CN106879585A - 木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂及其制备方法和应用 - Google Patents

木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂及其制备方法和应用，所述可湿性粉剂包括木霉菌孢子菌丝匀浆、芸苔素内酯、食品级羟基淀粉醚混合得到的粉末，其中，所述粉末中木霉菌孢子菌丝匀浆与食品级羟基淀粉醚的质量比为2:1；所述可湿性粉剂还包括糊精、木质素磺酸钠、分散剂NNO、甲基纤维素、羧甲基纤维素、壳聚糖。本发明的可湿性粉剂具有配制方便，包衣容易，高效低毒，对环境相对安全，对番茄灰霉病具有良好的防效。

Description

木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂及其制备方法和应用，特别是涉及一种生防型木霉菌可湿性粉剂制备方法及其在番茄灰霉病防治中的应用。
背景技术
木霉菌(Trichoderma)作为生物防治中极为重要的生防真菌，由于具有多种拮抗机制，对镰刀菌、灰霉病菌、立枯丝核菌等多种病原真菌均有很好的抑制效果，不仅如此，木霉菌可以***诱导植物的防御反应，从而提高植物的抗病能力。然而，木霉菌在应用中存在两个问题需要解决：木霉菌有时会产生一些抑制性物质抑制种子萌发，因此利用植物源激素的促生功能可解决这一难题。另一方面，在木霉菌生物制剂中，多是利用其活孢子对植物进行生物防控。木霉菌孢子制剂中大部分应用的是分生孢子。但分生孢子受环境条件影响较大，寿命较短，生活力弱，不易长期保存。厚垣孢子虽然细胞壁厚，对环境要求不高，寿命较长，但产生条件相对严格，不易获得。除此之外，孢子制剂在货架期方面仍然存在诸多不足。如何提高木霉菌孢子制剂的货架期也是近年来研究的主要问题。
天然芸苔素内酯，也称油菜素内酯(Brassinolide,简写为BRs)，是一类甾醇类植物激素，是目前国际上公认的活性最佳、最广谱的一类植物生长激素。我国中科院上海植物生理研究所利用芸苔素内酯对小麦、玉米、西瓜、黄瓜、烤烟、葡萄、水稻等作物进行增产试验。结果表明，浓度为0.01～0.1ppm的芸苔素内酯类激素，可使小麦增产10％，玉米增产9.8％～18.4％，西瓜增产20％。芸苔素内酯不但对多种农作物有促生和增产的作用，在植物抗病抗逆性方面也同样起到不可或缺的作用。农作物经常遭受恶劣干旱气候的威胁，这种高温干旱天气会使植物细胞膜结构受到损害、削弱光合作用能力、使其生长受到抑制。BRs可通过改善植物的渗透调节、提高植物体内多种保护酶如过氧化物酶(POD)、超氧化物气化酶(SOD)等酶的活性来增强植物的抗逆能力。但芸苔素内酯单独使用几乎无抑制病菌的功能，因此通过与生防木霉菌混配可能提高其防病效果，弥补这一不足。
目前，利用木霉菌进行生物防治的效果已经获得国内外肯定，木霉菌与其他化学农药复配也已经有很广泛的研究。但这些复配制剂在应用时仍存在诸多问题：一、木霉菌复配制剂的防效仍不及化学杀菌剂的防治效果，多种化学杀菌剂对木霉菌本身的生长具有抑制作用，间接影响木霉菌的生防效果。田间应用时，木霉菌的稳定性较差，活性物质易受环境影响。二、木霉菌与化学农药的复配仍对环境有一定污染，并没有达到生物防治无污染的目的。三、国内市场上所生产的木霉菌可湿性粉剂在溶于水后仍残留部分沉淀，悬浮率较低。
发明内容
针对生防木霉菌和芸苔素内酯各自不足和互补优势，本发明提供了一种木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂及其制备方法和应用，有效用于番茄灰霉病的防治。本发明是从大量的木霉菌资源中筛选获得的拮抗木霉菌株，对番茄灰霉病具有很好的抑制作用。同时，将天然芸苔素内酯与木霉菌联用，发挥各自优势作用的同时，对番茄灰霉病的防治具有协同增效作用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂，包括木霉菌孢子菌丝匀浆、芸苔素内酯、食品级羟基淀粉醚混合得到的粉末，其中，所述粉末中木霉菌孢子菌丝匀浆与食品级羟基淀粉醚的质量比为2:1；
所述可湿性粉剂还包括糊精、木质素磺酸钠、分散剂NNO、甲基纤维素、羧甲基纤维素、壳聚糖，上述各组分的质量分别为所述木霉菌孢子菌丝匀浆、芸苔素内酯、食品级羟基淀粉醚混合得到的粉末质量的8.0-10.0％、4.0-6.0％、4.0-6.0％、9.5-11.0％、4.0-6.0％、3％。
优选地，所述芸苔素内酯的加入量为：每500g木霉菌孢子菌丝匀浆中加入800mL0.1％芸苔素内酯稀释10倍液。
