CN106885902B - 以ncam‑1为检测指标的金标试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明将NCAM‑1作为检测指标,应用于金标试剂盒,得可检测狼疮肾炎活跃度的试剂盒,包括底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫,样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次相接覆盖在底板上,且金标垫被样品垫部分覆盖;所述硝酸纤维素膜上设置有由鼠抗人/兔抗人NCAM‑1单克隆抗体、兔抗人/羊抗人NCAM‑1多克隆抗体中的任意一种包被形成的检测线;由羊抗鼠免疫球蛋白G和羊抗兔免疫球蛋白G多克隆抗体中的任意一种包被形成的控制线,金标垫包被有胶体金与鼠抗人/兔抗人NCAM‑1单克隆抗体中的任意一种偶联形成的结合物。该试剂盒检测尿液样本中NCAM‑1浓度,从而判断狼疮肾炎活跃度,实现快速、无创检测。
Description
技术领域
本发明属于医用检测工具,涉及狼疮肾炎活跃度的检测工具,特别涉及一种以NCAM-1为检测指标的金标试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
狼疮肾炎是***性红斑狼疮最常见的并发症之一,且狼疮肾炎所导致的终末期肾病是导致***性红斑狼疮病人死亡的主要因素。而从狼疮肾炎发展为终末期肾病最主要的原因就是因为活跃期的狼疮肾炎没有被及时发现,导致了治疗不及时,肾脏引发不可逆的肾小球硬化以及间质血管纤维化。对于狼疮肾炎活跃度的判断,“金标准”是通过肾脏穿刺活检术对肾脏组织进行病理学检查,根据病理学检查结果进行诊断。而肾脏穿刺活检术为有创性检查,禁忌症较多,无法多次常规进行,因此目前临床上缺乏无创、准确、快捷、安全的检测方法和工具。
NCAM-1(Neural cell adhesion molecule~1,中文名:神经细胞粘附分子~1)是一种非钙依赖性粘附因子,在细胞信号识别及传导、神经再生等方面都具有一定的作用。
发明内容
发明人在长期的研究中发现,NCAM-1在活跃期狼疮肾炎患者尿液中的浓度明显的高于非活跃期狼疮肾炎患者及未合并狼疮肾炎的***性红斑狼疮患者尿液中的浓度,因此,基于这一研究结果,NCAM-1可作为狼疮肾炎患者肾炎活跃度的诊断指标。
本发明的目的在于克服现有技术通过穿刺活检术检测狼疮肾炎活跃度的不足,首次以NCAM-1为检测指标特定的应用到金标试剂盒中,得到金标试剂盒通过检测尿液样本中NCAM-1浓度为检测指标,从而判断狼疮肾炎活跃度,实现快速、无创检测。
为解决上述技术问题,本发明通过以下技术方案实现;
NCAM-1为检测指标在检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒中的应用。本发明首次将NCAM-1作为检测指标,应用于金标试剂盒,制备得到可用于检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒,该金标试剂盒通过检测尿液样本中NCAM-1浓度作为指标,从而判断狼疮肾炎活跃度。
上述的检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒,包括底板7、吸水垫6、硝酸纤维素膜3、金标垫2和样品垫1,所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜3和吸水垫6依次相接覆盖在底板上,且金标垫被样品垫部分覆盖;所述硝酸纤维素膜上设置有由鼠抗人NCAM-1单克隆抗体、兔抗人NCAM-1单克隆抗体,兔抗人NCAM-1多克隆抗体和羊抗人NCAM-1多克隆抗体中的任意一种包被形成的检测线;由羊抗鼠免疫球蛋白G和羊抗兔免疫球蛋白G多克隆抗体中的任意一种包被形成的控制线,所述金标垫包被有胶体金与鼠抗人NCAM-1单克隆抗体和兔抗人NCAM-1单克隆抗体中的任意一种偶联形成的结合物。
