CN106922539B - 一种中药红背丝绸的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种中药红背丝绸的组培快繁方法，包括依次进行的如下步骤：获取红背丝绸的外植体、外植体诱导培养、继代培养、生根培养、移栽；所述的外植体诱导培养操作的外植体诱导培养基包括：MS培养基、2.0～4.0mg/L 6‑BA、0.5～1.0mg/L NAA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂、60～100ml/L椰子汁、0.1～0.3g/L活性炭，外植体诱导培养基pH为5.4～5.8，本发明选择红背丝绸带节茎段为外植体，经诱导培养、继代培养、生根培养以及移栽等步骤，其诱导率达到了88％以上，成活率达到了94％以上，实现了中药红背丝绸的组培快繁，从而实现了本发明的目的。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种中药红背丝绸的组培快繁方法。
背景技术
中药红背丝绸，即葡萄科白粉藤属植物苦郞藤(Cissus assamica(Laws.)Craib.)又名毛叶白粉藤、野葡萄、左边藤等，其性平，具有拔脓消肿、散瘀止痛等功效，民间常用于跌打损伤、风湿关节痛、痈疮、肿毒、蛇咬伤等疾病的治疗，特别是毒蛇咬伤，研究发现红背丝绸有抗拮内皮素作用，其乙醇提取物或乙酸乙酯萃取物或从其中分离得到的白藜芦醇在整体和离体水平对ET-1均具有明显拮抗作用，显著拮抗由ET-1引起的离体大鼠主动脉条的收缩并呈剂量依赖性，并且能够拮抗ET-1导致的大鼠血压上升的幅度，因此红背丝绸在广西有解蛇毒“圣药”之美誉。红背丝绸主要分布于广西、广东、江西、福建、贵州、云南、湖南等地，常见于山谷溪边林中、林缘或山坡中。由于红背丝绸生长境地的特殊性，生长缓慢以及被过度采挖，其野生资源锐减。
鉴于目前国内对中药红背丝绸的人工繁育未取得突破性进展，本发明选择红背丝绸带节茎段为外植体，经诱导培养、继代培养、生根培养以及移栽等步骤，实现了中药红背丝绸的组培快繁。本发明具有操作性强、成本低、工艺简单等特点，可直接用于红背丝绸种苗的工厂化生产，对于促进红背丝绸产业化开发具有重要的现实意义。
目前，国内外尚未有红背丝绸组织培养技术的报道，也未有红背丝绸组培快繁专利的申请。
发明内容
本发明的目的是提供一种中药红背丝绸的组培快繁方法，本发明选择红背丝绸带节茎段为外植体，经诱导培养、继代培养、生根培养以及移栽等步骤，其诱导率达到了88％以上，成活率达到了94％以上，实现了中药红背丝绸的组培快繁，从而实现了本发明的目的。
本发明提供的技术方案为：一种中药红背丝绸的组培快繁方法，包括依次进行的如下步骤：获取红背丝绸的外植体、外植体诱导培养、继代培养、生根培养、移栽；
所述的外植体诱导培养操作的外植体诱导培养基包括：MS培养基、2.0～4.0mg/L6-BA、0.5～1.0mg/LNAA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂、60～100ml/L椰子汁、0.1～0.3g/L活性炭，外植体诱导培养基pH为5.4～5.8。
在上述的中药红背丝绸的组培快繁方法中，所述的外植体诱导培养操作的方法为：将采集得到的作为外植体的红背丝绸的带节藤茎消毒后剪切成1.5～2.5cm的带节藤茎并接种到诱导培养基中，置于25～28℃进行全暗培养45～50天即可诱导形成不定芽。
在上述的中药红背丝绸的组培快繁方法中，所述的继代培养操作所用到的继代培养基包括：MS培养基、1.0～2.0mg/L 6-BA、0.1～0.3mg/LNAA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂、0.1～0.5g/L活性炭，继代培养基pH为5.4～5.8。
在上述的中药红背丝绸的组培快繁方法中，所述的继代培养操作具体为：将外植体诱导培养操作得到的不定芽切成长1～1.5cm的茎段并接种到继代培养基中培养25～30天即可实现不定芽的继代。
在上述的中药红背丝绸的组培快繁方法中，所述的生根培养操作所用到的生根培养基包括：MS、0.5～1.0mg/LABT-6、2.0～4.0mg/LNAA、15～20g/L蔗糖、3.0～4.0g/L琼脂、0.1～0.3g/L活性炭，生根培养基pH为5.4～5.8。
在上述的中药红背丝绸的组培快繁方法中，所述的生根培养操作的方法为：从基部切取所述的继代培养操作得到的长1.5～2.0cm的不定芽并接种到生根培养基中培养25～30天即能实现试管苗的生根。
在上述的中药红背丝绸的组培快繁方法中，所述的移栽操作的具体方法为：将经生根培养操作得到的根系生长良好的试管苗在温室的自然光下炼苗1～3天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的腐殖土、树皮混合基质中栽培成苗即得种苗。
在上述的中药红背丝绸的组培快繁方法中，继代培养操作、生根培养操中培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为2500～3000lx，光照时间为10～12小时/天。
有益效果：
本发明利用植物组织培养技术实现了中药红背丝绸的组培快繁，本发明具有操作性强、成本低、工艺简单等特点，可直接用于红背丝绸种苗的工厂化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例一