优选地，所述可湿性粉剂中，木霉菌的浓度为7.5-8.0×108个/g。
优选地，所述木霉菌为深绿木霉菌CGMCC No.6479(该菌株见中国发明专利文献CN103484377A中的记载)。
优选地，所述木霉菌孢子菌丝匀浆的制备方法如下：以0.5％的接种量将一级菌种接种于优化后的木霉菌液体发酵培养基中，发酵培养7天后，30Hz高速离心机离心5min，即得木霉菌孢子菌丝匀浆。
优选地，所述一级菌种是通过将木霉菌菌饼以3-5片/三角瓶的接种量于PD培养基中、180r/min、28℃条件下培养4d获得。
优选地，所述优化后的木霉菌液体发酵培养基组成包括：玉米粉5.0g，葡萄糖2.0g，大豆蛋白胨2.0g，K2HPO4 1.0g，FeSO40.01g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g；培养基的装液量为100mL/250mL。
优选地，所述发酵培养的条件为：温度28.33℃，PH＝6.28，转速183.72r/min。
第二方面，本发明提供了一种木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：将木霉菌孢子菌丝匀浆、芸苔素内酯、食品级羟基淀粉醚混合得到的粉末与糊精、木质素磺酸钠、分散剂NNO、甲基纤维素、羧甲基纤维素、壳聚糖按比例混合均匀后，进行干燥，即得所述可湿性粉剂。
第三方面，本发明提供了一种木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂作为生防制剂在防治番茄灰霉病中的应用。
第四方面，本发明提供了一种木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂在防治番茄灰霉病中的使用方法，所述使用方法具体为：将所述可湿性粉剂溶解在水中形成混合溶液，叶面喷施即可；所述混合溶液中可湿性粉剂的浓度为2g/L。
本发明经过木霉菌初筛，复筛纯化后保存于冻存管中。在上述优化培养基中进行液体发酵使其产生木霉菌孢子发酵液，将含有大量孢子的发酵液装入30Hz高速离心机中离心5min，与芸苔素内酯、芸苔素内酯、食品级羟基淀粉醚、糊精、木质素磺酸钠、分散剂NNO、甲基纤维素、羧甲基纤维素、壳聚糖；按照最佳配比混合制成木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂，将所述可湿性粉剂(10g/5L)溶解在水中，在温室与田间叶面喷施。与对照相比，防治番茄灰霉病效果显著，平均达70％以上。
本发明的可湿性粉剂具有配制方便，包衣容易，高效低毒，对环境相对安全，对番茄灰霉病具有良好的防效。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、该木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂中不仅含有大量木霉菌孢子和菌丝体，同时还有芸苔素内酯天然植物激素。研究表明，木霉菌孢子发酵液有抑制多种病原菌的功能。而本发明采用的深绿木霉菌CGMCC No.6479，经过反复试验得出，其对番茄灰霉病的防治具有明显的效果。芸苔素内酯，作为一种新型植物生长调节剂，可在植物的各个阶段起到调控作用。不但可以促进细胞的伸长和***，促进光合作用，提高作物抗高温、抗干旱等抗逆性；幼苗期促进根的伸长、营养期促进茎叶的生长、生殖期促进果实成熟。芸苔素内酯能够有利于植物过氧化氢CAT、超氧化物酶SOD、过氧化物酶POD活性的提高，增强细胞自我保护功能。
2、该木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂是由专门针对番茄灰霉病具有很好防治效果的深绿木霉菌及天然植物生长调节剂芸苔素内酯优化组配而成，功能上优势互补；二者不仅在防治灰霉病的机制上具有协同增效作用，同时对植物的生长指标有显著的促进作用，对种子的萌发及发芽势具有显著促进作用。
3、该木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂的载体选用的是可溶于水且对木霉菌及芸苔素内酯本身无影响的食品级羟基淀粉醚，消除了传统可湿性粉剂中使用高岭土、硅藻土等惰性等不溶于水的载体；同时在分别优化保护剂、润湿剂、稳定剂的种类及量的前提下，加入了崩解剂甲基纤维素，大大加快了粉剂浸入水中后的分散与润湿速率。
