CN106906305A

CN106906305A - lncRNA在胃腺癌诊断中的应用

Info

Publication number: CN106906305A
Application number: CN201710301316.8A
Authority: CN
Inventors: 谷建斌
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-05-02
Filing date: 2017-05-02
Publication date: 2017-06-30

Abstract

本发明公开了lncRNA在胃腺癌诊断中的应用，所述lncRNA选自LINC01234、HOTAIR和FEZF1‑AS1中的至少两种。本发明通过实验证明了LINC01234、HOTAIR和FEZF1‑AS1在胃腺癌患者中表达显著上调；ROC曲线分析显示，上述lncRNA联合应用具有较高的AUC值，提示LINC01234、HOTAIR和FEZF1‑AS1可以联合应用于胃腺癌的诊断中。

Description

lncRNA在胃腺癌诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及lncRNA在胃腺癌诊断中的应用，具体的涉及LINC01234、HOTAIR和/或FEZF1-AS1在胃腺癌诊断中的应用。

背景技术

胃癌(gastric carcinoma，GC)是人类常见的恶性肿瘤，胃癌患者中90％以上为胃腺癌(gastric adenocarcinoma，GAC)，同时，胃癌因其侵袭性和转移性强，而成为对人类健康危害较大的恶性肿瘤之一。在世界范围内，胃癌的发病率排在人类常见恶性肿瘤的第五位，但由于其早期症状不明显，常常被误认为慢性胃炎(chronic gastritis)而延误诊断，往往发现诊断较晚，治疗结果不让人满意，死亡率高。人类罹患的癌症肿瘤中，胃癌病死率排在第二位。亚洲是胃癌的高发区，我国属于胃癌高发的国家之一，在我国的东部沿海及西北部地区胃癌的发病率及死亡率高于中国的南方地区。尽管现在针对胃癌的手术方式和化疗方案已经相当规范，但总体的生存率和预后却仍不尽如人意。胃癌患者的不良预后可能与患者诊断时病程大部分在进展期有很大关系。胃癌的发生和发展是由多种内部和外部因素共同作用的结果，但对其分子生物学行为我们知之甚少，针对胃癌发生和发展分子机制方面的研究具有十分重要的意义。

迄今为止，早期诊断、早期行手术根治切除对于胃癌患者的预后有重要临床意义。胃癌患者的早期症状不典型，临床表现较为隐匿，早期难以明确诊断，多数患者确诊时已处于疾病的中晚期，无法手术根治切除进一步降低了患者的5年生存率。目前，针对进展期胃癌的治疗方法主要包括手术切除、新辅助化疗和辅助放化疗等，但已侵犯腹腔脏器或多发***转移的患者，往往难以行手术根治性切除。因此胃癌的早期诊断对于胃癌患者的有效治疗具有重要的意义。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，简称lncRNA)是最近备受瞩目的哺乳动物转录组重要成员。与蛋白编码基因相比，它具有明显的组织特异性及发育阶段特异性，更可从多个角度调节蛋白编码基因的表达及修饰，如对蛋白编码基因的表观遗传学调节等。因此，lncRNA失调成为多种癌症的特征之一。lncRNA的发现为研究恶性肿瘤的生物学行为、揭示恶性肿瘤化疗耐药本质提供了重要契机。研究胃腺癌lncRNA表达谱变化，并深入研究这些差异表达lncRNA分子与胃腺癌的发生发展的关系，为胃腺癌的机制研究提供新视角，为胃腺癌的治疗提供新靶点和新策略。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，在于提供与胃腺癌发生发展相关的分子标志物。

本发明的目的之二，在于提供一种诊断胃腺癌的产品和手段，通过检测分子标志物的表达水平来判断患者是否患有胃腺癌或者患胃腺癌的风险，从而指导临床医生进行早期干预和治疗，提高患者的生存率和生存质量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测lncRNA的试剂在制备诊断胃腺癌的产品中的应用，所述lncRNA选自LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1中的任意两种或三种。

进一步，所述lncRNA为LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1中的三种。使用三种lncRNA进行联合诊断，具有较高的准确性，以及特异性和敏感性。

进一步，所述检测lncRNA的试剂选自：

特异性识别LINC01234、HOTAIR或FEZF1-AS1的探针；或

特异性扩增LINC01234、HOTAIR或FEZF1-AS1的引物。

本发明提供了一种诊断胃腺癌的产品，，所述产品包括检测LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1中至少两种lncRNA表达水平的试剂。

进一步，所述产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台的方法检测所述lncRNA表达水平的试剂。

本发明提供了一种诊断胃腺癌的芯片，所述产品包括固相载体，以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性识别LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1中的至少两种。优选的，所述寡核苷酸探针特异性识别LINC01234、HOTAIR和EZF1-AS1三种lncRNA。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

本发明提供了一种诊断胃腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增lncRNA以及管家基因的引物对，所述lncRNA选自LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1中至少两种。

优选的，所述试剂盒包括特异性扩增LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1三种lncRNA的引物对。

