CN106902098A - 一种抗肿瘤植入膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种抗肿瘤植入膜及其制备方法，所述抗肿瘤植入膜为负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜，制备方法如下：步骤一、用静电纺丝技术将带氨基的可生物降解高分子材料制备成由纳米纤维组成的电纺膜；步骤二、将步骤一所述电纺纳米纤维膜浸泡到溶瘤病毒溶液中，通过静电吸附作用将溶瘤病毒富集到纤维膜上，获得所述抗肿瘤植入膜。针对肿瘤手术后面临的局部化疗和耐药性等问题，以及溶瘤病毒应用时瘤内注射的技术局限性，本发明直接植入肿瘤切除部位，对残余肿瘤进行局部治疗，避免肿瘤复发，并拓宽了溶瘤病毒的应用范围。该植入膜为可生物降解高分子材料，生物相容性好，可被人体完全吸收，并且可以物理隔绝肿瘤切除部位与腹膜，起到防粘连作用。

Description

一种抗肿瘤植入膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤植入膜及其制备方法。
背景技术
手术切除是癌症病人最有效的治疗方法，但是由于肿瘤切除边缘难以界定，易残留隐匿性肿瘤细胞，导致手术后复发率较高，其5年复发率可高达77％-100％。为了防止肿瘤复发，手术后往往需要进行化疗。传统的化疗方法多为全身静脉给药，但因为化疗药物选择性差，对于正常细胞和肿瘤细胞具有几乎同样的杀伤性，全身用药，毒性较大，副作用比较多，很多病人都难以接受。另外，长期使用化疗药物会导致肿瘤细胞的耐药性。尤其是，肝脏等解毒器官对于化疗药物非常不敏感，这对这类脏器的化疗治疗起到了极大的阻碍作用。
溶瘤病毒(oncolytic virus)是天然存在或经过人工改造之后的能够选择性感染并裂解肿瘤细胞的一类病毒。它们通过删除一些在正常细胞中复制所必需而在肿瘤细胞中复制所不需要的病毒关键基因从而达到特异性靶向肿瘤细胞的作用，能选择性感染肿瘤细胞并在其中复制，最终裂解、杀死肿瘤细胞，并释放出子代病毒颗粒进一步感染周围的肿瘤细胞，而在正常组织细胞中则无复制或杀伤作用，而且它还可以诱导特异性抗肿瘤免疫反应。由于溶瘤病毒具有与传统化疗药物不同的抗肿瘤机制，具有化疗抵抗性的肿瘤细胞仍然对溶瘤病毒治疗敏感。2015年10月27日，美国食品药品监督局(FDA)已经批准安进(Amgen)公司经过基因改造的单纯疱疹病毒用于治疗病灶在皮肤和***的黑色素瘤。2016年8月16日英国医疗成本监管机构——英国国家卫生与临床优化研究所(NICE)发布最终指南，支持将溶瘤免疫疗法用于英格兰和威尔士国家卫生服务(NHS)***，用于治疗黑色素瘤患者。但是溶瘤病毒治疗法需要较高的病毒浓度，治疗方式通常是直接将病毒溶液注射到肉眼可分辨的肿瘤中并用病毒溶液饱和整个肿瘤。这种给药方式对于体内深部的肿瘤和手术残留的隐匿性肿瘤细胞的来说，难以实现。因此亟需一种针对溶瘤病毒应用时瘤内注射的技术局限，以及肿瘤手术后面临的局部化疗和耐药性等问题有效抗肿瘤药物和方法。
发明内容
基于以上现有技术的不足，针对肿瘤手术后面临的局部化疗和耐药性等问题，以及溶瘤病毒应用时瘤内注射的技术局限性，本发明运用静电纺丝技术制备了一种负载溶瘤病毒的纳米纤维植入膜。在肿瘤手术中直接植入肿瘤切除部位，原位将溶瘤病毒缓释出来，特异性靶向肿瘤细胞，对残余肿瘤进行局部治疗，避免肿瘤复发，并拓宽了溶瘤病毒的应用范围。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗肿瘤植入膜，所述抗肿瘤植入膜为负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜。
作为上述技术方案的优选实施方式，本发明实施例提供的一种抗肿瘤植入膜进一步包括下列技术特征的部分或全部：
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述电纺纳米纤维膜为以带氨基的可生物降解高分子材料为电纺材料，采用静电纺丝技术制备的高分子纳米纤维膜。
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述溶瘤病毒为溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤新城疫病毒中的一种或者多种的混合。
一种抗肿瘤植入膜的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
步骤一、电纺纳米纤维膜的制备，用静电纺丝技术将带氨基的可生物降解高分子材料制备成由纳米纤维组成的电纺膜；
