CN106857406A - 一种通过饮食诱导sd大鼠糖尿病动物模型的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明主要应用于以SD大鼠为研究对象的医学研究，通过高脂高糖饲料模拟人类糖尿病发病特点，提供一种建造单纯高脂高糖饮食诱导糖尿病动物模型的方法。主要研究方法：40只SPF级健康SD大鼠，分为普通饲料对照组（C）、高脂高糖饲料造模组(CH)，20只/组，雌雄各半。普通饲料供能比：63.02%糖水化合物，24.93%蛋白质，12.05%脂肪；高脂高糖饲料功能比：66.14%碳水化合物，10.33%蛋白质，23.53%脂肪。本发明采取长期高脂高糖饲料喂养大鼠诱导单纯高脂高糖饮食糖尿病动物模型的建造，该方法可以更好的模拟人群Ⅱ型糖尿病发病发展特征，与化学性糖尿病造模相比，更具有科学意义。

Description

一种通过饮食诱导SD大鼠糖尿病动物模型的建立方法

技术领域

本发明属于医学领域，尤其涉及一种通过饮食诱导SD大鼠糖尿病动物模型的建立方法。

背景技术

由于不同动物之间存在种属差异，鼠类需要成本较低，操作方便易行，糖尿病动物模型中常选鼠类做为造模对象。我国患者有90%属于Ⅱ型糖尿病，针对Ⅱ型糖尿病动物模型的构造，大多选择啮齿类动物。哺乳动物中灵长类、小型猪等种属与人类较接近，但因研究造价高，操作不易，故较少研究。当前应用广泛的糖尿病动物模型主要分为：实验性糖尿病动物模型、自发性糖尿病动物模型、转基因和基因提出糖尿病动物模型。实验性糖尿病动物模型中最为常见的是链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）诱导的糖尿病动物模型。关于造模过程中STZ的用量并不统一，为了更好的提高造模成功率和降低STZ引起的毒性作用，需要相对精确地控制STZ的注射剂量。对于STZ的剂量考量和造模稳定性困难较大。注射化学药物的剂量较大易造成小鼠死亡，故多选大鼠。有报道称SD大鼠糖尿病造模成功率高于Wistar鼠（P＞0.05），且Wistar鼠造模过程中会出现自发缓解现象，综上，本发明研究对象选择为SD大鼠。

自发性糖尿病动物模型主要是指实验动物未经过任何人工处置，由于基因突变或者在自然条件下发生的异常表现通过遗传育种保留下来的动物模型。常选择ob/ob小鼠、db/db小鼠、GK大鼠和CD大鼠等。转基因和基因剔除糖尿病动物模型表现为外周胰岛素抵抗和β细胞分泌胰岛素功能受损。

本发明主要是以SD大鼠为研究对象，模拟2型糖尿病人群不良饮食习惯（长期高脂高糖饮食的饮食习惯）所致的Ⅱ型糖尿病动物模型，开发出更接近人类Ⅱ型糖尿病的动物模型对推动糖尿病的机制研究和药物研发具有重要意义。目前人群研究发现糖尿病人群年龄年轻化，本发明试验中大鼠开始造模周龄换算为人类大约在20岁左右，建模成功时间换算约为人类35岁左右，这一特点较为符合糖尿病发病人群特征。

SD大鼠单纯高脂高糖饲料诱导Ⅱ型糖尿病动物模型在国内未见报道。

发明内容

本发明以SD大鼠为实验动物，模拟2型糖尿病人群长期高脂高糖的不良饮食习惯，提供一种长期高脂高糖饲料喂养诱导单纯高脂高糖饮食Ⅱ型糖尿病动物模型的方法，旨在解决目前各种化学物造模给动物带来的副作用大，稳定性差的问题。

本发明通过饮食诱导SD大鼠糖尿病动物模型的建立方法，具体方法如下述：

实验动物用SPF级SD大鼠，体重150g±10g，20只/组，雌雄各半；随机分为普通饲料对照组 C、高脂高糖饲料造模组 CH；普通组饲料：63.02%碳水化合物，24.93%蛋白质，12.05%脂肪；高脂高糖组饲料：66.14%碳水化合物，10.33%蛋白质，23.53%脂肪；

实验监测周期为180天，每日按照大鼠体重的10%给予饲料，分组后均进行普通饲料适应性喂养1周，然后对照组给予普通饲料，造模组给予高脂高糖饲料；

180天试验期间，每周观察大鼠一般活动状况及体重变化，每10天监测摄食和饮水情况，每30天监测体重一次，分别于0周、4周禁食12小时后尾静脉取血监测空腹血糖水平变化，自第8周开始，每周监测一次空腹血糖，并于第90天 OGTT监测糖耐量水平；

