CN106831945A

CN106831945A - 多肽及其在治疗急性肾损伤中的应用

Info

Publication number: CN106831945A
Application number: CN201710223327.9A
Authority: CN
Inventors: 黄昆; 陈红; 程呈; 黄依雪; 王超
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2017-04-07
Filing date: 2017-04-07
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2037-04-07
Also published as: CN106831945B

Abstract

本发明构建了C末端为羧基的11肽，以及包含11肽氨基酸序列的32肽和22肽。所述32肽和11肽能够显著地抑制阿霉素(ADR)处理的或缺氧再灌注(简称H/R)的肾小管细胞的DNA损伤反应，凋亡和炎症，其中以11肽效果最佳。在C57小鼠模型中，32肽和11肽能够明显缓解小鼠肾脏的缺血再灌注损伤(简称I/R损伤)；22肽也在一定程度上能够缓解这种损伤。本发明的11肽、32肽和22肽可以用于制备治疗急性肾损伤的治疗药物。

Description

多肽及其在治疗急性肾损伤中的应用

技术领域

本发明属于生物药学领域，更具体地，涉及一种多肽及其在治疗急性肾损伤中的应用。

背景技术

急性肾损伤是一个在全球有较高死亡率的疾病，其肾小管细胞缺血或者受到毒性损伤造成肾功能的急剧下降。急性肾损伤是造成终期肾脏疾病的重要原因之一。每年1.33亿人发生急性肾损伤并且大约每年造成170人死亡。

肾脏的缺血再灌注损伤是造成急性肾损伤的最主要原因，并在全球很高的死亡率。肾脏缺血再灌注的病理过程包括炎症的发生和凋亡的出现。有效的抑制促炎细胞因子和凋亡能够保护急性的肾脏缺血再灌注损伤。现在的医疗技术还没有比较有效的手段进行治疗，常以肾脏替代疗法延长肾病患者的生存期，所以寻找缓解肾脏缺血再灌注损伤的药物迫在眉睫。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种多肽及其在应用，其目的在于通过构建C末端为羧基的11肽以及包含11肽氨基酸序列的22肽和32肽，并应用于急性肾损伤修复，本发明的11肽和32肽对肾脏的缺血再灌注损伤有明显的保护作用；22肽在一定程度上对肾脏的缺血再灌注损伤有保护作用，由此解决现有技术对急性肾损伤缺乏有效治疗手段的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种多肽，所述多肽的氨基酸序列包括第一序列，所述第一序列为：

(1)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或

(2)与序列SEQ ID NO：1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID NO：1限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物具有与序列SEQ ID No：1表达蛋白具有同等活性的氨基酸序列。

优选地，所述第一序列N端连接有第二序列，所述第二序列为：

(1)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或

(2)与序列SEQ ID NO：2限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID NO：2限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物具有与序列SEQ ID No:2表达蛋白具有同等活性的氨基酸序列。

优选地，所述第一序列N端连接有第三序列，所述第三序列为：

(1)由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；或

(2)与序列SEQ ID NO：3限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID NO：3限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物具有与序列SEQ ID No:3表达蛋白具有同等活性的氨基酸序列。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的多肽的应用，应用于制备治疗急性肾脏损伤或糖尿病并发肾病的药物。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的多肽的应用，应用于制备修复DNA损伤的药物或保健产品。

按照本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，其包含如权利要求所述的多肽和药学上可接受的赋形剂。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的药物组合物的制备方法，包括将如权利要求1～3任意一项所述的多肽与至少一种药学上可接受的赋形剂混合。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。

本研究发现11肽以及包含11肽氨基酸序列的22肽和32肽可以抑制C57BL/6小鼠肾脏缺血再灌注损伤引起的炎症的上调和DNA损伤的加剧，其中，11肽和32肽能够对急性肾损伤较明显的保护作用，其中以11肽效果尤为显著，22肽在一定程度上也对肾脏的缺血再灌注损伤有保护作用，本发明的11肽、22肽和32肽为制备治疗缺血再灌注药物奠定了基础，为开发出更有效的治疗药物提供了新思路。

