CN106884056A

CN106884056A - 检测寨卡病毒的引物、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN106884056A
Application number: CN201710069427.0A
Authority: CN
Inventors: 郭旭光; 周永焯; 夏勇
Original assignee: Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Current assignee: Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2017-02-08
Filing date: 2017-02-08
Publication date: 2017-06-23

Abstract

本发明公开了检测寨卡病毒的引物、试剂盒以及方法，所述引物包括有序列组成为SEQ ID.NO.1‑SEQ ID.NO.2的内引物，序列组成为SEQ ID.NO.3‑SEQ ID.NO.4的外引物，还具有序列组成为SEQ ID.NO.5‑SEQ ID.NO.6的环引物。本发明所述试剂盒具有检测寨卡病毒灵敏度高，特异性强，且检测快速的优点。

Description

检测寨卡病毒的引物、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于生物技术，具体是涉及一种检测寨卡病毒的引物、试剂盒和方法。

背景技术

寨卡(Zika)病毒主要通过埃及伊蚊叮咬传播，患者、隐性感染者和感染寨卡病毒的非人灵长类动物是该病的传染源。寨卡病毒疫情通过蚊虫叮咬传播，感染后症状与登革热相似，包括发烧、疹子、关节疼痛、肌肉疼痛、头痛和结膜炎(红眼)。寨卡病毒感染者中，只有约20％会表现轻微症状，如发烧、皮疹、关节疼痛和结膜炎等，症状通常不到一周即可消失。然而，如果孕妇感染，胎儿可能会受到影响，导致新生儿小头症甚至死亡。有研究发现寨卡病毒也可以通过母婴途径传播，包括胎儿宫内感染或者在分娩过程中受到感染，有报道发现在乳汁中可以检测到寨卡病毒的核酸。目前，全球超过150万人感染寨卡病毒，中国感染人数较少，但感染人数不断增加，寨卡病毒感染已成为威胁人类健康的一个严重的全球性公共卫生问题。寨卡病毒感染一年四季均可发病，也可存在某个地区或者季节蚊虫孳生繁殖快而导致爆发感染的可能。我们需要予以重视，并且要研发一种快速、准确的方法用作其检测方法。

寨卡病毒的核酸是由三个结构基因和五个非结构基因组成，具有10,794个核苷酸的ss(+)RNA基因组。寨卡病毒有原型MR766和ZIKA EC 2007两个全基因组序列在GenBank中公开，它们的序列具有89％的同源性，具有97％的氨基酸相似性。

环介导恒温扩增技术(Real-time loop mediated isothermal amplification，Real-time LAMP)是21世纪初期研发的一种新技术，是一项适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，针对靶序列上6或8个特异区域设计4或6条特异引物，在链置换Bst DNA聚合酶下快速扩增目的片段，扩增时间只需60min。目前，环介导等温扩增技术已广泛应用于国内外各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中。

实时荧光LAMP技术是LAMP技术的优化，该技术可直接用临床血液样本提取核酸，然后便可进行扩增，与传统的检测技术相比，该技术的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作简单、快速，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，通过检测荧光信号强弱可判断检测结果，适用于对疾病的快速诊断。将其用于寨卡病毒的快速诊断，可大大地缩短检验报告时间，更加快速地提供诊断寨卡病毒感染的依据，而后及时给予患者适当的治疗，以免耽误病程。

Rea-LAMP作为一种扩增基因的检测技术，也有其缺陷，例如气溶胶的污染是不可避免的，这也是导致Rea-LAMP出现假阳性的主要原因；Rea-LAMP比PCR通用性差，Rea-LAMP主要用作诊断或检测技术，不用于克隆目的；Rea-LAMP反应体系加入中引物数量较多，增加了引物与引物之间的相互作用，例如形成二聚体机会增加；Rea-LAMP检测技术不如PCR成熟。

到目前为止，尚未有研究对Real-time LAMP检测寨卡病毒进行***的评价与分析。为检测寨卡病毒提供新的检测技术，我们试行运用Real-time LAMP技术检测寨卡病毒，寻找高特异性的检测寨卡(Zika)病毒的Real-time LAMP试剂盒。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种检测寨卡(Zika)病毒的试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高、特异性强的优点。

