CN106908562A - 一种莲藕多糖hpsec指纹图谱的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，其包括如下步骤：准备藕皮、食用部位和藕节三个供试部位并分别粉碎；将粉碎的三个供试部位分别进行多糖提取处理，得到多糖样品；对多糖样品分别进行检测，得到HPSEC‑UV‑RI二元图谱；多次重复得到多个不同品种莲藕的三个供试部位多糖的HPSEC‑UV‑RI二元图谱，进一步以平均向量构建得多糖HPSEC‑UV‑RI二元标准指纹图谱。优点在于，不同品种及不同部位莲藕多糖的HPSEC‑RI指纹特征具有明显差异，能用于鉴别莲藕品种；HPSEC‑UV指纹图谱可作为HPSEC‑RI指纹图谱的补充，以更准确的对莲藕品种进行鉴别。

Description

一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法
技术领域
本发明属于农产品及其功能成分的指纹图谱分析领域，具体涉及一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法。
背景技术
莲藕是我国栽培最广、销售量和销售范围最大的水生蔬菜。据中药大辞典所述，莲藕生用可清热、凉血、散疲、治热病烦渴，熟用可健脾、开胃、益血、生肌、止泻。上述功效可能部分与多糖有关，莲藕多糖经研究证实具有抗疲劳(周桃英，2011)、降血糖(罗登宏，2011)、抗氧化(罗登宏，2011；严浪，2008；Jiang,2011)和免疫调节(Jiang,2011)等活性。新鲜莲藕中多糖提取得率可达5％(孙杰，2016；王瑜，2007)，且藕皮、藕节和藕渣等传统加工副产物中也含有丰富的多糖(李正一，2016；严浪，2007)。目前，莲藕加工科技水平薄弱，产品“同质化”现象严重，经济附加值不高，且加工过程中产生大量的藕皮、藕节和藕渣等副产物均未得到有效开发利用。相应地，莲藕多糖的高值开发利用有助于完善产品结构和拓展产业链，在功能食品和生物医药领域应用前景良好，而多糖的质量控制极为关键。
莲藕种质资源极为丰富，在“国家种质武汉水生蔬菜资源圃”中保存资源已达310份，而人工选育品种达12种(柯卫东，2015)。韩延闯(2004)、刘月光(2006)、全志武(2008)和***(2011)均采用分子生物学技术研究了莲藕种质资源的遗传多态性，并构建生物指纹图谱用于品种鉴别，但相关技术因无法直接用于藕原料的分析鉴别而与实际生产脱节，亦无法反应莲藕中的生物活性成分信息。
基于物质群体的认识，指纹图谱可实现资源真实性鉴别、质量一致性评价和产品稳定性分析(***，2013)。多糖的组成与结构极为复杂，导致一般的理化分析和结构鉴定很难辨识多糖的质量优劣，但却为多糖的识别提供了丰富的指纹信息。多糖的指纹图谱技术在多糖及其原料质量控制方面有广泛的应用。枸杞多糖(高向东，2014)、猴头菇多糖(周春晖，2016)、铁皮石斛多糖(罗建平，2009)、决明子多糖(高新开，2014)、芦荟多糖(董银卯，2015)的指纹图谱技术不仅可以突破多糖品质与真伪鉴别，还可以实现原料品种及产地的区别。然而，莲藕多糖的指纹图谱技术尚未见报道。
莲藕中多糖具有良好的开发价值，急需研发可靠的质量评价技术。原料质量控制是多糖品质的重要保障，莲藕的种质资源丰富，现有的品种鉴别技术尚无法直接应用于藕精深加工产品质量控制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，其可用于莲藕品种的鉴别。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，其包括如下步骤：
1)取莲藕洗净后切分为藕段和藕节，藕段刨取皮部，藕节切除须根，得到藕皮、食用部位和藕节三个供试部位，分别粉碎至5～20目待用；
2)将步骤1)中粉碎的藕皮、食用部位和藕节三个供试部位分别进行多糖提取处理，分别得到相应的三份莲藕多糖样品；
3)以步骤2)得到的三份莲藕多糖样品为测试对象，采用HPSEC检测多糖样品的分子量分布，检测时将UV检测器和RI检测器串联使用，得到藕皮、食用部位和藕节三个供试部位相应的多糖HPSEC-UV图谱和多糖HPSEC-RI图谱；