步骤二、负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜的制备，将步骤一所述的电纺纳米纤维膜浸泡到溶瘤病毒溶液中，通过静电吸附作用将溶瘤病毒富集到电纺纤维膜上面，获得负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜即抗肿瘤植入膜。
作为上述技术方案的优选实施方式，本发明实施例提供的一种抗肿瘤植入膜的制备方法进一步包括下列技术特征的部分或全部：
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述带氨基的可生物降解高分子材料优选为壳聚糖。
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述溶瘤病毒为溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤新城疫病毒中的一种或者多种的混合。
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述溶瘤病毒溶液优选的为溶瘤病毒水溶液，所述溶瘤病毒溶液浓度为103～107pfu/mL。
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述抗肿瘤植入膜置于-100℃～-5℃保存。
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述抗肿瘤植入膜置于-80℃条件下冻存。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：
(1)本发明的抗肿瘤植入膜可以实现局部抗肿瘤治疗，避免了全身化疗的毒副反应；提高了肿瘤部位的药物浓度，降低了药物使用量，减少成本。(2)本发明使用溶瘤病毒进行抗肿瘤治疗，解决了使用化疗药物后产生的耐药性问题和某些肿瘤细胞对化疗药物不敏感的问题。(3)本发明使用的电纺纳米纤维膜具有较大的比表面积和孔隙率，是富集溶瘤病毒的良好载体，并通过植入膜的形式简易的将溶瘤病毒释放到残留的肿瘤细胞部位，提高了局部溶瘤病毒的浓度也突破了溶瘤病毒瘤内注射的技术局限。(4)本发明使用的高分子材料均为可生物降解高分子材料，生物相容性好，可被人体完全吸收，不用二次手术取出。(5)本发明所用的制备方法，静电纺丝技术和负载溶瘤病毒的静电吸附法，可以适用于多种高分子材料和溶瘤病毒，具有普适性。(6)该植入膜还可以物理隔绝肿瘤切除部位与腹膜，起到防粘连作用。
本发明利用静电纺丝技术将壳聚糖等高分子材料制备成具有高比表面积和孔隙率的纳米纤维膜，并用其负载溶瘤病毒，在肿瘤手术中直接植入肿瘤切除部位，以杀死附近潜在的肿瘤细胞，避免肿瘤复发。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下结合优选实施例，详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍。
图1：抗肿瘤植入膜作用效果示意图；
图2：负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜的扫描电子显微镜照片；
图3：泡膜前溶瘤病毒溶液中病毒滴度与负载到电纺纳米纤维膜上的病毒负载量的关系图；
图4：负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜的对于各种人肝癌细胞的抗肿瘤效果；
图5：负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜对于Bel-7402细胞的杀伤力与MOI的关系图。
具体实施方式
下面详细说明本发明的具体实施方式，其作为本说明书的一部分，通过实施例来说明本发明的原理，本发明的其他方面、特征及其优点通过该详细说明将会变得一目了然。
利用静电纺丝技术将高分子材料制备成电纺纳米纤维膜，将纳米纤维膜浸泡在溶瘤病毒溶液中，通过静电吸附作用将溶瘤病毒富集到电纺纤维膜上面，获得负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜。在肿瘤手术中直接植入肿瘤切除部位，原位将溶瘤病毒缓释出来，特异性靶向肿瘤细胞，起到原位局部抗肿瘤作用。如图1所示即为本发明的抗肿瘤植入膜的作用效果示意图。
所述的高分子材料为带氨基的可生物降解高分子材料，如壳聚糖等。静电纺丝技术可以将该高分子溶液制备成纳米纤维膜，即由直径从3nm–5μm的纤维组成的三维空间结构。由于纳米级纤维的比表面积是微米级纤维的1000倍，由纳米级纤维组成的纳米纤维膜的比表面积将比由普通纺丝技术制备的纤维膜大几个数量级。
