-PAC-1二者都似乎可强效对抗所有试验的淋巴瘤细胞系。用U-937细胞进行的其它分析显示，S-PAC-1可诱导这些细胞凋亡。将U-937细胞以DMSO、50μM的PAC-1或50μM的S-PAC-1处理12小时。在孵育后，用膜联蛋白V/PI染色评价凋亡并通过流式细胞术进行分析(图16d)。PAC-1和S-PAC-1二者的处理都可导致呈现膜联蛋白V染色的细胞群增加。在该实验中，S-PAC-1可诱导与PAC-1程度相同的凋亡(约40％)。
在确定用于体内评价S-PAC-1的合适治疗策略的努力中，评价了S-PAC-1细胞毒性的时间依赖性。将U-937细胞以S-PAC-1处理不同的时长。在以S-PAC-1处理后，将细胞洗涤以除去化合物并在没有化合物的生长培养基中培养。在72小时时评价所有处理时间的细胞死亡。测定每个暴露时间的IC50值并记录于表1B。在3、6和9小时时，IC50值大于所测试的最高浓度。在12小时的暴露时间时，观察到IC50值快速减小。通过24小时的暴露，IC50值接近最小值并在后续48小时的时程中几乎没有显示变化。这些时间依赖性的实验表明，如果将癌细胞暴露于该化合物至少24小时，则S-PAC-1在体内是最有效的。
S-PAC-1在小鼠中没有神经毒性效应。已证实S-PAC-1在体内和在细胞培养物中的活性，在C57/BL6小鼠中评价了S-PAC-1的毒性效应。以与PAC-1的毒性确定类似的方式，将S-PAC-1(以2-羟丙基-β-环糊精溶解)经侧尾静脉注射以12.5mg/kg、25mg/kg、37.5mg/kg和350mg/kg给予C57/BL6小鼠。甚至在350mg/kg的剂量下也没有观察到神经毒性。
对于在鼠肿瘤模型中评估S-PAC-1的初始目标，确定了小鼠中S-PAC-1的药代动力学。如果S-PAC-1能够以使S-PAC-1的血浆浓度在24小时的时程中超过约10μM的方式给药，则所述治疗能够有效诱导胱天蛋白酶原-3活化和肿瘤细胞凋亡。为了顺着这些思路开发治疗策略，以125mg/kg溶于2-羟丙基-β-环糊精中的S-PAC-1经腹膜内给药治疗C57/BL6小鼠。将小鼠处死并在给药后的不同时间点取血。将血液样品离心并收集血清，然后用液相色谱法分析以确定药物浓度。S-PAC-1随时间的药物浓度在图17A中显示。在注射后30分钟时该剂量达到约170μM的血浆浓度峰值。然后S-PAC-1的血浆浓度快速下降，在注射后4小时时，血液中没有残余的S-PAC-1。对该数据的分析表明，S-PAC-1在小鼠体中的消除半衰期为约1小时。基于S-PAC-1在小鼠中达到的血浆浓度峰值和短半衰期，预测小鼠将需要以每两小时350mg/kg S-PAC-1的剂量进行治疗，以在24小时的时程中达到并维持10μM的最小血浆浓度。尽管S-PAC-1的这种频繁给药的方案(每2小时腹膜内给药，持续24小时)在技术上是可行的，但是使用鼠肿瘤模型对S-PAC-1作为新治疗剂的进一步评估在方法学上是不实际的。因此，本发明人尝试在更大的哺乳动物实验***——特别是健康和自发性患癌的狗——中进一步研究S-PAC-1，这赋予更大的实用性，原因是保持S-PAC-1稳定状态浓度达更长时间。
在研究用狗中评估S-PAC-1。将健康的研究用猎狗用于S-PAC-1的药代动力学和毒性研究。将四只研究用猎狗以在10分钟内经静脉注射的25mg/kg的S-PAC-1(溶解于2-羟丙基-β-环糊精中)进行处理。在24小时中收集多个血清样品以在狗中表征静脉给药的S-PAC-1的药代动力学谱。除了药代动力学分析之外，每周在研究用狗中监测单剂量的静脉S-PAC-1给药的血液耐受性和非血液耐受性，连续持续四周(表2A)。如图17B中所示，由此25mg/kg静脉推注剂量形成的血浆浓度峰值为约150μM，类似于以125mg/kg腹膜内剂量处理的小鼠中达到的值。根据对药代动力学谱的分析，狗中S-PAC-1的半衰期被计算为3小时。此外，单剂量的静脉S-PAC-1处理被所有四只研究用狗很好地耐受，用这些动物未观察到由于处理导致的短期或长期的不利事件。
尽管狗中3小时的半衰期比小鼠中S-PAC-1的半衰期有显著提高，但是药代动力学计算预测，所述药物需要在一天的时程中给药数次以维持高于约10μM的血清水平。或者，可用连续速率输注(continuous rateinfusion)以在治疗过程中维持药物的稳定状态的血清浓度。连续速率输注策略已用于其他化学治疗药物，例如达卡巴嗪(dacarbazine)(34)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)(35)和吉西他滨(gemcitabine)(36)，输注时间最长达98小时。此外，YM155——一种在较长暴露时间下呈现活性增加的研究中促凋亡药物——现正进行临床试验，并且采用168小时的连续速率输注(37)。
