CN106860449B - 苦参碱衍生物在治疗糖尿病中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及式I所示化合物、其立体异构体、或其可药用盐在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途，或在制备用于预防或治疗糖尿病并发症的药物中的用途，或在制备作为胰岛素增敏剂的药物中的用途，

Description

苦参碱衍生物在治疗糖尿病中的用途

技术领域

本发明涉及苦参碱衍生物的新用途，具体涉及苦参碱衍生物作为胰岛素增敏剂的用途，还涉及苦参碱衍生物在制备用于治疗或预防糖尿病或糖尿病并发症的药物中的用途。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus)是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，分为1型和2型糖尿病。长期血糖增高，大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等，将会引发如糖尿病肾病、糖尿病眼病、糖尿病心血管并发症、糖尿病神经病变等一系列并发症。并发症一旦产生，药物治疗很难逆转，因此强调尽早预防糖尿病并发症。

目前用于治疗糖尿病的药物主要有胰岛素及其类似物、口服降糖药等。口服降糖药主要包括了磺酰脲类促胰岛素分泌剂、非磺酰脲类促胰岛素分泌剂、噻唑烷二酮类、双胍类、胰高血糖素样肽1类似物、DPP-4抑制剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂等。临床上常用的这些口服降糖药都存在一定得副作用。例如，有报道显示使用磺酰脲类降糖药可能产生低血糖，主要不良心血管事件，胃肠道损伤等副作用。非磺酰脲类促胰岛素分泌剂可能产生恶心，腹痛，腹泻等胃肠道不良反应。噻唑烷二酮类药物被报道可能与动脉粥样硬化的产生有关，罗格列酮可能导致心血管风险，匹格列酮可能导致膀胱癌的产生。双胍类药物临床不良反应主要为消化道症状，如腹泻、腹胀、恶心、食欲减退、上腹不适，另可见乳酸性酸中毒等不良反应。有严重肝、肾、心、肺功能不全的糖尿病患者不宜使用双胍类药物。DPP-4抑制剂可能产生低血糖反应。α-葡萄糖苷酶抑制剂可能产生胃肠胀气等副作用。

因此研究开发更加安全有效的新型口服降糖药就显得至关重要。

发明内容

发明人通过体外筛选以及动物体内药学验证，意外地发现苦参碱衍生物能够降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖，改善口服葡萄糖耐量，改善胰岛素耐量以及改善小鼠尿液相关指标，并且不会增加血清ALT含量，同时还降低了肝脏系数，降低肝脏甘油三脂含量，降低肝脏AGEs含量。这表明苦参碱衍生物可以作为胰岛素增敏剂，和/或用于预防和/或治疗糖尿病或糖尿病并发症，例如糖尿病肾病。本发明基于上述发现而得以完成。

本发明涉及式I所示化合物、其立体异构体、或其可药用盐在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。

本发明还涉及式I所示化合物、其立体异构体、或其可药用盐在制备用于预防和/或治疗糖尿病并发症的药物中的用途。

本发明还涉及式I所示化合物、其立体异构体、或其可药用盐在制备作为胰岛素增敏剂的药物中的用途。

本发明还涉及一种药物组合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途，或在制备用于预防或治疗糖尿病并发症的药物中的用途，或在制备作为胰岛素增敏剂的药物中的用途，其中所述药物组合物含有式I所示化合物、其立体异构体、或其可药用盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明还涉及式I所示化合物、其立体异构体、或其可药用盐，其用于治疗糖尿病。

本发明还涉及式I所示化合物、其立体异构体、或其可药用盐，其用于预防和/或治疗糖尿病并发症。

本发明还涉及式I所示化合物、其立体异构体、或其可药用盐，其作为胰岛素增敏剂。

本发明一种治疗糖尿病的方法，其包括，给有此需要的受试者施用有效量的式I所示化合物、其立体异构体、或其可药用盐。

本发明还涉及一种预防和/或治疗糖尿病并发症的方法，其包括，给有此需要的受试者施用有效量的式I所示化合物、其立体异构体、或其可药用盐。

本发明所述的式I所示化合物的结构如下：

其中，

R₁代表芳基或杂环基，所述芳基或杂环基任选地被R₄单取代或多取代，R₄选自：C_1-4烷酰基、氰基、C_1-4烷氧基、卤代C_1-4烷氧基、羧基、磺酸基、C_1-4烷氧羰基、C_1-4烷酰氨基、硝基、卤素、羟基、巯基、氨基、C_1-4烷基磺酰基、C_1-4烷基和卤代C_1-4烷基；