所述的溶瘤病毒包含溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤新城疫病毒等。
所述负载溶瘤病毒的方法为静电吸附法。由于溶瘤病毒通常带负电，而由带氨基的高分子材料制备的电纺纳米纤维膜在溶液中会带正电，通过静电吸附可以将溶瘤病毒富集到电纺纳米纤维膜上面。而如上所述，电纺纳米纤维膜具有极大的比表面积，是富集溶瘤病毒的良好载体，该植入膜植入体内后可以提高局部溶瘤病毒的浓度。
实施例1：负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜的制备方法
将壳聚糖(粘均分子量约为85万，脱乙酰度为95％)与聚氧化乙烯(重均分子量为60万)共同溶于90％的乙酸溶液中，配置成质量分数为3.25％的高分子溶液，其中壳聚糖与聚氧化乙烯的质量比为90:10。将该高分子溶液置于静电纺丝装置的进样装置中，调节电压为20kv，喷头与收集板的距离为15cm，收集厚度为150～200μm的纳米纤维膜。从收集板上取下纳米纤维膜，浸泡在1mol/L的碳酸钾溶液中1hr，然后用去离子水洗涤干净并室温干燥，以去除未挥发干净的醋酸溶液和聚氧化乙烯，释放壳聚糖上带正电的氨基基团。室温干燥器中保存。其它带氨基的高分子材料的电纺纳米纤维膜的制备方法与之相似，只是将壳聚糖换成其它高分子材料。
将干燥的壳聚糖纳米纤维膜裁剪成1×1cm2的小块并浸泡到0.5mL溶瘤病毒溶液中，如单纯疱症病毒(武汉滨会生物科技有限公司赠送)，在4℃下通过静电吸附作用将带负电的溶瘤病毒富集到表面带正电的纳米纤维膜上，2hr后取出吸附溶瘤病毒的纤维膜，-80℃冻存。
用扫描电子显微镜观测负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜形貌。如图2所示，溶瘤病毒颗粒附着在电纺纳米纤维膜上面，电纺膜由直径约为150nm的纳米纤维组成。
实施例2：溶瘤病毒负载量的控制
将面积为1×1cm2，重量为1.5mg的电纺纳米纤维膜浸泡到0.5mL具有不同病毒滴度的溶瘤病毒溶液中，在4℃下静置2hr。检测泡膜前后溶瘤病毒溶液中病毒滴度的变化，其差值即为负载到电纺纳米纤维膜上的病毒负载量。
如图2的曲线所示，当泡膜前溶瘤病毒溶液中病毒的浓度从7×103、1.11×105、2.79×105增加到1.11×106pfu/mL，负载到电纺纳米纤维膜上的溶瘤病毒负载量随之从1.29×103、3.35×104、8.4×104增大到3.35×105pfu/mg，即泡膜前溶瘤病毒溶液中病毒的浓度越大，负载到电纺纳米纤维膜上的溶瘤病毒就越多。
实施例3：负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜的肿瘤治疗效果
1)细胞培养
人肝癌细胞Bel-7402(记作2D-7402)用含10％FBS、1％双抗的DMEM完全培养基，置于5％CO2，37℃恒温培养箱中培养传代。用倒置显微镜观察其生长情况，大约2天传一次代，取处于对数生长期的细胞用于细胞毒性实验。
Bel-7402耐化疗药物5-氟尿嘧啶(5-fu)的耐药细胞株7402-5fu，其培育方式与2D-7402相似，只是其培养液为含20μg/mL 5-fu的DMEM完全培养基。
用3D细胞培养技术培养的Bel-7402细胞具有干细胞的性质，记作3D-7402。
人肝癌细胞HepG2的培育方式与2D-7402相同。
HepG2耐化疗药物阿霉素(DOX)的耐药细胞株HepG2-ADM，其培育方式与HepG2相似，只是其培养液为含200ng/mL DOX的DMEM完全培养基。
2)细胞毒性实验
选择处于对数生长期的上述各种肝癌细胞，接种到24孔培养板内，每种细胞均分为5组。对照组只加培养基；空白膜组，加培养基和电纺纳米纤维膜；载溶瘤病毒膜组，加培养基和负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜；5-fu组，加含20μg/mL 5-fu的培养基；Dox组，加含200ng/mL DOX的培养基。
将不同细胞系的各组细胞置于5％CO2，37℃恒温培养箱中培养96hr后，用SRB法检测其细胞杀伤性。结果如图4所示，空白膜组的细胞存活率与对照组类似接近100％，说明未负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜不具有细胞毒性。从5-fu组和Dox组的细胞存活率来看，耐药细胞7402-fu和HepG2-ADM对于化疗药物5-fu和Dox均不敏感，具有化疗耐药性；用3D技术培养的具有干细胞性质的3D-7402细胞对于5-fu也具有一定的耐药性。但是载溶瘤病毒膜组，不管是对于人肝癌细胞，耐药性肝癌细胞甚至是具有干细胞性质的3D技术培养的细胞均具有很强的杀伤力(细胞存活率低于40％)，说明负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜具有很好的抗肿瘤效果。