4、该木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂中加入了壳聚糖与海藻酸钠，使常温下货架期时长提高45.4％；对可湿性粉剂的常温储存具有显著的意义。
5、将本发明提供的木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂按照一定比例要求对番茄进行喷施，对土壤无污染。在上海交通大学温室、七宝农场进行试验，此可湿性粉剂对番茄灰霉病的防效均能达到70％以上。
6、将本发明提供的木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂按照一定比例要求对番茄进行喷施，与国内外同类可湿性粉剂及化学杀菌剂嘧霉胺进行防效对比，木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂的防效与化学杀菌剂嘧霉胺防效相当，分别为75％、73％；远高于其他可湿性粉剂。
7、本发明适用于大多数具有良好生防效果的木霉菌菌株，制作方法简单，成本低，适合于不同规模生产，市场前景广阔。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为不同药剂处理对番茄盆栽防治效果；
图2不同药剂对番茄果实灰霉病的防治效果；
图3为采用不同载体制备的木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂沉淀情况对比；
图4为本发明制备的可湿性粉剂货架期测定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供了一种木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂的制备方法，具体步骤如下：
1、平板菌种活化：将深绿木霉菌CGMCC No.6479接种于PDA培养皿中，28℃培养箱中倒置培养4-5天；然后将番茄灰霉菌接种于PDA培养皿中，25℃培养箱中倒置培养7天，光照黑暗交替处理。
所述PDA培养基为：200g马铃薯蒸煮后过滤的上层汁液，20g葡萄糖，20g琼脂粉，纯净水定容至1L，每250mL分装至500mL三角瓶，121℃高压灭菌25min。
2、一级菌种的制备：先制备PD培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，纯净水1L，每250mL分装至500mL三角瓶，121℃高压灭菌25min。然后在PD培养基中接入步骤1活化后的平板菌种，置于180r/min、28℃摇床中摇瓶培养5天，得到深绿木霉菌CGMCC No.6479液体发酵菌种，即一级菌种。
3、木霉菌液体发酵：玉米粉含量为10kg，葡萄糖为4kg，大豆蛋白胨为4kg，磷酸氢二钾2kg，硫酸亚铁10g，硫酸镁100g，氯化钾100g，水补足至200L，装入300L发酵罐。培养基初始pH调节为6.2-6.5,121℃下高温灭菌40-60min。接入重量比为0.5％的深绿木霉菌CGMCC No.6479液体发酵菌种，发酵温度为28.33℃，PH＝6.28，转速183.72r/min，发酵时间7天，即得深绿木霉菌孢子发酵液。
4、木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂的制备：将深绿木霉菌发酵液用30Hz高速离心机离心5min，得木霉菌孢子菌丝匀浆。向500g木霉菌孢子菌丝匀浆中加入0.1％芸苔素内酯稀释10倍液800mL，制得初步混合匀浆。向上述混合匀浆中加入250g食品级羟基淀粉醚，不足则用吸水性较强且沉淀较少的白炭黑补足，手动研磨成细度均匀的粉末。
称取上述细度均匀的粉末500g，分别加50g糊精、25g木质素磺酸钠、25g分散剂NNO、50g甲基纤维素、25g羧甲基纤维素、15g壳聚糖；混合均匀。通过活性孢子粉专用干燥机中，气流作用吹成细度匀称的干燥粉末状，制成可湿性粉剂。
效果验证：
1)木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂对盆栽番茄的防病效果
以实施例1方法制得的木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂为样品1、牛博士可湿性粉剂为对照样品2、哈茨木霉可湿性粉剂为对照样品3、杀菌剂嘧霉胺为对照样品4、CK(不采用任何药剂处理)为样品5，对盆栽番茄的防病效果进行考察。由表1、图1可知，盆栽试验中，接种灰霉病的植株发病率为71.6％，四种药剂处理中，牛博士木霉菌可湿性粉剂处理的植株发病率相对较高，为40.1％。由防效可知，化学药剂嘧霉胺的防效最好，为74.7％；深绿木霉·芸苔素内酯复合型可湿性粉剂与哈茨木霉菌可湿性粉剂防效差异不显著，分别为71.2％，71.5％；而牛博士木霉菌可湿性粉剂防效仅为61.2％，与其他三组差异均显著(p<0.05)，效果相对较差。