R₂代表-(CH₂)_nR₃；其中，

n＝0、1、2、3或4；

R₃选自氢、氨基、巯基、卤素和C_1-6烷氧基。

在一个实施方案中，本发明所述的式I所示化合物中，所述的杂环基为5-6元单杂芳基。

在以上任意一个实施方案中，本发明所述的式I所示化合物中，所述杂环基选自咪唑基、噻唑基、吡啶基、噻吩基。

在以上任意一个实施方案中，本发明所述的式I所示化合物中，所述芳基为苯基。

在以上任意一个实施方案中，本发明所述的式I所示化合物中，R₄选自卤代甲氧基、卤代乙氧基、卤代丙氧基、乙酰基、卤代甲基、卤代乙基、卤代丙基、氰基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、羧基、甲氧羰基、乙酰氨基、硝基、氨基、甲磺酰基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。优选地，R₄选自三氟甲氧基、三氟甲基、氰基、甲氧基、羧基、硝基、氨基、甲磺酰基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。进一步优选地，R₄为三氟甲基。

在以上任意一个实施方案中，本发明所述的式I所示化合物中，R₂代表-(CH₂)_nR₃，其中，n＝1、2或3；R₃选自氢、氨基、甲氧基、乙氧基。

在以上任意一个实施方案中，本发明所述的式I所示化合物中，R₂代表甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。

在以上任意一个实施方案中，本发明所述的式I所示化合物中，R₂代表甲基、乙基、正丙基或异丙基。

在以上任意一个实施方案中，本发明所述的式I所示化合物选自：

本发明所述的式I所示化合物的合成方法可参见CN106279167A。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

本发明所述的糖尿病为1型糖尿病或2型糖尿病。

本发明所述的糖尿病并发症为糖尿病肾病、糖尿病眼病、糖尿病心血管并发症或糖尿病神经病变，优选为糖尿病肾病。

本发明所述的胰岛素增敏剂又称“胰岛素增敏因子”，它是一类能增强人体内胰岛素敏感性，促进胰岛素充分利用的物质。

本发明中使用的术语“芳基”是指包含至少一个不饱和芳环的单环或双环芳香***，优选具有6-10，即6，7，8，9或10个碳原子的芳基。具体的例子包括但不限于苯基、萘基等。

本发明中使用的术语“杂环基”是指任选地被至少一个和最多四个独立的选自N、O或S的杂原子取代的单环或双环饱和、部分饱和或不饱和的芳香或脂肪环状***，优选具有4-7个原子(包含4、5、6或7个原子)的单杂环基或7-11个原子(包含7、8、9、10或11个原子)的双杂环基，例如5-6元单杂芳基、7-11元双杂芳基、氮杂环或4-6元脂肪氮杂环。具体的例子包括但不限于咪唑基、噻唑基、吡啶基、噻吩基。

本发明中使用的术语所述“C_1-4烷基”是指具有1-4个碳原子，如1、2、3或4个碳原子的直链或支链烷基。具体的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。

本发明中使用的术语“C_1-6烷氧基”是指如前述的C_1-6烷基上的碳原子与氧原子连接后得到的基团，优选为“C_1-4烷氧基”，具体的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基或丙氧基等。