使用本发明所述检测工具,当质控线位置可见一条清晰的红色线,证明本发明所述快速检测工具有效;在本发明所述快速检测工具有效的情况下,当检测线位置可见一条清晰的红色线,此结果判定为阳性(即该患者处于狼疮肾炎活跃期);若检测线 位置未出现红色线,则判定为阴性(即该患者处于狼疮肾炎非活跃期)。
所述检测线、控制线的宽度各控制为0.5 mm~0.8 mm,所述检测线与控制线之间的间距控制为5 mm~10 mm。
本发明的检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒的形状为一矩形条。所述样品垫是由具有吸水功能的玻璃纤维、聚酯纤维膜、纤维素滤纸或无纺布制作的垫体。金标垫为吸水材料制作,吸水材料包括玻璃纤维、聚酯纤维膜、无纺布或纤维素滤纸等。所述吸水垫6是由吸水纸制作的垫体。
所述试剂盒的制备包括下述步骤:
(1)检测线、质控线的包被:
以鼠抗人NCAM-1单克隆抗体、兔抗人NCAM-1单克隆抗体,兔抗人NCAM-1多克隆抗体和羊抗人NCAM-1多克隆抗体中的任意一种为溶质,加入缓冲溶液为溶剂,配制成浓度为1~4mg/mL的检测线溶液;以羊抗鼠免疫球蛋白G多克隆抗体或者羊抗兔免疫球蛋白G多克隆抗体为溶质,加入缓冲溶液为溶剂,配制成浓度为0.5~1 mg/mL的质控线溶液;通过划膜机将制备得到的控制线溶液、检测线溶液包被在硝酸纤维素膜上,所述硝酸纤维素膜贴在底板上,将完成包被后的硝酸纤维素膜-底板组合体在37℃干燥12~16小时;
(2)制备金标垫:
①以鼠抗人NCAM-1单克隆抗体或兔抗人NCAM-1单克隆抗体为溶质,加入缓冲液为溶剂,配制浓度为0.5~2mg/mL的鼠抗人NCAM-1单克隆抗体溶液或兔抗人NCAM-1单克隆抗体溶液;
②将步骤①中制备得到的鼠抗人NCAM-1单克隆抗体溶液或兔抗人NCAM-1单克隆抗体溶液与适量胶体金溶液混合,制得鼠抗人NCAM-1单克隆抗体或兔抗人NCAM-1单克隆抗体的浓度为10~20μg/mL的混合液;
③将步骤②制备得到的混合液摇床标记20min~30 min,然后加入浓度为1 mg/mL牛血清白蛋白溶液并继续摇床标记20min~30 min,标记结束后离心,获得的沉淀即为鼠抗人NCAM-1单克隆抗体结合物或兔抗人NCAM-1单克隆抗体结合物;离心时以8000rpm~12,000rpm离心30min~40min;
④将步骤③得到的结合物溶于金标复溶液中,配制成浓度0.2~0.4 mg/mL的金标鼠抗人NCAM-1单克隆抗体或金标兔抗人NCAM-1单克隆抗体结合物溶液,
⑤通过喷金机将金标鼠抗人NCAM-1单克隆抗体或金标兔抗人NCAM-1单克隆抗体结合物溶液喷在制作金标垫的吸水材料上,在37℃干燥12~16小时得金标垫。
本发明中,胶体金溶液按下述方法制备:取氯金酸溶解于三蒸水中,形成氯金酸浓度为0.1~0.2g/100 mL的氯金酸水溶液,并加热至溶液沸腾,在搅拌下将浓度为0.9~1.1g/100mL的柠檬酸三钠水溶液加入到沸腾的氯金酸水溶液中,柠檬酸三钠水溶液与氯金酸水溶液的体积比为1.35~1.5:50,当所述混合液呈现透明的酒红色时停止加热,让其自然冷却至室温后用K2CO3溶液调节pH至6~7,即获得胶体金溶液;
(3)组合
将吸水垫、金标垫和样品垫粘贴步骤(1)得到的硝酸纤维素膜-底板组合体的底板上,即得所述金标试剂盒。
在步骤(1)中,配制检测线溶液时用缓冲液为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液中的任意一种;配制质控线溶液用缓冲液为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液中的任意一种;在步骤①中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液中的任意一种。