本发明的32肽和11肽能够通过抑制DNA损伤蛋白如p-ATR、p-chk1和p-H2A.X等从而抑制肾脏缺血再灌注引起的DNA损伤；能够抑制肾脏缺血再灌注引起炎症因子的上调、炎症细胞的浸润；能够减少肾脏缺血再灌注引起的细胞凋亡；能够抑制肾脏缺血再灌注引起肾脏形态的恶化、纤维化相关基因的上调和纤维化蛋白的沉积。而22肽也能够一定程度的缓解这些情况，但是32肽和11肽表现出更好的效果，尤其是11肽尤为显著。

附图说明

图1是本发明的11肽、22肽和32肽的氨基酸序列；

图2是本发明11肽、22肽和32肽给药后各组细胞的炎症基因Kim1、Ilb、Icam1、Tnfa的相对mRNA水平以及DNA损伤和凋亡蛋白的测试；

图3是本发明的11肽、22肽和32肽抑制H/R引起的DNA损伤以及细胞凋亡情况测试；

图4是本发明11肽、22肽和32肽给药后细胞存活率、DNA损伤相关蛋白和凋亡蛋白测试；

图5是动物实验设计图；

图6是本发明的11肽、22肽和32肽给药后肾脏功能测试；

图7是本发明的11肽、22肽和32肽给药后凋亡相关蛋白测试。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供了一种多肽，所述多肽的氨基酸序列包括第一序列，所述第一序列为：

(1)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或

优选地，本发明的多肽的氨基酸序列可以为：在所述第一序列N端连接有第二序列，所述第二序列为：

(1)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或

优选地，本发明的多肽的氨基酸序列还可以为：在所述第一序列N端连接有第三序列，所述第三序列为：

(1)由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；或

本发明的多肽可以应用于制备治疗急性肾脏损伤或糖尿病并发肾病的药物，或应用于制备修复DNA损伤的药物或保健产品。

本发明的多肽通过与至少一种药学上可接受的赋形剂混合制备得到药物组合物。

作为其中的一种优选，本发明设计、构建了C末端为羧基的11肽(其序列为CMPLHSRVPFP-COOH)，包括11肽氨基酸序列的22肽(其序列为KLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP-COOH)以及32肽(QRPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP-COOH)，结构如图1所示。

本发明实施例中使用的C57BL/6小鼠购买于湖北动物中心，本发明的11肽、22肽和32肽按照标准的固相多肽合成步骤合成。多肽合成方向为C端到N端，首先是树脂的溶胀，使用的是氯树脂；然后将第一个氨基酸连在树脂上；第一个氨基酸连在树脂上需要doublecoupling即氨基酸与树脂反应两次；随后将氨基酸氨基端Fmoc基团的去除(脱保护)；再次是肽链延长的过程，经过重复缩合、洗涤、脱保护、洗涤、缩合的步骤，按多肽序列从C端向N端逐一连接氨基酸，直至合成所需肽片段；随着树脂去溶胀及干燥、将肽段切除和粗肽的纯化，即可合成我们需要的11肽、22肽和32肽。

本发明的32肽和11肽能够通过抑制DNA损伤蛋白如p-ATR、p-chk1和p-H2A.X等从而抑制肾脏缺血再灌注引起的DNA损伤；能够缓解肾脏缺血再灌注引起炎症因子的上调、炎症细胞的浸润；能够减少肾脏缺血再灌注引起的细胞凋亡；能够缓解肾脏缺血再灌注引起肾脏形态的恶化、纤维化相关基因的上调和纤维化蛋白的沉积。而22肽也能够一定程度的缓解这些情况，但是32肽和11肽表现出更好的效果，尤其是11肽尤为显著。