本发明中使用的术语“C_1-4烷酰基”是指羰基碳原子一端与前述定义的C_1-4烷基连接后得到的基团，具体的例子包括但不限于甲酰基、乙酰基、丙酰基等。

本发明中使用的术语“C_1-4烷氧羰基”是指羰基碳原子一端与前述定义的C_1-4烷氧基连接后得到的基团。具体的例子包括但不限于甲氧羰基、乙氧羰基等。

本发明中使用的术语“C_1-4烷酰氨基”是指氨基氮原子一端与前述定义的C_1-4烷酰基连接后得到的基团。具体的例子包括但不限于甲酰氨基、乙酰氨基等。

本发明中使用的术语C_1-4烷基磺酰基”是指磺酰基硫原子一端与前述定义的C_1-4烷基连接后得到的基团。具体的例子包括但不限于甲磺酰基、乙磺酰基等。

如本发明中所使用的术语“卤素”是指氟、氯、溴、碘。

本发明中使用的术语“受试者”包括哺乳动物和人，优选为人。

本发明中使用的术语“可药用盐”意指在制药上可接受的并且具有母体化合物的所需药理学活性的本发明化合物的盐。这类盐包括：与无机酸或与有机酸形成的酸加成的盐，所述的无机酸诸如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；所述的有机酸诸如乙酸，丙酸，己酸，环戊丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，苹果酸，马来酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，萘磺酸，樟脑磺酸，葡庚糖酸，葡糖酸，谷氨酸，羟基萘甲酸，水杨酸，硬脂酸，粘康酸等；或在母体化合物上存在的酸性质子被金属离子，例如碱金属离子或碱土金属离子取代时形成的盐；或与有机碱形成的配位化合物，所述的有机碱诸如乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，N-甲基葡糖胺等。

本发明所述的药物组合物中含有式I所示化合物、其立体异构体、或其可药用盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。所述的载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。所述赋形剂是指在药物制剂中除主药以外的附加物。其性质稳定，与主药无配伍禁忌，不产生副作用，不影响疗效，在常温下不易变形、干裂、霉变、虫蛀、对人体无害、无生理作用，不与主药产生化学或物理作用，不影响主药的含量测定等。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；中药丸剂中的酒、醋、药汁等；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂，等等。

本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。

本发明中所使用的术语“有效量”是指，足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度，患者自己的免疫***的总体状态，患者的一般情况例如年龄、体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

对受试者给予的本发明化合物的量取决于所述疾病或病况的类型和严重程度以及受试者的特征，如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受度，还取决于制剂的类型和药物的给药方式，以及给药周期或时间间隔等因素。本领域技术人员能够根据这些因素和其它因素来确定适当的剂量。一般而言，本发明的化合物用于治疗日剂量可为大约1～800毫克，该日剂量可以视情况一次或分多次给予。本发明化合物可以在剂量单位中提供，在剂量单位中的含量可以为0.1～200毫克，例如1～100毫克。

本发明的有益技术效果

本发明所述的式I所示化合物能够降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖，改善口服葡萄糖耐量，改善胰岛素耐量以及改善小鼠尿液相关指标，并且不会增加血清ALT含量，同时还降低了肝脏系数，降低肝脏甘油三脂含量，降低肝脏AGEs含量。本发明所述的式I所示化合物可以作为胰岛素增敏剂，和/或用于预防和/或治疗糖尿病或糖尿病并发症，例如糖尿病肾病。

附图说明

图1 HepG2细胞糖消耗情况柱状图；

图2 L6细胞糖消耗情况柱状图；

图3 3T3-L2细胞糖消耗情况柱状图；

图4小鼠空腹血糖变化情况柱状图；

图5口服葡萄糖耐量(OGTT)曲线；

图6 OGTT曲线下面积柱状图；

图7胰岛素耐量(ITT)曲线；

图8 ITT曲线下面积柱状图；

图9给药前和给药49天后，小鼠24小时尿量变化柱状图；

图10给药前和给药49天后，小鼠尿液葡萄糖浓度变化柱状图；

图11给药前和给药49天后，小鼠尿微量白蛋白产生量变化柱状图；

图12给药前和给药49天后，小鼠尿总蛋白产生量变化柱状图；

图13给药第50天后，小鼠血清中ALT含量柱状图；

图14给药第50天后，小鼠血清中AST含量柱状图；

图15给药第50天后，小鼠血清中CHO含量柱状图；

图16给药第50天后，小鼠血清中LDL-c含量柱状图；

图17给药第50天后，小鼠血清中TG含量柱状图；

图18给药50天后，小鼠血清中胰岛素浓度柱状图；

图19给药50天后，小鼠血清中晚期糖基化终末产物含量柱状图；

图20给药50天后，小鼠肝脏系数柱状图；

图21给药50天后，肝脏组织甘油三酯含量柱状图；

图22给药50天后，肝脏组织总胆固醇含量柱状图；

图23给药50天后，肝脏组织AGEs含量柱状图；

图24给药50天后，肝脏组织SOD活力柱状图；

图25给药50天后，肝脏组织MDA含量柱状图。

图1至图25中，横坐标标记，“DB-1,10”表示10μM的化合物DB-1，“DB-1,10+I”表示10μM的化合物DB-1+0.05nM胰岛素，“DB-1,20”表示20μM的化合物DB-1，“DB-1,20+I”表示20μM的化合物DB-1+0.05nM胰岛素，其他的横坐标标记的含义与之类似。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