(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无明显病害的苦郞藤植株中上部、向阳充实的带节藤茎为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)诱导培养：当步骤(1)采集回实验室外植体先在自来水下冲洗过夜，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒5秒钟，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒15分钟，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干水分后切成1.5～2.5cm左右的带节藤茎并接种到诱导培养基中，置于25℃进行全暗培养45天即可诱导形成不定芽，诱导率为90.1％，污率低于25％。所述的诱导培养基为：MS培养基+4.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+60ml/L椰子汁+0.1g/L活性炭，pH为5.4。
(3)继代培养：将步骤(2)诱导得到的不定芽切成长约1～1.5cm的茎段并接种到继代培养基中培养25天即可实现不定芽的继代，增殖系数达到6倍。所述的继代培养基为：MS培养基+2.0mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA+20～30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+0.1g/L活性炭，pH为5.4。
(4)生根培养：从基部切取步骤(3)继代得到的长约1.5～2.0cm的不定芽并接种到生根培养基中培养25天即能实现试管苗的生根，生根率达到100％。所述的生根培养基为：MS+1.0mg/LABT-6(生根粉)+4.0mg/LNAA+15g/L蔗糖+3.0g/L琼脂+0.1g/L活性炭，pH为5.4。
(5)移栽：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室的自然光下炼苗1天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的腐殖土、树皮混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率达到95.6％。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为25℃，光照强度为2000lx，光照时间为10小时/天。
实施例二
(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无明显病害的苦郞藤植株中上部、向阳充实的带节藤茎为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)诱导培养：当步骤(1)采集回实验室外植体先在自来水下冲洗过夜，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒7秒钟，无菌水冲洗6次后用无菌滤纸吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒17分钟，无菌水冲洗6次后用无菌滤纸吸干水分后切成1.5～2.5cm左右的带节藤茎并接种到诱导培养基中，置于27℃进行全暗培养47天即可诱导形成不定芽，诱导率为94.7％，污染率低于20％。所述的诱导培养基为：MS培养基+3.0mg/L6-BA+0.8mg/LNAA+25g/L蔗糖+3.8g/L琼脂+80ml/L椰子汁+0.2g/L活性炭，pH为5.6。
(3)继代培养：将步骤(2)诱导得到的不定芽切成长约1～1.5cm的茎段并接种到继代培养基中培养27天即可实现不定芽的继代，增殖系数达到5倍。所述的继代培养基为：MS培养基+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+25g/L蔗糖+3.8g/L琼脂+0.3g/L活性炭，pH为5.6。
(4)生根培养：从基部切取步骤(3)继代得到的长约1.5～2.0cm的不定芽并接种到生根培养基中培养28天即能实现试管苗的生根，生根率为96％。所述的生根培养基为：MS+0.7mg/LABT-6(生根粉)+3.0mg/LNAA+17g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+0.2g/L活性炭，pH为5.6。
(5)移栽：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室的自然光下炼苗2天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的腐殖土、树皮混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率在95％以上。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为27℃，光照强度为2300lx，光照时间为11小时/天。
实施例三