将三只健康的研究用狗用于确定S-PAC-1是否能够经连续速率输注方案安全地给药，并确定合适的剂量水平来维持高于约10μM的血清浓度。每只狗都在10分钟的时程中经静脉输注接受初始负荷剂量，随后通过输注泵送递维持剂量另外24小时。在其24小时的输注时程中观察每只狗的不利反应，并间隔取血以评价S-PAC-1处理的药代动力学谱。此外，在完成S-PAC-1输注之后，每周对研究用狗评价血液和非血液毒性，持续连续4周。
作为24小时连续速率输注物给药的S-PAC-1可安全地给予至研究用狗并且容易达到微摩尔的稳态血浆浓度。以此方式给予S-PAC-1的狗的药代动力学谱显示，稳态的血浆浓度与剂量增加有关(图17C)。基于这些结果预测出，7mg/kg负荷剂量和3mg/kg/hr恒定速率输注将足以达到约10μM的稳态血浆浓度。此外，S-PAC-1的连续速率输注在所有试验剂量下均被很好地耐受，并且在任何研究用狗中都没有观察到血液毒性或非血液毒性。
已证实了S-PAC-1的体外活性，表明所述化合物可经连续速率输注安全地给药，并且＞10μM的S-PAC-1的稳态血浆浓度可维持24小时的持续时间，对患有自发性淋巴瘤的就诊宠物狗进行了小规模(n＝5)临床试验。宠物狗中自发出现的癌症与人癌症之间具有许多相似之处，包括组织学外观、肿瘤遗传学、分子靶、生物和临床表现以及对治疗的响应(38)。这些自发性犬癌症中，多中心淋巴瘤最常见，每100000只狗发生13至24例(39)。多中心B-细胞或T-细胞犬淋巴瘤的临床进展和治疗与人的非何杰金氏淋巴瘤有许多相同特性。犬淋巴瘤和人非何杰金氏淋巴瘤都对相同的细胞毒性药物(例如多柔比星(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)和环磷酰胺(cyclophosphamide))都有临床响应。这些药物是CHOP治疗方案的组分，该治疗方案为用于人弥漫性大B-细胞淋巴瘤的一线疗法(40)。当对狗给药时，CHOP方案将会在大约90％被诊断患有淋巴瘤的狗中诱导完全的临床缓解(41，42)。类似于人的响应，大部分经CHOP治疗实现减轻的狗将经历疾病复发(43)。鉴于人与犬淋巴瘤之间的共同点，在犬淋巴瘤临床试验中对S-PAC-1的评估可为开发S-PAC-1作为新型人治疗物提供重要的转译信息。
S-PAC-1试验的选择标准。受赠予或属于伊利诺伊大学香槟分校兽医学院小动物诊所(University of Illinois-Urbana Champaign、College ofVeterinary Medicine、Small Animal Clinic)的狗被考虑参与本临床试验。合格患者的选择标准如下：组织学或细胞学证实的多中心淋巴瘤；可测量的肿瘤负荷；良好的体力状况；＞4周的预期寿命；进入研究前3周内无在前化学治疗；无明显的共患疾病，包括肾衰竭或肝脏衰竭、充血性心力衰竭病史或临床凝血病。此外，根据大学准则，在进入研究前宠物主人必须签署书面知情同意书。
犬淋巴瘤患者中S-PAC-1的毒性和药代动力学。五只狗患者经两种治疗方案中的一种接受S-PAC-1治疗(总结在表7C中)。参与第一治疗方案的患者每周一次接受24小时的连续S-PAC-1输注，持续4个周循环。参与第二治疗方案的患者隔周接受72小时的连续S-PAC-1输注，持续2个治疗循环。在每个S-PAC-1治疗循环过程中收集血液，用于药代动力学分析。此外，在每次排定的跟踪回诊时从所有宠物狗收集血液，以表征血液毒性和非血液毒性。在给药之间，由宠物主人对患者进行监测，以进行兽医合作肿瘤小组的不利事件普通术语和标准(VeterinaryCo-operative oncology group common terminology andcriteria foradverse events)(VCOG_CTCAE)随附的胃肠道毒性观察评分(44)。参与治疗方案1或2的所有患者都未表现出任何临床上显著的血液毒性或非血液毒性(表7C和D)。宠物主人仅报告了少数不利事件，例如在输注部位的自限刺激和局部刺激(n＝3)、食欲暂时丧失(n＝1)和中度腹泻(n＝2)。所有不利反应在每个治疗循环结束的48小时内消退。
如图18中所示，药代动力学分析表明，所有患者都具有可测量的S-PAC-1血清浓度。S-PAC-1浓度在输注开始6小时内达到稳定状态。根据从健康的研究用狗的预测，负荷剂量为7mg/kg的输注和3mg/kg/hr的恒定速率输注在大多数治疗中足以达到＞10μM的稳定状态的血浆浓度。