下面实施例中涉及的实验材料及试剂如下：

HepG2细胞、L6细胞、3T3-L1细胞购自美国模式培养物集存库(American typeculture collection，ATCC)。

DMEM培养基、EDTA-胰酶、胎牛血清FBS购自美国gibco公司。

葡萄糖检测试剂盒(葡萄糖氧化酶法)购自朗道实验诊断有限公司(Randox)。

雄性C57BL/6J小鼠和雄性KK/upj-Ay/J小鼠，维持饲料，高脂高糖饲料购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

化合物DB-1和DB-1-3由中国医学科学院医药生物技术研究所化学室合成(合成方法参见CN106279167A的实施例28和实施例30)，小檗碱(BBR)由东北制药集团沈阳第一制药厂提供，罗格列酮(RGZ)购自sigma公司。

血糖仪和血糖试纸购自罗氏诊断产品(上海)有限公司。

D-葡萄糖、SOD试剂盒、MDA试剂盒、己糖激酶试剂盒、糖原检测试剂盒购自sigma公司。

0.22μm滤膜、小鼠胰岛素ELISA试剂盒购自Millpore公司。

重组人胰岛素注射液购自礼来公司。

EDTA-K2抗凝采血管购自美国BD公司。

晚期糖基化终末产物AGE含量利用ELISA试剂盒购自cell biolabs公司。

蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo公司。

RNA提取试剂盒购自Qiagen公司。

反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自Promega公司。

下面实验中所用浓度单位“M”表示mol/L。

实施例1体外HepG2细胞系/L6细胞系/3T3-L1细胞系糖消耗及胰岛素刺激的糖消耗实验

1.1实验方法如下：

①细胞培养：HepG2细胞用10％FBS+DMEM培养基培养，于37℃，5％CO₂细胞培养箱培养。

L6细胞用10％FBS+DMEM培养基培养，于37℃，5％CO₂细胞培养箱培养，L6细胞接种培养板后，在细胞密度长至80％-90％后继续用10％FBS+DMEM培养基诱导分化5-7天。

3T3-L1细胞使用10％FBS+DMEM高糖培养，于37℃，5％CO₂细胞培养箱进行生长培养。然后置于37℃，5％CO₂细胞培养箱进行诱导分化培养，诱导分化培养基为：10％FBS+DMEM高糖培养基，其中添加了1μM***，0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和1μg/ml胰岛素。

②糖消耗测定：

待测化合物为：化合物DB-1、DB-1-3、小檗碱(BBR)和罗格列酮(RGZ)，其中小檗碱和罗格列酮作为阳性对照药。各待测化合物均使用DMSO配制成溶液。

将HepG2细胞、L6细胞、3T3-L1细胞分别接种至96孔板中。其中：

HepG2细胞每孔接种2*10⁴个，培养24小时后，进行加药处理，进行进行基础糖消耗和胰岛素刺激的糖消耗实验；

L6细胞每孔接种5*10³个，培养和诱导分化后作加药处理，进行基础糖消耗和胰岛素刺激的糖消耗实验；

同样的3T3-L1细胞每孔接种2*10³个，生长培养基培养48小时，更换新鲜生长培养基继续培养48小时，然后更换分化培养基诱导分化48小时后进行加药处理，进行基础糖消耗和胰岛素刺激的糖消耗实验。

基础糖消耗实验，向孔中加入0.5％FBS+DMEM培养基和待测化合物，同时设置对照组。对照组向孔中加入相同量的0.5％FBS+DMEM培养基和DMSO。每孔中待测化合物的终浓度分别设置为10μM、20μM、40μM。加药后培养24小时，吸取一定量上清液测定培养基中葡萄糖剩余量，计算葡萄糖消耗量。其中葡萄糖消耗量＝培养基中葡萄糖初始含量－培养基中葡萄糖剩余含量。

