CN106823009A - 一种具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学工程技术领域，公开了一种具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架材料及其制备方法，所述的骨修复材料为三维多孔柱状结构，由二氧化硅、生物活性肽EAbuK和抗菌肽LL‑37组成。该种骨修复支架以二氧化硅支架为基质，通过3‑氨基丙基三乙氧基硅烷对其进行表面活化使其表面具有反应活性，再通过与生物活性肽EAbuK进行反应，是到生物活性肽EAbuK在其表面上进行自组装，最后利用物理吸附的方法将抗菌肽LL‑37负载到骨修复支架上，从而制备出具用诱导修复和抗菌性能的骨修复支架。该种支架具有良好的孔洞结构，而且因为生物活性肽EAbuK和抗菌肽LL‑37的加入具有良好的生物相容性、骨诱导能力和抗菌能力，满足临床对骨修复材料的要求。

Description

一种具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架材料及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，特别是骨修复支架制备技术领域，公开了一种具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架材料的制备方法。
背景技术
因细菌感染引起的慢性骨感染是骨缺损治疗中的难点。其中骨修复材料相关的感染随着其应用的增多，发病率明显增高，防治以骨修复材料相关感染是临床面临急需解决的问题。很多研究表明骨修复材料的植入增加了细菌入侵宿主途径，降低机体的防御能力，减弱了阻止细菌粘附和生物膜形成的作用。生物膜一旦形成，为游离细菌提供了新的粘附位点，同时细菌不断的游离或从生物膜释放出来，成为慢性感染源。因此，研究具有抗菌性能的骨修复材料成为该领域的研究热点。
目前，国外采用在骨修复材料表面涂饰抗感染剂或抗生素的方法解决骨修复材料植入时可能发生的细菌感染，起到了一定的作用。但在实际使用中发现通过涂饰抗感染剂或抗生素制备得到的抗菌骨修复材料有以下缺点:(1)涂覆型涂层在体液的浸泡下，可能从骨修复材料表面脱离从而失去抗菌作用。而且脱落层可能引起局部抗菌剂或抗生素浓度过高影响人体的健康。(2)抗菌涂层有效作用期短，长期使用时无法保证抗感染性。（3）抗菌剂的生物选择性低会对人体健康造成一定的影响。（4）现有的涂覆型抗菌骨修复材料，因在要在支架表面涂覆一层抗菌层，所以会导致支架表面的活性位点减少，使其骨诱导能力大大下降，导致骨缺损部位重建延误。
基于此，临床上急需高性能的具有诱导修复能力的抗菌骨修复支架，用于有效修复慢性骨感染引起的骨缺损，尽可能恢复患者功能，降低手术失败率及感染复发率，最终减轻患者痛苦及经济负担。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的骨修复支架的生物相容性低，长期使用会产生耐药性，功能单一不具备诱导组织再生功能等不足，提供一种具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架材料的制备方法。本发明以二氧化硅为基材制备出具有三维孔洞结构的骨修复支架材料，再利用表面活化剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷对二氧化硅骨修复支架进行表面活化，然后通过多肽缩合剂将生物活性肽EAbuK固定在二氧化硅骨修复支架表面，最后通过物理吸附的方法将抗菌肽LL-37负载在骨修复支架上。该骨修复支架具有良好的力学性能和生物相容性，抗菌性能优异长时间使用后不会产生耐受性，且该种骨修复支架又有良好的骨诱导能力和骨传导能力，能诱导骨组织缺损部位的再生。
为实现上述目的，本发明的技术方案为一种具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架为三维多孔柱状结构，由二氧化硅、生物活性肽EAbuK和抗菌肽LL-37组成。
进一步的，所述的具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架按重量份数计由二氧化硅20份、生物活性肽EAbuK 0.2-0.6份和抗菌肽LL-37 0.1-0.3份组成。
优选的，所述的二氧化硅购自美国sigma公司、生物活性肽EAbuK和抗菌肽LL-37购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