在步骤③中,所述牛血清白蛋白溶液的加入量以牛血清白蛋白在混合液中的浓度达到0.1g/100 mL为准。
在步骤④中,所述金标复溶液是将Tris、牛血清白蛋白、叠氮钠溶于三蒸水中而成,所述金标复溶液中,Tris的浓度为0.01~0.02 mol/L,牛血清白蛋白的浓度为0.1~0.5g/100mL,叠氮钠的浓度为0.2g/100mL;
在步骤⑤中,所述金标鼠抗人NCAM-1单克隆抗体或金标兔抗人NCAM-1单克隆抗体结合物的喷量为2~4 μl/cm2。
所述磷酸盐缓冲液的pH=7.2~7.4,浓度为0.01mol/L,所述碳酸盐缓冲液的pH=9.2~10.7,浓度为0.05mol/L,所述硼酸盐缓冲液的pH=8.5~10.0,浓度为0.05mol/L,所述三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液的pH=7.0~9.2,浓度为0.05mol/L。
本发明具有以下有益效果:
1、本发明为狼疮肾炎患者检测肾炎活跃度提供了一种采用新检测指标的新型检测工具。
2、使用本发明所述检测工具对临床确诊狼疮肾炎活跃期和临床确诊狼疮肾炎非活跃期患者进行采样检测,检测结果表明:该检测工具的灵敏度最高可达90%左右,特异度最高也可达90%左右。
3、使用本发明所述检测工具,操作简单,检测一个样品仅需3~6分钟,与临床上现有检测方法(金标准、常规检测方法)相比,检测速度大幅度提高。由于检测样品为患者的尿液样本,因而是一种无创检测。
4、本发明所述检测工具结构简单,易于加工制作,生产成本低,便于工业化生产。
附图说明
1、图1为本发明金标试剂盒结构示意图。
上述附图中的附图标记:1样品垫、2金标垫、3硝酸纤维素膜、4检测线、5控制线、6吸水垫、7底板。
具体实施方式
下面结合具体实施方式详细说明本发明。
下述实施例中:
所述鼠抗人NCAM-1单克隆抗体、兔抗人NCAM-1单克隆抗体,兔抗人NCAM-1多克隆抗体、羊抗人NCAM-1多克隆抗体分别购自美国bio-techne公司、美国Abcam公司;
羊抗鼠免疫球蛋白G和羊抗兔免疫球蛋白G多克隆抗体购自武汉博士德公司。
磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液可自制,也可购买市售符合上述要求的各缓冲液。
磷酸盐缓冲液制备:称取8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾溶于900mL双蒸水中,用盐酸调节溶液pH值至7.2,最后加入双蒸水定容至1L,溶液通过0.45μm滤膜过滤后保存于4℃冰箱中。
硼酸盐缓冲液制备:称取19.07g硼砂溶于900mL双蒸水中,用氢氧化钠调整溶液pH值至9.0,最后加入双蒸水定容至1L,溶液通过0.45μm滤膜过滤后保存于4℃冰箱中。
碳酸盐缓冲液制备:称取0.16g碳酸钠和0.3g碳酸氢钠溶于1L双蒸水中即为pH为9.6碳酸盐缓冲液,溶液通过0.45μm滤膜过滤后保存于4℃冰箱中。
三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液制备:称取6.06g三羟甲基氨基甲烷溶于800mL双蒸水中,用盐酸调整溶液pH值至8.0,最后加入双蒸水定容至1L,溶液通过0.45μm滤膜过滤后保存于4℃冰箱中。
牛血清白蛋白、叠氮钠购自索莱宝公司。
实施例1
以NCAM-1作为检测指标的金标试剂盒在检测狼疮肾炎活跃度中的应用,所述的金标试剂盒通过检测尿液样本中NCAM-1浓度作为指标。
上述的以NCAM-1作为检测指标的检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒,包括底板7、吸水垫6、硝酸纤维素膜3、金标垫和样品垫1,所述样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫6依次相接覆盖在底板7上,且金标2垫被样品1垫部分覆盖;所述硝酸纤维素膜3上设置有由羊抗人NCAM-1多克隆抗体中包被形成的检测线4;由羊抗鼠免疫球蛋白G多克隆抗体包被形成的控制线5,所述金标垫2包被有胶体金与鼠抗人NCAM-1单克隆抗体偶联形成的结合物。