胰岛素刺激的糖消耗实验，向孔中加入胰岛素和待测化合物，同时设置胰岛素对照组。胰岛素对照组向孔中加入相同量胰岛素和DMSO。每孔中待测化合物的终浓度分别设置为10μM、20μM、40μM，胰岛素的终浓度设置为0.05nM。加药后培养24小时，吸取一定量上清液测定培养基中葡萄糖剩余量，计算葡萄糖消耗量。

1.2实验结果

实验独立重复三次，得到平均糖消耗量。分别绘制不同细胞的糖消耗柱状图，如图1至图3所示。结果显示，在HepG2细胞系、L6细胞系、3T3-L1细胞系中，在相同测定条件下，化合物DB-1和化合物DB-1-3在促进细胞基础水平的糖消耗以及促进胰岛素刺激的细胞糖消耗方面具有与阳性对照药小檗碱和罗格列酮相当或更加显著的效果，表明化合物DB-1和化合物DB-1-3在细胞水平具有较好的降糖作用以及增加胰岛素敏感性的作用。

实施例2降低2型糖尿病小鼠空腹血糖、增加胰岛素敏感性以及治疗糖尿病肾病的药理作用实验

2.1实验方法

①动物实验：8只10周龄雄性C57BL/6J小鼠，63只10周龄雄性KK/upj-Ay/J小鼠，其中：C57BL/6J小鼠给予维持饲料，KK/upj-Ay/J小鼠给予高脂高糖饲料，饲养两周后测定空腹血糖，并随机分组。C57BL/6J小鼠作为正常对照组，KK/upj-Ay/J小鼠为5组，每组9只，其中1组为模型对照组，4组为给药组，给药量分别为DB-1 50mg/kg，DB-1 100mg/kg，BBR100mg/kg，RZG 5mg/kg。

高脂高糖饲料配方为：蛋白质16.46％，脂肪45.65％，碳水化合物37.89％。

②空腹血糖测定：于给药前测定不禁食情况下体重作为初始值，给药之后每3天测定一次体重。测定初始空腹血糖之后，称取一定量饲料给予每只小鼠，每5天称量剩余食物量，重新给予一定量饲料，给药结束后计算每只小鼠每天进食量。于前一日晚8:30禁食12小时，次日早上8:30测定空腹血糖，剪尾尖，用罗氏血糖仪活力型测定，给药前测定空腹血糖作为初始值，给药之后每10天测定空腹血糖。绘制小鼠空腹血糖变化情况柱状图，如图4所示。

③口服葡萄糖耐量实验(OGTT)：给药30天后，晚8:30禁食12小时，次日早上8:30进行OGTT实验，称取4g葡萄糖溶于20ml水中，0.22μm滤膜过滤除菌，配置成20％葡萄糖溶液，称体重，测定空腹血糖作为0点血糖值，灌胃给予小鼠20％葡萄糖溶液，最终给予葡萄糖量2g/kg，然后在30min，60min，120min，180min分别测定血糖值，统计血糖值，绘制OGTT曲线，并计算OGTT曲线下面积。

④胰岛素耐量实验(ITT)：给药35天后，早上8:30小鼠禁食6小时，测定小鼠禁食6小时后血糖值作为ITT实验0点血糖值，同时称量小鼠禁食6小时后的体重，按体重给予礼来常规性重组人胰岛素注射液，腹腔注射给予，最终给予胰岛素浓度为0.5U/kg体重，分别在注射胰岛素后15min，30min，60min，90min，120min测定血糖，以0点血糖值为1，其余各时间点计算相对血糖浓度，绘制ITT曲线，并计算ITT曲线下面积。

⑤尿液收集和测定：用代谢笼分别收集小鼠给药前和给药49天后的24小时尿液，将小鼠单独放入代谢笼中，自由饮食饮水，收集每只小鼠24小时尿液，12000rpm，4℃离心10min去除杂质，测量尿液体积，用试剂盒测定尿液总蛋白浓度，尿液微量白蛋白浓度，尿液葡萄糖浓度，根据尿量计算小鼠24小时尿总蛋白，尿微量白蛋白产生量，试剂盒购自北京九强生物技术股份有限公司。