为实现上述目的，本发明的另一技术方案为：一种具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架材料的制备方法，所述的制备方法通过以下步骤实现：（1）二氧化硅支架的制备及表面活化处理、（2）生物活性肽EAbuK的固定、（3）抗菌肽LL-37的负载。
进一步的，所述二氧化硅支架的制备及活化处理具体步骤为：（1）二氧化硅骨修复支架的制备：按配方比将二氧化硅加入到质量浓度为10%的聚乙烯醇溶液中，搅拌2-3小时后得二氧化硅聚乙烯醇溶液，然后将圆柱状的聚氨酯多孔海绵浸入到二氧化硅聚乙烯醇溶液中，反复挤压聚氨酯多孔海绵，使二氧化硅聚乙烯醇溶液能完全进入到聚氨酯多孔海绵的内部，然后将浸泡过二氧化硅聚乙烯醇溶液的聚氨酯多孔海绵置于马弗炉中1000℃煅烧，冷却后，用去离子水冲洗，室温下真空干燥，即得二氧化硅骨修复支架；（2）二氧化硅骨修复支架表面活化处理：将所制得的二氧化硅支架浸泡于由浓盐酸、浓硫酸和水按体积比1:1:6混合而成的溶液中加热至85℃反应6-10 分钟，然后用去离子水冲洗；然后将二氧化硅骨修复支架浸泡于由浓盐酸和质量浓度为30%的过氧化氢溶液按体积比1:1混合而成的溶液中室温下反应2小时，然后用去离子水冲洗；然后将二氧化硅骨修复支架浸泡于由3-氨基丙基三乙氧基硅烷和甲苯按体积比1:9混合而成的溶液中加热至110℃反应3-4小时，然后用离子水冲洗，置于真空干燥箱中100℃真空干燥6小时。
更进一步的，所述的生物活性肽EAbuK的固定具体步骤为：（1）按配方量将生物活性肽EAbuK溶于N-甲基吡咯烷酮（NMP）中配成浓度为2.5mg/mL的EAbuK/NMP溶液，备用；将N，N-二异丙基乙胺、1-羟基苯并***、O-苯并三氨唑-四甲基脲六氟磷酸酯按摩尔比1:1:1配成DIPEA/HOBT/HBTU混合溶液，备用；（2）将经表面活化处理的二氧化硅支架浸泡于步骤（1）中所配制的生物活性肽EAbuK/NMP溶液中，然后加入DIPEA/HOBT/HBTU混合溶液中，室温反应12小时。（3）反应结束后，将支架移出反应液，用N-甲基吡咯烷酮洗涤三次、丙酮洗涤三次，最后用去离子水洗涤2~3次，置于37℃真空干燥箱中干燥24小时；
更进一步的，所述的抗菌肽LL-37的负载具体步骤为：（1）将抗菌肽LL-37溶于磷酸盐缓冲液中配制成质量浓度为0.5~1.5%的溶液，备用；（2）将表面固定有生物活性肽EAbuK浸泡于抗菌肽LL-37溶液中24小时后，置于-80℃冷冻干燥机中干冷冻干燥24小时，即得具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架材料。
本发明的有益效果为：
（1）本发明所制得的具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌均有较强的长效抑菌作用（接触细菌24和72小时后，抑菌率均能达95%以上）。
（2）本发明所制得的具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架是以二氧化硅为基质，通过表面活化后再将生物活性肽EAbuK固定在支架的表面，使得骨修复支架的细胞黏附能力和骨诱导能力提高，使所制得的骨修复支架能诱导骨缺损部位的骨组织的再生。
（3）本发明所制得的具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架，通过将生物活性肽EAbuK固定在其表面上，使骨修复支架的表面具有更多的活性位点，再将抗菌肽LL-37负载到骨修复支架上，因为骨修复支架表面上的生物活性肽EAbuK上的末端氨基能与抗菌肽LL-37的羟基发生作用使得支架材料在使用时能缓慢释放，并且在抗菌肽LL-37释放后，能使活性EAbuK的抗菌性能重新激活，能与抗菌肽LL-37产生协同杀菌作用，使得所制得的骨修复支架的抗菌性能相比于通过涂覆或负载抗生素所制得的抗菌骨修复材料的抗菌能力要高。
附图说明
图1为实施例1～3与对比例的抗菌性能评价结果对比图；
图2为实施例1～3和对比例与人骨髓间充质干细胞共培养24小时和48小时后细胞毒性评价结果对比图；
图3为实施例1～3与对比例的碱性磷酸酶试验结果对比图；
图4为实施例1～3与对比例的骨钙蛋白酶联吸附试验结果对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1
一种具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架为多孔柱状结构，按重量份数计由二氧化硅20份、生物活性肽EAbuK 0.2份和抗菌肽LL-37 0.1份组成。
实施例2
一种具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架为多孔柱状结构，按重量份数计由二氧化硅20份、生物活性肽EAbuK 0.4份和抗菌肽LL-37 0.2份组成。