本实施例中,所述检测线4、控制线5的宽度各控制为0.5mm,所述检测线4与控制线5之间的间距控制为10mm。
本实施例中,所述的检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒的形状为一矩形条。所述样品垫1是由具有吸水功能的玻璃纤维制作的垫体。金标垫2为吸水材料制作,吸水材料为玻璃纤维。所述吸水垫6是由吸水纸制作的垫体。
为了更好的实施本发明,本实施例进一步提供了以NCAM-1作为检测指标的金标试剂盒的制备方法,所述试剂盒的制备包括下述步骤:
(1)检测线、质控线的包被:
羊抗人NCAM-1多克隆抗体为溶质,加入磷酸盐缓冲溶液为溶剂,配制成浓度为1mg/mL的检测线溶液;以羊抗鼠免疫球蛋白G多克隆抗体为溶质,加入磷酸盐缓冲溶液为溶剂,配制成浓度为0.5mg/mL的质控线溶液;通过划膜机将制备得到的控制线溶液、检测线溶液包被在硝酸纤维素膜上,所述硝酸纤维素膜贴在底板上,将完成包被后的硝酸纤维素膜-底板组合体在37℃干燥12小时;
(2)制备金标垫:
①以鼠抗人NCAM-1单克隆抗体为溶质,加入磷酸盐缓冲液为溶剂,配制浓度为1mg/mL的鼠抗人NCAM-1单克隆抗体溶液;
②将步骤①中制备得到的鼠抗人NCAM-1单克隆抗体溶液与适量胶体金溶液混合,制得鼠抗人NCAM-1单克隆抗体的浓度为10μg/mL的混合液;
③将步骤②制备得到的混合液摇床标记20min,然后加入浓度为1 mg/mL牛血清白蛋白溶液并继续摇床标记20min,标记结束后离心,获得的沉淀即为鼠抗人NCAM-1单克隆抗体结合物;离心时以9000rpm离心30~40 min;
④将步骤③得到的结合物溶于金标复溶液中,配制成浓度0.3mg/mL的金标鼠抗人NCAM-1单克隆抗体结合物溶液;
⑤通过喷金机将金标鼠抗人NCAM-1单克隆抗体结合物溶液喷在制作金标垫的吸水材料上,在37℃干燥12小时得金标垫。
本实施例中,胶体金溶液按下述方法制备:取氯金酸溶解于三蒸水中,形成氯金酸浓度为0.1~0.2g/100 mL的氯金酸水溶液,并加热至溶液沸腾,在搅拌下将浓度为0.9~1.1g/100mL的柠檬酸三钠水溶液加入到沸腾的氯金酸水溶液中,柠檬酸三钠水溶液与氯金酸水溶液的体积比为1.35~1.5:50,当所述混合液呈现透明的酒红色时停止加热,让其自然冷却至室温后用K2CO3溶液调节pH至6~7,即获得胶体金溶液;
(3)组合
将吸水垫、金标垫和样品垫粘贴步骤(1)得到的硝酸纤维素膜-底板组合体的底板上,即得所述金标试剂盒。
实施例2
以NCAM-1作为检测指标的金标试剂盒,包括底板7、吸水垫6、硝酸纤维素膜3、金标垫2和样品垫1,所述样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫6依次相接覆盖在底板7上,且金标垫2被样品垫1部分覆盖;所述硝酸纤维素膜3上设置有由兔抗人NCAM-1单克隆抗体中包被形成的检测线4;由羊抗鼠免疫球蛋白G)包被形成的控制线5,所述金标垫2包被有胶体金与鼠抗人NCAM-1单克隆抗体偶联形成的结合物。
本实施例中,所述检测线4、控制线5的宽度各控制为0.5mm,所述检测线4与控制线5之间的间距控制为10mm。
本实施例中,所述的检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒的形状为一矩形条。所述样品垫1是由具有吸水功能的玻璃纤维制作的垫体。金标垫2为吸水材料制作,吸水材料为玻璃纤维。所述吸水垫6是由吸水纸制作的垫体。
为了更好的实施本发明,本实施例进一步提供了以NCAM-1作为检测指标的金标试剂盒的制备方法,本实施例的制备方法包括下述步骤:
