CN106834235B - 抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株及其筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株及其筛选方法和应用，属于鱼类疫病检测技术领域。本发明通过筛选得到抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株并运用于ELISA检测试剂盒的优化，通过筛选出试剂盒的最佳工作条件，对罗非鱼无乳链球菌血清抗体进行检测，灵敏度更高，并且可进行大批量的检测，本发明可应用于罗非鱼的疾病检测和免疫效果监测。本发明建立了良好的ELIS检测方法，对于将来研究鱼类免疫反应，病原防治，提供了重要的实验方法。

Description

抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株及其筛选方法和应用
技术领域
本发明属于鱼类疫病检测技术领域，具体涉及抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株及其筛选方法和应用。
背景技术
罗非鱼无乳链球菌病，是罗非鱼养殖中危害严重的疾病，发病时死亡率高损失大。目前对罗非鱼无乳链球菌病的诊断主要有常规的平板细菌分离培养，核酸检测，如PCR，巢式PCR，LAMP等。免疫学检测，主要有斑点ELISA法，免疫荧光法。有报道，鱼类在感染病原体后，也同样产生抗病原体的抗血清，主要为IgM型。为了检测和研究罗非鱼感染后血清抗体的变化，研究罗非鱼免疫后抗体的保护作用等，需要抗罗非鱼IgM抗体，在人类链球菌病有报道已运用抗体检测方法进行疾病的筛查。因此进行罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体的制备,为生产和研究提供抗体是十分必要的。同时，实行血清间接ELISA的优化，能为生产和实验室研究提供新的评价和检测技术。
发明内容
本发明提供抗罗非鱼IgM单克隆抗体的制备方法及应用，为生产和研究提供抗体，为生产和实验室研究提供新的评价和检测技术。
本发明采取的技术方案如下：
抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)罗非鱼血清IgM的提取：将罗非鱼经3～5次免疫，收集全血，在室温自然析出血清，离心分离取上清液得到血清，将血清于－20～－30℃保存，使用时于3～5℃解冻，用PBS液稀释进行2倍稀释，进行血清IgM蛋白的分离，将稀释后的血清用饱和硫酸铵沉淀，离心，取沉淀，将沉淀用PBS溶解后，再用Protein-A柱层析纯化IgM蛋白，层析后浓缩；
(2)小鼠免疫：将纯化罗非鱼IgM蛋白和等量体积的佛氏完全佐剂进行乳化后，在小鼠皮下多点注射，完成小鼠的首次免疫；将纯化罗非鱼IgM蛋白和等量体积的佛氏不完全佐剂乳化，在小鼠皮下多点免疫，在小鼠首次免疫后每隔2周进行免疫一次；第三次免疫后一周，尾静脉采血测效价，效价达到1：10000以上，进行融合准备，融合前2～5天用罗非鱼IgM蛋白对小鼠直接腹腔和静脉进行加强免疫；所述小鼠为BALB/C小鼠；
(3)细胞融合及筛查：取加强免疫2～5天后的小鼠，断颈处死，无菌取出脾脏，分离脾细胞，将脾细胞与对数生长期的SP2/0细胞按4～6：1的个数比例混合，得到混合细胞，在35～40℃水浴预热，将混合细胞弹松散；加入已预热到35～40℃的细胞融合剂，在30～50秒内加完，静置1～2min后，加入预热到35～40℃的DMEM培养基，800～1000rpm离心10～15min；最后在含氨基喋呤(A)、次黄腺嘌呤(HT)、20％质量分数的胎牛血清和1.2％质量分数的的甲基纤维素半固体培养基中培养；7－10天后，融合的细胞生长成团，将细胞团吸出培养，培养液为DMEM细胞培养液，2～5天后半量换液，再过2～5天后换全液，并用常规培养基培养；当细胞生长到孔底一半时，开始筛查，阳性孔扩大培养，冻存和测试，经2～4次培养检查仍为阳性，获得抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株2C10和4G6。
优选的，所述步骤(3)中，脾细胞与对数生长期的SP2/0细胞按5：1的个数比例混合。
优选的，所述步骤(3)中，经3次克隆培养仍为阳性，获得抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株。