实施例3
一种具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架为多孔柱状结构，按重量份数计由二氧化硅20份、生物活性肽EAbuK 0.6份和抗菌肽LL-37 0.3份组成。
实施例4
实施例1～实施例3任一例，其制备方法的具体步骤如下：
1. 二氧化硅骨修复支架的制备其表面活化处理：
（1）二氧化硅骨修复支架的制备：按配方比将二氧化硅加入到质量浓度为10%的聚乙烯醇溶液中，搅拌2-3小时后得二氧化硅聚乙烯醇溶液，然后将圆柱状的聚氨酯多孔海绵浸入到二氧化硅聚乙烯醇溶液中，反复挤压聚氨酯多孔海绵，使二氧化硅聚乙烯醇溶液能完全进入到聚氨酯多孔海绵的内部，然后将浸泡过二氧化硅聚乙烯醇溶液的聚氨酯多孔海绵置于马弗炉中1000℃煅烧，冷却后，用去离子水冲洗，室温下真空干燥，即得二氧化硅骨修复支架；
（2）二氧化硅骨修复支架表面活化处理：将所制得的二氧化硅支架浸泡于由浓盐酸、浓硫酸和水按体积比1:1:6混合而成的溶液中加热至85℃反应10 分钟，然后用去离子水冲洗；然后将二氧化硅骨修复支架浸泡于由浓盐酸和质量浓度为30%的过氧化氢溶液按体积比1:1混合而成的溶液中室温下反应2小时，然后用去离子水冲洗；然后将二氧化硅骨修复支架浸泡于由3-氨基丙基三乙氧基硅烷和甲苯按体积比1:9混合而成的溶液中加热至110℃反应4小时，然后用离子水冲洗，置于真空干燥箱中100℃真空干燥6小时。
2. 生物活性肽EAbuK的固定：
（1）按配方量将生物活性肽EAbuK溶于N-甲基吡咯烷酮（NMP）中配成浓度为2.5mg/mL的EAbuK/NMP溶液，备用；将 N，N-二异丙基乙胺、1-羟基苯并***、O-苯并三氨唑-四甲基脲六氟磷酸酯按摩尔比1:1:1配成DIPEA/HOBT/HBTU混合溶液，备用；
（2）将经表面活化处理的二氧化硅支架浸泡于步骤（1）中所配制的生物活性肽EAbuK/NMP溶液中，然后加入DIPEA/HOBT/HBTU混合溶液中，室温反应12小时。
（3）反应结束后，将支架移出反应液，用N-甲基吡咯烷酮洗涤三次、丙酮洗涤三次，最后用去离子水洗涤3次，置于37℃真空干燥箱中干燥24小时；
3.抗菌肽LL-37的负载：
（1）将抗菌肽LL-37溶于磷酸盐缓冲液中配制成质量浓度为0.5~1.5%的溶液，备用；
（2）将表面固定有生物活性肽EAbuK浸泡于抗菌肽LL-37溶液中24小时后，置于-80℃冷冻干燥机中干冷冻干燥24小时。
实施例5
对比例：为市售的由羟基磷灰石制成的骨修复材料；
实验组1~3：为实施例1～3所得的具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架，采用实施例4的方法制备而成。
将上述实施例1～3所制备的具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架与对比例进行抗菌能力评价实验，对比实施例1~3和对比例对大肠杆菌和金黄葡萄球菌接触24和36小时后的抑菌效果。实验结果如图1示。
从抗菌性能评价试验结果可知实施例1~3对大肠杆菌和金黄葡萄球菌均有较强的杀灭作用，而且实施例1~3的抑菌能力不因接触时间的延长而降低。
实施例6
对比例：为市售的由羟基磷灰石制成的骨修复材料；
实验组1~3：为实施例1～3所得的具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架，采用实施例4的方法制备而成。
将上述实施例1～3所制备的具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架与对比例进行细胞毒性评价实验（按国标GB/T 16886.5-2003进行实验），对比实施例1~3和对比例对。实验结果如图2示。
细胞毒性检测结果显示实施例1~3在与人骨髓间充质干细胞共培养24小时和48小时后其对应的细胞相对增殖率均在90%以上，细胞毒性评级为0级，证明其具有良好的细胞形容性，而对比例与人骨髓间充质干细胞共培养24小时和48小时后其对应细胞相对增殖率均在80%左右，细胞毒性评级为2级，具有轻微的细胞毒性。此外，共培养时间的延长实施例1~3的相对相比增殖率均有明显提高，实施例1~3在48小时后其细胞相对增殖率均较阴性组要高（均高于100%），证明采用本发明所公开的制备方法所制得的骨修复支架具有促进人骨髓间充质干细胞的生长，有利于骨缺损部位骨髓间充质干细胞的生长，促进其分泌生长因子，促进新骨组织的生长。
实施例7
对比例：为市售的由羟基磷灰石制成的骨修复材料；
实验组1~3：实验组1~3：为实施例1～3所得的具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架，采用实施例4的方法制备而成。