进一步，所述试剂盒还包括逆转录体系、聚合酶链式反应体系以及使用说明书。具体的，试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

附图说明

图1是QPCR检测五个lncRNA在胃腺癌组织和癌旁组织中的差异表达图；其中，图A是QPCR检测LINC01234在胃腺癌组织和癌旁组织中的差异表达图；图B是QPCR检测HOTAIR在胃腺癌组织和癌旁组织中的差异表达图；图C是QPCR检测FEZF1-AS1在胃腺癌组织和癌旁组织中的差异表达图；图D是QPCR检测LINC01105在胃腺癌组织和癌旁组织中的差异表达图；图E是QPCR检测LINC00982在胃腺癌组织和癌旁组织中的差异表达图。

图2是利用TCGA数据库交叉验证五个lncRNA在为胃腺癌组织和癌旁组织中的差异表达图；其中，图A是图A是验证LINC01234在胃腺癌组织和癌旁组织中的差异表达图；图B是验证HOTAIR在胃腺癌组织和癌旁组织中的差异表达图；图C是验证FEZF1-AS1在胃腺癌组织和癌旁组织中的差异表达图；图D是验证LINC01105在胃腺癌组织和癌旁组织中的差异表达图；图E是验证LINC00982在胃腺癌组织和癌旁组织中的差异表达图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序方法，检测胃腺癌标本中lncRNA在肿瘤组织和癌旁组织的表达，发现其中具有明显表达差异的lncRNA片段，探讨其与胃腺癌的发生之间的关系，从而为胃腺癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明发现了胃腺癌中LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1显著性上调。使用生物信息学方法证明，LINC01234、HOTAIR或FEZF1-AS1作为分子标志物应用于胃腺癌的早期诊断具有较高的准确性。

分子标志物

“分子标志物”是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因。

“差异表达基因”或“基因差异表达”是指，与正常或对照用靶的表达相比，在患有胃腺癌的患者体内得到更高或更低水平的活化的基因。此外，“差异表达基因”或“差异基因表达”包括相同疾病的不同分期内得到更高或更低水平的活化的基因。这种差异可通过如多肽的mRNA水平、表面显示、分泌或其他分配上的变化而得以证明。从本发明的目的出发，将“差异基因表达”视为从正常的或患有疾病的受试者中，或从患有疾病的受试者的各分期中的取得的基因的表达之间存在1.5倍或以上、约4倍或以上、约6倍或以上、约10倍或以上的差异时存在的现象。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因LINC01234、LINC01105、HOTAIR和FEZF1-AS1基因可具有SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，其具有与所列的序列至少70％相同或相似的cDNA序列，诸如上述所列的序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列。

LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1基因

LINC01234基因位于12号染色体长臂2区4带上，该基因目前存在5个转录本，一种代表性的人LINC01234基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。HOTAIR基因位于12号染色体长臂1区3带上，该基因目前存在5个转录本，一种代表性的人HOTAIR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。FEZF1-AS1基因位于7号染色体长臂3区1带上，该基因目前存在3个转录本，一种代表性的人FEZF1-AS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明中的lncRNA包括野生型、突变型或其片段。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸***或缺失)，在至少大约60％的核苷酸碱基、通常至少大约70％、更通常至少大约80％、优选至少大约90％、及更优选至少大约95-98％核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。

或者，当核酸或其片段与另一核酸(或其互补链)、一条链或其互补序列在选择性杂交条件下杂交时，则其间存在基本同源或(相同性)。当杂交比特异性整体丧失发生更具选择性时，存在杂交选择性。典型地，当在至少大约14个核苷酸的一段序列存在至少大约55％相同性、优选至少大约65％、更优选至少大约75％及最优选至少大约90％相同性时，发生选择性杂交。如本文所述，同源对比的长度可以是较长的序列节段，在某些实施方案中通常为至少大约20个核苷酸，更通常为至少大约24个核苷酸，典型为至少大约28个核苷酸，更典型为至少大约32个核苷酸，及优选至少大约36或更多个核苷酸。

因此，本发明的多核苷酸与lncRNA的代表性核苷酸序列优选具有至少75％、更优选至少85％、更优选至少90％同源性。更优选地，存在至少95％、更优选至少98％同源性。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

检测方法

本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

在本发明的某些实施方式中，基因表达产物标志物和可选择剪接标志物可通过微阵列分析确定，例如使用Affymetrix阵列、cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列、点样微阵列或来自Biorad、Agilent或Eppendorf的其他微阵列产品。微阵列提供特别的优势，因为它们可包括可在单个试验中分析的大量基因或可选择剪接变异体。在某些情况下，微阵列装置可包括整个人基因组或转录物组或它们的大部分，从而允许全面评价基因表达模式、基因组序列或可选择剪接。

微阵列分析开始于使用本领域已知的方法从生物样品(如活组织检查或细针吸取物)提取和纯化核酸。对于表达和可选择剪接分析，从DNA提取和/或纯化RNA可能是有利的。从其他形式的RNA如tRNA和rRNA提取和/或纯化mRNA可能是更有利的。