实现上述目的的技术方案如下。

一种检测寨卡病毒的试剂盒，包括有序列组成为SEQID.NO.1-SEQID.NO.2的内引物，序列组成为SEQID.NO.3-SEQID.NO.4的外引物。

在其中一个实施例中，还包括有序列组成为SEQID.NO.5-SEQID.NO.6的环引物。

在其中一个实施例中，在检测体系中，所述内引物的浓度为40±0.5μM、所述环引物的浓度为20±0.5μM、所述外引物的浓度为5±0.5μM。

本发明的另一个目的是提供一种检测寨卡病毒的引物。

实现上述目的的技术方案如下。

一种检测寨卡病毒的引物，包括有序列组成为SEQID.NO.1-2的内引物，序列组成为SEQID.NO.3-4的外引物。

在其中一个实施例中，还包括有序列组成为SEQID.NO.5-6的环引物。

本发明的另一个目的是提供一种检测寨卡病毒的方法。

实现上述目的的技术方案如下。

一种检测寨卡病毒的方法，采用上述检测试剂盒，包括以下步骤：

(1)提取待检测样品的基因组；

(2)配置引物和反应体系，进行环介导恒温扩增；

(3)检测扩增产物。

在其中一个实施例中，在反应体系中，所述内引物的浓度为40±0.5μM、所述环引物的浓度为20±0.5μM、所述外引物的浓度为5±0.5μM。

本发明具有以下有益效果：

本发明经过发明人精心筛选到的一套针对检测寨卡病毒RNA的引物，选取8株常见病原菌做阴性对照，结果显示均为阴性，只有寨卡病毒出现典型的阳性结果，显示特异性强；且检测寨卡病毒RNA的灵敏度较高，可达3.3ng/μl。进一步地，本发明所筛选到的引物，因为还具有特异性的环引物，除有特异性强，灵敏度高的优点之外，还具有检测时间短，阳性结果可在35min内检测完成的优点。本发明所述的检测试剂盒可用于寨卡病毒感染的早期诊断。

附图说明

图1 NS5-1加环引物的引物筛选试验(上)及其溶解曲线(下)；

图2 NS5-2加环引物的引物筛选试验(上)及其溶解曲线(下)；

图3 NS5-3加环引物的引物筛选试验(上)及其溶解曲线(下)；

图4 NS5-4加环引物的引物筛选试验(上)及其溶解曲线(下)；

图5 NS5-1不加环引物的引物筛选试验(上)及其溶解曲线(下)；

图6 NS5-2不加环引物的引物筛选试验(上)及其溶解曲线(下)；

图7 NS5-3不加环引物的引物筛选试验(上)及其溶解曲线(下)；

图8 NS5-4不加环引物的引物筛选试验(上)及其溶解曲线(下)；

图9 Rea-LAMP检测NS5基因的特异性结果示意图；

图10 Rea-LAMP检测NS5的灵敏度试验结果示意图；

图11 Rea-LAMP检测NS5的重复性试验结果示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

1.1材料

1.1.1病毒核酸或菌株来源病毒核酸购自北京市普瑞麦迪实验室有限公司。另选取常见的病原菌作为对照菌，包括铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌、阴沟肠杆菌、肺炎链球菌，均为广州医科大学附属第三医院检验科微生物室分离菌株，于-20℃保存。

1.1.2 DNA提取试剂及仪器设备细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，试剂包括：缓冲液GA(Buffer GA)、缓冲液GB(Buffer GB)、缓冲液GD(Buffer GD)、漂洗液PW(Buffer PW)、洗脱缓冲液TE(Buffer TE)、Proteinase K、吸附柱CB3(spinColumns CB3)、收集管(Collection Tubes 2ml)；-20℃、-80℃冰箱，DAYA-204，ThermoFisher Scientific；高速离心机，PICO17，Thermo Fisher Scientific；ESE-Quant TubeSanner，广州迪澳生物科技有限公司；加样枪10ul、200μl、1000μl，德国Eppendorf公司；数显恒温水浴锅，HH-1，常州澳华仪器有限公司；漩涡混合器，MS2，德国IKA公司；超净工作台，SW-CJ-1FD，苏州安泰空气技术有限公司；荧光分光光度计，F96PRO。

1.1.3细菌基因组DNA提取及浓度、纯度的测定将-20℃保存的菌株接种于血平板，在37℃温箱培养18-24h，取平板上的细菌混于生理盐水，配制成,3-4麦氏单位的细菌，取1ml菌悬液，其余具体按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作。

