CN106834235B - 抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株及其筛选方法和应用,属于鱼类疫病检测技术领域。本发明通过筛选得到抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株并运用于ELISA检测试剂盒的优化,通过筛选出试剂盒的最佳工作条件,对罗非鱼无乳链球菌血清抗体进行检测,灵敏度更高,并且可进行大批量的检测,本发明可应用于罗非鱼的疾病检测和免疫效果监测。本发明建立了良好的ELIS检测方法,对于将来研究鱼类免疫反应,病原防治,提供了重要的实验方法。
Description
技术领域
本发明属于鱼类疫病检测技术领域,具体涉及抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株及其筛选方法和应用。
背景技术
罗非鱼无乳链球菌病,是罗非鱼养殖中危害严重的疾病,发病时死亡率高损失大。目前对罗非鱼无乳链球菌病的诊断主要有常规的平板细菌分离培养,核酸检测,如PCR,巢式PCR,LAMP等。免疫学检测,主要有斑点ELISA法,免疫荧光法。有报道,鱼类在感染病原体后,也同样产生抗病原体的抗血清,主要为IgM型。为了检测和研究罗非鱼感染后血清抗体的变化,研究罗非鱼免疫后抗体的保护作用等,需要抗罗非鱼IgM抗体,在人类链球菌病有报道已运用抗体检测方法进行疾病的筛查。因此进行罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体的制备,为生产和研究提供抗体是十分必要的。同时,实行血清间接ELISA的优化,能为生产和实验室研究提供新的评价和检测技术。
发明内容
本发明提供抗罗非鱼IgM单克隆抗体的制备方法及应用,为生产和研究提供抗体,为生产和实验室研究提供新的评价和检测技术。
本发明采取的技术方案如下:
抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株的筛选方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)罗非鱼血清IgM的提取:将罗非鱼经3~5次免疫,收集全血,在室温自然析出血清,离心分离取上清液得到血清,将血清于-20~-30℃保存,使用时于3~5℃解冻,用PBS液稀释进行2倍稀释,进行血清IgM蛋白的分离,将稀释后的血清用饱和硫酸铵沉淀,离心,取沉淀,将沉淀用PBS溶解后,再用Protein-A柱层析纯化IgM蛋白,层析后浓缩;
(2)小鼠免疫:将纯化罗非鱼IgM蛋白和等量体积的佛氏完全佐剂进行乳化后,在小鼠皮下多点注射,完成小鼠的首次免疫;将纯化罗非鱼IgM蛋白和等量体积的佛氏不完全佐剂乳化,在小鼠皮下多点免疫,在小鼠首次免疫后每隔2周进行免疫一次;第三次免疫后一周,尾静脉采血测效价,效价达到1:10000以上,进行融合准备,融合前2~5天用罗非鱼IgM蛋白对小鼠直接腹腔和静脉进行加强免疫;所述小鼠为BALB/C小鼠;
(3)细胞融合及筛查:取加强免疫2~5天后的小鼠,断颈处死,无菌取出脾脏,分离脾细胞,将脾细胞与对数生长期的SP2/0细胞按4~6:1的个数比例混合,得到混合细胞,在35~40℃水浴预热,将混合细胞弹松散;加入已预热到35~40℃的细胞融合剂,在30~50秒内加完,静置1~2min后,加入预热到35~40℃的DMEM培养基,800~1000rpm离心10~15min;最后在含氨基喋呤(A)、次黄腺嘌呤(HT)、20%质量分数的胎牛血清和1.2%质量分数的的甲基纤维素半固体培养基中培养;7-10天后,融合的细胞生长成团,将细胞团吸出培养,培养液为DMEM细胞培养液,2~5天后半量换液,再过2~5天后换全液,并用常规培养基培养;当细胞生长到孔底一半时,开始筛查,阳性孔扩大培养,冻存和测试,经2~4次培养检查仍为阳性,获得抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株2C10和4G6。
优选的,所述步骤(3)中,脾细胞与对数生长期的SP2/0细胞按5:1的个数比例混合。
优选的,所述步骤(3)中,经3次克隆培养仍为阳性,获得抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株。