还可以用荧光、放射性核素或化学标记(如生物素或地高辛)通过例如逆转录、PCR、接合、化学反应或其他技术来标记纯化的核酸。标记可以是直接或间接的，其可能进一步需要偶联阶段。偶联阶段可发生在杂交前，例如使用氨基烯丙基-UTP和NHS氨基反应性染料(如氰蓝染料)，或在杂交后，例如使用生物素和标记的抗生蛋白链菌素。修饰的核苷酸以与常规核苷酸相比较低的比率(如以1aaUTP∶4TTP的比例)酶促加入，通常得到每60个碱基1个的结果(用分光光度计测量)。然后可用例如柱或透析过滤装置纯化DNA。氨基烯丙基基团是连接到核苷碱基的长连接体上的氨基，其与反应性标记(如荧光染料)反应。

杂交探针是不同长度的DNA或RNA的片段，其用于检测DNA或RNA样品中与探针序列互补的核苷酸序列的存在。因此，探针与其碱基序列允许由于探针与靶之间的互补性而使得探针-靶碱基配对的单链核苷酸(DNA或RNA)杂交。

除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

生物学分析

样品与正常的比较

可将在个体提供的样品(测度样品)上进行的分子表达谱的结果与已知或怀疑为正常的生物样品相比较。正常样品是没有或预期没有任何癌症、疾病或状况的样品或在分子表达谱分析中对于任何癌症疾病或状况测试为阴性的样品。正常样品可来自与被测试个体不同的个体或来自相同个体。正常样品可与测试样品在同一时间或不同时间进行分析。

可将测试样品的分析结果与在正常样品上进行的相同分析的结果相比较。在某些情况下，在正常样品上的分析结果来自于数据库或基准。在某些情况下，在正常样品上的分析结果是已知的或通常被本领域普通技术人员所接受的值。在某些情况下，比较是定性的。在其他情况下，比较是定量的。在一些情况下，定性或定量比较可包括但不限于以下一种或多种：比较荧光值、点强度、吸光度值、化学发光信号、柱状图、关键阈值、统计学显著性值、基因产物表达水平、基因产物表达水平的改变、可选择外显子使用、可选择外显子使用的改变、蛋白质水平、DNA多态性、拷贝(copy)数变异、一种或多种DNA标志物或区域存在或不存在的指示或核酸序列。

结果评估

在某些实施方式中，使用本领域已知的方法评估分子表达谱结果以将基因产物表达水平或可选择外显子使用与特定表型如恶性、恶性类型(如滤泡状癌)、良性或正常性(如不具有疾病或状况)相关联。在某些情况下，可以确定指定的统计学置信度水平以提供诊断置信水平。例如，可以确定，大于90％的置信度水平可以是恶性、恶性类型或良性的可用预测值。在其他实施方式中，可以选择更高或更低严格性的置信度水平。例如，可以选择大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或99.9％的置信度水平作为有用的表型预测值。在某些情况下，所提供的置信度水平可与样品的质量、数据的质量、分析的质量、所使用的特定方法和所分析的基因表达产物的数量相关。用于提供诊断的指定置信度水平可基于预期的假阳性或假阴性的数目和/或费用进行选择。选择用于实现指定的置信度水平或用于识别具有诊断能力的标志物的参数的方法包括但不限于：受试者工作特征曲线分析(Receiver Operator Curve analysis，ROC)、副法线ROC、主成分分析、部分最小平方分析、奇异值分解、最小绝对收缩和选择操作器(least absolute shrinkage andselection operator)分析、最小角回归和阈值梯度导向规则化(threshold gradientdirected regularization)方法。

数据分析

在某些情况下，原始基因表达水平和可选择剪接数据可通过应用设计用于归一化和/或提高数据的可信度的算法来改进。在本发明的某些实施方式中，由于处理的单个数据点的巨大数量，数据分析要求计算机或其他装置、机器或设备来应用本文所述的各种不同算法。“机器学***的信号(其通过例如基于微阵列杂交分析获得)通常经过算法处理以分类表达谱。监管的学习通常包括“训练”分类器以识别类之间的区别，然后“测试”分类器在独立测试集上的准确性。对于新的未知样品，可使用分类器来预测该样品所属的类。

在某些情况下，稳定多阵列平均(RMA)方法可用于归一化原始数据。RMA方法通过计算许多微阵列上各匹配细胞的背景校正强度开始。背景校正的值限于阳性值。在背景校正后，随后获得各个背景校正的匹配细胞强度的基础-2算法。然后使用分位数归一化方法使各微阵列上背景校正的、对数转化的、匹配的强度归一化，其中对于各输入阵列和各探针表达值，阵列百分位探针值被所有阵列百分位点的平均值取代。分位数归一化后，随后可将归一化的数据拟合到线性模型中，以获得各个微阵列上各个探针的表达测量值。然后可使用Tukey中位数平滑算法来确定归一化的探针组数据的对数标度表达水平。