⑥血液指标测定：动物给药48天后，禁食12小时，断尾取全血于EDTA-K2抗凝采血管中(购自BD)，取10μL抗凝全血测定糖化血红蛋白浓度和血红蛋白浓度，二者比值作为糖化血红蛋白含量(试剂盒购自RNADOX)。

给药50天后，小鼠摘眼球取血，室温静置2小时后，于15℃，3000rpm，离心10min，分离血清，用全自动生化仪(日立7100)和生化检测试剂盒(购自中生北控)测定谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，甘油三酯(TG)，总胆固醇(CHO)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，尿素(UREA)。肌酐(CRE)利用全波长酶标仪进行手工测定，利用全波长酶标仪测定总胆汁酸(TBA)，总胆红素(T-Bil)，直接胆红素(D-Bil)，手工测定所用试剂盒购自北京九强生物。血清胰岛素含量利用ELISA试剂盒(购自Merck Millipore)测定。血清晚期糖基化终末产物AGEs含量利用ELISA试剂盒(购自cell biolabs)。

⑦动物组织器官的处理：给药50天后处死动物。动物处理前禁食12小时，称量禁食后体重，取血后，脱颈椎处死动物，取肝脏，肾脏，胰腺，附睾脂肪，肾周脂肪分别称重。分别取肝脏大叶的一半，取小鼠左侧肾脏，胰腺一半用10％***溶液固定过夜，进行病理HE染色，剩余肝脏大叶，右侧肾脏，剩余胰腺即刻冻存于液氮中，以备后续处理。

⑧肝脏甘油三脂及总胆固醇测定：切取50mg左右肝脏组织，按比例每毫克组织加入20μL裂解液，后续步骤按照说明书进行，测定组织TG和CHO，所用试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。

⑨肝脏AGE和SOD活力测定:切取约30mg肝脏组织，按每毫克组织加入20μL T-PER组织蛋白提取试剂(购自thermo scientific)，后用组织匀浆器(购自Qiagen)裂解，12000g，4℃，离心15min取上清，利用试剂盒测定肝脏晚期糖基化终末产物AGE含量(AGE测定试剂盒购自cell biolabs)和SOD活力(SOD活力测定试剂盒购自sigma)，测得结果用蛋白浓度校准(蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo)。

⑩丙二醛(MDA)含量，己糖激酶活力，糖原含量测定：同样的切取一定量的肝脏组织加入试剂盒提供的裂解液，用组织匀浆器裂解，后续步骤均按照试剂盒说明书进行，相关结果均用蛋白浓度校准(蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo)。

2.2实验结果

①空腹血糖变化情况

小鼠空腹血糖变化情况如图4所示。结果显示，在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠体内，按体重50mg/kg、100mg/kg的给药量，化合物DB-1和化合物DB-1-3经口给药20天、30天、40天、48天后，给药组动物空腹血糖均出现显著性降低，且化合物DB-1和化合物DB-1-3的降糖效果与100mg/kg剂量的小檗碱以及5mg/kg的罗格列酮相当。

②口服葡萄糖耐量实验(OGTT)结果

OGTT曲线如图5所示，OGTT曲线下面积如图6所示。结果显示，在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠体内，经口给药30天后，给药量为50mg/kg、100mg/kg的化合物DB-1给药组以及给药量为100mg/kg的化合物DB-1-3给药组口服葡萄糖耐量具有不同程度的改善，100mg/kg的DB-1给药组以及100mg/kg的DB-1-3给药组改善口服葡萄糖耐量的程度与100mg/kg的小檗碱或5mg/kg的罗格列酮相当。

③胰岛素耐量实验(ITT)结果

ITT曲线如图7所示，ITT曲线下面积如图8所示。结果显示，在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠体内，经口给予35天后，给药量为50mg/kg、100mg/kg的化合物DB-1、化合物DB-1-3给药组的胰岛素耐量均有不同程度的改善。给药量为100mg/kg的DB-1给药组以及DB-1-3给药组改善胰岛素耐量的程度与给药量为100mg/kg的小檗碱或给药量为5mg/kg的罗格列酮相当。