S-PAC-1的抗肿瘤活性。在整个研究时程中通过对外周***的累积测径器测量以及对下颌***的CT扫描监测对肿瘤负荷的评估。测径器测量依照RECIST法进行(45)。简言之，对4对外周***(下颌骨、肩胛骨前、腹股沟和腘部)记录最长的直线测量长度，对这些值求和得到RECIST分值。除了测径器测量所有4组外周***之外，在每个患者中对下颌***进行CT扫描，使得可精确且客观地测量最大***直线长度。在5个治疗的患者中，一个患者(患者1)显示部分响应，在4周的治疗时程中通过CT扫描获得的下颌***测量值和RECIST分值都有约30％的减小(图19A和B)。在四个治疗周期后，停止给予药物，在后续的2周中通过RECIST监测所述狗。无治疗时，该狗的RECIST分值剧烈增大(第36和42天)。除了这种部分响应外，三个患者显示出稳定的疾病(患者2-4)，而一个患者表现出疾病进展(患者5)。
S-PAC-1是PAC-1类中将在癌症患者的临床试验中进行评价的第一个化合物(和胱天蛋白酶原-3的第一个小分子活化剂)。这些数据对于作为抗癌疗法的胱天蛋白酶原-3活化策略很重要。或许不令人惊奇的是，鉴于PAC-1的作用机理及预测的其BBB穿透性，高剂量的该化合物可诱导神经毒性。而且，发生这种神经毒性的短暂滞后(约5分钟)表明所观察的神经毒性不是PAC-1的初始血浆浓度峰值的导致的，而是PAC-1穿透BBB的再分布导致的。锌的内稳态在中枢神经***中是重要的(46)，并且NMDA受体需要结合的锌以提供紧张性抑制(28)。NMDA受体以低亲和性(Kd＝5.5μM)结合锌(47)，这表明对锌有较高亲和性的锌螯合剂(例如PAC-1或S-PAC-1(Kd分别＝46和52nM))能够成功地从这些受体中分离锌。一些研究表明，胞内锌螯合可导致这些受体兴奋过度(27)，造成诸如不受控制的肌肉运动和癫痫发作的症状(28)。事实上，可穿透细胞的锌螯合剂TPEN已被证明，在低浓度下可在小鼠中诱导严重的神经毒性，在较高浓度下可诱导快速死亡(48)。
有数种因素可影响化合物通过BBB的穿透性，包括极性、亲脂性和大小(29)。降低化合物对BBB的穿透性的一个策略是增加该分子的极性。加入氨磺酰官能团是这种极性增加的良好候选方案，因为芳基氨磺酰基序在许多小分子治疗物中是常见的。FDA批准的含有芳基氨磺酰官能团的药物包括塞来考昔(Celecoxib)
Figure BSA0000135556050000391
坦索洛新(Tamsulosin)
Figure BSA0000135556050000392
和盐酸噻嗪。
患有淋巴瘤的宠物狗代表了一种用于对研究中新药进行研究的重要工具(26)。US有将近1/4的宠物狗死于癌症(49)，不经治疗时自诊断的平均存活时间是4-6周。对患有淋巴瘤的狗的标准护理法是给予CHOP治疗(26)。这种治疗由19周内16个给药疗程组成，通常导致完全减轻。与人疾病类似，实现减轻的大多数狗都会出现复发，并且通常伴有耐药性。这样，需要新的药效团来解决原发性淋巴瘤和复发性淋巴瘤。如表6C中所示，参与本研究的一只狗(患者1)在CHOP治疗后减轻了5个月，最近被诊断出患有复发性淋巴瘤。一旦参与本研究，这只狗对S-PAC-1治疗的响应是肿瘤大小减小27％。鉴于治疗持续时间相对较短，这种部分响应是显著的(S-PAC-1的4周相对于CHOP的19周)。令人鼓舞的是，5个患者中的4个达到部分响应或稳定疾病，维持4周的持续时间，因为犬淋巴瘤通常是一种快速进行性恶性肿瘤，同时在疾病诊断的数周内外周***剧烈扩大。这一点可通过停止治疗后患者1的***出现快速扩大来进一步表明。
PAC-1类的化合物可通过螯合抑制性锌离子活化胱天蛋白酶原-3(25)。细胞内锌主要存在于金属蛋白酶中紧密结合的复合物、锌指结构域(zinc-finger domain)和其它金属结合蛋白中；然而，据信约10％的细胞锌存在于疏松结合的不稳定库(labile pool)中(50)。许多研究暗示不稳定的锌可作为内源性的抗凋亡调节剂(51-54)。值得注意的是，螯合疏松结合的锌库是一种新出现的抗癌策略(24，25)。近来，另一种小分子锌螯合剂ML-133被报道在体外和在鼠结肠癌异种移植物模型中具有抗癌性质(55)。尽管作者没有报道，但是ML-133可能是以类似于PAC-1和S-PAC-1的方式起作用(即活化胱天蛋白酶原-3)。因此，评估S-PAC-1也可用于螯合不稳定的锌库作为抗癌策略。
总之，S-PAC-1是一种具有类似母体化合物——PAC-1——的活性的强效细胞毒性小分子。虽然高剂量的PAC-1(当在2-羟丙基-β-环糊精中给药时)可在体内诱导神经毒性，S-PAC-1并不引起这种副作用。S-PAC-1可被安全地给药于小鼠、研究用狗和患有淋巴瘤的狗，并在该初步单剂量评估中显示令人鼓舞的临床效果。鉴于S-PAC-1无神经毒性，预计S-PAC-1甚至在比本文评价的剂量更高的剂量下也将被证明是安全的。S-PAC-1的完全犬临床试验——包括在患淋巴瘤狗中的剂量扩大——目前正在进行。