本发明筛查获得的抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株2C10和4G6已于2016年3月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,简称CCTCC),地址:湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内,保藏编号为CCTCC NO:C201644(2C10)和CCTCC NO:C201645(4G6)。
本发明还提供了抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株2C10和4G6在检测罗非鱼无乳链球菌血清抗体中的应用。
在具体的应用方面,本发明提供了一种检测罗非鱼无乳链球菌血清抗体的方法,包括如下步骤:
(1)单克隆抗体的制备:用佛氏不完全佐剂对BALB/C小鼠进行腹腔注射,0.2~0.5ml/只,一周后得到备用BALB/C小鼠;将获得的阳性抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株2C10和4G6培养到生长对数期,吹打下来,计数,分别接种备用BALB/C小鼠,每只备用BALB/C小鼠腹腔接种2×106~3×106个,10-15天即长出腹水,抽取腹水,12000~15000rpm离心5~10min,得到单克隆抗体,分装并于-20~-30℃保存;
(2)单克隆抗体的提纯和West-blot鉴定:用抗体亚型鉴定试剂盒鉴定所得单克隆抗体的亚型,然后用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法提纯并进行West-blot鉴定;
(3)提纯单克隆抗体的HRP酶标及效价的测定:将提纯的单克隆抗体,用HRP快速酶标试剂盒进行标记后,得到酶标二抗2C10和酶标二抗4G6,用ELISA法测定效价;
(4)间接ELISA的优化:新培养的罗非鱼无乳链球菌经灭活后,采用干燥包被法进行包被,在ELISA试剂盒加入效价高的酶标二抗2C10进行反应,得到ELISA试剂盒的最佳工作条件为:包被菌液浓度为1.5×108CFP,血清稀释度为1:8稀释,酶标二抗2C10最佳工作稀释度为1:1000;
(5)罗非鱼血清抗体的检测:将罗非鱼适应性饲养3~5天,进行免疫,每尾腹腔接种灭活无乳链球菌1.5×107~1.5×108CFU后,每15天接种一次,共接种3次,每次接种进行尾部采血,分离血清,用步骤(4)所得试剂盒的最佳工作条件进行罗非鱼抗体检测,同时设对照组,只注射生理盐水。
优选的,步骤(1)中,每只备用BALB/C小鼠腹腔接种细胞2×106个。
优选的,步骤(1)中,用佛氏不完全佐剂对BALB/C小鼠进行腹腔注射,0.3ml/只。
优选的,步骤(5)中,将罗非鱼适应性饲养3天,进行免疫,每尾腹腔接种灭活无乳链球菌1.5×108CFU。
有益效果:本发明通过筛选得到抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株并运用于ELISA检测试剂盒的优化,通过筛选出试剂盒的最佳工作条件,对罗非鱼无乳链球菌血清抗体进行检测,灵敏度更高,并且可进行大批量的检测,本发明可应用于罗非鱼的疾病检测和免疫效果监测。本发明建立了良好的ELIS检测方法,对于将来研究鱼类免疫反应,病原防治,提供了重要的实验方法。
生物材料保藏信息说明
分类命名:杂交瘤细胞,于2016年3月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenter for Type Culture Collection,简称CCTCC),地址:湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内,保藏编号为CCTCC NO:C201644(2C10)和CCTCC NO:C201645(4G6)。
附图说明
图1为罗非鱼血清和提纯后IgM电泳图(图中标记:1-Maker;2-罗非鱼血清;3、4-提纯后的IgM);
图2为单抗2C10的West-blot(图中标记:1-变性罗非鱼IgM的SDS-PAGE;2、3-非变性罗非鱼IgM的SDS-PAGE;4-变性IgM的West-blot;5、6-非变性的IgM的Westb-lot);
图3为单抗4G6的West-blot(图中标记:1-变性罗非鱼IgM的SDS-PAGE;2-非变性罗非鱼IgM的SDS-PAGE;3-非变性IgM的West-blot;4-变性的IgM的Westb-lot);