(1)检测线、质控线的包被:
以兔抗人NCAM-1单克隆抗体为溶质,加入缓冲溶液为溶剂,配制成浓度为1mg/mL的检测线溶液;以羊抗鼠免疫球蛋白G多克隆抗体为溶质,加入缓冲溶液为溶剂,配制成浓度为0.5mg/mL的质控线溶液;通过划膜机将制备得到的控制线溶液、检测线溶液包被在硝酸纤维素膜上,所述硝酸纤维素膜贴在底板上,将完成包被后的硝酸纤维素膜-底板组合体在37℃干燥14小时;
(2)制备金标垫:
①以鼠抗人NCAM-1单克隆抗体为溶质,加入缓冲液为溶剂,配制浓度为1 mg/mL的鼠抗人NCAM-1单克隆抗体溶液;
②将步骤①中制备得到的鼠抗人NCAM-1单克隆抗体溶液与适量胶体金溶液混合,制得鼠抗人NCAM-1单克隆抗体的浓度为10μg/mL的混合液;
③将步骤②制备得到的混合液摇床标记30 min,然后加入浓度为1mg/mL牛血清白蛋白溶液并继续摇床标记30 min,标记结束后离心,获得的沉淀即为鼠抗人NCAM-1单克隆抗体结合物;离心时以12,000 rpm离心30 min;
④将步骤③得到的结合物溶于金标复溶液中,配制成浓度0.2mg/mL的金标鼠抗人NCAM-1单克隆抗体或结合物溶液,
⑤通过喷金机将金标鼠抗人NCAM-1单克隆抗体体结合物溶液喷在制作金标垫的吸水材料上,在37℃干燥16小时得金标垫。
(3)组合
将吸水垫、金标垫和样品垫粘贴步骤(1)得到的硝酸纤维素膜-底板组合体的底板上,即得所述金标试剂盒。
本实施例中,在步骤(1)中,配制检测线溶液时用缓冲液为磷酸盐缓冲液、;配制质控线溶液用缓冲液为磷酸盐缓冲液;在步骤①中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
本实施例中,步骤③中所述牛血清白蛋白溶液的加入量以牛血清白蛋白在混合液中的浓度达到0.1g/100 mL为准。
步骤②中所述胶体金溶液按实施例1方法制备。
步骤④中所述金标复溶液与实施例1中相同。
步骤⑤中所述金标鼠抗人NCAM-1单克隆抗体的喷量为4μL/cm2。
实施例3
以NCAM-1作为检测指标的金标试剂盒,包括底板7、吸水垫6、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫,所述样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫6依次相接覆盖在底板7上,且金标垫2被样品垫1部分覆盖;所述硝酸纤维素膜3上设置有由兔抗人NCAM-1多克隆抗体包被形成的检测线4;由羊抗鼠免疫球蛋白G包被形成的控制线5,所述金标垫2包被有胶体金与鼠抗人NCAM-1单克隆抗体偶联形成的结合物。
本实施例中,所述检测线4、控制线5的宽度各控制为0.5mm,所述检测线4与控制线5之间的间距控制为10mm。
本实施例中,所述的检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒的形状为一矩形条。所述样品垫1是由具有吸水功能的纤维素滤纸制作的垫体。金标垫2为吸水材料制作,吸水材料为纤维素滤纸。所述吸水垫6是由吸水纸制作的垫体。
为了更好的实施本发明,本实施例进一步提供了以NCAM-1作为检测指标的金标试剂盒的制备方法,本实施例的制备方法包括下述步骤:
(1)检测线、质控线的包被:
以兔抗人NCAM-1多克隆抗体为溶质,加入缓冲溶液为溶剂,配制成浓度为1mg/mL的检测线溶液;以羊抗鼠免疫球蛋白G多克隆抗体为溶质,加入缓冲溶液为溶剂,配制成浓度为0.5mg/mL的质控线溶液;通过划膜机将制备得到的控制线溶液、检测线溶液包被在硝酸纤维素膜上,所述硝酸纤维素膜贴在底板上,将完成包被后的硝酸纤维素膜-底板组合体在37℃干燥13小时;
(2)制备金标垫:
①以鼠抗人NCAM-1单克隆抗体为溶质,加入缓冲液为溶剂,配制浓度为1 mg/mL的鼠抗人NCAM-1单克隆抗体溶液;所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