还可进一步过滤数据以除去可以被认为可疑的数据。在某些实施方案中，从具有小于约4、5、6、7或8个鸟苷+胞嘧啶核苷酸的微阵列探针获得的数据可被认为是不可靠的，因为它们的异常杂交倾向或二级结构问题。类似地，从具有大于约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个鸟苷+胞嘧啶核苷酸的微阵列探针获得的数据可以被认为是不可靠的，因为它们的异常杂交倾向或二级结构问题。

在某些实施方案中，可以通过针对一系列参照数据集对探针组的可靠性分级选择不可靠的探针组以从数据分析中排除。例如，RefSeq或Ensembl(EMBL)被认为是非常高质量的参照数据集。在某些情况下，匹配RefSeq或Ensembl序列的探针组的数据由于它们预期的高可靠性可特别地包括在微阵列分析实验中。类似地，来自匹配较低可靠性的参照数据集的探针组的数据可从进一步分析中排除，或在各案基础上考虑包括在内。在某些情况下，Ensembl高通量cDNA(HTC)和/或mRNA参照数据集可单独地或一起用于确定探针组的可靠性。在其他情况下，探针组的可靠性可被分级。可以理解存在于现有技术中的任何可用于评估分子表达谱的给定探针和/或探针组的可靠性的方法以及不同方法之间的组合，都包括在本发明中。

在本发明的具体实施例中，实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，基因在实验组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

样本

本发明中，术语“样本”包括细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、胃胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。在本发明的具体实施例中，所述样本为组织。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与胃腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

收集3例进行了根治性切除手术的胃腺癌患者的癌旁组织和癌组织样本，患者在进行胃切除术前未接受任何化疗或放疗，纳入的患者的信息包括性别、年龄、lauren类型、组织学分型、以及肿瘤分期，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意，且患者签订了知情同意书。

2、RNA样品的制备

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，按说明书的具体步骤进行操作。

利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

3、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

4、构建cDNA文库(利用Illumina的Truseq RNA sample Prep Kit进行操作)

(1)片段化RNA

利用金属离子，将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。

(2)cDNA的合成

在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转录合成cDNA第一链cDNA，用dUTP代替dTTP，合成cDNA的第二链。

(3)连接适配子

加入End Repair Mix将双链cDNA补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。

(4)使用UNG酶消化cDNA二链

5、高通量测序

(1)文库富集，PCR扩增15个循环；

(2)使用2％琼脂糖凝胶回收目的条带；

(3)TBS380(Picogreen)定量，按数据比例混合上机；

(4)cBot上进行桥式PCR扩增，生成数据集；

(5)Hiseq4000测序平台，进行2*150bp测序。

6、高通量转录组测序数据分析

1)RNA-seq读段定位

首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的***默认参数。

2)转录丰度评估

匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。

3)差异表达基因的检测

将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。当FDR<0.05以及|log2FC>1|，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。

7、结果

RNA-seq结果显示，与癌旁组织相比，共有74个显著差异表达的基因，其中43个lncRNA表达上调，31个表达下调；其中LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1在胃腺癌组织中表达显著上调；LINC01105、LINC00982在胃腺癌组织中表达显著下调。

实施例2QPCR测序验证相关基因的差异表达

1、对LINC00511基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式收集胃腺癌组织和癌旁组织样本各10例。

2、RNA提取步骤同实施例1。

3、逆转录：

(1)逆转录体系的配置

采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mM dNTP，0.1mM DTT，30μM Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

(2)QPCR扩增检验

引物设计

LINC01234基因的引物序列为：

正向引物：5’-CGTGAAGAGTAGATGTAGA-3’(SEQ ID NO.4)

反向引物：5’-TGTATCATAGGTGCTGTAA-3’(SEQ ID NO.5)

LINC01105基因的引物序列为：

正向引物：5’-AAGCCATAAGCAGGTATTCT-3’(SEQ ID NO.6)

反向引物：5’-GCGATTCAGACGACATTG-3’(SEQ ID NO.7)

HOTAIR基因的引物序列为：

正向引物：5’-AATAGACATAGGAGAACACTT-3’(SEQ ID NO.8)

反向引物：5’-AATCTTAATAGCAGGAGGAA-3’(SEQ ID NO.9)

FEZF1-AS1基因的引物序列为：

正向引物：5’-ATTGATTGATTAGCGTTCTG-3’(SEQ ID NO.10)

反向引物：5’-GTGTCTTGAATATGGTTGTT-3’(SEQ ID NO.11)

LINC00982基因的引物序列为：

正向引物：5’-TTTCTGGCACCAGAGATTGAG-3’(SEQ ID NO.12)

反向引物：5’-CATCCAGGCAACAGCATTCG-3’(SEQ ID NO.13)

管家基因β-actin的引物序列为：

正向引物：5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’(SEQ ID NO.14)

反向引物：5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’(SEQ ID NO.15)