本发明筛查获得的抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株2C10和4G6已于2016年3月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO:C201644(2C10)和CCTCC NO:C201645(4G6)。
本发明还提供了抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株2C10和4G6在检测罗非鱼无乳链球菌血清抗体中的应用。
在具体的应用方面，本发明提供了一种检测罗非鱼无乳链球菌血清抗体的方法，包括如下步骤：
(1)单克隆抗体的制备：用佛氏不完全佐剂对BALB/C小鼠进行腹腔注射，0.2～0.5ml/只，一周后得到备用BALB/C小鼠；将获得的阳性抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株2C10和4G6培养到生长对数期，吹打下来，计数，分别接种备用BALB/C小鼠，每只备用BALB/C小鼠腹腔接种2×106～3×106个，10－15天即长出腹水，抽取腹水，12000～15000rpm离心5～10min，得到单克隆抗体，分装并于－20～－30℃保存；
(2)单克隆抗体的提纯和West-blot鉴定：用抗体亚型鉴定试剂盒鉴定所得单克隆抗体的亚型，然后用辛酸－饱和硫酸铵沉淀法提纯并进行West-blot鉴定；
(3)提纯单克隆抗体的HRP酶标及效价的测定：将提纯的单克隆抗体，用HRP快速酶标试剂盒进行标记后，得到酶标二抗2C10和酶标二抗4G6，用ELISA法测定效价；
(4)间接ELISA的优化：新培养的罗非鱼无乳链球菌经灭活后，采用干燥包被法进行包被，在ELISA试剂盒加入效价高的酶标二抗2C10进行反应，得到ELISA试剂盒的最佳工作条件为：包被菌液浓度为1.5×108CFP，血清稀释度为1：8稀释，酶标二抗2C10最佳工作稀释度为1：1000；
(5)罗非鱼血清抗体的检测：将罗非鱼适应性饲养3～5天，进行免疫，每尾腹腔接种灭活无乳链球菌1.5×107～1.5×108CFU后，每15天接种一次，共接种3次，每次接种进行尾部采血，分离血清，用步骤(4)所得试剂盒的最佳工作条件进行罗非鱼抗体检测，同时设对照组，只注射生理盐水。
优选的，步骤(1)中，每只备用BALB/C小鼠腹腔接种细胞2×106个。
优选的，步骤(1)中，用佛氏不完全佐剂对BALB/C小鼠进行腹腔注射，0.3ml/只。
优选的，步骤(5)中，将罗非鱼适应性饲养3天，进行免疫，每尾腹腔接种灭活无乳链球菌1.5×108CFU。
有益效果：本发明通过筛选得到抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株并运用于ELISA检测试剂盒的优化，通过筛选出试剂盒的最佳工作条件，对罗非鱼无乳链球菌血清抗体进行检测，灵敏度更高，并且可进行大批量的检测，本发明可应用于罗非鱼的疾病检测和免疫效果监测。本发明建立了良好的ELIS检测方法，对于将来研究鱼类免疫反应，病原防治，提供了重要的实验方法。
生物材料保藏信息说明
分类命名：杂交瘤细胞，于2016年3月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenter for Type Culture Collection，简称CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO:C201644(2C10)和CCTCC NO:C201645(4G6)。
附图说明
图1为罗非鱼血清和提纯后IgM电泳图(图中标记：1-Maker；2-罗非鱼血清；3、4-提纯后的IgM)；
图2为单抗2C10的West-blot(图中标记：1-变性罗非鱼IgM的SDS-PAGE；2、3-非变性罗非鱼IgM的SDS-PAGE；4-变性IgM的West-blot；5、6-非变性的IgM的Westb-lot)；
图3为单抗4G6的West-blot(图中标记：1-变性罗非鱼IgM的SDS-PAGE；2-非变性罗非鱼IgM的SDS-PAGE；3-非变性IgM的West-blot；4-变性的IgM的Westb-lot)；
图4为罗非鱼血清抗体的变化图(图中标记：a-免疫后的罗非鱼抗体变化；b-未免疫的罗非鱼抗体变化)。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