表6.A)PAC-1和S-PAC-1在多种所培养的癌细胞系中的细胞毒性分析。B)U-937细胞中S-PAC-1细胞毒性的时间依赖性。C)以S-PAC-1治疗的五只患有淋巴瘤的狗的特征。
A)
Figure BSA0000135556050000401
a该细胞系使用MTS细胞活性测定法进行评价。
B)
Figure BSA0000135556050000402
Figure BSA0000135556050000403
表7.A)选择以单剂量S-PAC-1治疗的研究用狗的血液参数和非血液参数，C)每周以S-PAC-1进行24小时连续速率输注(四次连续处理)的患有淋巴瘤的狗，D)隔周以S-PAC-1进行72小时恒定速率输注(2次连续处理)的患有淋巴瘤的狗。
A)
Figure BSA0000135556050000411
C)
Figure BSA0000135556050000412
D)
Figure BSA0000135556050000413
Figure BSA0000135556050000414
WBC-白细胞，ALT-丙氨酸转移酶，BUN-血浆尿素氮，ALP-碱性磷酸酶。
材料和方法
总述
所有要求无水条件的反应都在经烘干的玻璃器皿中在氮气或氩气的正气氛下进行。标准注射技术用于液体的无水添加。干的四氢呋喃是通过穿过市售溶剂纯化***(Innovative Technologies)中经过活化的铝柱或分子筛得到。除非另外注明，否则所有原料、溶剂和试剂都购自市售供应商并且不经进一步纯化而直接使用。快速色谱法是用230-400目的硅胶进行。化合物1、2和5(Naganawa，Bioorg Med Chem，2006，14，7121-7137)依照文献方法制备。
化合物分析
所有NMR实验都在Varian Unity 400MHz或500MHz的光谱仪上在D2O(Sigma)、CD3OD(sigma)或丙酮-d6(Sigma)中记录，以残留的非氘化溶剂作为内参。记录了化学位移δ(ppm)；耦合常数J(Hz)；多峰性(s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰)；以及积分。高分辨质谱数据是用伊利诺伊大学质谱实验室的Micromass Q-Tof Ultimahybridquadrupole/time-of-flight ESI质谱仪记录。所有熔点都未校正。LC-MS在C18柱(2.1×5mm)上进行，流动相A为0.1％的TFA的H2O溶液，B为乙腈，使用的梯度***为在0-2分钟恒定为0％的B，然后在2-5分钟从0％至50％的B，然后在5-7分钟从50％至100％的B，在7-8分钟恒定为100％，然后在8-10分钟从100％至0％的B。
方案7：S-PAC-1的毫克级(Minigram-scale)合成
Figure BSA0000135556050000421
方案8：S-PAC-1的克级合成
Figure BSA0000135556050000431
2-(4-(4-氨磺酰基苄基)哌嗪-1-基)乙酸乙酯(3)
Figure BSA0000135556050000432
向搅拌的1(108g，440.7mmol，1.4当量)和K2CO3(132.4g，958.2mmol，3当量)在3∶2THF/丙酮(总计2192mL)中的混合物中加入2-(哌嗪-1-基)乙酸乙酯2(79.9g，319.4mmol，1当量)。将所述反应物回流24h，通过TLC进行监测。将所述溶液过滤并用丙酮(80mL)洗涤所得固体。将所述滤液在真空中浓缩，然后通过在乙醇中重结晶纯化得到浅黄色固体3(57.4g，60％)。对于毫克级，将所述粗品通过快速柱色谱法在硅胶上纯化(1∶4MeOH/EtOAc)。1H-NMR(500MHz，CD3OD)：δ7.86(d，J＝8.0Hz，2H)，7.52(d，J＝8.0Hz，2H)，4.17(q，J＝7.1Hz，2H)，3.61(s，2H)，3.24(s，2H)，2.58(宽d，J＝50.4Hz，8H)，1.26(t，J＝7.1Hz，3H).13C NMR(126MHz，CD3OD)：δ170.4，142.8，142.4，129.7，126.0，61.9，60.6，58.5，52.5，52.4，13.3.HRMS(ESI)：测定值：342.1487(M+1)；C15H24N3O4S计算值：342.1488.m.p.：153.0-154.5.IR(纯的)：3319，1739，1160cm-1。