图4为罗非鱼血清抗体的变化图(图中标记:a-免疫后的罗非鱼抗体变化;b-未免疫的罗非鱼抗体变化)。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
保藏号为CCTCC NO:C201644的抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株2C10和保藏号为CCTCC NO:C201645的抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株4G6的筛选方法,包括如下步骤:
(1)罗非鱼血清IgM的提取:将50~100克的罗非鱼(尼罗罗非鱼或吉富罗非鱼)经3次免疫,收集全血,在室温自然析出血清,用6000rpm离心10min,离心分离取上清液得到血清,将血清于-20℃保存,使用时于4℃解冻,用PBS液稀释进行2倍稀释,进行血清IgM蛋白的分离,将稀释后的血清用饱和硫酸铵沉淀,离心,取沉淀,将沉淀用PBS溶解后,再用Protein-A柱层析纯化IgM蛋白,层析后蛋白浓缩到1mg/mL,用SDS-PAGE检测蛋白纯度。
罗非鱼血清经饱和硫酸铵分级提纯后,再通过Protein A柱层析,浓缩后,一共制备得8mg蛋白。经SDS-PAGE电泳,结果见图1,IgM蛋白重链处于45-66KD之间;轻链处于20-35KD之间,经过提取,得到的蛋白纯度高。
(2)小鼠免疫:购回BALB/C小鼠(广西医科大学动物实验室),4周龄,将50μg纯化罗非鱼IgM蛋白和等量体积的佛氏完全佐剂进行乳化后,在小鼠皮下多点注射,完成小鼠的首次免疫;将50μg纯化罗非鱼IgM蛋白和不完全佐剂乳化,在小鼠皮下多点免疫,在小鼠首次免疫后每隔2周进行免疫一次;第三次免疫后一周,尾静脉采血测效价,小鼠血清效价达到1:10000以上,进行融合准备,融合前3天用罗非鱼IgM蛋白120μg对小鼠直接腹腔和静脉进行加强免疫。
(3)细胞融合及筛查:取加强免疫3天后的小鼠,断颈处死,无菌取出脾脏,分离脾细胞,将脾细胞与对数生长期的SP2/0细胞按5:1比例混合,得到混合细胞,在37℃水浴预热,将混合细胞弹松散;加入已预热到37℃的细胞融合剂1.5ml,逐滴加入,在40秒内加完,静置1min后,逐滴加入预热到37℃的DMEM培养基,1000rpm离心10min;最后在含氨基喋呤(A),次黄腺嘌呤、20%胎牛血清和1.2%的甲基纤维素半固体培养基中培养;7-10天后,融合的细胞生长成团,在体视解剖镜下,逐个细胞团吸出到96孔板中培养,培养液为DMEM细胞培养液(Gibico公司生产),3天后半量换液,再过3天后换全液,并用常规培养基培养;当细胞生长到孔底一半时,开始筛查,阳性孔扩大培养,冻存和测试,经3次克隆培养检查仍为阳性,则获得抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株。
经过筛查,得到2株稳定的分泌抗体的细胞,分别为2C10和4G6,细胞培养上清效价分别达到1:100000和1:24000;经亚型鉴定,均为IgG1型。
一种检测罗非鱼无乳链球菌血清抗体的方法,包括如下步骤:
(1)单克隆抗体的制备:预先用佛氏不完全佐剂处理的BALB/C小鼠,0.3ml/只,腹腔注射一周;将获得的阳性抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞2C10和4G6培养到生长对数期,吹打下来,计数,分别接种三只BALB/C小鼠,每只BALB/C小鼠腹腔接种细胞2×106,10-15天即长出腹水,抽取腹水后,继续饲养小鼠,一共抽取3次,每株收集约10ml,于12000rpm离心10min,得到单克隆抗体,分装并于-20℃保存。
(2)单克隆抗体的提纯和West-blot鉴定:用抗体亚型鉴定试剂盒鉴定所得单克隆抗体的亚型,然后用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法提纯并进行West-blot鉴定。
单克隆抗体的亚型的鉴定:参照试剂盒说明书(单克隆抗体亚型鉴定试剂盒,Siga公司生产):
提取的罗非鱼IgM蛋白包板,加入细胞株的培养上清液100ul;置于37℃1小时后用PBST洗涤3次;加入单克隆抗体亚型血清,室温30min后用PBST洗涤3次;加入酶标兔抗羊抗体,室温30min后用PBST洗涤3次,加入底物缓冲液,室温15min,最后加入2N硫酸,用450nm波长读数。
收集的腹水即单克隆壳体经辛酸-饱和硫酸铵进行提纯,单克隆抗体提纯后浓度为2.9mg/ml(2C10株),2.5mg/ml(4G6株),效价分别为1:640000和1:100000以上。