(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无明显病害的苦郞藤植株中上部、向阳充实的带节藤茎为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)诱导培养：当步骤(1)采集回实验室外植体先在自来水下冲洗过夜，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒10秒钟，无菌水冲洗7次后用无菌滤纸吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水冲洗7次后用无菌滤纸吸干水分后切成1.5～2.5cm左右的带节藤茎并接种到诱导培养基中，置于28℃进行全暗培养50天即可诱导形成不定芽，诱导率为88％，污染率低于15％。所述的诱导培养基为：MS培养基+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+100ml/L椰子汁+0.3g/L活性炭，pH为5.8。
(3)继代培养：将步骤(2)诱导得到的不定芽切成长约1～1.5cm的茎段并接种到继代培养基中培养30天即可实现不定芽的继代，增殖系数达到4.1倍。所述的继代培养基为：MS培养基+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH为5.8。
(4)生根培养：从基部切取步骤(3)继代得到的长约1.5～2.0cm的不定芽并接种到生根培养基中培养30天即能实现试管苗的生根，生根率为89％。所述的生根培养基为：MS+0.5mg/LABT-6(生根粉)+2.0mg/LNAA+20g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+0.3g/L活性炭，pH为5.8。
(5)移栽：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室的自然光下炼苗3天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的腐殖土、树皮混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为94％。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为28℃，光照强度为2500lx，光照时间为12小时/天。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种中药红背丝绸的组培快繁方法，其特征在于：依次进行如下步骤：获取红背丝绸的外植体、外植体诱导培养、继代培养、生根培养、移栽；
所述的外植体诱导培养的外植体诱导培养基包括：MS培养基、2.0～4.0mg/L 6-BA、0.5～1.0mg/L NAA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂、60～100ml/L椰子汁、0.1～0.3g/L活性炭，外植体诱导培养基pH为5.4～5.8；所述的外植体为红背丝绸的带节藤茎消毒后剪切成1.5～2.5cm的带节藤茎；
所述的继代培养的继代培养基包括：MS培养基、1.0～2.0mg/L 6-BA、0.1～0.3mg/LNAA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂、0.1～0.5g/L活性炭，继代培养基pH为5.4～5.8；
所述的生根培养的生根培养基包括：MS培养基、0.5～1.0mg/L ABT-6、2.0～4.0mg/LNAA、15～20g/L蔗糖、3.0～4.0g/L琼脂、0.1～0.3g/L活性炭，生根培养基pH为5.4～5.8。
2.根据权利要求1所述的中药红背丝绸的组培快繁方法，其特征在于：所述的外植体诱导培养的方法为：将采集得到的作为外植体的红背丝绸的带节藤茎消毒后剪切成1.5～2.5cm的带节藤茎并接种到诱导培养基中，置于25～28℃进行全暗培养45～50天即可诱导形成不定芽。
3.根据权利要求1所述的中药红背丝绸的组培快繁方法，其特征在于：所述的继代培养具体为：将外植体诱导培养操作得到的不定芽切成长1～1.5cm的茎段并接种到继代培养基中培养25～30天即可实现不定芽的继代。
4.根据权利要求1所述的中药红背丝绸的组培快繁方法，其特征在于：所述的生根培养的方法为：从基部切取所述的继代培养操作得到的长1.5～2.0cm的不定芽并接种到生根培养基中培养25～30天即能实现试管苗的生根。
5.根据权利要求1所述的中药红背丝绸的组培快繁方法，其特征在于：所述的移栽的具体方法为：将经生根培养操作得到的根系生长良好的试管苗在温室的自然光下炼苗1～3天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的腐殖土、树皮混合基质中栽培成苗即得种苗。
6.根据权利要求1-5任一所述的中药红背丝绸的组培快繁方法，其特征在于：继代培养、生根培养中培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为2500～3000lx，光照时间为10～12小时/天。
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