4-((4-(2-肼基-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)甲基)苯磺酰胺(4)
Figure BSA0000135556050000433
向搅拌的3(110.9g，324.8mmol，1当量)的2∶1乙醇/甲醇(总计650mL，0.5M)溶液中加入无水肼(30.6mL，974.5mmol，3当量)。将所述反应物回流16h，通过TLC进行监测(1∶1MeOH/EtOAc)。将所述反应混合物在真空中浓缩。将所得残留物溶解于CH2Cl2并用水(100mL)和盐水(100mL)洗涤。将水层用CH2Cl2(3×18mL)和EtOAc(80mL)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥、过滤并在真空中浓缩。通过在甲醇中重结晶纯化，得到白色固体4(96.3g，91％)。对于毫克级，在乙醇(0.06M)中进行所述反应。1H NMR(500MHz，CD3OD)：δ7.85(d，J＝8.2Hz，2H)，7.51(d，J＝8.2Hz，2H)，3.61(s，2H)，3.04(s，2H)，2.54(宽s，8H)。13C NMR(126MHz，CD3OD)：δ170.2，142.8，142.4，129.7，126.0，61.9，59.8，53.0，52.6.HRMS(ESI)：测定值：328.1436(M+1)；C13H22N5O3S计算值：328.1443.m.p.：194.5-196.0.IR(纯的)：3320，1670，1158cm-1。
(E)-4-((4-(2-(2-(3-烯丙基-2-羟基亚苄基)肼基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)甲基)苯磺酰胺(S-PAC-1)
Figure BSA0000135556050000441
向搅拌的5(28.8g，177.3mmol，1当量)的1∶2乙腈/甲醇(总计1180mL，0.15M)溶液中加入4(98.7g，301.4mmol，1.7当量)和HCl(7mol％)。将所述反应物回流48h，通过TLC进行监测。将所述溶液在真空中浓缩。将粗品通过快速柱色谱法在硅胶上纯化(1∶4MeOH/EtOAc)，然后通过在甲醇中重结晶得到灰白色固体S-PAC-1(45.9g，55％)。对于毫克级，在乙醇(0.02M)中进行所述反应。1H NMR(500MHz，(CD3)2CO)：δ11.86(s，1H)，10.79(s，1H)，8.51(s，1H)，7.85(d，J＝8.2Hz，2H)，7.53(d，J＝8.2Hz，2H)，7.19(d，J＝7.6Hz，2H)，6.86(t，J＝7.6Hz，1H)，6.56(s，2H)，6.02(tdd，1H，J＝6.7Hz，J＝10.1Hz，J＝16.9Hz)，5.04(m，2H)，3.60(s，2H)，3.42(d，J＝6.7Hz，2H)，3.18(s，2H)2.57(宽d，J＝46.5Hz，8H)。13C NMR(126MHz，(CD3)2CO)：δ165.7，156.4，150.0，143.4，143.2，136.9，131.8，129.32，129.30，127.9，126.2，119.1，117.8，115.1，62.0，61.1，53.7，52.9，33.8。HRMS(ESI)：测定值：472.2014(M+1)；C23H30N5O4S计算值：472.2019.m.p.：108.5-111.0.IR(纯的)：3227，1684，1606，1157cm-1。纯度：＞99.5％(LC-MS)。
4-(哌嗪-1-基甲基)苯磺酰胺(6)
Figure BSA0000135556050000442
将无水哌嗪(860mg，10.0mmol，5当量)加入至THF(10mL)中，将所述混合物加热回流，直到哌嗪完全溶解。向该溶液中加入1(500mg，2.0mmol，1当量)。将所述反应混合物回流2.5hr，通过TLC进行监测。将所述反应混合物用1M的KOH溶液中和，然后在真空中浓缩。通过快速柱色谱法在硅胶上纯化(1∶4MeOH/EtOAc)，得到浅黄色半固体6(250mg，49％)。1H NMR(400MHz，D2O/(CD3)2CO)：δ7.84(d，J＝8.4Hz，2H)，7.51(d，J＝8.4Hz，2H)，3.69(s，2H)，3.42(s，2H)，3.22(m，4H)，2.74(m，4H)，1.87(表观s，1H).13C NMR(126MHz，CDCI3)：δ140.93，140.87，131.0，126.3，61.1，49.0，43.13。HRMS(ESI)：测定值：256.1114(M+1)；C11H18N3O2S计算值：256.1120。IR(纯的)：3142，1158cm-1。