保藏号为CCTCC NO:C201644的抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株2C10和保藏号为CCTCC NO:C201645的抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株4G6的筛选方法，包括如下步骤：
(1)罗非鱼血清IgM的提取：将50～100克的罗非鱼(尼罗罗非鱼或吉富罗非鱼)经3次免疫，收集全血，在室温自然析出血清，用6000rpm离心10min，离心分离取上清液得到血清，将血清于－20℃保存，使用时于4℃解冻，用PBS液稀释进行2倍稀释，进行血清IgM蛋白的分离，将稀释后的血清用饱和硫酸铵沉淀，离心，取沉淀，将沉淀用PBS溶解后，再用Protein-A柱层析纯化IgM蛋白，层析后蛋白浓缩到1mg/mL，用SDS-PAGE检测蛋白纯度。
罗非鱼血清经饱和硫酸铵分级提纯后，再通过Protein A柱层析，浓缩后，一共制备得8mg蛋白。经SDS-PAGE电泳，结果见图1，IgM蛋白重链处于45-66KD之间；轻链处于20-35KD之间，经过提取，得到的蛋白纯度高。
(2)小鼠免疫：购回BALB/C小鼠(广西医科大学动物实验室)，4周龄，将50μg纯化罗非鱼IgM蛋白和等量体积的佛氏完全佐剂进行乳化后，在小鼠皮下多点注射，完成小鼠的首次免疫；将50μg纯化罗非鱼IgM蛋白和不完全佐剂乳化，在小鼠皮下多点免疫，在小鼠首次免疫后每隔2周进行免疫一次；第三次免疫后一周，尾静脉采血测效价，小鼠血清效价达到1：10000以上，进行融合准备，融合前3天用罗非鱼IgM蛋白120μg对小鼠直接腹腔和静脉进行加强免疫。
(3)细胞融合及筛查：取加强免疫3天后的小鼠，断颈处死，无菌取出脾脏，分离脾细胞，将脾细胞与对数生长期的SP2/0细胞按5：1比例混合，得到混合细胞，在37℃水浴预热，将混合细胞弹松散；加入已预热到37℃的细胞融合剂1.5ml，逐滴加入，在40秒内加完，静置1min后，逐滴加入预热到37℃的DMEM培养基，1000rpm离心10min；最后在含氨基喋呤(A)，次黄腺嘌呤、20％胎牛血清和1.2％的甲基纤维素半固体培养基中培养；7－10天后，融合的细胞生长成团，在体视解剖镜下，逐个细胞团吸出到96孔板中培养，培养液为DMEM细胞培养液(Gibico公司生产)，3天后半量换液，再过3天后换全液，并用常规培养基培养；当细胞生长到孔底一半时，开始筛查，阳性孔扩大培养，冻存和测试，经3次克隆培养检查仍为阳性，则获得抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株。
经过筛查，得到2株稳定的分泌抗体的细胞，分别为2C10和4G6，细胞培养上清效价分别达到1：100000和1：24000；经亚型鉴定，均为IgG1型。
一种检测罗非鱼无乳链球菌血清抗体的方法，包括如下步骤：
(1)单克隆抗体的制备：预先用佛氏不完全佐剂处理的BALB/C小鼠，0.3ml/只，腹腔注射一周；将获得的阳性抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞2C10和4G6培养到生长对数期，吹打下来，计数，分别接种三只BALB/C小鼠，每只BALB/C小鼠腹腔接种细胞2×106，10－15天即长出腹水，抽取腹水后，继续饲养小鼠，一共抽取3次，每株收集约10ml，于12000rpm离心10min，得到单克隆抗体，分装并于-20℃保存。
(2)单克隆抗体的提纯和West-blot鉴定：用抗体亚型鉴定试剂盒鉴定所得单克隆抗体的亚型，然后用辛酸－饱和硫酸铵沉淀法提纯并进行West-blot鉴定。
单克隆抗体的亚型的鉴定：参照试剂盒说明书(单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，Siga公司生产)：
提取的罗非鱼IgM蛋白包板，加入细胞株的培养上清液100ul；置于37℃1小时后用PBST洗涤3次；加入单克隆抗体亚型血清，室温30min后用PBST洗涤3次；加入酶标兔抗羊抗体，室温30min后用PBST洗涤3次，加入底物缓冲液，室温15min,最后加入2N硫酸，用450nm波长读数。
收集的腹水即单克隆壳体经辛酸-饱和硫酸铵进行提纯，单克隆抗体提纯后浓度为2.9mg/ml(2C10株)，2.5mg/ml(4G6株)，效价分别为1：640000和1：100000以上。