配制25μl反应体系

加入SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正反向引物(5μM)各1μl，模板cDNA2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增

设置程序为：95℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×35个循环。

以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

4、结果

结果如图1所示，与癌旁组织相比，LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1在胃腺癌组织中表达上调；LINC01105、LINC00982在胃腺癌组织中表达下调；差异具有统计学意义(P<0.01)，同RNA-sep结果一致。

实施例3分析候选lncRNAs在TCGA数据库中的表达情况

1、数据收集

从TCGA数据库中收集285例胃腺癌组织和30例癌旁组织的lncRNA表达谱数据，分析lncRNA LINC01234、LINC01105、HOTAIR、FEZF1-AS1、LINC00982、LINC00261在胃腺癌组织和癌旁组织中的表达水平；绘制箱形图。

2、ROC曲线分析

使用R语言中的pROC包分析lncRNA LINC01234、LINC01105、HOTAIR、FEZF1-AS1、LINC00982的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，绘制ROC曲线。

3、候选lncRNA联合应用的ROC曲线分析

4、结果

候选lncRNA的表达水平如图2所示，相比对照组，LINC01105(P＝0.002724)、LINC00982(P＝0.001156)在胃腺癌组织中表达显著下调；FEZF1-AS1(P＝2.2e-16),HOTAIR(P＝2.2e-16)、LINC01234(P＝6.78e-16)在胃腺癌组织中表达显著上调。

候选lncRNA的ROC曲线显示，LINC01105、FEZF1-AS、HOTAIR、LINC00982、LINC01234的AUC值高于0.7。其中，FEZF1-AS1、HOTAIR、LINC01234具有较高的特异性和敏感性，而LINC01105具有较高的敏感性，说明FEZF1-AS1、HOTAIR、LINC01234、LINC01105应用于胃腺癌的诊断具有较高的准确性。

候选lncRNA联合应用的AUC值如表1所示，FEZF1-AS1、HOTAIR、LINC01234联合用于诊断相比单独应用具有较高的准确性。

表1候选lncRNA联合应用AUC值

实施例4胃腺癌诊断试剂盒的制备

根据LINC01234、HOTAIR、FEZF1-AS1基因与胃腺癌的相关性，可以通过检测LINC01234、HOTAIR、FEZF1-AS1基因的表达情况来诊断胃腺癌是否发生，据此本发明提供了一种基于检测LINC01234、HOTAIR、FEZF1-AS1基因表达来诊断胃腺癌的试剂盒，试剂盒组分如下：SYBR Green聚合酶链式反应体系、扩增LINC01234、HOTAIR、FEZF1-AS1基因和β-actin基因的引物对、M-MLV逆转录体系、RNA提取试剂。扩增LINC01234基因的正向引物序列为5’-CGTGAAGAGTAGATGTAGA-3’，反向引物序列为5’-TGTATCATAGGTGCTGTAA-3’；扩增HOTAIR基因的正向引物序列为5’-AATAGACATAGGAGAACACTT-3’，反向引物序列为5’-AATCTTAATAGCAGGAGGAA-3’；扩增FEZF1-AS1基因的正向引物序列为5’-ATTGATTGATTAGCGTTCTG-3’，反向引物序列为5’-GTGTCTTGAATATGGTTGTT-3’；扩增β-actin的正向引物序列为5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，反向引物序列为5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。PCR缓冲液组分为：25mM KCl、2.5mM MgCl₂、200mM(NH₄)₂SO₄。M-MLV逆转录体系组分为：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。逆转录反应液组分为：250mM的Tris-HCl(PH8.3)、375mM的KCl、15mM的MgCl₂，50mM的DTT。RNA酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。

实施例5胃腺癌诊断试剂盒的制备

根据LINC01234、FEZF1-AS1基因与胃腺癌的相关性，可以通过检测LINC01234、FEZF1-AS1基因的表达情况来诊断胃腺癌是否发生，据此本发明提供了一种基于检测LINC01234、FEZF1-AS1基因表达来诊断胃腺癌的试剂盒，试剂盒组分如下：SYBR Green聚合酶链式反应体系、扩增LINC01234、FEZF1-AS1基因和β-actin基因的引物对、M-MLV逆转录体系、RNA提取试剂。扩增LINC01234基因的正向引物序列为5’-CGTGAAGAGTAGATGTAGA-3’，反向引物序列为5’-TGTATCATAGGTGCTGTAA-3’；扩增FEZF1-AS1基因的正向引物序列为5’-ATTGATTGATTAGCGTTCTG-3’，反向引物序列为5’-GTGTCTTGAATATGGTTGTT-3’；扩增β-actin的正向引物序列为5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，反向引物序列为5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。PCR缓冲液组分为：25mM KCl、2.5mM MgCl₂、200mM(NH₄)₂SO₄。M-MLV逆转录体系组分为：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。逆转录反应液组分为：250mM的Tris-HCl(PH8.3)、375mM的KCl、15mM的MgCl₂，50mM的DTT。RNA酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 谷建斌