表1不同药剂处理对番茄盆栽防效的影响
2)木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂对番茄果实的防病效果
以实施例1方法制得的木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂为样品1、牛博士可湿性粉剂为对照样品2、哈茨木霉可湿性粉剂为对照样品3、杀菌剂嘧霉胺为对照样品4、CK(不采用任何药剂处理)为样品5，对番茄果实的防病效果进行考察。由表2、图2可知，四种不同药剂处理番茄果实后，对番茄果实防效不同。化学杀菌剂嘧霉胺对果实的防效最好，为61.3％；深绿木霉·芸苔素内酯复合型可湿性粉剂与哈茨木霉菌可湿性粉剂防效分别为58.1％，52.6％；差异不显著(p<0.05)。牛博士木霉菌可湿性粉剂对果实的防效为47.4％。与其他三组差异均显著，效果相对较差。
表2不同药剂处理对番茄果实灰霉病的防效
处理 病情指数 防效(％)
1 17.7 58.1Aa
2 22.2 47.4Bb
3 20.0 52.6Ab
4 16.3 61.3Aa
5 42.2 —
3)田间试验番茄的灰霉病防效
以实施例1方法制得的木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂为样品1和11(其中样品1为木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂按照10g/5L喷施，样品11为木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂按照5g/5L喷施)、牛博士可湿性粉剂为对照样品2、哈茨木霉可湿性粉剂为对照样品3、杀菌剂嘧霉胺为对照样品4、CK(不采用任何药剂处理)为样品5，对田间试验番茄的灰霉病防效进行考察。由表3可知，深绿木霉菌·芸苔素内酯复合型可湿性粉剂按照5g/5L喷施与哈茨木霉菌可湿性粉剂按照10g/5L喷施防效分别为67.3％、61.5％。二者差异不显著，前者防效略高于后者；而深绿木霉·芸苔素内酯复合型可湿性粉剂按照10g/5L稀释喷施，防效为75％，与化学杀菌剂嘧霉胺防效差异不显著，分别为75.0％、73.0％，且远高于其他药剂处理。牛博士木霉菌可湿性粉剂防效仅为57.6％，与其它处理组均差异显著。
表3田间药剂防效调查
处理 发病率(％) 病情指数 防效(％)
1 12.3 13 75.0Aa
2 14.3 22 57.6Cc
3 12.8 20 61.5Bb
4 7.5 14 73.0Aa
11 12.4 17 67.3Bb
5 33.5 52 —
4)对本实施例制备的可湿性粉剂进行货架期的测定
本实施例制备的可湿性粉剂中最初含孢量为7.63×108CFU/g，以不加壳聚糖制备的粉剂进行对照。结果表明，壳聚糖在可湿性粉剂中不仅可以对病原菌有抑制作用，作为一种糖类物质，保护剂的一种，为粉剂中的木霉菌孢子提供持续营养成分，使其货架期延长，4个月后，孢子量可达1.35×108CFU/g，见图4。
实施例2
本实施例考察了本发明的可湿性粉剂的两种有效组分的不同浓度配比对番茄灰霉病的防治效果，如表4和表5所示。表4的结果表明，当木霉菌孢子浓度为108CFU/g，0.1％芸苔素内酯稀释10倍时，二者共同对灰霉病菌菌丝生长的抑制效果最好，抑菌率可达到73.6％，抑菌率均高于其它处理组。进一步地，表5的研究结果表明，木霉菌孢子浓度在7.5-8.0×108个/g，0.1％10倍液(浓度为0.01％)的每克木霉菌孢子粉末中加入0.1％芸苔素内酯的稀释10倍液(浓度为0.01％)的芸苔素内酯1-3mL，二者共同对番茄灰霉病菌有较明显的抑制作用，防效达到74.84％，与其他配比组分相比较，差异显著。
表4不同浓度木霉菌与芸苔素内酯复配对灰霉菌生长的影响
表5不同配比含量复配对番茄植株灰霉病的抑菌效果
同时，本实施例还考察了本发明中不同木霉菌孢子含量与芸苔素内酯含量配比对番茄植株的促生长作用。由表6可知，木霉菌孢子浓度在7.5-8.0×108个/g，芸苔素内酯浓度为0.01％且每克木霉菌孢子粉末中加入1.0-3.0mL时，对番茄植株的株高、根长及鲜重均有明显的促进效果，与其他配比的促生效果相比，差异显著；与单独处理及空白对照相比，差异极显著。说明在此浓度配比范围内，可湿性粉剂的促生效果最好。