1.1.4引物的设计与合成引物包括正向外引物F3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、反向外引物B3、正向环引物LoopF、反向环引物LoopB，由天根生化科技(北京)有限公司合成，分别是NS5-1、NS5-2、NS5-3和NS5-4，见表1，2，3，4。

表1 zika virus Real-LAMP检测体系引物NS5-1

表2 zika virus Real-LAMP检测体系引物NS5-2

表3 zika virus Real-LAMP检测体系引物NS5-3

表4 zika virus Real-LAMP检测体系引物NS5-4

1.1.5引物配制将装有引物干粉的离心管放进离心机，12000rpm离心1min；根据引物干粉的摩尔总量加超纯水溶解干粉，室温下放置5min，振荡混匀；将已溶解的引物放进离心机，12000rpm离心1min；引物工作液配制：配制70μl引物工作液，所配引物工作液各组分浓度为：40μM内引物、20μM环引物、5μM外引物具体如表5。

表5引物工作液配制

1.1.6 Real-LAMP反应体系配制按照Real-RT-LAMP扩增试剂盒的说明书配制LAMP反应体系，注意在冰盒上操作，具体如表6，配制完体系后加入一滴密封液(石蜡油)，混匀离心，盖紧管盖。荧光通道选择SYBR。

表6反应体系配制

1.2方法

1.2.1引物筛选和引物二聚体排查先筛选出四套引物，分别是NS5-1、NS5-2、NS5-3和NS5-4，并且分别用上述工作液，以zika virus的RNA为模板，设置反应程序为63℃15s，63℃45s作为一个循环，做60个循环，95℃15s终止反应，于63℃45s处收集荧光信号，同时对各反应管做溶解曲线检测，比较四套引物的扩增效率，最终筛选出扩增效率最高并且不存在二聚体影响的一套引物(NS5-1,SEQ ID NO.1-6)，以下灵敏度和特异性以及重复性试验中所用的引物为NS5-1(SEQ ID NO.1-6)。

1.2.2环引物增强反应速率的验证以筛选出来的引物配制工作液，分别配制加环引物工作液和不加环引物工作液，将两份工作液分别加入LAMP反应体系，对zaka virus基因NS5进行扩增，观察扩增曲线，比较加与不加环引物对扩增的影响。

1.2.3引物灵敏度测定zika virus的RNA浓度，先用1μl TE buffer对ThermoScientific Nanodrop 2000微量分光光度计调0，再加1μl zaka virus的RNA提取液，测量RNA模板浓度。取10μl RNA原液用超纯水进行10倍梯度稀释4次，得到5个不同浓度的RNA模板，加入Real-LAMP体系中反应，观察扩增曲线，检测引物对zika virus的检测灵敏度。

1.2.4引物特异性提取zika virus及其他阴性病原菌的基因组DNA，按照Real-LAMP的反应条件进行扩增，分析检测的信号，评价该引物的特异性。

1.2.5重复性试验用Real-LAMP对1份阳性菌株及3份阴性菌株各进行3次重复试验，所有菌株重复性试验所用引物一样，以评价其重复性试验的可靠性。

2.结果

2.1引物筛选试验在开始反应后约15min，引物NS5-3的体系出峰，在反应约21min引物NS5-1的体系出峰，Bio-Rad CFX Manager检测到NS5基因的扩增信号，NS5-2和NS5-4两套引物无出峰，虽然引物NS5-3对zika virus NS5基因有相对高的扩增效率，但是结合溶解曲线，可见阴性对照曲线的荧光强度有明显下降，可能存在二聚体的影响；四套引物不加环引物扩增的结果显示，在开始反应后约39min，引物NS5-3的体系出峰，在反应约31min引物NS5-1的体系出峰，扩增效率均比加环引物的低。同样，NS5-2和NS5-4两套引物均无出峰。故选择引物NS5-1做后续试验，见图1，2，3，4，5，6，7，8。

2.2特异性试验本试验选取的临床常见病原菌作为阴性对照，均未出现扩增，而zika virus RNA可扩增出来，出现典型的“S”曲线，说明该引物对zika virus RNA检测的特异性比较好，所设计的Rea-LAMP引物NS5-1具有良好的特异性，与非目标菌不存在交叉反应，见图9。

2.3灵敏度试验经微量分光光度计测量，本实验的寨卡病毒核酸浓度为33ng/μl，经4次梯度稀释，得到的浓度是：3.3ng/μl、0.33ng/μl、33pg/μl、3.3pg/μl。分析本试验的检测灵敏度可达到3.3ng/μl，试验结果可靠，见图10。