实施例7.制药实施方案
以下描述了与制药和药理实施方案有关的信息，并进一步补充本领域普通技术人员能获得的信息。确切的制剂、给药途径和剂量可由各个医师考虑患者状况选择(参见例如Fingl et al.，in The PharmacologicalBasis of Therapeutics，1975，Ch.lp.1)。
应该注意，主治医师将知道由于毒性、器官功能障碍等如何且在何时停止、中断或调节给药。相反，主治医师还将知道，如果临床响应不足(根据或排除毒性方面)，如何将治疗调节至较高水平。治疗目的病症中给药剂量的大小可随要待治疗病症的严重程度和给药途径而变化。例如，所述病症的严重程度可通过标准的预后评估方法部分地评估。此外，剂量和可能的给药频率还可根据情况——例如各个患者的年龄、体重和响应——估变化。与以上讨论的程序相当的程序还可用于兽医学。
取决于要治疗的具体病症和所选的靶向方法，可配制这类试剂并进行全身给药或局部给药。配制和给药的技术可见于Alfonso and Gennaro(1995)和本领域中它处。合适的途径可包括，例如口服给药、直肠给药、经皮给药、***给药、经粘膜给药或肠内给药；肠胃外送递，包括肌内注射、皮下注射或髓内注射，以及眼内给药、鞘内给药、静脉给药或腹膜内给药。
对于注射或其它途径，本发明的试剂可以配制在水性溶液中，优选生理上相容的缓冲液，例如Hank’s溶液、Ringer’s溶液、注射用水、生理盐水缓冲液或其它溶液。对于经粘膜给药，可将适于要穿透的屏障的渗透剂用于所述制剂中。这类渗透剂是本领域中公知的。
使用可药用载体来将本文中所公开的可用于实施本发明的化合物配制成适于全身给药或其它方式给药的剂量是在本发明的范围内。通过合适地选择载体和适合的制造过程，本发明的组合物，特别是配制成溶液的那些组合物，可以被肠胃外给药，例如通过静脉注射或其它途径。可容易地将合适的化合物使用本领域中熟知的可药用载体配制成适于口服给药的剂量。这类载体能使本发明的化合物被配制成片剂、丸剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、酏剂、溶液剂、悬浮剂等，例如用于由要治疗患者口服摄取。对于其它途径，可将制剂制备成乳剂、软膏剂、洗剂等。
意在被胞内给药的试剂可使用本领域普通技术人员熟知的技术给药。例如，可将这类试剂包囊至脂质体中、其它膜易位促进部分或其它靶向部分中；然后如上文所述给药。脂质体可包括具有水性内部的球形类脂双层。在脂质体形成时存在于水性溶液中的所有分子都可被纳入所述水性内部中。脂质体的内容物不仅被与外部微环境隔离，而且由于脂质体与细胞膜融合而可被有效地送递至细胞质中。此外，由于疏水属性，有机小分子可直接胞内给药。
适合用于本发明的药物组合物包括其中包含有效量活性成分以实现预期目标的组合物。确定有效量是本领域技术人员力所能及的，尤其是考虑到本文提供的公开内容和本领域的其它信息之后。
除了所述活性成分之外，这些药物组合物还可包含合适的可药用载体，包括有利于所述活性化合物被加工成可用于制药的制品的赋形剂和助剂。配制用于口服给药的制剂可为片剂、锭剂、胶囊剂或溶液剂的形式，包括配制用于缓释或仅在药物到达小肠或大肠时释放的形式。
本发明的药物组合物可以以本身已知的方式制造，例如借助于常规的混合、溶解、悬浮、颗粒化、制锭、漂浮、乳化、包囊、制粒(entrapping)、冻干和其它方法。
用于肠胃外给药的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水性溶液。此外，活性化合物的悬浮剂可被制备成合适的油性注射悬浮剂。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如芝麻油)或合成的脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。水性注射悬浮剂可包含增加所述悬浮剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，所述悬浮剂还可包含合适的稳定剂或者增加所述化合物溶解度以使得可制备高浓缩溶液的试剂。
口服使用的药物制剂可通过以下方法获得：将活性化合物与固体赋形剂结合，任选研磨所得混合物，并加工颗粒的混合物，在加入合适的助剂后(根据需要)，得到片剂或锭剂核。合适的赋形剂为，特别是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制品例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入分解剂，例如交联的聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、藻酸或其盐(例如藻酸钠)。