表6不同配比复配对番茄植株生理指标的影响
通过优化可湿性粉剂助剂配方，用食品级羟基淀粉醚作为此粉剂的载体，消除了传统惰性载体沉淀量极大的问题；由图3可知，与其他载体相比，食品级羟基淀粉醚的沉淀量最少，为11.48％，差异显著。在此基础上，通过优化分散剂、润湿剂、悬浮剂的组分含量，极大提高了可湿性粉剂的悬浮率及润湿时间。由表7可知，在木质素磺酸钠、NNO、甲基纤维素分别为4％，5％，10％的配比下，可湿性粉剂的悬浮率最高，为77.26％，且此时的润湿时间最短为21s。
由表8可知，在10％糊精的保护作用下，木霉菌在紫外照射下，生长活性提高68.9％，在紫外照射120min后，木霉菌菌丝直径与无保护剂处理的菌丝直径相比，差异极显著。
表7不同助剂配比对可湿性粉剂悬浮率及润湿时间的影响
表8保护剂对可湿性粉剂中木霉菌活性的保护作用
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (9)

1.一种木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂，其特征在于，包括木霉菌孢子菌丝匀浆、芸苔素内酯、食品级羟基淀粉醚混合得到的粉末，其中，所述粉末中木霉菌孢子菌丝匀浆与食品级羟基淀粉醚的质量比为2:1；
所述可湿性粉剂还包括糊精、木质素磺酸钠、分散剂NNO、甲基纤维素、羧甲基纤维素、壳聚糖，上述各组分的质量分别为所述木霉菌孢子菌丝匀浆、芸苔素内酯、食品级羟基淀粉醚混合得到的粉末质量的8.0-10.0％、4.0-6.0％、4.0-6.0％、9.5-11.0％、4.0-6.0％、3％。
2.根据权利要求1所述的木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂，其特征在于，所述芸苔素内酯的加入量为：每500g木霉菌孢子菌丝匀浆中加入800mL质量分数为0.01％芸苔素内酯。
3.根据权利要求1所述的木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂，其特征在于，所述木霉菌为深绿木霉菌CGMCC No.6479。
4.根据权利要求1所述的木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂，其特征在于，所述木霉菌孢子菌丝匀浆的制备方法如下：先将木霉菌菌饼以3-5片/三角瓶的接种量于PD培养基中、180r/min、28℃条件下培养4-5d获得一级菌种；再以0.5％的接种量将一级菌种接种于优化后的木霉菌液体发酵培养基中，发酵培养7天后，30Hz高速离心机离心5min，即得木霉菌孢子菌丝匀浆。
5.根据权利要求4所述的木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂，其特征在于，所述优化后的木霉菌液体发酵培养基的组成包括：玉米粉5.0g，葡萄糖2.0g，大豆蛋白胨2.0g，K2HPO41.0g，FeSO40.01g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g；培养基的装液量为100mL/250mL。
6.根据权利要求4所述的木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂，其特征在于，所述发酵培养的条件为：温度28.33℃，PH＝6.28，转速183.72r/min。
7.一种据权利要求1至6任一项所述的木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将木霉菌孢子菌丝匀浆、芸苔素内酯、食品级羟基淀粉醚混合得到的粉末与糊精、木质素磺酸钠、分散剂NNO、甲基纤维素、羧甲基纤维素、壳聚糖按比例混合均匀后，进行干燥，即得所述可湿性粉剂。
8.一种据权利要求1至6任一项所述的木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂作为生防制剂在防治番茄灰霉病中的应用。
9.一种根据权利要求1至6任一项所述的木霉菌·芸苔素内酯可湿性粉剂在防治番茄灰霉病中的使用方法，其特征在于，所述使用方法具体为：将所述可湿性粉剂溶解在水中形成混合溶液，叶面喷施即可；所述混合溶液中可湿性粉剂的浓度为2g/L。
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