4)多次重复步骤1)、2)和3)分别得到多个不同品种莲藕的藕皮、食用部位和藕节三个供试部位的多糖HPSEC-UV图谱和多糖HPSEC-RI图谱(HPSEC-UV-RI二元图谱)，以所有多糖HPSEC-UV指纹图谱的平均向量构建得多糖HPSEC-UV标准指纹图谱，以所有多糖HPSEC-RI图谱的平均向量构建得多糖HPSEC-RI标准指纹图谱，则完成莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以有如下进一步的具体选择。
具体的，步骤2)中的多糖提取处理的具体内容为：将供试部位按料液比1g:15mL加入蒸馏水，在12000r/min的转速下均质处理5min后转入90℃水浴恒温浸提2h；浸提结束后，采用4500r/min离心10min，过滤分离多糖提取液；调节多糖提取液pH至6.5，加入α-淀粉酶在70℃水浴中酶解至碘液反应呈阴性，冷却至室温后调节至pH 4.5，加入糖化酶在55℃水浴中酶解至还原糖含量不再增加，升温至95℃并保持10min灭酶；酶解提取液在70℃下真空浓缩至原体积1/4，采用Sevage法脱蛋白后加入无水乙醇至80％乙醇体积浓度，于4℃静置过夜；采用4500r/min离心10min分离沉淀多糖；多糖经80％乙醇洗涤后挥发乙醇，以少量水复溶后冷冻干燥得到莲藕多糖样品。
具体的，步骤3)中HPSEC检测的具体条件为：色谱柱为Ultrahydrogel250，柱温为45℃，流动相为0.1mol/L硝酸钠，洗脱流速为0.5mL/min，进样体积为15μL，采用0.1mol/L硝酸钠配制2.5mg/mL的莲藕多糖样液，经0.45μm滤膜过滤后进样分析。
具体的，所述多糖HPSEC-UV标准指纹图谱包括5个共有特征峰，其对应的保留时间依次为：12.55min、13.23min、13.53min、13.84min、15.39min。
具体的，所述多糖HPSEC-UV标准指纹图谱包括7个共有特征峰，其对应的保留时间依次为：13.00min、13.82min、14.30min、15.07min、15.47min、15.90min、16.80min。
具体的，步骤4)中多个不同品种莲藕的数量为13个以上。
本发明的有益效果是：本发明以不同品种及不同部位的莲藕多糖为研究对象，以多个莲藕多糖样品HPSEC-RI图谱的平均向量构建得多糖HPSEC-RI标准指纹图谱，以此为参照图谱，采用相关系数(R)和夹角余弦(cosθ)分析不同品种及不同部位莲藕多糖HPSEC-RI图谱的相似性，发现不同品种及不同部位莲藕多糖的HPSEC-RI指纹特征具有明显差异，可以作为莲藕品种鉴别的重要依据；本发明同时还以多个莲藕多糖样品HPSEC-UV图谱的平均向量构建得多糖HPSEC-UV标准指纹图谱，以此为参照图谱，采用相关系数(R)和夹角余弦(cosθ)进行相似性分析，发现有一些品种莲藕的不同部位对应多糖的HPSEC-UV图谱相似度较高，而另一些品种莲藕的不同部位对应的HPSEC-UV图谱的指纹特征具有明显异，故HPSEC-UV指纹图谱可作为HPSEC-RI指纹图谱的补充，两者配合可更加准确的反映莲藕多糖的结构特征，弥补单一HPSEC图谱指纹信息单薄的缺陷，以更加准确有效的对莲藕品种进行鉴别，同时也可进行莲藕多糖的真实性鉴别；以从多个品种莲藕的藕皮、藕节和食用部位提取的多糖为研究对象，整合莲藕资源中多糖的多维数据体系，增加了指纹图谱信息的全面性和可靠性。
附图说明
图1为莲藕多糖的HPSEC-RI指纹图谱，其中a和b分别为莲藕食用部位多糖HPSEC-RI指纹图谱及其标准图谱、c和d分别为藕皮多糖HPSEC-RI指纹图谱及其标准图谱；e和f分别为藕节多糖HPSEC-RI指纹图谱及其标准图谱；g为不同品种及不同部位莲藕多糖HPSEC-RI标准指纹图谱。
图2为莲藕多糖的HPSEC-RI指纹图谱，其中a和b分别为莲藕食用部位多糖HPSEC-UV指纹图谱及其标准图谱；c和d分别为藕皮多糖HPSEC-UV指纹图谱及其标准图谱；e和f分别为藕节多糖HPSEC-UV指纹图谱及其标准图谱；g为不同品种及不同部位莲藕多糖HPSEC-UV标准指纹图谱。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明作进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发提供一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，该包括如下具体内容：