实施例4：负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜的细胞杀伤力
将具有不同溶瘤病毒负载量的负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜与Bel-7402细胞共同孵育，如上述方法来检测其细胞杀伤力。MOI为负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜上溶瘤病毒的数量与Bel-7402细胞数目的比值。结果如图5所示，当MOI从0、0.01、0.3、0.8、1.3增加到8.4时，细胞存活率从106％、75.3％、44％、37.5％、29.7％下降到13.5％。说明负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜对于细胞的杀伤力与膜上溶瘤病毒的负载量有关，随负载量的增加而增大。
本发明利用静电纺丝技术将带氨基的可生物降解高分子材料，如壳聚糖等制备成纳米纤维膜，然后通过静电吸附作用将溶瘤病毒包含溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤新城疫病毒等，富集到电纺纳米纤维膜上面，获得负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜。在肿瘤手术中直接植入肿瘤切除部位，原位将溶瘤病毒缓释出来，特异性靶向肿瘤细胞，起到原位局部抗肿瘤作用。提高了局部溶瘤病毒的浓度也突破了溶瘤病毒瘤内注射的技术局限。实验证明，本发明的负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜对于多种肝癌细胞Bel-7402和HepG2，耐药性肝癌细胞7402-5fu和HepG2-ADM，甚至是具有干细胞性质的3D技术培养的3D-7402细胞均具有很强的杀伤力。本发明的植入膜生物相容性好，可被人体完全吸收，不用二次手术取出，还可以物理隔绝肿瘤切除部位与腹膜，起到防粘连作用。本发明所使用的制备方法，静电纺丝技术和负载溶瘤病毒的静电吸附法，可以适用于多种高分子材料和溶瘤病毒，具有普适性。
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种抗肿瘤植入膜，其特征在于：所述抗肿瘤植入膜为负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜。
2.如权利要求1所述的一种抗肿瘤植入膜，其特征在于：所述电纺纳米纤维膜为以带氨基的可生物降解高分子材料为电纺材料，采用静电纺丝技术制备的高分子纳米纤维膜。
3.如权利要求1所述的一种抗肿瘤植入膜，其特征在于：所述溶瘤病毒为溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤新城疫病毒中的一种或者多种的混合。
4.一种抗肿瘤植入膜的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
步骤一、电纺纳米纤维膜的制备，用静电纺丝技术将带氨基的可生物降解高分子材料制备成由纳米纤维组成的电纺膜；
步骤二、负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜的制备，将步骤一所述的电纺纳米纤维膜浸泡到溶瘤病毒溶液中，通过静电吸附作用将溶瘤病毒富集到电纺纤维膜上面，获得负载溶瘤病毒的电纺纳米纤维膜即抗肿瘤植入膜。
5.如权利要求4所述的一种抗肿瘤植入膜的制备方法，其特征在于：所述可生物降解高分子材料优选为壳聚糖。
6.如权利要求4所述的一种抗肿瘤植入膜的制备方法，其特征在于：所述溶瘤病毒为溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤新城疫病毒中的一种或者多种的混合。
7.如权利要求4所述的一种抗肿瘤植入膜的制备方法，其特征在于：所述溶瘤病毒溶液优选的为溶瘤病毒水溶液，所述溶瘤病毒溶液浓度为103～107pfu/mL。
8.如权利要求4所述的一种抗肿瘤植入膜的制备方法，其特征在于：所述抗肿瘤植入膜置于-100℃～-5℃保存。
9.如权利要求4所述的一种抗肿瘤植入膜的制备方法，其特征在于：所述抗肿瘤植入膜置于-80℃条件下冻存。
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