任选地为锭剂核提供合适的包衣。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，其任选地可包含***胶、滑石、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加入至所述片剂或锭剂包衣中用于识别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可口服使用的药物制品包括由明胶制成的压接式胶囊剂以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨糖醇)制成的密封软胶囊。压接式胶囊可包含活性化合物，混有填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)和/或润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂。在软胶囊中，可将活性化合物溶解或悬浮于合适的液体中(例如脂肪油、液体石蜡、液体聚乙二醇)。此外，可加入稳定剂。
本申请通过引用的方式全文纳入以下申请，用于所有目的：2005年5月26日提交、发明人为Paul J.Hergenrother、Karson S.Putt、GraceW.Chen、Jennifer M.Pearson的美国临时申请60/684,807[代理所卷号47-05P]；2006年3月28日提交、发明人为PaulJ.Hergenrother、KarsonS.Putt、Grace W.Chen、Jennifer M.Pearson的美国临时申请60/743,878[代理所卷号47-05P1]；2006年5月25日提交、发明人为Paul J.Hergenrother，Karson S.Putt，Grace W.Chen，Jennifer M.Pearson的美国专利申请11/420,425[代理所卷号47-05US]；2006年5月26日提交、发明人为Paul J.Hergenrother、Karson S.Putt、Grace W.Chen、JenniferM.Pearson的PCT国际申请PCT/US 06/020910[代理所卷号47-05WO]；2008年4月25日提交、发明人为Paul J.Hergenrother、Karson S.Putt、JosephS.Sandhurst、Quinn P.Peterson和Valerie Fako的PCT国际申请PCT/US2008/061510[代理所卷号73-07WO]；2007年4月27日提交、发明人为Paul J.Hergenrother；Karson S.Putt；Joseph S.Sandhurst；Quinn P.Peterson；Valerie Fako的美国临时申请60/914,592[代理所卷号73-07P]。2009年10月23日提交的美国专利申请号12/597,287[代理所卷号73-07US]。在本文列出的具有与本申请相同发明人的专利申请中作为主题组合物要求保护的化合物不是意欲作为本申请的主题组合物要求保护，意欲本申请中出现的充分公开内容能够从权利要求中单独或结合地排除每个化合物。
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已参考多个具体且优选的实施方案和技术描述了本发明。但是，应理解，在保持本发明的主旨和范围的同时，可进行多种变化和修改。本领域普通技术人员应了解，本文具体描述之外的组合物、方法、装置、装置元件、材料、任选的特征、过程和技术都可作为本文广义公开的内容被应用于实施本发明，无需借助过度的实验。本文所述的组合物、方法、装置、装置元件、材料、过程和技术的所有本领域已知功能性等价物；及其部分；都意欲包括在本发明内。任何时候公开一个范围，都意欲包括所有子范围和单个的值。本发明不受公开的实施方案的限制，所述公开的实施方案包括附图中所示的和说明书中示例性的任何实施方案，它们通过实例或示例而非限制的方式给出。本发明的范围将仅被权利要求书限制。
参考文献
2005年5月26日提交的美国临时申请60/684,807；2006年3月28日提交的美国临时申请60743878；2006年5月25日提交的美国专利申请11/420,425(2007年3月1日公开为US20070049602)；2006年5月26日提交的PCT国际申请PCT/US 06/020910(2006年11月30日公开为WO2006/128173)与本申请的主题有关，这些申请通过引用的方式纳入本文。