1.莲藕供试样品的制备
鄂莲5号、鄂莲6号、鄂莲7号、鄂莲8号、应城白莲、走马羊、贵溪浮藕、巴河藕、白泡子、博白藕、武植2号、8143、常州漂江，共计13个品种莲藕由国家种质武汉水生蔬菜资源圃提供，取样时间为2015年10月。
取莲藕洗净后切分为藕段和藕节；藕段刨取皮部，藕节切除须根，得到藕皮、食用部位和藕节三个供试部位；供试部位分别粉碎至5～20目待用。
2.莲藕多糖的制备
称取步骤1)中莲藕供试样品100g，按料液比(g/mL)1:15加入蒸馏水，在12000r/min的转速下均质处理5min后转入90℃水浴恒温浸提2h；浸提结束后，采用4500r/min离心10min，过滤分离多糖提取液；调节多糖提取液pH至6.5，加入α-淀粉酶在70℃水浴中酶解至碘液反应呈阴性，冷却至室温后调节至pH 4.5，加入糖化酶在55℃水浴中酶解至还原糖含量不再增加，升温至95℃并保持10min灭酶；酶解提取液在70℃下真空浓缩至原体积1/4，采用Sevage法脱蛋白后加入无水乙醇至80％乙醇体积浓度，于4℃静置过夜；采用4500r/min离心10min分离沉淀多糖；多糖经80％乙醇洗涤后挥发乙醇，以少量水复溶后冷冻干燥得到莲藕多糖。
3.莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建
(1)莲藕多糖的HPSEC分析方法
采用HPSEC法检测莲藕多糖的分子量分布，色谱分析条件为：UV(或PDA)检测器(280nm)和RI检测器串联使用，色谱柱为Ultrahydrogel250，柱温为45℃，流动相为0.1mol/L硝酸钠，洗脱流速为0.5mL/min，进样体积为15μL。采用0.1mol/L硝酸钠配制2.5mg/mL的多糖样液，经0.45μm滤膜过滤后进样分析。
(2)莲藕多糖的HPSEC-RI标准指纹图谱构建及分析
不同品种及不同部位莲藕多糖的HPSEC-RI指纹图谱如图1所示。莲藕不同部位多糖的分子量分布存在相似之处，但亦存在明显的差异(表1)。相似之处在于：不同部位多糖均在保留时间13.00、13.82、14.30、15.47和15.90min附近出现色谱峰，对应分子量分别约18.45、11.57、9.18、5.94和5.30kDa，其共有特征峰所占总峰面积百分比均超过89％。不同之处在于：各共有特征峰所占总峰面积百分比大小不同，食用部位多糖和藕节多糖均以5.94kDa组分含量最高，而藕片多糖以11.57kDa组分含量最高；食用部位多糖和藕皮多糖含有少量分子量为6.75kDa的组分；藕皮多糖和藕节多糖含有少许分子量为4.60kDa的组分；藕节多糖中低分子组分含量较高，含有唯一的4.33kDa组分。
以39个多糖样品HPSEC-RI图谱的平均向量构建多糖HPSEC-RI标准指纹图谱(图1g所示)，以此为参照图谱，采用相关系数(R)和夹角余弦(cosθ)分析不同品种及不同部位多糖的HPSEC-RI指纹图谱相似性，由表2可见。39个多糖样品的相关系数值介于0.0775～0.9936，而夹角余弦值介于0.5143～0.9947，不同品种及不同部位多糖的HPSEC-RI指纹特征具有明显差异，可以作为莲藕品种鉴别的重要依据。
表1.莲藕多糖HPSEC-RI指纹图谱共有峰信息
表2.莲藕多糖HPSEC-RI指纹图谱的相似度分析
(3)莲藕多糖的HPSEC-UV标准指纹图谱的构建
13个品种莲藕的食用部位、皮部、节部制备所得多糖的HPSEC-UV指纹图谱如图2所示。莲藕不同部位多糖中蛋白特征色谱峰位于保留时间约12.55、13.23、13.53、13.84、14.55和15.39min处，对应分子量分别约17.56、11.66、9.93、8.52、6.29和4.79kDa，如表3所示。因分子量分布检测中RI和UV检测器为串联使用，标准品的RI信号较PDA信号延迟0.45～0.65min。以此判断，HPSEC-UV指纹图谱共有峰1和5分别对应HPSEC-RI指纹图谱共有峰1和4，即相应组分为多糖-蛋白质复合物，而其余组分为多糖或蛋白质。不同部位多糖之间的HPSEC-UV指纹图谱存在显著差异：食用部位多糖中不含分子量约11.66和4.79kDa的蛋白组分；藕节多糖中不含分子量约9.93和6.29kDa的蛋白组分。