West-blot鉴定:配5%分离胶和12%的浓缩胶,上样电泳。先用80V电泳30min,然后用120V电泳1h;电泳结束后,用半干转膜仪转膜,转30min;用预染液染色;加入5%奶粉,封闭1h;然后用PBST洗3次,每次5min;加入单抗(2C10和4G6),室温反应1h;然后用PBST洗3次,每次5min;加入酶标羊抗鼠二抗,室温反应1h;然后用PBST洗3次,每次5min;加入DAB显色液,显色。
经West-blot,2C10和4G6株与重链反应,与完整的免疫球蛋白也有反应。由图2和图3可知,制备的单克隆抗体能够与罗非鱼的IgM蛋白反应。
(3)提纯单克隆抗体的HRP酶标及效价的测定:将提纯的单克隆抗体,用HRP快速酶标试剂盒(湖洲英创生物科技有限公司),参照说明书的方法进行标记后,得到酶标二抗,用ELISA法测定效价;
经鉴定后用效价最高的2C10进行酶标。按试剂说明,酶标提纯后,测定效价为1:24000。
(4)间接ELISA的优化:新培养的罗非鱼无乳链球菌经灭活后,分别采用不同的包被方法进行包被,包括5%戌二醛包被法、干燥包被法和碳酸盐包被法,在包被好的板中加入无乳链球菌免疫的罗非鱼阳性血清和阴性血清,37℃孵育1h,PBST洗涤3次,每次5min;加入酶标二抗,在37℃孵育1h,PBST洗涤3次,每次5min;加入TMB底物显色液,37℃15min,最后加入2N硫酸,每孔50μL,终止反应,在酶标仪上用450nm波长读数,记录OD值,确定哪种方法最稳定后,采用棋盘法对抗罗非鱼无乳链球菌阳性血清和阴性血清稀释倍数、酶标二抗的稀释倍数和包被细菌数进行优化,得出ELISA试剂盒的最佳工作条件。
5%戌二醛包被法的具体步骤如下:将灭活的罗非鱼无乳链球菌用5%戌二醛调整浓度到1.5×108,加入ELISA板中,每孔100μL,37℃2h后,于4℃放置12h,然后用PBST洗涤3次,每次5分钟,再用5%脱酯奶粉封闭37℃2h或4℃12h,然后用PBST洗涤3次,拍干放4℃备用。
干燥包被法的具体步骤如下:用PBS把罗非鱼无乳链球菌悬液调到1.5×108,放到50℃烘箱中12h干燥后加入-20℃冰冻的甲醇,每孔50μL,15min后用蒸馏水洗涤3次,每次5min,最后用5%奶粉封闭37℃2h或4℃12h。用PBST洗3次,每次5min,放4℃备用。
碳酸盐包被法的具体步骤如下:将灭活的细菌用pH=9.6碳酸盐溶液调整浓度到1.5×108,加入ELISA板中,每孔100μL,37℃2h后,于4℃放置12h,然后用PBST洗涤3次,每次5分钟,再用5%脱酯奶粉封闭37℃2h或4℃12h,然后用PBST洗涤3次,拍干放4℃备用。
经过预试验,最后选择干燥包被法。经试验后,由表1数据可知,得到最佳工作条件为,包被菌液浓度为1.5×108CFP,血清稀释度为1:8稀释,酶标二抗2C10最佳工作稀释度为1:1000,阴阳对照成立的前提下,OD P(阳)/N(阴)≥2即为阳性。
表1为不同的无乳链球菌浓度包板的反应结果。
表1
(5)罗非鱼血清抗体的检测:从鱼种场购进吉富罗非鱼,3月龄大,适应性饲养3天,进行免疫,每尾腹腔接种灭活无乳链球菌1.5×108CFU后,每15天接种一次,共接种3次,每次接种进行尾部采血,分离血清,用步骤(4)所得ELISA试剂盒的最佳工作条件进行罗非鱼抗体检测,同时设对照组,只注射生理盐水。
罗非鱼免疫后血清抗体的变化:如图4所示,罗非鱼进行免疫后,罗非鱼血清中抗无乳链球菌抗体升高,而没有免疫的,抗体变化不大,说明罗非鱼对免疫产生应答,用本方法的ELISA试剂盒可以检测得到。
鱼类与哺乳动物一样,对外来病原体能产生体液免疫,与哺乳动物不同的是鱼类主要的免疫球蛋白是IgM。本发明经过提取、纯化制备出罗非鱼IgM球蛋白,并用于免疫小鼠,经筛查得2株稳定的抗罗非鱼IgM的单克隆抗体。罗非鱼在我国鱼类养殖中占有重要的地位,而无乳链球菌病是主要危害养殖的病原。经过优化,建立了良好的ELIS检测方法,对于将来研究鱼类免疫反应,病原防治,提供了重要的实验方法。
Claims (1)
1.一种生产抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株,其特征在于:所述细胞株为细胞株2C10,保藏号为CCTCC NO:C201644。
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2016
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