<120> lncRNA在胃腺癌诊断中的应用

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2088

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

acattttcct ggagcggctg ggaaagagga gtctctcgaa attcagcaac tgctaacagc 60

gaggaggggg tgctagccag gatcactccc tccgaagtca caccagaggg agggctggag 120

ggagaatcaa atgaaagaga gagggagaga aaggaaggaa gagaaggagg gagaatggaa 180

ggatgtatgg atttggatgt atgggttcca ttccttctac cctggcaaaa gcttactcat 240

ccttcagtgt ccatccaaaa tggcatctct tcttgggcac catctccaga gtctcctgca 300

agcaggtagc tacatcccac aaaacaacca cccatctgac catgcaagtg tgtgggggaa 360

tgaagaccag cccaggaatc tgagatgaat gttttgcttc ttgctctgcc actgactcac 420

agggtacccc aagcaagtcc cttcacctcc tcggtctcag tttctccatt tatactacta 480

aggcagtgga catgatggcc tcaagtctca acatttttat tccctgaaaa gaaactcttg 540

gtgctgagtg gtcttcttct gccctgacat ctcacctttc aaacgcttgt ctcttctcac 600

cccacccacc acttagcatg tgctcttgga gaacacccag gactcagggt ctctgcacac 660

atcatgagtc cagctcagca tttgaggtgg aatcagagga aaggaaggag agtggggaga 720

atagtcagta ttttggcaag ctcatcatac cttccccctt tgtatagaaa cttcaaacca 780

tttccctttg aaggcactac ctccttcccc cagttataaa tgagtgaagg tctcaagcct 840

ggacaaccaa atgcacagtg attggttcaa ctctggacct gtgactcaag ccagaccaag 900

ggagtgacat gcagggcttt gcctggaact attctgaaag gggcactctc tttctgctgg 960

gctactgata atatgtgcat ccgtgataga agagcctgcc tgataataaa gccaataagg 1020

gaagagcaga gccaagagat ggtgggagag cagatgcctg aaaatatcat ttgagcccct 1080

gggtccagct gcacctgaag ccaccacgat ctcctggact ttgcagttac ttgagttcat 1140

aaataccctt tggcattaag ccagattgag tcttaatgca tatagaaata agagaaatga 1200

gaaaagaaat tgaaaagaga gacagcagag aactgattct ctactagagc ctccagaagg 1260

aatcaactct gccaacacct tgattttgga cttgtggcct tcagaacagt gaaatgataa 1320

acatctgtta ttttaaggta cctagtgtgt aacattccgt catgacagcc ctaggaaatg 1380

aatacagcga ggaaaatcct accagcacaa aggcatggag gtgccaggat gtctcctctg 1440

cgtgaagagt agatgtagat gaggctggaa ttatctatcc tagctgccca gacccatgtg 1500

cctttgtttt atgtagttac agcacctatg atacatattt gttaccatgt atgtcactat 1560

gaacctcctc tggaggacgg agaagtcaaa taccttaatt attccaacac aagcttgcgt 1620

gaacagataa tcatcactac gagtatattg tgtgcctgct aagcaccaca cctgagataa 1680

gcatttgctg tggtttgaat gtcccctcca aagctcatgc taaaatttaa ttgccattgc 1740

aacagtgttg caaggtgaga actttaagag atgatcaggt catgagaact ctgccctcgt 1800

gaatggatta atacccttat cgcagtagtg gacccccctt ttctcttgct gtctgtctct 1860

catgttagct tgtgcttcct cctttcacca tgggataaca cagcaagaag cccctcacca 1920

gatgctggca ccttgctatt ggacttccgg cctccagaac tgagaaatac atgtcttttc 1980

cttataaatt acccagtctg tggtattctg ttatagcggc agaaaatgga ctaagacggc 2040

attttgcata cattatctgt cttattaaaa ataatgtttt tgcccagg 2088

<210> 2

<211> 2421

<212> DNA

<213> 人源

<400> 2

ccagttctca ggcgagagcc gcggctgaca gggtctggga cagaaggaaa gccctccagc 60

ctccaggccc tgccttctgc ctgcacattc tgccctgatt tccggaacct ggaagcctag 120

gcaggcagtg gggaactctg actcgcctgt gctctggagc ttgatccgaa agcttccaca 180

gtgaggactg ctccgtgggg gtaagagagc accaggcact gaggcctggg agttccacag 240

accaacaccc ctgctcctgg cggctcccac ccgggactta gaccctcagg tccctaatat 300

cccggaggtg ctctcaatca gaaaggtcct gctccgcttc gcagtggaat ggaacggatt 360

tagaagcctg cagtagggga gtggggagtg gagagaggga gcccagagtt acagacggcg 420

gcgagaggaa ggaggggcgt ctttattttt ttaaggcccc aaagagtctg atgtttacaa 480

gaccagaaat gccacggccg cgtcctggca gagaaaaggc tgaaatggag gaccggcgcc 540

ttccttataa gtatgcacat tggcgagaga agtgctgcaa cctaaaccag caattacacc 600

caagctcgtt ggggcctaag ccagtaccga cctggtagaa aaagcaacca cgaagctaga 660

gagagagcca gaggagggaa gagagcgcca gacgaaggtg aaagcgaacc acgcagagaa 720

atgcaggcaa gggagcaagg cggcagttcc cggaacaaac gtggcagagg gcaagacggg 780

cactcacaga cagaggttta tgtattttta ttttttaaaa tctgatttgg tgttccatga 840