将上述实施例1～3所制备的具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架与对比例分别与MG-63（人成骨肉瘤细胞）进行共培养7天后对其碱性磷酸酶和骨钙蛋白值进行检测，对比实验组和对比例的骨诱导能力。实验结果如图3和4所示：
碱性磷酸酶（alkaline phosphate ALP）和骨钙蛋白（osteocaltin OCN）均是分化成骨细胞的标志物，能促进骨基质的矿化。从上图可知，与对比例相比，实施例1~3的ALP值和骨钙蛋白含量均明显较对比例要高。由此可见，本发所制备的具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架具有较高的骨诱导能力，可以促进骨组织的诱导再生。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定；对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举；凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架材料，其特征在于，由下列重量份数的成分组成：二氧化硅20份、生物活性肽EAbuK 0.2-0.6份、抗菌肽LL-370.1-0.3份。
2.权利要求1所述的一种具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，所述的制备方法通过以下步骤实现：二氧化硅支架的制备及表面活化处理，生物活性肽EAbuK的固定，抗菌肽LL-37的负载。
3.根据权利要求2所述的一种具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，所述的二氧化硅支架的制备及表面活化处理的具体步骤为：
(1)二氧化硅骨修复支架的制备：按配方比将二氧化硅加入到质量浓度为10％的聚乙烯醇溶液中，搅拌2-3小时后得二氧化硅聚乙烯醇溶液，然后将圆柱状的聚氨酯多孔海绵浸入到所述二氧化硅聚乙烯醇溶液中，反复挤压聚氨酯多孔海绵，使二氧化硅聚乙烯醇溶液能完全进入到聚氨酯多孔海绵的内部，然后将浸泡过二氧化硅聚乙烯醇溶液的聚氨酯多孔海绵置于马弗炉中1000℃煅烧，冷却后，用去离子水冲洗，室温下真空干燥，即得所述二氧化硅骨修复支架；
(2)二氧化硅骨修复支架表面活化处理：将步骤(1)所制得的二氧化硅骨修复支架浸泡于由浓盐酸、浓硫酸和水按体积比1:1:6混合而成的溶液中加热至85℃反应6-10分钟，然后用去离子水冲洗；然后将二氧化硅骨修复支架浸泡于由浓盐酸和质量浓度为30％的过氧化氢溶液按体积比1:1混合而成的溶液中室温下反应2小时，然后用去离子水冲洗；然后再将二氧化硅骨修复支架浸泡于由3-氨基丙基三乙氧基硅烷和甲苯按体积比1:9混合而成的溶液中加热至110℃反应3-4小时，然后用离子水冲洗，置于真空干燥箱中100℃真空干燥6小时，即得经表面活化处理的二氧化硅骨修复支架。
4.根据权利要求2所述的一种具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，所述的生物活性肽EAbuK的固定的具体步骤为：
(1)按配方量将所述生物活性肽EAbuK溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP)中配成质量浓度为2.5mg/mL的EAbuK/NMP溶液，备用；将N，N-二异丙基乙胺、1-羟基苯并***、O-苯并三氨唑-四甲基脲六氟磷酸酯按摩尔比1:1:1配成DIPEA/HOBT/HBTU混合溶液，备用；
(2)将经表面活化处理的二氧化硅骨修复支架浸泡于步骤(1)中所配制的生物活性肽EAbuK/NMP溶液中，然后加入DIPEA/HOBT/HBTU混合溶液中，室温反应12小时；
(3)反应结束后，将支架移出反应液，用N-甲基吡咯烷酮洗涤三次、丙酮洗涤三次，最后用去离子水洗涤2～3次，置于37℃真空干燥箱中干燥24小时，即得表面固定有生物活性肽EAbuK的二氧化硅骨修复支架。
5.根据权利要求2所述的一种具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，所述的抗菌肽LL-37的负载的具体步骤为：
(1)将所述抗菌肽LL-37溶于磷酸盐缓冲液中配制成质量浓度为0.5～1.5％的溶液，备用；
(2)将表面固定有生物活性肽EAbuK的二氧化硅骨修复支架浸泡于抗菌肽LL-37溶液中24小时后，置于-80℃冷冻干燥机中干冷冻干燥24小时，即得所述具有诱导修复作用的抗菌骨修复支架材料。
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