分别在90天和180天后，每组随机选取10只大鼠处死，全自动生化分析仪监测大鼠血糖、血脂水平，ELISA检测胰岛素水平，取适量胰腺组织做HE染色观察胰腺病理改变。

本发明采取长期高脂高糖饲料喂养大鼠诱导单纯高脂高糖饮食Ⅱ型糖尿病动物模型的建造，该方法可以更好的模拟人群Ⅱ型糖尿病发病发展特征，与化学性糖尿病造模相比，更具有科学意义。

具体实施方式

为了让本发明的目的、技术方案实施以及优势更加清楚具体，一下结合发明实验，对本发明进行进一步详细说明。应该指出，以下描述内容仅仅是针对本发明进行阐述，并不用于限定本发明。

本发明采取长期高脂高糖饲料喂养SD大鼠诱导单纯高脂高糖Ⅱ型糖尿病动物模型的建造，该方法可以更好地模拟人群Ⅱ型糖尿病发病发展特征，与化学性糖尿病造模相比，更具有科学意义。

本发明中，实验动物选择SPF级SD大鼠，20只雌鼠，20只雄鼠，体重均为（150±10）g，由第三军医大学医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（渝）2012-0005。实验开始实施之前各组大鼠血糖、体重均无差异（p＞0.05），血糖≤5mmol/L。所有大鼠均饲养于聚丙烯鼠笼，雌雄分笼，5只/笼。动物房条件：温度：20-25℃，湿度：55%-65%，光照周期：12h。

本发明实验中，试验周期为180天，每日按照10g/100g.BW的摄食量给予饲料。分组后大鼠普通饲料适应性喂养1周后，对照组给予普通饲料，造模组给予高脂高糖饲料。饲料均由第三军医大学医学实验动物中心提供，普通饲料功能比：63.02%碳水化合物，24.93%蛋白质，12.05%脂肪；高脂高糖饲料供能比：66.14%碳水化合物，10.33%蛋白质，23.53%脂肪。

本发明试验中，各组大鼠均饮用去离子水，自由饮水。动物垫料4天更换一次。动物福利均符合“the National Institutes of Health Guide for the Care and Use ofLaboratory Animal”要求，所有实验方案都经过中心动物福利和使用委员会的审查和同意。

AU5800全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司），TD4X离心机（重庆松朗仪器有限公司），Aligent 1100高效液相色谱仪（美国Aligent公司），DM4000B显微镜观察（德国Leica Microsystems GmbH公司）。

本发明试验中，诱导单纯高脂高糖饮食Ⅱ型糖尿病大鼠模型详述如下：

（1） 体重变化

在试验期间，每30天监测体重变化。

（2）空腹血糖水平和胰岛素水平

在试验期间，分别于0周、4周、8周禁食12小时后尾静脉取血监测空腹血糖水平变化，自第8周开始，每周监测一次空腹血糖；第90天、180天监测胰岛素水平。

本发明试验中空腹血糖的检测均采用血糖仪进行检测，胰岛素水平检测均用大鼠胰岛素ELISA试剂盒分析。

a.提前准备好监测所需仪器和试剂，如酶标仪、移液枪、ddH₂O、和EP管等。

b.血清制备：室温血液自然凝固4h，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。吸取上清。

c.操作步骤：与大鼠胰岛素ELISA试剂盒步骤一致。

d.计算方法：取标准品OD值除空白孔OD值外作七点图，以标准品的浓度为纵坐标(对数坐标)，OD值为横坐标(对数坐标)用curve expert1 .3绘制标准曲线；以标准品的浓度与OD值计算标准曲线的回归方程，将样品OD值代入方程式，计算样品浓度，再乘以稀释倍数得样品实际浓度。

（3）口服葡萄糖耐量试验(oral glueose tolerance test，OGTT)

本发明实验于90天 大鼠禁食12h后。按2 mg/kg剂量灌胃,给予50%葡萄糖溶液，分别于葡萄糖负荷后0 min,15 min，30 min，45 min,60 min，120 min采血用血糖分析仪测定0min，15 min，30 min，60 min ，120 min血液样本中的葡萄糖水平，绘制OGTT曲线。

（4）各组大鼠胰腺组织病理改变

本发明试验中通过HE染色后镜下观察胰腺组织的形态学变化。

a.大鼠麻醉后，开腹取新鲜胰腺组织，称取胰腺湿重，计算胰腺系数=胰腺重量(g)/体重(g)×100%。取适量胰腺组织于10%多聚甲醛溶液中固定。

b.将固定好的胰腺组织制成5μm 厚的石蜡切片，连续切片，乙醇梯度脱水，苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察胰腺组织病理变化。