以下为实施例：

实施例1

11肽和32肽能够抑制大鼠肾小管细胞(NRK-52E)缺氧复氧损伤所致的炎症、DNA损伤和凋亡。

具体操作：对NRK-52E细胞进行处理，分为正常组(CT组)、缺氧复氧组(H/R组)、缺氧复氧组给32肽(E32组)、缺氧复氧组给22肽(E22组)和缺氧复氧组给11肽(E11组)。收集各组细胞，提取RNA后运用实时定量PCR仪检查各组的Kim1、Ilb、Icam1、Tnfa的相对mRNA水平(图2A)。将各组不同处理的细胞进行MTT实验(图2B)，检测细胞的存活率。收集NRK-52E细胞，进行超声裂解，通过免疫印迹检测DNA损伤相关蛋白(p-ATR、p-Chk1和p-H2A.X)和凋亡相关蛋白(caspase3和c-caspase3)(图2C和D)。图2分析表明本发明的32肽、22肽和11肽能够抑制H/R引起的炎症上调、DNA损伤和凋亡。

对各组细胞通过免疫荧光染色检测DNA损伤发生的标志物p-H2A.X的荧光强度，通过TUNEL染色检测各组细胞的凋亡情况，结果如图3所示。

结果如图2和图3所示，在缺氧复氧的条件下，NRK-52E细胞Kim1、Ilb、Icam1、Tnfa的相对mRNA水平有明显的上升，给32肽和11肽后有明显的下降；给22肽在一定程度上也有下降。在缺氧复氧处理后给予NRK-52E细胞32肽和11肽后，p-ATR、p-Chk1和p-H2A.X的蛋白水平有明显的下调；22肽也在一定程度上改善了缺氧复氧损伤(简称H/R)。通过TUNEL染色和c-caspase3的蛋白水平检测，32肽和11肽能够明显缓解细胞受到的缺氧复氧损伤(简称H/R)导致的凋亡增加。

实施例2

32肽和11肽能够抑制肾小管细胞(NRK-52E)受到阿霉素(简称ADR)诱导的DNA损伤

具体操作：对NRK-52E细胞进行处理，分为正常组(PBS组)、给予ADR处理(ADR组)、ADR处理后给32肽(E32组)、ADR处理后给22肽(E22组)和ADR处理后给11肽(E11组)。将各组不同处理的细胞进行MTT实验，检测细胞的存活率(图4A)。收集NRK-52E细胞，进行超声裂解，通过免疫印迹检测DNA损伤相关蛋白(p-ATR、p-Chk1和p-H2A.X)和凋亡相关蛋白(caspase3和c-caspase3、PARP-1和c-PARP-1)(如图4B和C)。

实验结果如图4所示，在ADR处理后给予NRK-52E细胞32肽和11肽后，p-ATR、p-Chk1的蛋白水平有明显的下调。给予22肽后，有一定程度的上升。通过MTT实验，发现给予32肽、22肽和11肽后能够减少ADR导致的细胞死亡。通过免疫印迹发现给予32肽和11肽后，c-caspase3和c-PARP-1有明显的减少，说明32肽和11肽能改善ADR诱导的凋亡。

实施例3

本发明的多肽能够抑制C57BL/6小鼠肾脏缺血再灌注(简称I/R)引起的肾脏形态的改变、炎症和纤维化。

具体操作：在正式实验进行前我们进行了本发明的系列多肽注射剂量预实验，系列多肽注射后小鼠各方面生理指标均正常，认为系列多肽是安全的。

将体重在25g左右的小鼠分为三组：对照小鼠组(CT组)、肾脏缺血再灌注小鼠组(I/R组)、肾脏缺血再灌注小鼠组给32肽(E32组)和肾脏缺血再灌注小鼠组给11肽组(E11组)。肾脏缺血再灌注小鼠组进行45分钟的I/R手术。对照小鼠组(CT组)、肾脏缺血再灌注小鼠组(I/R组)腹腔注射磷酸盐缓冲液每天两次。肾脏缺血再灌注小鼠给32肽组(E32组)和肾脏缺血再灌注小鼠给11肽组(E11组)按照每千克体重注射1.2mol的32肽和11肽每天两次，共三天。实验三天后，取肾脏测重并收集血液，实验设计如图5。