ggaaaaggga aaatctaggg aacgggagta cagagagaat aatccgggtc ctagctcgcc 900

acatgaacgc ccagagaacg ctggaaaaac ctgagcgggt gccggggcag cacccggctc 960

gggtcagcca ctgccccaca ccgggcccac caagccccgc ccctcgcggc caccggggct 1020

tccttgctct tcttatcatc tccatcttta tgatgaggct tgttaacaag accagagagc 1080

tggccaagca cctctatctc agccgcgccc gctcagccga gcagcggtcg gtggggggac 1140

tgggaggcgc taattaattg attcctttgg actgtaaaat atggcggcgt ctacacggaa 1200

cccatggact cataaacaat atatctgttg ggcgtgagtg cactgtctct caaataattt 1260

ttccataggc aaatgtcaga gggttctgga tttttagttg ctaaggaaag atccaaatgg 1320

gaccaatttt aggaggccca aacagagtcc gttcagtgtc agaaaatgct tccccaaagg 1380

ggttgggagt gtgttttgtt ggaaaaaagc ttgggttata ggaaagcctt tccctgctac 1440

ttgtgtagac ccagcccaat ttaagaatta caaggaagcg aaggggttgt gtaggccgga 1500

agcctctctg tcccggctgg atgcagggga cttgagctgc tccggaattt gagaggaaca 1560

tagaagcaaa ggtccagcct ttgcttcgtg ctgattccta gacttaagat tcaaaaacaa 1620

atttttaaaa gtgaaaccag ccctagcctt tggaagctct tgaaggttca gcacccaccc 1680

aggaatccac ctgcctgtta cacgcctctc caagacacag tggcaccgct tttctaactg 1740

gcagcacaga gcaactctat aatatgctta tattaggtct agaagaatgc atcttgagac 1800

acatgggtaa cctaattata taatgcttgt tccatacagg agtgattatg cagtgggacc 1860

ctgctgcaaa cgggactttg cactctaaat atagacccca gcttgggaca aaagttgcag 1920

tagaaaaata gacataggag aacacttaaa taagtgatgc atgtagacac agaaggggta 1980

tttaaaagac agaaataata gaagtacaga agaacagaaa aaaaatcagc agatggagat 2040

taccattccc aatgcctgaa cttcctcctg ctattaagat tgctagagaa ttgtgtctta 2100

aacagttcat gaacccagaa gaatgcaatt tcaatgtatt tagtacacac acagtatgta 2160

tataaacaca actcacagaa tatattttcc atacattggg taggtatgca ctttgtgtat 2220

atataataat gtattttcca tgcagtttta aaatgtagat atattaatat ctggatgcat 2280

tttctgtgca ctggttttat atgccttatg gagtatatac tcacatgtag ctaaatagac 2340

tcaggactgc acattccttg tgtaggttgt gtgtgtgtgg tggttttatg cataaataaa 2400

gttttacatg tggtgaatat a 2421

<210> 3

<211> 2653

<212> DNA

<213> 人源

<400> 3

gaaaactttg ggcttggcat taggagagcc tcggctgaaa tccgaggttt tgaacgcgat 60

tttttccgac agaagctggg cgctttcttt catgtaatgc tgcagctgag cctgggacag 120

gtctttgaaa gctactccag aagggtattt ctccaccgcc gggaccacca gtttattcct 180

ttcggctaaa tacgtttttg gctgcgggtg caaaggggaa ctgaggaagt aggaggccac 240

cgggtggatg ttcacgccgg ctgccgggtg gcatgggccg tcacctcggt tcaggtagca 300

caaggcgccc atggcgtgga atgaagagtg gttgaccaca cgcggcctta ccagcttgta 360

ctgctgcagc ggcagcgcgt cgcgggccag gtcgcccttg agactcagtg cgcagttgag 420

caggtcgctg cagctgaatg cgggagccga gggcaccgcc gcgggcgccg ccggggcctc 480

cagactggcc ttccgcggct cggagcccgt cactcctgcc ttggggctcg tgtcgtaggc 540

cacaggcacg aaggggatca tgcaggggat cgacgagttg agatgcagag agtgcttggg 600

ttcccccttg gcatcaccag ccgaacctgc ctgcccagcc caatggactc ctgccagccc 660

atcgcagagt tcttggcgca ccaatgactc ggggacaatc actacttatt tctatcaata 720

gaaagtgttg tgtcaataac gcagccaaga tctcgccaat cgttaacttc caagaggaga 780

agggctcggg gttgcccgct cccggaatcc cggagtctcc gcggcccgaa ccgagtctgg 840

accatttaga agacgccggc aggtaactgg cctccccaaa cgccccgaaa attaaaagcc 900

ttaggaggct tgttctgtgt ttgtggtttt gtaaaggcaa tgcccgcggc aataggcctg 960

ggaaagtcgc actttcatcc acaaagttga ggagttgcaa ggaataattg ggtgtcacac 1020

cacaagcaac cttgactcga tcggacccca cccaggatac acacagacgc gcgcgcgcgc 1080

acgcttccga gtttccattg agagtctgga aagagcattt ctttcttaag tacctgcgct 1140

cagctagagc tctcccggag cattttaaat actgaatgcc gagcggagaa gggaaacaga 1200

gtgtattaat ccccactccg gttgccggtg tctgcaagcc tcctctaagc agcgcaggcg 1260

gcagcctgga tgtctgtgcg catcaaggag acttgccggc gccagagttg tgtccacagg 1320

tgcacttgtg cctcccaaag agcgcgcgta gagaccattt cccctgcaac gccccccagc 1380

cgaacacccg ccgggtgtgg cacctcggcc gaaactcctg gggcggcgcg gtggagcgtg 1440