本发明试验中，判断Ⅱ型糖尿病动物模型建造成功的标准：

长期以来，实验性啮齿类大、小鼠1 型糖尿病动物模型血糖值的确立标准各文献报道不一，近年来通过国内外学者的深入研究，已基本倾向于认定空腹或非空腹血糖值>11.1mmol L 或>16.7 mmol L , 还要伴有胰岛素抵抗等Ⅱ 型糖尿病特征, 通过灌胃葡萄糖耐量试验, 依据空腹和葡萄糖负荷后结果来判断。

目前, 多数参照人类Ⅱ 型糖尿病血糖诊断水平，作为实验性啮齿类大、小鼠1型糖尿病动物模型成模标准。

数据录入SPSS18.0进行统计分析，结果描述以均数±标准差表示，统计方法选择两独立样本T检验，检验水准α=0.05,P＜0.05表示差异有统计学意义。

（6）结果分析

本发明实验结果为：（1）一般情况：实验过程中C组大鼠精神状态，饮水摄食正常，活动灵敏，皮毛洁白，垫料5天更换一次；CH组饮水摄食变化不明显，自12周后，行动稍显迟缓，皮毛逐渐泛黄，失去光泽。垫料易潮湿，平均3天更换一次。

（2）体重：在30、60、90、120、150、180天体重均无统计学差异，但表现出随着时间的推移CH组体重均大于C组的趋势，且差值逐渐增大。

（3）空腹血糖水平：在第0周、4周、8周空腹血糖水平无统计学差异；从第10周开始，CH组血糖值均大于C组（P＜0.05）；从15周开始C组血糖水平（6.17±0.48 mmol/L）正常，CH组血糖水平（10.24±0.90 mmol/L）上升，CH组17周血糖水平（11.19±1.04 mmol/L）,18周CH组血糖水平（12.46±0.64 mmol/L），之后一直维持较高水平。从17周开始，结合下述OGTT实验结果，可以认为糖尿病动物模型造模成功。

（4）胰岛素水平：90天时，CH组血清胰岛素水平（18.51±0.79 mU/L）低于C组（19.02±0.91 mU/L），但差异无统计学意义（P＞0.05）；180天胰岛素水平CH组（15.85±0.57 mU/L）低于C组（19.26±0.75 mU/L），差异有统计学意义（P＜0.05）；

（5）OGTT：糖耐量异常。

(6)胰腺病理改变：90天，C组中胰腺组织细胞胞质紧密，排列整齐，未见细胞水肿、坏死等病变；CH组胰腺组织细胞胞质疏松，出现不同程度的细胞水肿、坏死，胰腺细胞出现淋巴细胞浸润，少数胰岛体积变小。180天，C组中胰腺组织细胞胞质紧密，排列整齐，少量细胞可见水肿现象，均无坏死、炎症细胞浸润；CH组胰腺细胞大面积肿胀、坏死，炎症细胞浸润明显，胰岛体积变小。

本发明实验对象选择SD大鼠，种属纯正，是动物实验中最为常见的大鼠类别，该动物模型可向外界提供一定的参考。实验时间为长期（180天）啮齿动物单纯高脂高糖饮食诱导的Ⅱ型糖尿病模型，与人群糖尿病的发生、发展较为接近。且实验动物糖尿病相关症状和机体内环境改变也与人类相似，动物模型稳定性较好，更有助于糖尿病机制及药物治疗研究。本实验分别观察了90天、180天各指标的变化，实验结果也说明了动物模型的稳定性。针对本实验中高脂高糖饲料的配方，是经过预试验调整后的新配方，既符合糖尿病患病危险人群的膳食结构，也解决了由于配方不合理导致实验动物出现少食、厌食等状况出现。

应当指出，综上所述仅是本发明的优选实验方法，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种通过饮食诱导SD大鼠糖尿病动物模型的建立方法，其特征包括：

实验用SPF级SD大鼠，体重150g±10g，20只/组，雌雄各半；随机分为普通饲料对照组C、高脂高糖饲料造模组 CH；普通组饲料：63.02%碳水化合物，24.93%蛋白质，12.05%脂肪；高脂高糖组饲料：66.14%碳水化合物，10.33%蛋白质，23.53%脂肪；

实验监测周期为180天，每日按照大鼠体重的10%给予饲料，分组后均进行普通饲料适应性喂养1周，然后对照组给予普通饲料，造模组给予高脂高糖饲料；

180天试验期间，每周观察大鼠一般活动状况及体重变化，每10天监测摄食和饮水情况，每30天监测体重一次，分别于0周、4周禁食12小时后尾静脉取血监测空腹血糖水平变化，自第8周开始，每周监测一次空腹血糖，并于第90天 OGTT监测糖耐量水平；

分别在90天和180天后，每组随机选取10只大鼠处死，全自动生化分析仪监测大鼠血糖、血脂水平，ELISA检测胰岛素水平，取适量胰腺组织做HE染色观察胰腺病理改变。