West-blot鉴定：配5％分离胶和12％的浓缩胶，上样电泳。先用80V电泳30min，然后用120V电泳1h；电泳结束后，用半干转膜仪转膜，转30min；用预染液染色；加入5％奶粉，封闭1h；然后用PBST洗3次，每次5min；加入单抗(2C10和4G6)，室温反应1h；然后用PBST洗3次，每次5min；加入酶标羊抗鼠二抗，室温反应1h；然后用PBST洗3次，每次5min；加入DAB显色液，显色。
经West-blot，2C10和4G6株与重链反应，与完整的免疫球蛋白也有反应。由图2和图3可知，制备的单克隆抗体能够与罗非鱼的IgM蛋白反应。
(3)提纯单克隆抗体的HRP酶标及效价的测定：将提纯的单克隆抗体，用HRP快速酶标试剂盒(湖洲英创生物科技有限公司)，参照说明书的方法进行标记后，得到酶标二抗，用ELISA法测定效价；
经鉴定后用效价最高的2C10进行酶标。按试剂说明，酶标提纯后，测定效价为1：24000。
(4)间接ELISA的优化：新培养的罗非鱼无乳链球菌经灭活后，分别采用不同的包被方法进行包被，包括5％戌二醛包被法、干燥包被法和碳酸盐包被法，在包被好的板中加入无乳链球菌免疫的罗非鱼阳性血清和阴性血清，37℃孵育1h,PBST洗涤3次，每次5min；加入酶标二抗，在37℃孵育1h,PBST洗涤3次，每次5min；加入TMB底物显色液，37℃15min,最后加入2N硫酸，每孔50μL，终止反应，在酶标仪上用450nm波长读数，记录OD值，确定哪种方法最稳定后，采用棋盘法对抗罗非鱼无乳链球菌阳性血清和阴性血清稀释倍数、酶标二抗的稀释倍数和包被细菌数进行优化，得出ELISA试剂盒的最佳工作条件。
5％戌二醛包被法的具体步骤如下：将灭活的罗非鱼无乳链球菌用5％戌二醛调整浓度到1.5×108,加入ELISA板中，每孔100μL,37℃2h后，于4℃放置12h，然后用PBST洗涤3次，每次5分钟，再用5％脱酯奶粉封闭37℃2h或4℃12h，然后用PBST洗涤3次，拍干放4℃备用。
干燥包被法的具体步骤如下：用PBS把罗非鱼无乳链球菌悬液调到1.5×108，放到50℃烘箱中12h干燥后加入-20℃冰冻的甲醇，每孔50μL，15min后用蒸馏水洗涤3次，每次5min，最后用5％奶粉封闭37℃2h或4℃12h。用PBST洗3次，每次5min，放4℃备用。
碳酸盐包被法的具体步骤如下：将灭活的细菌用pH＝9.6碳酸盐溶液调整浓度到1.5×108,加入ELISA板中，每孔100μL,37℃2h后，于4℃放置12h，然后用PBST洗涤3次，每次5分钟，再用5％脱酯奶粉封闭37℃2h或4℃12h，然后用PBST洗涤3次，拍干放4℃备用。
经过预试验，最后选择干燥包被法。经试验后，由表1数据可知，得到最佳工作条件为，包被菌液浓度为1.5×108CFP，血清稀释度为1：8稀释，酶标二抗2C10最佳工作稀释度为1：1000，阴阳对照成立的前提下，OD P(阳)/N(阴)≥2即为阳性。
表1为不同的无乳链球菌浓度包板的反应结果。
表1
Figure BDA0001191472910000081
Figure BDA0001191472910000091
(5)罗非鱼血清抗体的检测：从鱼种场购进吉富罗非鱼，3月龄大，适应性饲养3天，进行免疫，每尾腹腔接种灭活无乳链球菌1.5×108CFU后，每15天接种一次，共接种3次，每次接种进行尾部采血，分离血清，用步骤(4)所得ELISA试剂盒的最佳工作条件进行罗非鱼抗体检测，同时设对照组，只注射生理盐水。
罗非鱼免疫后血清抗体的变化：如图4所示，罗非鱼进行免疫后，罗非鱼血清中抗无乳链球菌抗体升高，而没有免疫的，抗体变化不大，说明罗非鱼对免疫产生应答，用本方法的ELISA试剂盒可以检测得到。
鱼类与哺乳动物一样，对外来病原体能产生体液免疫，与哺乳动物不同的是鱼类主要的免疫球蛋白是IgM。本发明经过提取、纯化制备出罗非鱼IgM球蛋白，并用于免疫小鼠，经筛查得2株稳定的抗罗非鱼IgM的单克隆抗体。罗非鱼在我国鱼类养殖中占有重要的地位，而无乳链球菌病是主要危害养殖的病原。经过优化，建立了良好的ELIS检测方法，对于将来研究鱼类免疫反应，病原防治，提供了重要的实验方法。

Claims (1)

1.一种生产抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株，其特征在于：所述细胞株为细胞株2C10，保藏号为CCTCC NO:C201644。
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