②将步骤①中制备得到的鼠抗人NCAM-1单克隆抗体溶液与适量胶体金溶液混合,制得鼠抗人NCAM-1单克隆抗体的浓度为10μg/mL的混合液;
③将步骤②制备得到的混合液摇床标记30min,然后加入浓度为1 mg/mL牛血清白蛋白溶液并继续摇床标记30min,标记结束后离心,获得的沉淀即为鼠抗人NCAM-1单克隆抗体结合物;离心时以10,000rpm离心40min;
④将步骤③得到的结合物溶于金标复溶液中,配制成浓度0.4mg/mL的金标鼠抗人NCAM-1单克隆抗体结合物溶液;
⑤通过喷金机将金标鼠抗人NCAM-1单克隆抗体结合物溶液喷在制作金标垫的吸水材料上,在37℃干燥12h得金标垫。
(3)组合
将吸水垫、金标垫和样品垫粘贴步骤(1)得到的硝酸纤维素膜-底板组合体的底板上,即得所述金标试剂盒。
本实施例中,在步骤(1)中,配制检测线溶液时用缓冲液为磷酸盐缓冲液、;配制质控线溶液用缓冲液为磷酸盐缓冲液。
本实施例中,步骤③中所述牛血清白蛋白溶液的加入量以牛血清白蛋白在混合液中的浓度达到0.1g/100 mL为准。
步骤②中所述胶体金溶液按实施例1方法制备。
步骤④中所述金标复溶液与实施例1中相同。
步骤⑤中所述金标鼠抗人NCAM-1单克隆抗体结合物的喷量为4μL/cm2。
实施例4
以NCAM-1作为检测指标的金标试剂盒,包括底板7、吸水垫6、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫,所述样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫6依次相接覆盖在底板7上,且金标垫2被样品垫1部分覆盖;所述硝酸纤维素膜3上设置有由羊抗人NCAM-1多克隆抗体包被形成的检测线4;由羊抗兔免疫球蛋白G多克隆抗体包被形成的控制线5,所述金标垫2包被有胶体金与兔抗人NCAM-1单克隆抗体偶联形成的结合物。
本实施例中,所述检测线4、控制线5的宽度各控制为0.5mm,所述检测线4与控制线5之间的间距控制为10mm。
本实施例中,所述的检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒的形状为一矩形条。所述样品垫1是由具有吸水功能的无纺布制作的垫体。金标垫2为吸水材料制作,吸水材料为无纺布。所述吸水垫6是由吸水纸制作的垫体。
为了更好的实施本发明,本实施例进一步提供了本实施例以NCAM-1作为检测指标的金标试剂盒的制备方法,本实施例的制备方法包括下述步骤:
(1)检测线、质控线的包被:
以羊抗人NCAM-1多克隆抗体为溶质,加入缓冲溶液为溶剂,配制成浓度为1mg/mL的检测线溶液;以羊抗兔免疫球蛋白G多克隆抗体为溶质,加入缓冲溶液为溶剂,配制成浓度为1mg/mL的质控线溶液;通过划膜机将制备得到的控制线溶液、检测线溶液包被在硝酸纤维素膜上,所述硝酸纤维素膜贴在底板上,将完成包被后的硝酸纤维素膜-底板组合体在37℃干燥14小时;
(2)制备金标垫:
①以兔抗人NCAM-1单克隆抗体为溶质,加入缓冲液为溶剂,配制浓度为2 mg/mL的兔抗人NCAM-1单克隆抗体溶液;
②将步骤①中制备得到的兔抗人NCAM-1单克隆抗体溶液与适量胶体金溶液混合,制得兔抗人NCAM-1单克隆抗体的浓度为20μg/mL的混合液;
③将步骤②制备得到的混合液摇床标记30min,然后加入浓度1 mg/mL牛血清白蛋白溶液并继续摇床标记30min,标记结束后离心,获得的沉淀即为兔抗人NCAM-1单克隆抗体结合物;离心时以8000rpm离心30min;
④将步骤③得到的结合物溶于金标复溶液中,配制成浓度0.4 mg/mL的金标兔抗人NCAM-1单克隆抗体结合物溶液,
⑤通过喷金机将金标兔抗人NCAM-1单克隆抗体结合物溶液喷在制作金标垫的吸水材料上,在37℃干燥14小时得金标垫。