以39个多糖样品HPSEC-UV图谱的平均向量构建多糖HPSEC-UV标准指纹图谱(图2g所示)，以此为参照图谱，采用相关系数(R)和夹角余弦(cosθ)分析不同品种及不同部位多糖的HPSEC-UV指纹图谱相似性，如表4所示。13个莲藕品种中，不同部位多糖HPSEC-UV指纹图谱相似度均达0.9以上的有6种。不同品种及不同部位多糖的HPSEC-UV指纹特征具有明显差异，可用于莲藕品种和不同部位莲藕原料的鉴别，其作为HPSEC-RI标准指纹图谱的补充，提供更多莲藕多糖的结构特征，以更准确的判断莲藕品种。
表3.莲藕多糖HPSEC-UV指纹图谱共有峰信息
表4.莲藕多糖HPSEC-UV指纹图谱的相似度分析
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取莲藕洗净后切分为藕段和藕节，藕段刨取皮部得到藕皮和食用部位，藕节切除须根，将藕皮、食用部位和藕节三个供试部位分别粉碎至5～20目，待用；
2)将步骤1)中粉碎的藕皮、食用部位和藕节三个供试部位分别进行多糖提取处理，分别得到相应的三份莲藕多糖样品；
3)以步骤2)得到的三份莲藕多糖样品为测试对象，采用HPSEC检测多糖样品的分子量分布，检测时将UV检测器和RI检测器串联使用，得到藕皮、食用部位和藕节三个供试部位相应的多糖HPSEC-UV图谱和多糖HPSEC-RI图谱；
4)多次重复步骤1)、2)和3)分别得到多个不同品种莲藕的藕皮、食用部位和藕节三个供试部位的多糖HPSEC-UV图谱和多糖HPSEC-RI图谱，以所有多糖HPSEC-UV图谱的平均向量构建得多糖HPSEC-UV标准指纹图谱，以所有多糖HPSEC-RI图谱的平均向量构建得多糖HPSEC-RI标准指纹图谱，则完成莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建。
2.根据权利要求1所述的一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤2)中的多糖提取处理的具体内容为：将供试部位按料液比1g:15mL加入蒸馏水，在12000r/min的转速下均质处理5min后转入90℃水浴恒温浸提2h；浸提结束后，采用4500r/min离心10min，过滤分离多糖提取液；调节多糖提取液pH至6.5，加入α-淀粉酶在70℃水浴中酶解至碘液反应呈阴性，冷却至室温后调节至pH 4.5，加入糖化酶在55℃水浴中酶解至还原糖含量不再增加，升温至95℃并保持10min灭酶；酶解提取液在70℃下真空浓缩至原体积1/4，采用Sevage法脱蛋白后加入无水乙醇至溶液中乙醇的体积浓度为80％，于4℃静置过夜；采用4500r/min离心10min分离沉淀多糖；多糖经体积浓度为80％乙醇洗涤后挥发乙醇，以少量水复溶后冷冻干燥得到莲藕多糖样品。
3.根据权利要求1所述的一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤3)中HPSEC检测的具体条件为：色谱柱为Ultrahydrogel250，柱温为45℃，流动相为0.1mol/L硝酸钠，洗脱流速为0.5mL/min，进样体积为15μL，采用0.1mol/L硝酸钠配制2.5mg/mL的莲藕多糖样液，经0.45μm滤膜过滤后进样分析。
4.根据权利要求1所述的一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述多糖HPSEC-UV标准指纹图谱包括5个共有特征峰，其对应的保留时间依次为：12.55min、13.23min、13.53min、13.84min、15.39min。
5.根据权利要求1所述的一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述多糖HPSEC-UV标准指纹图谱包括7个共有特征峰，其对应的保留时间依次为：13.00min、13.82min、14.30min、15.07min、15.47min、15.90min、16.80min。
6.根据权利要求1至5任一项所述的一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤4)中多个不同品种莲藕的数量为13个以上。
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