④尿液指标测定结果

给药前后，各组动物24小时尿量、尿液葡萄糖浓度、尿微量白蛋白产生量以及尿总蛋白产生量变化情况如图9至图12所示。从图中可以看出，在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病动物模型中，给药前，各组动物24小时尿量、尿液葡萄糖浓度、尿微量白蛋白产生量以及尿总蛋白产生量与C57BL/6J小鼠比较具有极显著的升高，KK/upj-Ay/J小鼠各组之间没有统计学差异；给药后，模型组较给药前具有不同程度的升高，与正常对照组相比有极显著差异，而各给药组较模型组均有不同程度的降低，且有统计学差异。结果表明，给药量为50mg/kg以及100mg/kg的化合物DB-1、化合物DB-1-3均能抑制KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠糖尿病肾病的发展恶化，效果与给药量为100mg/kg的小檗碱以及给药量为5mg/kg的罗格列酮相当。结果预示着化合物DB-1和DB-1-3有望制备用于治疗糖尿病肾病。

⑤血清生化指标测定结果

给药50天后，各组动物血清生化指标如图13至17所示。从图中可以看出，在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠动物模型中，给药50天后，模型组与正常对照组相比，ALT、AST、CHO、TG、LDL-c均有升高，有极显著差异。而各给药组与模型组相比，给药量为100mg/kg的化合物DB-1-3和给药量为100mg/kg的BBR均能降低血清ALT，有统计学差异，而给药量为5mg/kg的罗格列酮导致血清ALT有统计学差异的升高，考虑是罗格列酮副作用所致；给药量为100mg/kg的化合物DB-1-3还能显著降低血清AST；给药量为100mg/kg的化合物DB-1能够显著降低血清CHO和LDL-c；给药量为100mg/kg的化合物DB-1，50mg/kg的化合物DB-1-3，100mg/kg的化合物DB-1-3，100mg/kg的BBR，5mg/kg的罗格列酮均能显著降低血清TG。

⑥血清胰岛素含量测定结果

给药50天后，各组动物血清胰岛素含量情况如图18所示。从图中可以看出，在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠动物模型中，给药50天后，模型组动物与正常组动物相比胰岛素含量显著升高，有极显著统计学差异，各给药组与模型组相比均有不同程度的降低，有显著统计学差异。这说明，化合物DB-1和化合物DB-1-3能够改善动物体内高胰岛素状态，增加体内胰岛素的敏感性，有望制备用于胰岛素增敏剂。

⑦血清AGEs测定结果

给药50天后，各组动物血清中晚期糖基化终末产物含量情况如图19所示。在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠动物模型中，给药50天后，取血测定血清中晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)。AGEs是一组在蛋白质、脂肪酸或核酸的氨基基团与还原糖的醛基之间发生非酶糖基化反应所形成的一系列具有高度活性终产物的总称，AGEs在体内的积聚将会引发如糖尿病肾病等各种并发症。结果表明，模型组动物血清AGEs含量显著高于正常组动物，有极显著统计学差异，各给药组动物血清AGEs含量与模型组比均有不同程度的降低，有显著统计学差异。这说明，化合物DB-1和化合物DB-1-3均能够显著降低血清AGEs含量，从而达到预防如糖尿病肾病等糖尿病并发症。

⑧脏器系数测定结果

在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠动物模型中，给药50天后，取动物肝脏，肾脏，胰腺，附睾脂肪，肾周脂肪称重。各脏器重量与动物体重的比值即为各脏器系数。

给药50天后，各组动物的肝脏系数情况如图20所示。结果表明，各组动物的肝脏系数均有明显的变化，模型组与对照组相比肝脏系数显著增高，有极显著统计学差异，化合物DB-1、化合物DB-1-3以及BBR均能显著降低肝脏系数，改善肝脏功能。而给予罗格列酮后，肝脏系数却有统计学差异的升高，我们推测这是罗格列酮产生的副作用导致。

⑨肝脏组织甘油三酯和总胆固醇含量测定结果

给药50天后，肝脏组织甘油三酯含量，总胆固醇含量的柱状图如图21和图22所示。结果表明，模型组动物肝脏甘油三酯含量和总胆固醇含量相比正常对照组有显著升高，有极显著统计学差异，给药量为100mg/kg的化合物DB-1给药组，给药量为50mg/kg以及100mg/kg的化合物DB-1-3的给药组，给药量为100mg/kg的BBR对照组能不同程度的降低肝脏甘油三脂含量，而给药量为5mg/kg的罗格列酮对照组，肝脏甘油三酯含量反而有统计学差异的升高，推测是由罗格列酮产生的副作用导致。给予50mg/kg以及100mg/kg的化合物DB-1和DB-1-3，100mg/kg的BBR以及5mg/kg的罗格列酮均能不同程度降低肝脏总胆固醇含量。