(3)组合
将吸水垫、金标垫和样品垫粘贴步骤(1)得到的硝酸纤维素膜-底板组合体的底板上,即得所述金标试剂盒。
本实施例中,在步骤(1)中,配制检测线溶液时用缓冲液为磷酸盐缓冲液、;配制质控线溶液用缓冲液为磷酸盐缓冲液;在步骤①中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
本实施例中,步骤③中所述牛血清白蛋白溶液的加入量以牛血清白蛋白在混合液中的浓度达到0.1g/100 mL为准。
步骤②中所述胶体金溶液按实施例1方法制备。
步骤④中所述金标复溶液与实施例1中相同。
步骤⑤中所述金标兔抗人NCAM-1单克隆抗体结合物的喷量为4μL/cm2。
上述实施例1-4中,所述磷酸盐缓冲液的pH=7.2~7.4,浓度为0.01mol/L。
将上述实施例1-4试剂盒用于检测临床已确诊的活跃性狼疮肾炎及非活跃性狼疮肾炎患者的尿液样本,并将检测结果灵敏度和特异度统计在下表1中;
表1
由上表1数据可知,本发明试剂盒用于狼疮肾炎检测,其灵敏度或特异度最高可达90%,与现有的金标准-肾脏活检相比,为无创性检查,可多次常规进行检测,相比现有的常规检测(尿液检查显示尿蛋白>0.5g/天或者尿蛋白>=3+,或有细胞管型),本发明试剂盒检测更快捷,安全。
Claims (9)
1.NCAM-1作为检测指标在制备检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒中的应用,所述的金标试剂盒通过检测尿液样本中NCAM-1作为检测指标,所述NCAM-1在活跃期狼疮肾炎患者尿液中的浓度明显的高于非活跃期狼疮肾炎患者及未合并狼疮肾炎的***性红斑狼疮患者尿液中的浓度。
2.根据权利要求1所述的NCAM-1作为检测指标在制备检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒中的应用,其特征在于:所述金标试剂盒包括底板(7)、吸水垫(6)、硝酸纤维素膜(3)、金标垫(2)和样品垫(1),所述样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(6)依次相接覆盖在底板(7)上,且金标垫(2)被样品垫(1)部分覆盖;所述硝酸纤维素膜(3)上设置有由鼠抗人NCAM-1单克隆抗体、兔抗人NCAM-1单克隆抗体,兔抗人NCAM-1多克隆抗体和羊抗人NCAM-1多克隆抗体中的任意一种包被形成的检测线(4);由羊抗鼠免疫球蛋白G和羊抗兔免疫球蛋白G多克隆抗体中的任意一种包被形成的控制线(5),所述金标垫(2)包被有胶体金与鼠抗人NCAM-1单克隆抗体和兔抗人NCAM-1单克隆抗体中的任意一种偶联形成的结合物。
3.根据权利要求2所述的NCAM-1作为检测指标在制备检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒中的应用,其特征在于:所述检测线(4)、控制线(5)的宽度各控制为0.5 mm~0.8 mm,所述检测线(4)与控制线(5)之间的间距控制为5 mm~10 mm。
4.根据权利要求2所述的NCAM-1作为检测指标在制备检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒中的应用,其特征在于:所述试剂盒的制备包括下述步骤:
(1)检测线、控制线的包被:
以鼠抗人NCAM-1单克隆抗体、兔抗人NCAM-1单克隆抗体、兔抗人NCAM-1多克隆抗体和羊抗人NCAM-1多克隆抗体中的任意一种为溶质,加入缓冲溶液为溶剂,配制成浓度为1~4mg/mL的检测线溶液;以羊抗鼠免疫球蛋白G多克隆抗体或者羊抗兔免疫球蛋白G多克隆抗体为溶质,加入缓冲溶液为溶剂,配制成浓度为0.5~1 mg/mL的控制线溶液;通过划膜机将制备得到的控制线溶液、检测线溶液包被在硝酸纤维素膜上,所述硝酸纤维素膜贴在底板上,将完成包被后的硝酸纤维素膜-底板组合体在37℃干燥12~16h;