2.4重复性实验取zika virus NS5做3个重复试验，其中2个约23min出峰，另外一个约20min出峰，三次出峰时间相差约3min，说明Rea-LAMP用于检测zika virus的重复性一般，见图11。

本发明选取NS5基因作为寨卡病毒检测是靶基因，8株临床常见病原菌作为阴性对照，理论上应该选取黄热病毒属的病毒作为阴性对照进行扩增，但由于其在临床上罕见，不易获得，故选取常见病原菌代替。将NS5基因和阴性对照同时进行LAMP扩增，仅有NS5基因出现阳性扩增，表现为典型的“S”型曲线，其余8株阴性对照菌均未出现阳性扩增，说明所选取的引物对具有较强的特异性，不与非目标基因发生扩增反应。此外，反应体系中加与不加环引物的扩增效率比较，结果显示加环引物可明显缩短反应时间，加环引物的反应在约22min出峰，不加环引物出峰时间相对慢约10min，整个反应过程在35min内可完成相比PCR，检测时间可明显缩短，这有利于临床对寨卡病毒感染的快速诊断，及时发现寨卡病毒感染，及时给予治疗，避免耽误病程。

所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州医科大学附属第三医院

<120> 检测寨卡病毒的引物、试剂盒和方法

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctatgactg acaccacac 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

accttggatc attcacagc 19

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccagctcctt ccacagccca agaaggtact cgccag 36

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taagcggcca cgtgtctgaa tattgctccc agtgctg 37

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aggaagcgac catgttcatt 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaagagttca tcaacaaggt gc 22

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catcttccct cgtgaatgg 19

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

accttgttga tgaactcttc tt 22

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cggtgtggtg tcagtcatag cggttgttag actcctgtca aa 42

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gacaccaggg tgccagacgg aagcgaccat gttcat 36

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cctgtaactc cagtcaccac 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agaaggtact cgccaggt 18

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gccaacaaag agtcttcaaa g 21

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acaactatgg cactctcct 19

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agacacgtgg ccgcttacgc caggtaatga acatggt 37

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gcagcactgg gagcaatatt tgaccttgga tcattcacag c 41

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccttccacag ccaggaag 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aatggaagac ggctgtgg 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tcttccctcg tgaatggg 18

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

accttgttga tgaactcttc tt 22

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cggtgtggtg tcagtcatag cttgttagac tcctgtcaaa gc 42

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gacaccaggg tgccagacgg aagcgaccat gttcat 36

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cctgtaactc cagtcaccac 20

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

agaaggtact cgccaggt 18

Claims

1.一种检测寨卡病毒的试剂盒，其特征在于，包括有序列组成为SEQID.NO.1-SEQID.NO.2的内引物，序列组成为SEQID.NO.3-SEQID.NO.4的外引物。

2.根据权利要求1所述的检测寨卡病毒的试剂盒，其特征在于，还包括有序列组成为SEQID.NO.5-SEQID.NO.6的环引物。

3.根据权利要求1或2所述的检测寨卡病毒的试剂盒，其特征在于，在检测时，所述内引物的浓度为40±0.5μM、所述环引物的浓度为20±0.5μM、所述外引物的浓度为5±0.5μM。

4.一种检测寨卡病毒的引物，其特征在于，包括有序列组成为SEQID.NO.1-SEQID.NO.2的内引物，序列组成为SEQID.NO.3-SEQID.NO.4的外引物。

5.根据权利要求4所述的检测寨卡病毒的引物，其特征在于，还包括有序列组成为SEQID.NO.5-SEQID.NO.6的环引物。

6.一种检测寨卡病毒的方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的试剂盒，包括以下步骤：

(1)提取待检测样品的基因组；

(2)配置引物和反应体系，进行环介导恒温扩增；

(3)检测扩增产物。

7.根据权利要求6所述的检测寨卡病毒的方法，其特征在于，在反应体系中，所述内引物的浓度为40±0.5μM、所述环引物的浓度为20±0.5μM、所述外引物的浓度为5±0.5μM。

8.根据权利要求7所述的检测寨卡病毒的方法，其特征在于，在反应体系中，所述内引物的浓度为40μM、所述环引物的浓度为20μM、所述外引物的浓度为5μM。