这些申请通过引用的方式具体地全文纳入本文：2003年10月30日提交的Hergenrother等人的美国临时申请60/516556；2004年8月20日提交的Hergenrother等人的美国临时申请60/603246；2004年10月27提交的Hergenrother等人的U.S.10/976,186。
2005年5月26日提交的美国临时申请60/684,807；2006年3月28日提交的美国临时申请60743878；2006年5月25日提交的美国专利申请11/420,425；2006年5月26日提交的PCT国际申请PCT/US 06/020910；2007年4月27日提交的美国临时申请60/914,592。
US 6,762,045Membrane derived caspase-3，compositions comprisingthesame and methods of use therefore；US 6,534,267Polynucleotidesencodingactivators of caspases；US 6,403,765Truncated Apaf-1 andmethods of usethereof；Choong等人的US 6,303,329；6,878,743，于2005年4月12日授权；Wang，Xiaodong等人的US 20040077542，2004年4月22日公开；Shi，Yigong的US 20040180828，2004年9月16日公开。Slee EA et al.，Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(OMe)fluoromethylketone(Z-VAD.FMK)inhibits apoptosis by blocking the processing of CPP32，BiochemJ.1996Apr 1；315(Pt 1)：21-4.
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Claims (14)

1.一种具有式(FX1)的化合物：
Figure FDA0002549776320000011
其中：
X1、X2、X3、X4和X5各自为C；
R10、R11、R12、R13和R14之一为
Figure FDA0002549776320000012
其中Ra和Rb各自为氢；q为0；
R7、R8和R9，以及R10、R11、R12、R13和R14中的其他基团各自为氢；
R3为烯丙基；
n和m各自为1；
R4和R5各自为N；
A为O或S；
R6为氢；
X为氧；以及
R2为氢。
2.一种具有式(FX12)的化合物：
Figure FDA0002549776320000013
其中：
R10、R11、R12、R13和R14之一为
Figure FDA0002549776320000014
其中Ra和Rb各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基；q为0；
R3为烯丙基；以及
R6、R7、R8和R9，以及R10、R11、R12、R13和R14中的其他基团各自为氢。
3.权利要求2所述的化合物，其具有式(FX12)的结构，其中：
R12为
Figure FDA0002549776320000021
以及
R10、R11、R13和R14各自为氢。
4.权利要求3所述的化合物，其具有式(FX3)的结构：
Figure FDA0002549776320000022
5.一种药物组合物，包含有效量的权利要求1-4任一项所述的一种或多种化合物。
6.权利要求5所述的药物组合物，其还包含赋形剂。
7.权利要求5或6所述药物组合物用于制备治疗癌症的药物的用途。
8.一种胱天蛋白酶原活化化合物用于制备治疗癌症的药物的用途，其中所述胱天蛋白酶原活化化合物为权利要求1-4任一项所述的化合物。
9.权利要求8所述的用途，其中所述药物选择性诱导癌细胞凋亡。
10.权利要求8所述的用途，其中所述胱天蛋白酶原活化化合物能够活化胱天蛋白酶原-3和胱天蛋白酶原-7之一。
11.权利要求8所述的用途，其中所述癌症为淋巴瘤、白血病、黑素瘤、***和乳腺癌。
12.权利要求9所述的用途，其中所述化合物不穿透血脑屏障至引起患者可感知的神经毒性作用的程度。
13.权利要求8所述的用途，其中所述癌症选自乳腺癌、淋巴瘤、肾上腺癌、肾癌、黑素瘤、白血病、成神经细胞瘤、肺癌或脑癌。
14.权利要求12所述的用途，其中所述癌症为白血病。
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