(2)制备金标垫:
①以鼠抗人NCAM-1单克隆抗体或兔抗人NCAM-1单克隆抗体为溶质,加入缓冲液为溶剂,配制浓度为0.5~2 mg/mL的鼠抗人NCAM-1单克隆抗体溶液或兔抗人NCAM-1单克隆抗体溶液;
②将步骤①中制备得到的鼠抗人NCAM-1单克隆抗体溶液或兔抗人NCAM-1单克隆抗体溶液与适量胶体金溶液混合,制得鼠抗人NCAM-1单克隆抗体或兔抗人NCAM-1单克隆抗体的浓度为10~20μg/mL的混合液;
③将步骤②制备得到的混合液摇床标记20 min~30 min,然后加入浓度为1 mg/mL牛血清白蛋白溶液并继续摇床标记20 min~30 min,标记结束后离心,获得的沉淀即为鼠抗人NCAM-1单克隆抗体结合物或兔抗人NCAM-1单克隆抗体结合物;
④将步骤③得到的结合物溶于金标复溶液中,配制成浓度0.2~0.4 mg/mL的金标鼠抗人NCAM-1单克隆抗体或金标兔抗人NCAM-1单克隆抗体结合物溶液,
⑤通过喷金机将金标鼠抗人NCAM-1单克隆抗体或金标兔抗人NCAM-1单克隆抗体结合物溶液喷在制作金标垫的吸水材料上,在37℃干燥12~16h得金标垫;
(3)组合:
将吸水垫、金标垫和样品垫粘贴步骤(1)得到的硝酸纤维素膜-底板组合体的底板上,即得所述金标试剂盒。
5.根据权利要求4所述的NCAM-1作为检测指标在制备检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒中的应用,其特征在于:在步骤(1)中,配制检测线溶液时用缓冲液为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液中的任意一种;配制控制线溶液用缓冲液为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液中的任意一种;在步骤①中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液中的任意一种。
6.根据权利要求4所述的NCAM-1作为检测指标在制备检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒中的应用,其特征在于:在步骤③中,所述牛血清白蛋白溶液的加入量以牛血清白蛋白在混合液中的浓度达到0.1 g/100 mL为准。
7.根据权利要求4所述的NCAM-1作为检测指标在制备检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒中的应用,其特征在于:在步骤④中,所述金标复溶液是将Tris、牛血清白蛋白、叠氮钠溶于三蒸水中而成,Tris的浓度为0.01mol/L~0.02 mol/L,牛血清白蛋白的浓度为0.1 g/100mL~0.5 g/100mL,叠氮钠的浓度为0.2 g/100mL。
8.根据权利要求4所述的NCAM-1作为检测指标在制备检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒中的应用,其特征在于:在步骤⑤中,所述金标鼠抗人NCAM-1单克隆抗体或金标兔抗人NCAM-1单克隆抗体结合物的喷量为2~4μl/cm2。
9.根据权利要求5所述的NCAM-1作为检测指标在制备检测狼疮肾炎活跃度的金标试剂盒中的应用,其特征在于:所述磷酸盐缓冲液的pH=7.2~7.4,浓度为0.01mol/L,所述碳酸盐缓冲液的pH=9.2~10.7,浓度为0.05mol/L,所述硼酸盐缓冲液的pH=8.5~10.0,浓度为0.05mol/L,所述三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液的pH=7.0~9.2,浓度为0.05mol/L。
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