tggaggtttc cgggaagacg cctacggctg cggctccgac tgtgcgggct cccgccgccc 1500

aggcaagagc gtccaggagc gcgctggaag ctgcggcgcg caccttcccc ggcgcagtct 1560

cttgccagcc ggcgatcacg cagagctgaa ccccgcagct aggcgcgcag gaagggctgc 1620

acagagtttg aagacacggc agctgtaagc tggcgtgagg aggccaaagg agcgcgcaga 1680

gctgcaagca aagggcggtg gggcctggac cctgaagtga gtggccgacc gcagcagctc 1740

aaggtgccat ctgcctggca agctacccgg gtccctccgc cccactctaa ctttccgcga 1800

aaatcagttc cgcctctgcc ccaagagcca agaggggtgg aaaggaagag agcttgggct 1860

gggaacgcgc ctgatgtcta acagaaaggc agtggcagct ggcgaaaaat ccccctcctg 1920

ctgcactcct ccgccaccgg gctaggttga aaggaaaaag ccaagaagcg cgaagcagcc 1980

cggctctgga aggctttgga gagtccagct gacttgtaca caattcgcgg cctctggagc 2040

cttacctgcc ttcttgactg aatgccacca gttcgtttta cgcttgtggc tttttgttga 2100

agtccctatc ataagcaaat gcagtttctg gctatggtta ctgcaattcg aaataaaagg 2160

cctgtgaggt gtgtccctcc agactgagag gctatgactc agggttggac tttatggaaa 2220

aaaagaagtt tataaaacaa gtaacccagt ttctccaacc tttactgtgg agcaacagcg 2280

tcaagcaaca aaacccagca aagttttgct tgtcacttac aagggtgtta ctgaaatctg 2340

gaaggcgaac aattagaaga tagcccaaac atgctctatt gctctacact gaaatacttg 2400

cctccaataa tagaaaaaac ctgttttcgt gcaattgatt gattagcgtt ctgcagcagt 2460

ccctggacaa ttttaaagac attttgtgtt tgtggccaaa attagaaaca agcagacaca 2520

cacacaaaac aaccatattc aagacacggt tcgactgttt ccttgacact acccacgaag 2580

tttaaagcat tttttatgtt attttcaaac tttcttaagt gatcccatga aataaaagtc 2640

gataatagaa att 2653

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgtgaagagt agatgtaga 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtatcatag gtgctgtaa 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagccataag caggtattct 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcgattcaga cgacattg 18

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aatagacata ggagaacact t 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aatcttaata gcaggaggaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

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<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

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<210> 13

<211> 20

<212> DNA

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<400> 13

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<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agcgagcatc ccccaaagtt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gggcacgaag gctcatcatt 20

Claims

1.检测lncRNA的试剂在制备诊断胃腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述lncRNA选自LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1中的任意两种或三种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述lncRNA为LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1中的三种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测lncRNA的试剂选自：

特异性识别LINC01234、HOTAIR或FEZF1-AS1的探针；或

特异性扩增LINC01234、HOTAIR或FEZF1-AS1的引物。

4.一种诊断胃腺癌的产品，其特征在于，所述产品包括检测LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1中至少两种lncRNA表达水平的试剂。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台的方法检测所述lncRNA表达水平的试剂。

6.一种诊断胃腺癌的芯片，其特征在于，所述产品包括固相载体，以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性识别LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1中的至少两种。

7.根据权利要求6所述的芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探针特异性识别LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1三种lncRNA。

8.一种诊断胃腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增lncRNA以及管家基因的引物对，所述lncRNA选自LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1中的至少两种。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增LINC01234、HOTAIR和FEZF1-AS1三种lncRNA的引物对。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括逆转录体系、聚合酶链式反应体系以及使用说明书。