实验结果如图6和表1所示，小鼠在I/R损伤三天后，通过24h的尿液收集，发现尿液总量、蛋白尿、尿中肌酐的含量和氮含量有显著地上升，而给予32肽和11肽能够较好缓解这些肾脏功能指标的上升(表1)。通过对小鼠肾脏组织变化进行检测；与CT组相比，I/R损伤会导致严重的肾小管损伤，如广泛的肾小管坏死、肾小管细胞的脱落等。通过半定量的对组织切片进行评分，表明32肽和11肽能够明显的提高受损肾脏的评分(图6A)。通过对全部巨噬细胞的标志物F4/80的表达检测，发现肾脏I/R损伤后，巨噬细胞的浸润有明显的增加，32肽和11肽能够缓解这种浸润，从而表明32肽和11肽在一定程度上能够缓解炎症(图6B)。通过对纤维化的标记物，如胶原蛋白的沉积(马松三色染色简称Masson染色)，平滑肌激动蛋白(简称-SAM)和波形蛋白(简称Vimentin)进行分析，发现32肽和11肽能够保护I/R损伤的小鼠明显的纤维化变性(图6C)。通过实验测试能表明32肽和11肽有显著的改善效果，22肽有一定的改善效果但效果略逊色于32肽和11肽，其中11肽效果最好。

表1、32肽和11肽对肾脏功能的各种指标的影响

实施例4

32肽和11肽能够抑制肾脏I/R损伤诱导的DNA损伤反应和凋亡

具体操作：体重在25g左右的小鼠分为三组：对照小鼠组(CT组)、肾脏缺血再灌注小鼠组(I/R组)、肾脏缺血再灌注小鼠组给32肽(E32组)和脏缺血再灌注小鼠组给11肽组(E11组)。小鼠肾脏用石蜡包埋，切成5μM厚的切片，然后进行免疫组织化学染色和TUNEL染色。取肾脏研磨超声裂解，上样20ug进行免疫印迹实验对凋亡相关蛋白进行检测。

实验结果如图7所示，免疫印迹实验表明CT组p-ATR,p-Chk1和p-H2A.X在蛋白水平几乎检测不到；在肾脏发生I/R损伤时，p-ATR,p-Chk1和p-H2A.X在蛋白水平上又有明显的上调。32肽、22肽和11肽能够抑制肾脏I/R损伤诱导的p-Chk1和p-H2A.X的上调。相比于32肽和22肽，11肽表现出更强的抑制肾脏I/R损伤诱导的p-ATR和p-Chk1蛋白水平的上升(图7A)。肾表皮细胞的染色结果表明，32肽和11肽能抑制肾脏I/R损伤诱导的p-H2A.X染色加深(图7C)。肾脏I/R损伤能够上调c-caspase3，而32肽和11肽能下调I/R损伤诱导c-caspase3的上调(图7B)，并且TUNEL染色结果也是一致的(图7C)，表明32肽和11肽确实能够抑制肾脏I/R损伤诱导的细胞凋亡。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中科技大学

<120> 多肽

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Met Pro Leu His Ser Arg Val Pro Phe Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Lys Leu Arg Lys His Asn Cys Leu Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gln Arg Pro Val Asn Leu Thr Met Arg Arg Lys Leu Arg Lys His Asn

1 5 10 15

Cys Leu Gln Arg Arg

20

Claims

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列包括第一序列，所述第一序列为：

(1)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第一序列N端连接有第二序列，所述第二序列为：

(1)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或

3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第一序列N端连接有第三序列，所述第三序列为：

(1)由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；或

4.一种如权利要求1～3任意一项所述的多肽的应用，其特征在于，应用于制备治疗急性肾脏损伤或糖尿病并发肾病的药物。

5.一种如权利要求1～3任意一项所述的多肽的应用，其特征在于，应用于制备修复DNA损伤的药物或保健产品。

6.一种药物组合物，其特征在于，其包含如权利要求1～3任意一项所述的多肽和药学上可接受的赋形剂。

7.一种如权利要求6所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括将如权利要求1～3任意一项所述的多肽与至少一种药学上可接受的赋形剂混合。