⑩肝脏组织AGEs含量、SOD活力、MDA含量测定结果

肝脏中AGEs含量的升高将会导致肝脏损伤，肝脏中SOD活力和MDA含量反应了肝脏氧化应激水平。

给药50天后，肝脏组织AGEs含量，SOD活力，MDA含量的柱状图如图23至图25所示。肝脏组织中AGEs含量的测定结果表明，模型组动物相比正常对照组动物，肝脏AGEs含量有显著升高，有极显著统计学差异，化合物DB-1、DB-1-3和BBR均能不同程度的降低肝脏AGEs含量，而罗格列酮并不能降低肝脏AGEs含量，这表明化合物DB-1和DB-1-3相比罗格列酮具有优越性。肝脏SOD活力以及MDA含量的测定结果表明，模型组动物相比正常对照组动物，SOD活力显著降低，MDA含量显著升高，而各给药组动物肝脏SOD活力均有不同程度的升高，MDA含量均与不同程度的降低，表明化合物DB-1和DB-1-3能够改善肝脏氧化应激水平。

在结果①②③④中，本发明涉及的化合物DB-1和DB-1-3在降低KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠空腹血糖，改善口服葡萄糖耐量，改善胰岛素耐量以及改善小鼠尿液相关指标方面表现出良好效果，100mg/kg的DB-1以及DB-1-3与100mg/kg的BBR以及5mg/kg的罗格列酮效果相当，表明了本发明的两个化合物可用于治疗2型糖尿病以及预防糖尿病肾病。

在结果⑤⑧⑨⑩中，5mg/kg的罗格列酮表现出了一定的副作用，如显著增加了血清ALT含量，显著增加了肝脏系数，显著增加了肝脏组织的甘油三酯含量，而且不能降低肝脏AGEs含量，而本发明涉及的化合物DB-1以及DB-1-3并不会增加血清ALT含量，并且降低了肝脏系数，降低肝脏甘油三脂含量，同时能够降低肝脏AGEs含量，这些结果表明了本发明涉及的化合物DB-1,DB-1-3在制备用于治疗2型糖尿病，制备作为胰岛素增敏剂以及制备用于预防糖尿病肾病方面的优越性。

Claims (9)

1.式I所示化合物或其可药用盐在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途，或

在制备用于预防和/或治疗糖尿病并发症的药物中的用途，或

在制备作为胰岛素增敏剂的药物中的用途，

其中，

R₁代表苯基，所述苯基任选地被R₄单取代或多取代，R₄选自：C_1-4烷基和卤代C_1-4烷基；

R₂代表-(CH₂)_nR₃；其中，

n＝0、1、2、3或4；

R₃为氢，

所述的糖尿病为2型糖尿病，

所述的糖尿病并发症为糖尿病肾病。

2.一种药物组合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途，或

在制备用于预防或治疗糖尿病并发症的药物中的用途，或

在制备作为胰岛素增敏剂的药物中的用途，

其中所述药物组合物含有式I所示化合物或其可药用盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂，

其中，

R₁代表苯基，所述苯基任选地被R₄单取代或多取代，R₄选自：C_1-4烷基和卤代C_1-4烷基；

R₂代表-(CH₂)_nR₃；其中，

n＝0、1、2、3或4；

R₃为氢，

所述的糖尿病为2型糖尿病，

所述的糖尿病并发症为糖尿病肾病。

3.权利要求1或2所述的用途，其中，R₄选自卤代甲基、卤代乙基、卤代丙基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。

4.权利要求3所述的用途，其中R₄选自三氟甲基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。

5.权利要求4所述的用途，其中R₄为三氟甲基。

6.权利要求1或2所述的用途，其中，R₂代表-(CH₂)_nR₃，其中，n＝1、2或3；R₃为氢。

7.权利要求1或2所述的用途，其中，R₂代表甲基、乙基、正丙基或正丁基。

8.权利要求1或2所述的用途，其中，R₂代表甲基、乙基或正丙基。

9.权利要求1或2所述的用途，其中，所述的式I所示化合物选自：

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